超音波フィルター支援サンプル調製（FASP）：高度な超音波処理によるプロテオミクスワークフローの向上

超音波フィルター支援サンプル調製（FASP）は、現代のプロテオミクスにおいて、高効率で再現性の高い手法として台頭しています。確立されたFASPワークフローに制御された超音波処理を組み込むことで、研究者はタンパク質抽出、消化効率、データ品質全体を大幅に改善できます。ハイスループットで再現性の高いサンプル調製への需要が増す中、マイクロプレート用超音波処理装置UIP400MTPなど、集中的な超音波処理を行う装置の科学的・実用的な重要性が高まっています。

科学的背景：プロテオミクスでFASPが重要な理由

フィルター支援サンプル調製（FASP）は、界面活性剤、塩類、その他の汚染物質を除去しながら効率的な酵素消化を可能にするため、ボトムアッププロテオミクスの標準的な手法となっています。しかし、従来のFASPプロトコルには、不完全な溶解、消化の不均一性、サンプル間のばらつきに関する制約がしばしばあります – 特に、複雑な、または破砕しにくい生物の細胞や組織を扱う場合です。
こうした場面で、集中的に加えられる超音波エネルギー（超音波処理）が決定的な利点をもたらします。超音波処理は、機械的なせん断力とキャビテーションを生じさせることで、タンパク質の完全性を損なうことなく、FASPワークフローの複数の重要な工程を改善します。

超音波FASPにおける超音波処理の有益な効果

超音波処理は、制御された音響キャビテーション – 微小な気泡の形成と崩壊 – を生じさせ、局所的なせん断力とマイクロストリーミングを発生させます。
超音波処理は、物質移動を改善し、反応速度を高めることで、超音波FASPにおけるアルキル化工程と消化工程の両方を改善します。超音波エネルギーを加えるとキャビテーションが発生し、局所的なマイクロストリーミングと一過性のせん断力が生じます。これらは迅速な混合を促進し、タンパク質マトリックスまたはフィルター内の環境への試薬の効率的な浸透を促します。アルキル化では、これによりヨードアセトアミドによるシステイン残基の修飾がより均一かつ迅速になります。消化工程では、超音波処理によってタンパク質分解酵素が切断部位にアクセスしやすくなり、酵素と基質の相互作用が改善されるため、トリプシンの作用が促進され、消化効率が向上します。全体として、超音波処理は、反応の完結度と再現性を維持または改善しながら、処理時間を短縮します。

プロテオミクスのサンプル調製では、超音波FASPによって次の効果が得られます。

• 破砕しにくい組織や微生物サンプルでも、細胞破砕とタンパク質抽出をより効率的に実施
• タンパク質の可溶化の促進
• 消化時の酵素によるアクセス性の改善
• 処理時間の短縮と再現性の向上

従来の機械的または化学的な溶解方法とは異なり、超音波処理は高度に制御でき、スケール変更も可能なため、標準化されたプロテオミクスワークフローに特に適しています。

従来の手法に対する超音波FASPの利点

FASPプロトコルに超音波処理を組み込むことで、後段の質量分析結果に直接影響する、測定可能な利点が得られます。
超音波FASPは、特に線維性組織やバイオフィルムなどの扱いが難しいサンプルから、タンパク質をより完全に回収することを可能にします。均一なエネルギー分布によって反復サンプル間で一貫した処理が確保され、ばらつきが低減されます – これは定量プロテオミクスに不可欠な要件です。
さらに、超音波処理は酵素と基質の相互作用を改善することで、消化反応の速度を高めます。その結果、配列カバレッジを維持しながら、消化時間の短縮とペプチド収量の増加がしばしば得られます。
ワークフローの観点では、超音波システムは手作業による介入を減らし、強力な化学処理の必要性をなくすことで、サンプルの完全性を保ち、プロトコルの標準化を容易にします。

一晩処理するFASPと比較して、超音波FASPで同定されたタンパク質数の増加を示すベン図
画像および研究：©Carvalho et al., 2020

プロトコル：UIP400MTPによるハイスループット超音波FASP

大規模なサンプル群を処理する研究室では、マイクロプレート用超音波処理装置UIP400MTPにより、標準的なマルチウェルプレート（例：96ウェルプレート）の同時超音波処理が可能になり、サンプル処理能力と再現性が大幅に向上します。
この形式では、サンプル（通常、各ウェル50–200 µL）を、限外ろ過または後段の処理に対応したマイクロプレート内で直接調製します。溶解バッファーは、標準的なFASPプロトコルで使用するものと同様です。

UIP400MTPは、すべてのウェルに均一な超音波エネルギーを加えます。超音波処理は、サンプルの種類に応じて、通常60–80%の振幅で2–4分間行います。接続式の温度センサーを使用して温度を監視してください。パルス超音波処理を使用し、必要に応じて実験室用チラーを使用してください。

プロトコル例：

1. アルキル化工程では、マイクロプレート用超音波処理装置（UIP400MTP）を使用して、サンプルを40%の振幅で7サイクル超音波処理します（30 s ON、15 s OFF；総超音波処理時間：5 min 45 s）。
2. 超音波処理後、ヨードアセトアミド（IAA）溶液を遠心分離によって除去します。トリプシン消化の前に、酵素活性を阻害する強力なカオトロピック剤である残留尿素を除去するため、サンプルを洗浄する必要があります。そのため、25 mM炭酸水素アンモニウム（AmBic）200 μLでサンプルを二度洗浄します。
3. 続いて、12.5 mM炭酸水素アンモニウム中で調製したトリプシン溶液100 μL（酵素対タンパク質比1:30）を加えます。その後、UIP400MTPを使用し、同じ超音波処理条件（振幅40%、7サイクル、30 s ON / 15 s OFF；総時間：5 min 45 s）でタンパク質を消化します。
4. 超音波処理後、サンプルをフィルタープレートに移すか、プレート式FASPシステムを使用して処理します。還元工程とアルキル化工程をプレート内で行い、効率化されたワークフローを維持します。
5. トリプシン消化は、制御された条件下（例：37°C、4–16時間）で行います。酵素活性を促進し、ペプチド収量を向上させるため、短時間の超音波刺激を加えることもできます。
6. ペプチドを遠心分離によって回収すると、LC-MS/MS分析に使用できる状態になります。

このシステムの主な利点は、すべてのウェルに同一の処理条件を提供できることにあります。これにより、バッチ効果を最小限に抑え、大規模なプロテオミクス研究で信頼性の高い定量比較が可能になります。

設計、製造、コンサルティング – ドイツ製の品質

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文献 / 参考文献

FactSheet UIP550MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
• FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
• Luís B. Carvalho, José-Luis Capelo-Martínez, Carlos Lodeiro, Jacek R. Wiśniewski, Hugo M. Santos (2020): Ultrasonic-Based Filter Aided Sample Preparation as the General Method to Sample Preparation in Proteomics. Analytical Chemistry 92, 13; 2020. 9164–9171.
• Hugo M. Santos, Luís B. Carvalho, Carlos Lodeiro, Gonçalo Martins, Inês L. Gomes, Wilson D.T. Antunes, Vanessa Correia, Maria M. Almeida-Santos, Helena Rebelo-de-Andrade, António P.A. Matos, J.L. Capelo (2023): How to dissect viral infections and their interplay with the host-proteome by immunoaffinity and mass spectrometry: A tutorial. Microchemical Journal, Volume 186, 2023.
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