超音波フィルター補助サンプル前処理（FASP）：高度な超音波処理によるプロテオミクスワークフローの強化

超音波フィルター支援サンプル前処理（FASP）は、現代のプロテオミクスにおいて非常に効率的で再現性の高い手法として台頭してきている。確立されたFASPワークフローに制御された超音波処理を組み込むことで、研究者はタンパク質抽出、消化効率、全体的なデータ品質を大幅に向上させることができます。ハイスループットで再現性の高いサンプル前処理への要求が高まる中、マイクロプレートソニケーターUIP400MTPのような集束型ソニケーターは、科学的かつ実用的な関連性を増しています。

科学的背景プロテオミクスにおいてFASPが重要な理由

フィルター補助サンプル前処理（FASP）は、効率的な酵素消化を可能にしながら、洗浄剤、塩類、その他の汚染物質を除去できることから、ボトムアッププロテオミクスのゴールドスタンダードとなっている。しかしながら、従来のFASPプロトコールは、不完全な溶解、一貫性のない消化、サンプルのばらつきに関連する制限にしばしば直面する。 – 特に、複雑で弾力性のある生体細胞や組織を扱う場合には。
ここで、集束超音波エネルギー（超音波処理）が決定的な利点を提供する。機械的せん断力とキャビテーションを導入することで、超音波処理はタンパク質の完全性を損なうことなく、FASPワークフローの複数の重要なステップを強化します。

超音波FASPにおけるソニケーションのプラス効果

ソニケーションは制御された音響キャビテーションを導入 – 微細な気泡の形成と崩壊 – これは局所的なせん断力とマイクロストリーミングを発生させる。
ソニケーションは、物質移動の改善と反応速度論の促進により、超音波FASPにおけるアルキル化と消化の両ステップを強化する。超音波エネルギーの印加はキャビテーションを発生させ、局所的なマイクロストリーミングと過渡的なせん断力をもたらし、迅速な混合とタンパク質マトリックスまたはフィルター環境への試薬の効率的な浸透を促進する。アルキル化工程では、ヨードアセトアミドによるシステイン残基の修飾がより均一かつ迅速に行われる。消化ステップでは、超音波処理によりタンパク質分解切断部位へのアクセスが向上し、酵素-基質相互作用が改善されるため、トリプシン活性が促進され、消化効率が向上する。全体として、超音波処理は、反応の完全性と再現性を維持または改善しながら、処理時間を短縮する。

プロテオミクスのサンプル前処理では、超音波FASPが有効である：

• 硬い組織や微生物サンプルでも、より効率的な細胞破砕とタンパク質抽出が可能
• タンパク質の可溶化促進
• 消化中の酵素利用性の向上
• 処理時間の短縮と再現性の向上

従来の機械的または化学的溶解法とは異なり、超音波処理は高度に制御可能でスケーラブルであるため、標準化されたプロテオミクスワークフローに特に適している。

従来のアプローチに対する超音波FASPの利点

超音波処理をFASPプロトコールに組み込むことで、下流の質量分析結果に直接影響する測定可能な利点が得られる。
超音波FASPは、特に繊維組織やバイオフィルムのような困難なサンプルから、より完全なタンパク質回収を可能にする。均一なエネルギー分布により、複製間で一貫した処理が可能になり、ばらつきが減少します。 – 定量的プロテオミクスに不可欠な要件である。
さらに、超音波処理によって酵素と基質の相互作用が改善され、消化速度が加速される。この結果、シーケンスカバレッジを維持しながら、消化時間が短縮され、ペプチド収量が増加することが多い。
ワークフローの観点からは、超音波システムは手作業を減らし、積極的な化学処理の必要性を排除し、サンプルの完全性を保ち、プロトコルの標準化を簡素化する。

超音波FASPによって同定されたタンパク質の数がOver-Night FASPに比べて増加したことを示すベン図。
画像と研究：©Carvalho et al, 2020

プロトコルUIP400MTPによるハイスループット超音波FASP

UIP400MTPマイクロプレートソニケーターは、大量のサンプルを処理する研究室向けに、標準的なマルチウェルプレート（96ウェルプレートなど）の同時超音波処理を可能にし、スループットと再現性を大幅に向上させます。
このフォーマットでは、限外濾過や下流処理に対応したマイクロプレートにサンプル（通常、1ウェルあたり50～200μL）を直接調製する。溶解バッファーは、標準的なFASPプロトコールで使用されるものと同様である。

UIP400MTP は、すべてのウェルに均一な超音波エネルギーを印加します。超音波処理は、サンプルの種類にもよりますが、通常60～80％の振幅で2～4分間行います。プラグ可能な温度センサーを使用して温度をモニターします。パルス超音波処理を使用し、オプションでラボ用チラーを使用することもできます。

典型的なプロトコル：

1. アルキル化ステップでは、マイクロプレートソニケーター（UIP400MTP）を用い、40％の振幅で7サイクル（30秒ON、15秒OFF、合計超音波処理時間：5分45秒）超音波処理する。
2. 超音波処理後、ヨードアセトアミド（IAA）溶液を遠心分離で除去する。トリプシン消化の前に、酵素活性を阻害する強力なカオトロピック剤である残留尿素を除去するため、サンプルを洗浄する必要がある。そのため、サンプルは200μLの25mM重炭酸アンモニウム（AmBic）で2回洗浄する。
3. その後、12.5 mMの炭酸水素アンモニウムで調製したトリプシン溶液（酵素対タンパク質の比は1:30）100 μLを加える。その後、UIP400MTPを用いて、同じ超音波処理条件（振幅40%、7サイクル、30秒ON/15秒OFF、合計時間5分45秒）でタンパク質消化を行う。
4. 超音波処理後、サンプルはフィルタープレートに移されるか、プレートベースのFASPシステムで処理される。還元とアルキル化のステップはプレート内で行われ、合理的なワークフローを維持する。
5. トリプシン消化は、制御された条件下（例えば、37℃、4-16時間）で行われ、酵素活性を促進し、ペプチド収量を向上させるために、短時間の超音波刺激も可能である。
6. ペプチドは遠心分離によって回収され、LC-MS/MS分析の準備が整う。

このシステムの主な利点は、すべてのウェルで同一の処理条件を提供する能力にあり、バッチ効果を最小限に抑え、大規模プロテオミクス研究において強固な定量比較を可能にする。

デザイン、製造、コンサルティング – 品質 ドイツ製

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