Lisi a ultrasuoni per il Western blotting

• Il Western blot è una procedura analitica per il rilevamento di proteine specifiche in un campione di omogenato tissutale o di estratto cellulare.
• Per eseguire un Western blot o misurare l’attività enzimatica, molti saggi richiedono l’accesso ai materiali (ad es. proteine, DNA, frammenti subcellulari) racchiusi nella cellula.
• La sonicazione è un metodo affidabile e facile da utilizzare per la disgregazione cellulare e la lisi controllate.

Disgregazione cellulare a ultrasuoni

L’estrazione delle proteine da tessuti e cellule in coltura è il primo passaggio di molte tecniche biologiche, biochimiche e analitiche (PAGE, Western blotting, ELISA, spettrometria di massa, ecc.) o della purificazione delle proteine. Per ottenere un’elevata resa proteica, il materiale cellulare e i tessuti devono essere disgregati/lisati in modo efficiente. Che si tratti di cellule vegetali o di tessuti animali, la sonicazione è il metodo per preparare il lisato cellulare in modo semplice e rapido.

Vantaggi della sonicazione

• rapida ed efficiente
• facile da utilizzare
• elevata resa proteica
• riproducibile/ripetibile
• controllata con precisione
• scalabile

Protocollo di immunoprecipitazione per il Western immunoblotting

A. Reagenti

Per la preparazione delle soluzioni, utilizzare acqua purificata, come Milli-Q.

• Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) 1X
• Tampone di lisi cellulare 1X: 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM pirofosfato di sodio, 1 mM β-glicerofosfato, 1 mM Na3VO4, 1 μg/ml leupeptina
  Importante: aggiungere 1 mM PMSF immediatamente prima dell’uso.
• 15 μl di proteina A+15 μl di proteina G sono sufficienti per l’IP, ma la quantità può dipendere dall’anticorpo primario e dal volume del campione. È anche possibile utilizzare agarosio con proteine A/G premiscelate (ad es. proteina A per il pull-down delle IgG di coniglio e proteina G per il pull-down delle IgG di topo)
• Tampone per campioni SDS 3X: 187,5 mM Tris-HCl (pH 6,8 a 25°C), 6% w/v SDS, 30% glicerolo, 150 mM DTT, 0,03% w/v blu di bromofenolo

B. Preparazione dei lisati cellulari

• Raccogliere le cellule. Per raccogliere le cellule in condizioni non denaturanti, rimuovere il terreno di coltura e risciacquare le cellule una volta con PBS freddo come il ghiaccio.
• Rimuovere il PBS, aggiungere a ciascuna piastra (10 cm) 0,5 ml di tampone di lisi cellulare 1X freddo come il ghiaccio e incubare le piastre su ghiaccio per 5 minuti.
• Staccare le cellule dalle piastre mediante raschiamento e trasferirle in provette da microcentrifuga. Mantenere su ghiaccio.
• Sonicare due volte per 10 secondi in tampone di immunoprecipitazione freddo come il ghiaccio (tampone IP: 50 mM Tris-HCl [pH 7,4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% NP-40 e la miscela di inibitori delle proteasi). Per la sonicazione, il VialTweeter o un sonicatore a sonda come UP100H o UP200Ht sono i più adatti.
• Centrifugare i lisati a 15.000 g per 10 minuti a 4°C.
• Trasferire il surnatante in una nuova provetta. (Se necessario, il lisato può essere conservato a –80°C.)
• Aggiungere l’anticorpo primario al surnatante. Incubare il surnatante con l’anticorpo primario per 1 h a 4°C sotto lieve agitazione. L’anticorpo primario viene generalmente aggiunto a una concentrazione 10x superiore a quella utilizzata per il Western blotting. (È possibile iniziare con 1μg per 100μL.)
• Incubare quindi ulteriormente il surnatante con una miscela di quantità uguali di proteina A-agarosio (Invitrogen) e proteina G-agarosio per un’altra 1 h.
• Lavare i pellet di agarosio tre volte con tampone IP. Successivamente, estrarre le proteine legate con il tampone di caricamento per SDS-PAGE riscaldando a 95°C per 5 minuti.

C. Immunoprecipitazione

• Prelevare 200 μl di lisato cellulare e aggiungere l’anticorpo primario. Incubare per tutta la notte a 4°C con un delicato movimento oscillatorio.
• Aggiungere sfere di agarosio con proteina A o G (20 μl di sospensione di sfere al 50%). Incubare con un delicato movimento oscillatorio per 1–3 ore a 4°C.
• Microcentrifugare per 30 secondi a 4°C. Lavare il pellet cinque volte con 500 µl di tampone di lisi cellulare 1X. Mantenere su ghiaccio durante i lavaggi.
• Risospendere il pellet con 20 μl di tampone per campioni SDS 3X. Agitare al vortex, quindi microcentrifugare per 30 secondi.
• Riscaldare il campione a 95–100°C per 2–5 minuti e microcentrifugare per 1 minuto a 14.000 X g.
• Caricare il campione (15–30 μl) su gel SDS-PAGE (12–15%).
• Analizzare il campione mediante Western blotting.

Analisi Western blot con il sonicatore UP50H

Il seguente protocollo, che utilizza il sonicatore a sonda UP50H, è stato impiegato nello studio di Kriebisch et al. (2011):
Le proteine totali sono state isolate da cellule MC3T3-E1 trattate con 1,25(OH)₂D₃ (10⁻⁸ M) o con il veicolo. Le cellule sono state lisate con un tampone contenente 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0,1% dodecilsolfato di sodio (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) e 0,5% desossicolato di sodio (Merck). Il lisato cellulare è stato sonicato per 2 × 10 s con ciclo 1 e ampiezza 80 utilizzando il processore a ultrasuoni UP50H (Hielscher, Ultrasound Technology, Teltow, Germania). Successivamente, il materiale è stato centrifugato per 10 min a 14.000 rpm e il surnatante è stato utilizzato per il Western blotting. Venticinque μg di proteine sono stati portati a ebollizione in tampone per campioni e agente riducente (Invitrogen), successivamente separati mediante SDS-PAGE utilizzando gel di poliacrilammide al 4–12% (Invitrogen) e trasferiti su una membrana di nitrocellulosa (GE health care). La membrana è stata bloccata per 1 h con TBS (10 mM Tris-HCl; pH 7,6; 150 mM NaCl) contenente 1% caseina (Sigma-Aldrich) e 1% Tris (1 M). Dopo il blocco, la membrana è stata incubata sotto lieve agitazione per tutta la notte a 4°C con l’anticorpo primario (anticorpo di coniglio anti-CBS umana 1/500, sviluppato nel laboratorio del Prof. R. Banerjee, Ann Arbor, MI, USA). L’incubazione con un anticorpo secondario coniugato alla perossidasi di rafano (HPR) (Dako) è stata eseguita per 1 h a temperatura ambiente. Tutti i blot sono stati sviluppati mediante chemiluminescenza potenziata (Perkin Elmer).
 

Fai clic qui per saperne di più sulle migliori pratiche per la lisi e l’estrazione cellulare a ultrasuoni, sulla preparazione dei lisati e sulle raccomandazioni per migliorare il processo!
 
La tabella seguente fornisce un’indicazione della capacità di trattamento approssimativa dei nostri sonicatori da laboratorio:

Bibliografia / Riferimenti

• Koch RJ, Barrette AM, Stern AD, et al. Validating Antibodies for Quantitative Western Blot Measurements with Microwestern Array. Sci Rep. 2018;8(1):11329. Published 2018 Jul 27. doi:10.1038/s41598-018-29436-0
• Carsten Kriebitzsch, Lieve Verlinden, Guy Eelen, Natasja M. van Schoor, Karin Swart, Paul Lips, Mark B. Meyer, J Wesley Pike, Steven Boonen, Carsten Carlberg, Victor Vitvitsky, Roger Bouillon, Ruma Banerjee, and Annemieke Verstuyf (2011): 1,25-dihydroxyvitamin D3 influences cellular homocysteine levels in murine pre-osteoblastic MC3T3-E1 cells by direct regulation of cystathionine β-synthase. J Bone Miner Res. 26(12), 2011. 2991–3000.
• Tahrin Mahmood, Ping-Chang Yang (2012): Western Blot: Technique, Theory, and Trouble Shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4(9), 2012. 429-434.