Lisi a ultrasuoni per il Western Blotting

• Il western blot è una procedura analitica per la rilevazione di proteine specifiche in un campione di omogenato di tessuto o di estratto cellulare.
• Per eseguire un Western blot o misurare l'attività enzimatica, molti saggi richiedono l'accesso ai materiali (ad es. proteine, DNA, frammenti subcellulari) intrappolati nella cellula.
• La sonicazione è un metodo affidabile e facile da usare per la disgregazione e la lisi controllata delle cellule.

Interruzione cellulare a ultrasuoni

L'estrazione di proteine da tessuti e cellule coltivate è il primo passo per molte tecniche biologiche, biochimiche e analitiche (PAGE, Western blotting, ELISA, spettrometria di massa, ecc.) o per la purificazione delle proteine. Per ottenere un'elevata resa proteica, il materiale cellulare e il tessuto devono essere disgregati/lisati in modo efficiente. Che si tratti di cellule vegetali o di tessuti animali, la sonicazione è il metodo per preparare il lisato cellulare in modo facile e veloce.

Vantaggi della sonicazione

• Veloce & Efficiente
• Funzionamento semplice
• elevata resa proteica
• riproducibile/ ripetibile
• controllato con precisione
• scalabile

Protocollo di immunoprecipitazione per l'immunoblotting occidentale

A. Reagenti

Per la preparazione delle soluzioni, utilizzare acqua purificata, ad esempio Milli-Q.

• 1X tampone fosfato (PBS)
• Tampone di lisi cellulare 1X: 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM pirofosfato di sodio, 1 mM β-glicerofosfato, 1 mM Na3VO4, 1 μg/ml Leupeptina
  Importante: aggiungere 1 mM di PMSF immediatamente prima dell'uso.
• 15 μl di Proteina A+15 μl di Proteina G sono sufficienti per l'IP, ma possono dipendere dall'anticorpo primario e dal volume del campione. È anche possibile utilizzare agarosio premiscelato proteina A/G (ad esempio, proteina A per il pull down di IgG di coniglio e proteina G per il pull down di IgG di topo).
• Tampone campioni 3X SDS: 187,5 mM Tris-HCl (pH 6,8 a 25°C), 6% w/v SDS, 30% glicerolo, 150 mM DTT, 0,03% w/v blu bromofenolo

B. Preparazione dei lisati cellulari

• Raccogliere le cellule. Per raccogliere le cellule in condizioni di non denaturazione, rimuovere il terreno di coltura e sciacquare le cellule una volta con PBS freddo.
• Rimuovere il PBS e aggiungere 0,5 ml di tampone di lisi cellulare 1X freddo a ciascuna piastra (10 cm) e incubare le piastre in ghiaccio per 5 minuti.
• Raschiare le cellule dalle piastre e trasferirle in provette da microcentrifuga. Conservare in ghiaccio.
• Sonicare due volte per 10 secondi in tampone di immunoprecipitazione freddo (tampone IP: 50 mM Tris-HCl [pH 7,4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% NP-40 e miscela di inibitori delle proteasi). Per la sonicazione, il VialTweeter o un ultrasuonatore a sonda come il UP100H o UP200Ht sono i più adatti.
• Centrifugare i lisati a 15.000 g per 10 minuti a 4°C.
• Trasferire il surnatante in una nuova provetta. (Se necessario, il lisato può essere conservato a -80°C).
• Aggiungere l'anticorpo primario al surnatante. Il surnatante con l'anticorpo primario viene incubato per 1 ora a 4°C sotto leggera agitazione. L'anticorpo primario viene solitamente aggiunto in una quantità 10 volte più concentrata di quella utilizzata per il western blotting. (Si può iniziare con 1μg per 100μL).
• Il surnatante viene poi incubato ulteriormente con la miscela di quantità uguali di agarosio Proteina A (Invitrogen) e agarosio Proteina G per un'altra ora.
• Lavare i pellet di agarosio tre volte con il tampone IP. Successivamente, estrarre le proteine legate con il tampone di caricamento SDS-PAGE riscaldando a 95°C per 5 minuti.

C. Immunoprecipitazione

• Prelevare 200 μl di lisato cellulare e aggiungere l'anticorpo primario. Incubare con un leggero dondolio per tutta la notte a 4°C.
• Aggiungere le microsfere di agarosio proteina A o G (20 μl di slurry di microsfere al 50%). Incubare con un leggero agitarsi per 1-3 ore a 4°C.
• Microcentrifugare per 30 secondi a 4°C. Lavare il pellet cinque volte con 500 µl di tampone di lisi cellulare 1X. Tenere in ghiaccio durante i lavaggi.
• Risospendere il pellet con 20 μl di tampone per campioni SDS 3X. Vortexare, quindi microcentrifugare per 30 secondi.
• Riscaldare il campione a 95-100°C per 2-5 minuti e microcentrifugare per 1 minuto a 14.000 X g.
• Caricare il campione (15-30 μl) su gel SDS-PAGE (12-15%).
• Analizzare il campione mediante Western blotting.

Analisi Western Blot con il Sonicator UP50H

Il protocollo seguente, che utilizza il sonicatore a sonda UP50H, è stato utilizzato nello studio di Kriebisch et al. (2011):
Le proteine totali sono state isolate da cellule MC3T3-E1 trattate con 1,25(OH)₂d₃ (10^-8 M) o veicolo. Le cellule sono state lisate con un tampone contenente 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0,1% sodio dodecil solfato (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) e 0,5% sodio desossicolato (Merck). Il lisato cellulare è stato sonicato per 2 × 10 s a ciclo 1 e ampiezza 80 con l'apparecchio di controllo della temperatura. Processore a ultrasuoni UP50H (Hielscher, Ultrasound Technology, Teltow, Germania). Successivamente il materiale è stato centrifugato per 10 minuti a 14.000 giri/minuto e il surnatante è stato utilizzato per il Western blotting. Venticinque μg di proteine sono stati bolliti in tampone campioni e agente riducente (Invitrogen) e successivamente separati mediante SDS-PAGE utilizzando gel di poliacrilammide al 4-12% (Invitrogen) e trasferiti su una membrana di nitrocellulosa (GE health care). La membrana è stata bloccata per 1 ora con TBS (10 mM Tris-HCl; pH 7,6; 150 mM NaCl) contenente 1% di caseina (Sigma-Aldrich) e 1% di Tris (1 M). Dopo il blocco, la membrana è stata incubata con leggera agitazione per una notte a 4°C con l'anticorpo primario (coniglio anti-human CBS 1/500, sviluppato nel laboratorio del Prof. R. Banerjee, Ann Arbor, MI, USA). L'incubazione con un anticorpo secondario coniugato con perossidasi di rafano (HPR) (Dako) è stata eseguita per 1 ora a temperatura ambiente. Tutti i blot sono stati sviluppati con chemiluminescenza potenziata (Perkin Elmer).
 

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La tabella seguente fornisce un'indicazione della capacità di trattamento approssimativa dei nostri ultrasuoni da laboratorio:

Letteratura / Riferimenti