Lisi ad ultrasuoni per Western Blotting

• Il western blot è una procedura analitica per l'individuazione di proteine specifiche in un campione di tessuto omogeneo o di estratto cellulare.
• Per eseguire un Western blot o per misurare l'attività enzimatica, molti test richiedono l'accesso ai materiali (ad esempio proteine, DNA, frammenti subcellulari) intrappolati nella cellula.
• L'sonicazione è un metodo affidabile e facile da usare per la distruzione e la lisi cellulare controllata.

Interruzione delle celle a ultrasuoni

L'estrazione di proteine da tessuti e cellule coltivate è il primo passo per molte tecniche biologiche, biochimiche e analitiche (PAGE, Western blotting, ELISA, spettrometria di massa, etc.) o di purificazione delle proteine. Per ottenere un'elevata resa proteica, il materiale cellulare e il tessuto devono essere efficacemente perturbati/ lisati. Che si tratti di cellule vegetali o tessuto animale, la sonicazione è il metodo per preparare il vostro lisato cellulare in modo facile e veloce.

Vantaggi della sonicazione

• Veloce & efficiente
• facilità d'uso
• alto rendimento proteico
• riproducibile/ripetibile
• controllato con precisione
• modulabile

Protocollo di immunoprecipitazione per l'Immunoblotting occidentale

A. Reagenti

Per la preparazione delle soluzioni, utilizzare acqua purificata come Milli-Q.

• 1X soluzione salina tamponata ai fosfati (PBS)
• 1X Cell Lysis Buffer: 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM Pirofosfato di sodio, 1 mM β-glicerofosfato, 1 mM Na3VO4, 1 μg/ml Leupeptina
  Importante: Aggiungere 1 mM PMSF immediatamente prima dell'uso.
• 15 μl di Proteina A+15 μl di Proteina G è sufficiente per l'IP, ma può dipendere dall'anticorpo primario e dal volume del campione. È inoltre possibile utilizzare proteine A/G agarosio premiscelate (ad esempio, la proteina A per il coniglio IgG pull down e la proteina G per il mouse IgG pull down).
• 3X SDS Sample Buffer: 187,5 mM Tris-HCl (pH 6,8 a 25°C), 6% p/v SDS, 30% glicerolo, 150 mM DTT, 0,03% p/v blu bromophenol.

B. Preparazione dei lisati cellulari

• Raccogli le cellule. Per raccogliere le cellule in condizioni di non denaturazione, rimuovere i supporti e risciacquare le cellule una volta con PBS ghiacciato.
• Rimuovere PBS e aggiungere 0,5 ml di tampone di lisi cellulare 1X gelato a ciascuna piastra (10 cm) e incubare le piastre su ghiaccio per 5 minuti.
• Raschiare le cellule dalle piastre e trasferirle in tubi per microcentrifuga. Tieniti sul ghiaccio.
• Sonicare due volte per 10 secondi in tampone ghiacciato di immunoprecipitazione (tampone IP: 50 mM Tris-HCl [pH 7.4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1% NP-40 e la miscela di inibitori della proteasi). Per la sonicazione, la VialTweeter o un ultrasonorizzatore a sonda come il UP100H o UP200Ht sono le più adatte.
• Centrifugare il lisato a 15.000 g per 10 minuti a 4°C.
• Trasferire il surnatante in una nuova provetta. (Se necessario, il lisato può essere conservato a -80°C.)
• Aggiungere l'anticorpo primario al surnatante. Il supernatante con l'anticorpo primario viene incubato per 1 ora a 4°C in leggera agitazione. L'anticorpo primario viene tipicamente aggiunto in una quantità 10 volte più concentrata rispetto a quella utilizzata per il western blotting. (Si può iniziare con 1μg per 100μL.)
• Il surnatante viene quindi ulteriormente incubato con la miscela di uguali quantità di Proteine A-agarosio (Invitrogeno) e Proteine G agarosio per un altro 1 ora.
• Lavare i pellet di agarosio tre volte con tampone IP. Successivamente, estrarre le proteine legate con il tampone di caricamento SDS-PAGE riscaldando a 95°C per 5 minuti.

C. Immunoprecipitazione

• Prendere 200 μl di lisato cellulare e aggiungere l'anticorpo primario. Incubare con un leggero dondolio per una notte a 4°C.
• Aggiungere le perle di proteina A o G agarosio (20 μl di slurry perle al 50%). Incubare con un leggero dondolio per 1-3 ore a 4°C.
• Microcentrifuga per 30 secondi a 4°C. Lavare il pellet cinque volte con 500 µl di tampone di lisi cellulare 1X. Tenere il ghiaccio durante i lavaggi.
• Risospendere il pellet con 20 μl di tampone campione 3X SDS. Vortex, poi microcentrifuga per 30 secondi.
• Riscaldare il campione a 95-100°C per 2-5 minuti e microcentrifugare per 1 minuto a 14.000 X g.
• Caricare il campione (15-30 μl) su gel SDS-PAGE (12-15%).
• Analizzare il campione tramite Western blotting.

Analisi Western Blot con ultrasuoni UP50H

Il seguente protocollo è stato utilizzato nello studio di Kriebisch et al. (2011):
La proteina totale è stata isolata da cellule MC3T3-E1 trattate con 1,25(OH)₂D₃ (10⁻⁸ M) o del veicolo. Le cellule sono state lisate con un tampone contenente 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0,1% sodio dodecil solfato (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) e 0,5% sodio deossicolato (Merck). Il lisato cellulare è stato sonicato per 2 × 10 s al ciclo 1 e ampiezza 80 con il Processore ad ultrasuoni UP50H (Hielscher, Tecnologia ad ultrasuoni, Teltow, Germania). Successivamente il materiale è stato centrifugato per 10 minuti a 14.000 giri/minuto e il surnatante è stato utilizzato per l'imbrattamento occidentale. Venticinque μg di proteine sono stati bolliti in tampone campione e agente riducente (Invitrogen) e successivamente separati da SDS-PAGE utilizzando gel di poliacrilammide al 4-12% (Invitrogen) e trasferiti su una membrana di nitrocellulosa (GE health care). La membrana è stata bloccata per 1 ora con TBS (10 mM Tris-HCl; pH 7.6; 150 mM NaCl) contenente 1% caseina (Sigma-Aldrich) e 1% Tris (1 M). Dopo il blocco, la membrana è stata incubata con leggera agitazione notturna a 4°C con l'anticorpo primario (coniglio antiumano CBS 1/500, sviluppato nel laboratorio del Prof. R. Banerjee, Ann Arbor, MI, USA). L'incubazione con un anticorpo secondario coniugato con perossidasi di rafano perossidasi (HPR) (Dako) è stata eseguita per 1 ora a temperatura ambiente. Tutti i blot sono stati sviluppati da una maggiore chemiluminescenza (Perkin Elmer).

Letteratura / Referenze