Preparazione a ultrasuoni di campioni di C. elegans

C. elegans, un verme nematode, è un organismo modello ampiamente utilizzato in biologia. La preparazione dei campioni prima dell'analisi richiede la lisi, l'estrazione di proteine e lipidi e la frammentazione dell'RNA, che possono essere eseguite in modo affidabile mediante sonicazione. I disgregatori cellulari a ultrasuoni sono dispositivi affidabili, sofisticati e facili da usare per la preparazione rapida di campioni di C. elegans.

Preparazione a ultrasuoni di campioni di C. elegans

I C. elegans sono vermi rotondi, ampiamente utilizzati nei laboratori di ricerca per studiare la genomica, la biologia dello sviluppo e le malattie. Molti geni presenti nel genoma del C. elegans hanno controparti funzionali nell'uomo. Pertanto, il verme nematode è un modello estremamente utile per le malattie umane. Altri vantaggi per l'ampio uso di C. elegans sono la facilità e l'economicità della sua coltivazione su piastre contenenti batteri (ad esempio, E. coli), la sua trasparenza, la comodità di manipolazione e la possibilità di congelare e conservare i vermi per un periodo più lungo.
L'analisi delle proteine e dei lipidi è una procedura abituale nei laboratori e la preparazione del campione a ultrasuoni è il metodo consolidato per lisare i nematodi C. elegans in ogni stadio di sviluppo (embrioni, larve L1-L4, adulti). Poiché il C. elegans viene utilizzato anche come sistema di espressione proteica per sovraesprimere proteine mirate, è necessario un metodo di lisi e di estrazione delle proteine affidabile e riproducibile, che fornisca rese proteiche elevate. I sistemi di disgregazione ed estrazione cellulare a ultrasuoni sono disponibili come omogeneizzatori a sonda e come ultrasuonatori multi-campione. Hielscher Ultrasonics ha il disgregatore cellulare a ultrasuoni ideale per le vostre procedure di laboratorio.

Protocolli a ultrasuoni per la disgregazione e la lisi di C. Elegans

L'omogeneizzazione e la lisi a ultrasuoni di C. elegans e la successiva estrazione di proteine e lipidi possono essere eseguite con procedure diverse, utilizzando diversi tamponi di omogeneizzazione e lisi, ecc. Tutti i protocolli di lisi hanno in comune il fatto che i campioni devono essere tenuti costantemente in ghiaccio per evitare la degradazione delle proteine. Di seguito presentiamo alcuni protocolli di lisi ed estrazione a ultrasuoni rapidi e affidabili per la preparazione di campioni di C. elegans contenenti proteine o lipidi di alta qualità.

Vantaggi della lisi ultrasonica di C. elegans

• affidabile
• Riproducibile
• temperatura controllata con precisione
• controllo di processo affidabile
• metodo delicato
• Facile da applicare
• Sicuro

Estrazione di proteine a ultrasuoni da campioni di C. elegans

La lisi a ultrasuoni e l'estrazione di proteine di vermi C. elegans possono essere eseguite utilizzando diversi protocolli. Di seguito presentiamo alcuni protocolli di lisi rapidi e affidabili per ottenere risultati riproducibili nell'estrazione delle proteine.

Preparazione rapida dell'estratto citosolico di vermi C. elegans mediante sonicazione

Con il seguente protocollo è possibile preparare lisati di C. elegans in meno di 30 minuti.
Collezione di C. elegans
Prelevare i vermi C. elegans desiderati in una provetta da 1,5 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) o lavarli da una piastra con 1,5 ml di PBS. Centrifugare per 1 minuto a 2000 giri al minuto per ottenere il pellet. Conservare sempre i campioni in ghiaccio.
Quindi, lavare i vermi due volte con PBS.
Successivamente, lavare i vermi due volte con ddH₂O.
Risospendere i vermi in almeno 500ul di tampone di omogeneizzazione (HB). I campioni di vermi sono ora pronti per la lisi a ultrasuoni.
Per ottenere un estratto proteico di qualità superiore, è possibile ridurre la contaminazione batterica lavando i vermi per 5 minuti ciascuno in PBS e acqua sterile ultrapura (ddH₂O) o eseguire la flottazione con saccarosio. Conservare continuamente i campioni di vermi in ghiaccio.

Protocollo di lisi di C. elegans a ultrasuoni

• Assicurarsi di preparare in anticipo l'omogeneizzatore a ultrasuoni in modo che sia pronto per l'uso (sonda montata, programma di sonicazione preimpostato).

Se l'ultrasonorizzatore è montato su un supporto, posizionare la vasca di ghiaccio con le provette di campione sotto la sonda a ultrasuoni e inserire la sonda a ultrasuoni nella provetta da 1,5 ml.

• Per la lisi di C. elegans con UP200St o UP200Ht, gli ultrasuoni devono essere eseguiti utilizzando un micropuntale (ad esempio, la sonda S26d2 da 2 mm; vedere l'immagine a sinistra) al 40% di ampiezza per 1 secondo con pause di 30 secondi. 5 cicli di sonicazione per ogni 1 secondo con pause di 30 secondi sono ideali per la lisi di C. elegans. Se si esegue la lisi per la prima volta, è possibile controllare la progressione della lisi in piccole aliquote del campione dopo ogni impulso utilizzando un microscopio.
• La lisi è completata con successo quando i vermi sono disgregati. La sovrasonorizzazione provoca la rottura dei nuclei e diventa visibile quando il campione diventa viscoso o schiumoso. Per evitare la degradazione del campione, utilizzare più impulsi se necessario. Non aumentare il tempo di ciascun ciclo di impulsi ultrasonici per ottenere estratti di proteine di alta qualità.
• Eliminare il lisato cellulare centrifugando i vermi lisati a ultrasuoni a 14.000 giri/min per 10 minuti a 4ºC.
• Quindi, trasferire il surnatante in una nuova provetta e prepararlo per l'immunoprecipitazione o altri saggi.

Nota per il tampone di omogeneizzazione: Preparare il tampone di omogeneizzazione per il protocollo di lisi a ultrasuoni come segue:

Lisi ad alta velocità di C. elegans in piastre da 96 pozzetti con il sonicatore per piastre UIP400MTP

C. elegans Lisi (nematodi adulti)
UIP400MTP 80% di ampiezza, 20 cicli (ogni ciclo di sonicazione: 30 sec ON, 30 sec OFF)
Tampone di lisi:

• Opzione 1) 4% SDS, 0,1 M Tris/HCl pH 8,0, 1 mM EDTA
• Opzione 2) per la co-immunoprecipitazione (co-IP): 10 mM Tris HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,5% NP-40 (cocktail completo di inibitori di proteinasi).

Frammentazione del DNA ad alta velocità
DNA di C. elegans (nematodi adulti) 200-300bp: Sonicatore per piastre UIP400MTP – impostare l'80% di ampiezza, 30 impulsi – ogni 30sec acceso, 30sec spento

Il sonicatore per piastre UIP400MTP per la preparazione di campioni ad alta produttività sonicchia uniformemente i campioni in piastre multipozzetto, piastre per microtitolazione e piastre a 96 pozzetti.

Lisi ultrasonica di C. elegans per saggi di purificazione di affinità quantitativa

Gli embrioni di C. elegans (∼2 milioni per replica) sono stati raccolti in triplicato biologico mediante sbiancamento di giovani ermafroditi gravidi e sonicati in ghiaccio (ciclo: 0,5 s, ampiezza: 40-45%, 5 colpi/sessione, 5 sessioni, intervallo tra le sessioni: 30 s; Processore a ultrasuoni UP200S con micropunta S26d2 (Hielscher Ultrasonics GmbH)) in tampone di lisi (volume totale: ∼600 μl; 50 mm Tris-HCl, pH 7,4, 100 mm KCl, 1 mm MgCl2, 1 mm EGTA, 1 mm DTT, 10% glicerolo, miscela di inibitori delle proteasi, 0,1% Nonidet P-40 Sostituto). Dopo la sonicazione, è stato aggiunto Nonidet P-40 Sostituto fino all'1% e i lisati sono stati incubati con rotazione testa-coda a 4°C per 30 minuti, seguiti da centrifugazione a 20.000 × g per 20 minuti a 4°C. Il lisato è stato quindi aspirato senza disturbare lo strato lipidico superiore e suddiviso a metà nelle microsfere di agarosio anti-GFP o nelle microsfere di controllo bloccate (40-50 μl). Dopo una rotazione testa-coda a 4°C per 60-90 minuti, le microsfere sono state lavate una volta con tampone di lisi contenente 0,1% Nonidet P-40 Sostituto, seguito da due lavaggi in tampone I (25 mm Tris-HCl, pH 7,4, 300 mm NaCl, 1 mm MgCl2) o tampone II (1 mm Tris-HCl, pH 7,4, 150 mm NaCl, 1 mm MgCl2) o entrambi. Per il pull-down di GFP:MBK-2, sono stati eseguiti due esperimenti separati utilizzando diverse condizioni di lavaggio. Le proteine sono state eluite mediante agitazione orbitale in 50 μl di 6 m urea/2 M tiourea a temperatura ambiente. Per gli esperimenti di pull-down di MBK-1::GFP, le proteine sono state eluite due volte mediante agitazione in 50 μl di 8 m di cloruro di guanidinio a 90°C, seguita da precipitazione in etanolo. I campioni di proteine eluite sono stati poi digeriti in soluzione.
(cfr. Chen et al., 2016)

Omogeneizzazione e lisi dei vermi a ultrasuoni

Per la procedura di lisi e di estrazione delle proteine di C.elegans, sono stati raccolti 30.000 nemotodi del relativo stadio per ogni campione e sono stati lavati in S-basal ghiacciato, concentrati mediante centrifugazione a 1500 rpm per 2 minuti, lavati sei volte con S-basal ghiacciato per rimuovere i batteri residui e quindi conservati in ghiaccio fino al momento dell'uso. Per l'estrazione delle proteine, i vermi gravidi-adulti sono stati lasciati formare un pellet compatto dopo l'ultimo lavaggio con S-basal. I pellet di vermi sono stati quindi risospesi in 1 ml di tampone di estrazione freddo [20 mM potassio fosfato, pH 7,4, 2mM EDTA, 1% Triton-X-100, inibitori delle proteasi (Sigma P2714)] e trattati immediatamente.
∼30.000 vermi gravidi-adulti (corrispondenti a ∼100 mg di peso umido) sono stati sonicati in ghiaccio con un ultrasuonatore a sonda (ad es. UP50H con microtip MS2) al 40% di ampiezza per 10 cicli di 3 sec on, 30 sec off, in 1 ml di tampone di estrazione freddo. (cfr. Baskharan et al. 2012)

Estrazione ultrasonica di lipidi da C. elegans

Nella lipidomica, una branca della metabolomica, viene caratterizzato e analizzato il complemento lipidico dei sistemi biologici. I C. elegans sono ampiamente utilizzati nella lipidomica per studiare l'interazione dei lipidi metabolici e i loro effetti sulla salute e sulla durata della vita.
La lisi e l'estrazione a ultrasuoni sono utilizzate per rilasciare lipidi come gli sfingolipidi da embrioni, larve e vermi adulti di C. elegans. Gli ultrasuoni vengono utilizzati per preparare omogenati di vermi e successivamente per estrarre i lipidi dal campione.
Protocollo per l'estrazione ultrasonica dei lipidi da C. elegans
Scongelare il pellet di C. elegans con ghiaccio e risospenderlo con 0,5 ml di acqua di vegetazione. Sonicare i campioni di C. elegans in provette da 1,5 ml, mantenendo i campioni costantemente in ghiaccio.
La sonicazione può essere eseguita con una sonda-ultrasuoni, come il modello UP200Ht, l'unità di preparazione del campione a ultrasuoni VialTweeter (sonicazione simultanea di 10 campioni) o la UIP400MTP (per la sonicazione di piastre a più pozzetti come quelle a 96 pozzetti).Per la lisi a ultrasuoni con UP200Ht utilizzare il micropuntale S26d2. Preimpostare la modalità del ciclo ultrasonico nel menu digitale. Impostare l'ampiezza al 10% e la modalità di ciclo di sonicazione di impulsi di 2 secondi per 20 cicli con una pausa di 30 secondi tra ogni pulsazione ultrasonica.
Trasferire i surnatanti in provette di vetro con tappo a vite. Eseguire l'estrazione di Folch aggiungendo 1 ml di acqua ultraleggera a ciascuna provetta di vetro, seguita dall'aggiunta di 6 ml di miscela cloroformio/metanolo (rapporto = 2:1) a ciascuna provetta di vetro.
Vortexare ogni provetta di vetro per 30 secondi per 4 volte. Centrifugare le provette a 1.258 x g per 15 minuti (Eppendorf, 5810 R) per migliorare ulteriormente la separazione delle fasi. Trasferire la frazione idrofobica inferiore in una provetta di vetro pulita con una pipetta Pasteur di vetro. Essiccare la frazione idrofobica inferiore sotto flusso di azoto in un evaporatore di azoto. Conservare il pellet essiccato in un congelatore a -80 °C fino al momento dell'uso.

Preparazione a ultrasuoni dei lisati di verme

Lisato di verme: I vermi allo stadio L4 sono stati raccolti e lavati tre volte con tampone M9 (42,26 mM Na₂HPO₄, 22,04 mM KH₂OP₄, 85,56 mM NaCl e 0,87 mM MgSO₄) per rimuovere tutti i batteri. Dopo aver rimosso il più possibile il tampone M9, i vermi sono stati risospesi nel tampone di lisi: 50 mM HEPES, 50 mM KCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 5 mM fosfato β-glicerolo, 0,1% (v/v) Triton X-100, 50 mM fluoruro di sodio, 1 mM ortovanadato di sodio, 5 mM pirofosfato di sodio, 0,2 mM fenilmetanesulfonilfluoruro e inibitore della proteasi. I vermi sono stati congelati in azoto liquido e scongelati a 37°C per tre volte, quindi sono stati sonicati su ghiaccio secco con un'unità VialTweeter a ultrasuoni per la preparazione simultanea di 10 provette di campione. La sonicazione è stata effettuata al 50% di ampiezza in 10 cicli di 2 secondi con una pausa di 30 secondi tra le raffiche di sonicazione. Successivamente, i campioni sono stati centrifugati a 12000 rpm a 4°C per 15 minuti. Il surnatante è stato raccolto e conservato a -70°C. Un'aliquota è stata utilizzata per la quantificazione delle proteine mediante il saggio di Bradford.
Determinazione del glutatione totale, GSH e GSSG: per la quantificazione del glutatione, i lisati e la determinazione sono stati effettuati lo stesso giorno. Le larve L4 nutrite con glucosio e quelle di controllo sono state raccolte e lavate con tampone M9 per tre volte. Dopo aver rimosso il più possibile il tampone M9, i vermi sono stati risospesi in acido metafosforico freddo (5% p/v), quindi sono stati sonicati in ghiaccio con un VialTweeter a ultrasuoni al 50% di ampiezza in dieci cicli di sonicazione di 2 sec. con 30 sec. di pausa tra ciascun ciclo. Successivamente, sono stati centrifugati a 12000 rpm a 4 ̊C per 15 min.
(cfr. Alcántar-Fernández et al., 2018)

Preparazione del campione di C. elegans prima dell'immunoprecipitazione e del Western Blotting

In breve, per gli estratti embrionali, le larve L1 di C. elegans sono state coltivate in colture liquide S-medium su larga scala fino all'età adulta. Gli embrioni sono stati raccolti con il metodo standard della candeggina e sospesi in tampone di lisi (50 mM Tris, pH 7,5, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl2, 8,7% glicerolo, 0,05% NP-40, 1􏰅 Cocktail di inibitori delle proteasi e 1􏰅 Cocktail di inibitori delle fosfatasi I e II), congelati rapidamente in azoto liquido e lisati mediante disgregazione cellulare a ultrasuoni utilizzando un ultrasuonatore con micropunta come il UP200Ht con S26d2 per 10 impulsi su 10 s al 30% di ampiezza. Se è necessario preparare un numero maggiore di campioni, l'ultrasuono VialTweeter o il MultiSample-Ultrasonicator UIP400MTP per le piastre a pozzetto. Dopo la sonicazione, gli estratti sono stati pre-liquidati mediante centrifugazione a 30.000g per 20 minuti a 4°C. L'estratto pre-liberato (300 µg di proteine totali) è stato incubato con 40µ􏰂g di anticorpo anti-CDC-25.1 purificato per affinità (questo studio) reticolato alla proteina A-agarosio, o come controllo, è stata usata una quantità simile di immunoglobulina (Ig)G di coniglio reticolata alla proteina A-agarosio in un volume totale di 200 µl di tampone di lisi contenente l'1% di NP-40, la cui inclusione ha ridotto il legame non specifico delle proteine alla matrice. I campioni sono stati ruotati per 1 ora a 4°C, le microsfere sono state lavate tre volte con il tampone di lisi ed eluite con 30µl di glicina/HCl e 200 mM NaCl, pH 2,2. Dopo l'immunoprecipitazione, gli eluati sono stati diluiti in 30µ􏰂l di tampone campioni SDS, riscaldati a 95°C per 4 minuti e, in genere, il 3% del totale per l'input e il 30% per gli eluati sono stati sottoposti a SDS-PAGE seguita da Western blotting con anticorpi anti-CDC-25.1 (1:400), anti-LIN-23 (1:750), anti-ubiquitina (1:1000), anti-GSK3􏰁 (1:500) o anti-􏰁β-actina (1:2000). Nei casi in cui gli estratti non sono stati sottoposti a immunoprecipitazione, la stessa quantità di proteine totali derivate da tali estratti è stata risospesa in tampone campioni SDS, riscaldata a 95°C, quindi applicata direttamente a SDS-PAGE e analizzata mediante Western blotting. (cfr. Segref et al. 2020)

Lisi a ultrasuoni con controllo della temperatura di prescizione

Il controllo preciso e affidabile della temperatura è fondamentale quando si maneggiano campioni biologici. Le alte temperature innescano la degradazione termica delle proteine nei campioni.
Come tutte le tecniche di preparazione meccanica dei campioni, la sonicazione genera calore. Tuttavia, la temperatura dei campioni può essere ben controllata quando si utilizza il VialTweeter. Vi presentiamo diverse opzioni per monitorare e controllare la temperatura dei vostri campioni mentre li preparate per l'analisi con VialTweeter e VialPress.

1. Monitoraggio della temperatura del campione: Il processore a ultrasuoni UP200St, che pilota il VialTweeter, è dotato di un software intelligente e di un sensore di temperatura collegabile. Collegare il sensore di temperatura all'UP200St e inserire la punta del sensore di temperatura in una delle provette del campione. Tramite il display digitale a sfioramento colorato, è possibile impostare nel menu dell'UP200St un intervallo di temperatura specifico per la sonicazione dei campioni. L'ultrasuonatore si arresta automaticamente quando viene raggiunta la temperatura massima e si ferma finché la temperatura del campione non scende al valore inferiore del ∆ di temperatura impostato. A quel punto la sonicazione riprende automaticamente. Questa funzione intelligente previene la degradazione indotta dal calore.
2. Il blocco VialTweeter può essere pre-raffreddato. Mettere il blocco VialTweeter (solo il sonotrodo senza trasduttore!) nel frigorifero o nel congelatore per pre-raffreddare il blocco di titanio aiuta a posticipare l'aumento di temperatura nel campione. Se possibile, anche il campione stesso può essere pre-raffreddato.
3. Utilizzare ghiaccio secco per raffreddare durante la sonicazione. Utilizzare un vassoio poco profondo riempito di ghiaccio secco e posizionare il VialTweeter sul ghiaccio secco in modo da dissipare rapidamente il calore.

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Tutti gli omogeneizzatori digitali a ultrasuoni sono dotati di un software intelligente, di un display touch a colori e di un protocollatore automatico di dati, che rendono il dispositivo a ultrasuoni un comodo strumento di lavoro in laboratorio e negli impianti di produzione.
Fateci sapere che tipo di cellule, che volume, con quale frequenza e con quale obiettivo dovete trattare i vostri campioni biologici. Vi consiglieremo il distruttore cellulare a ultrasuoni più adatto alle vostre esigenze di processo.

La tabella seguente fornisce un'indicazione della capacità di trattamento approssimativa dei nostri sistemi a ultrasuoni, dagli omogeneizzatori compatti portatili e dagli ultrasonici multi-campione ai processori industriali a ultrasuoni per applicazioni commerciali: