Preparazione a ultrasuoni di campioni di C. elegans

C. elegans, un verme nematode, è un organismo modello ampiamente utilizzato in biologia. La preparazione dei campioni prima dell’analisi richiede la lisi, l’estrazione di proteine e lipidi e la frammentazione dell’RNA, operazioni che possono essere eseguite in modo affidabile mediante sonicazione. I disgregatori cellulari a ultrasuoni sono dispositivi affidabili, sofisticati e facili da usare per la preparazione rapida di campioni di C. elegans.

Preparazione a ultrasuoni di campioni di C. elegans

Caenorhabditis elegans sono vermi cilindrici ampiamente utilizzati nei laboratori di ricerca per studiare la genomica, la biologia dello sviluppo e le malattie. Molti geni del genoma di C. elegans hanno controparti funzionali nell’uomo. Il verme nematode è quindi un modello estremamente utile per le malattie umane. Altri vantaggi che favoriscono l’ampio utilizzo di C. elegans sono la coltivazione semplice ed economica su piastre contenenti batteri (ad es., E. coli), la trasparenza, la facilità di manipolazione e la possibilità di congelare e conservare i vermi per un periodo prolungato.
L’analisi delle proteine e dei lipidi è una procedura abituale nei laboratori e la preparazione dei campioni a ultrasuoni è il metodo consolidato per lisare i nematodi C. elegans in ogni stadio di sviluppo (ossia embrioni, larve L1–L4, adulti). Poiché C. elegans viene utilizzato anche come sistema di espressione proteica per sovraesprimere proteine bersaglio, è necessario un metodo di lisi ed estrazione proteica affidabile e riproducibile, che garantisca rese proteiche elevate. I sistemi di disgregazione cellulare ed estrazione a ultrasuoni sono disponibili come omogeneizzatori a sonda e come sonicatori multicampione. Per una preparazione pratica dei campioni, qualunque siano il loro volume e il loro numero, Hielscher Ultrasonics dispone del disgregatore cellulare a ultrasuoni ideale per la vostra procedura di laboratorio.

Protocolli a ultrasuoni per la disgregazione e la lisi di C. elegans

L’omogeneizzazione e la lisi a ultrasuoni di C. elegans e la successiva estrazione di proteine e lipidi possono essere eseguite con diverse procedure, utilizzando differenti tamponi di omogeneizzazione e lisi, ecc. Tutti i protocolli di lisi richiedono che i campioni siano mantenuti costantemente su ghiaccio per prevenire la degradazione delle proteine. Di seguito presentiamo alcuni protocolli affidabili e rapidi di lisi ed estrazione a ultrasuoni per la preparazione di campioni di C. elegans di alta qualità contenenti proteine o lipidi.

Vantaggi della lisi a ultrasuoni di C. elegans

• affidabile
• riproducibile
• temperatura controllata con precisione
• controllo affidabile del processo
• metodo delicato
• facile da applicare
• sicura

Estrazione a ultrasuoni delle proteine da campioni di C. elegans

La lisi a ultrasuoni e l’estrazione delle proteine dai vermi C. elegans possono essere eseguite mediante vari protocolli. Di seguito presentiamo alcuni protocolli di lisi affidabili e rapidi per ottenere risultati riproducibili nell’estrazione delle proteine.

Preparazione rapida di estratto citosolico da vermi C. elegans mediante sonicazione

Con il seguente protocollo è possibile preparare lisati di C. elegans in meno di 30 minuti.
Raccolta di C. elegans
Trasferire i vermi C. elegans desiderati in una provetta da 1,5ml contenente soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), oppure recuperarli da una piastra mediante lavaggio con 1,5ml di PBS. Centrifugare per 1min a 2000rpm per ottenere un pellet. Mantenere sempre i campioni su ghiaccio.
Quindi lavare i vermi due volte con PBS.
Successivamente lavare i vermi due volte con ddH₂O.
Risospendere i vermi in almeno 500ul di tampone di omogeneizzazione (HB). I campioni di vermi sono ora pronti per la lisi a ultrasuoni.
Per ottenere estratti proteici di qualità superiore, è possibile ridurre la contaminazione batterica lavando i vermi per 5min rispettivamente in PBS e in acqua ultrapura sterile (ddH₂O), oppure eseguire una flottazione in saccarosio. Mantenere costantemente i campioni di vermi su ghiaccio.

Protocollo di lisi a ultrasuoni di C. elegans

• Assicurarsi di preparare il sonicatore in anticipo, in modo che l’omogeneizzatore a ultrasuoni sia pronto all’uso (sonda montata, programma di sonicazione preimpostato). 

Se il sonicatore è montato su stativo, collocare il bagno di ghiaccio con le provette dei campioni sotto la sonda a ultrasuoni e inserire la sonda a ultrasuoni nella provetta da 1,5ml.

• Per la lisi di C. elegans con UP200St o UP200Ht, la sonicazione deve essere eseguita utilizzando una micropunta (ad es., sonda S26d2 da 2mm; vedere l’immagine a sinistra) al 40% di ampiezza per 1sec, con pause di 30sec tra gli impulsi. 5 cicli di sonicazione di 1 secondo ciascuno, con pause di 30sec, sono ideali per la lisi di C. elegans. Se si esegue la lisi per la prima volta, è possibile verificarne l’avanzamento su piccole aliquote del campione dopo ogni impulso, utilizzando un microscopio.
• La lisi è completata con successo quando i vermi sono disgregati. Una sonicazione eccessiva provoca la rottura dei nuclei, che diventa evidente quando il campione diventa viscoso o forma schiuma. Per prevenire la degradazione del campione, utilizzare più impulsi se necessario. Per ottenere estratti proteici di alta qualità, non aumentare la durata di ciascun ciclo di impulsi ultrasonici.
• Chiarificare il lisato cellulare centrifugando i vermi lisati a ultrasuoni a 14.000rpm per 10min a 4ºC.
• Quindi trasferire il surnatante in una nuova provetta e prepararlo per l’immunoprecipitazione o altri saggi.

Nota sul tampone di omogeneizzazione: preparare il tampone di omogeneizzazione per il protocollo di lisi a ultrasuoni sopra riportato come segue:

Lisi di C. elegans con elevata capacità di trattamento dei campioni in piastre a 96 pozzetti mediante il sonicatore per piastre UIP400MTP

Lisi di C. elegans (nematodi adulti)
UIP400MTP all’80% di ampiezza, 20 cicli (ogni ciclo di sonicazione: 30 sec attivo, 30 sec inattivo)
Tampone di lisi:

• Opzione 1) 4% SDS, 0,1 M Tris/HCl pH 8,0, 1 mM EDTA
• Opzione 2) per la coimmunoprecipitazione (co-IP): 10 mM Tris HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,5 % NP-40 (cocktail Complete di inibitori delle proteinasi)

Frammentazione del DNA con elevata capacità di trattamento dei campioni
DNA di C. elegans (nematodi adulti) 200–300bp: sonicatore per piastre UIP400MTP – impostare l’ampiezza all’80%, 30 impulsi – ciascuno con 30sec di attività e 30sec di pausa

Il sonicatore per piastre UIP400MTP per la preparazione dei campioni con elevata capacità di trattamento sonica uniformemente i campioni in piastre multipozzetto, piastre per microtitolazione e piastre a 96 pozzetti

Lisi a ultrasuoni di C. elegans per saggi quantitativi di purificazione per affinità

Gli embrioni di C. elegans (∼2 milioni per replica) sono stati raccolti freschi in triplicato biologico mediante trattamento con ipoclorito di giovani ermafroditi gravidi e sonicati su ghiaccio (ciclo: 0,5 s, ampiezza: 40–45%, 5 impulsi/sessione, 5 sessioni, intervallo tra le sessioni: 30 s; processore a ultrasuoni UP200S con micropunta S26d2 (Hielscher Ultrasonics GmbH)) in tampone di lisi (volume totale: ∼600 μl; 50 mm Tris-HCl, pH 7,4, 100 mm KCl, 1 mm MgCl2, 1 mm EGTA, 1 mm DTT, 10% glicerolo, miscela di inibitori delle proteasi, 0,1% Nonidet P-40 Substitute). Dopo la sonicazione, è stato aggiunto Nonidet P-40 Substitute fino all’1% e i lisati sono stati incubati con rotazione testa-coda a 4°C per 30 min, seguita da centrifugazione a 20.000 × g per 20 min a 4°C. Il lisato chiarificato è stato quindi aspirato senza disturbare lo strato lipidico superiore e suddiviso in due metà, aggiunte rispettivamente alle sfere di agarosio anti-GFP o alle sfere di controllo bloccate (40–50 μl). Dopo la rotazione testa-coda a 4°C per 60–90 min, le sfere sono state lavate una volta con tampone di lisi contenente 0,1% Nonidet P-40 Substitute e successivamente due volte con il tampone I (25 mm Tris-HCl, pH 7,4, 300 mm NaCl, 1 mm MgCl2) o il tampone II (1 mm Tris-HCl, pH 7,4, 150 mm NaCl, 1 mm MgCl2), oppure con entrambi. Per i pull-down di GFP:MBK-2 sono stati eseguiti due esperimenti separati utilizzando condizioni di lavaggio differenti. Le proteine sono state eluite mediante agitazione orbitale in 50 μl di urea 6 m/tiourea 2 M a temperatura ambiente. Per gli esperimenti di pull-down di MBK-1::GFP, le proteine sono state eluite due volte mediante agitazione in 50μl di cloruro di guanidinio 8 m a 90°C, seguita da precipitazione con etanolo. I campioni proteici eluiti sono stati quindi digeriti in soluzione.
(cfr. Chen et al., 2016)

Omogeneizzazione e lisi a ultrasuoni dei vermi

Per la procedura di lisi ed estrazione proteica di C.elegans, sono stati raccolti 30.000 nematodi dello stadio pertinente per campione, lavati in S-basal freddo come il ghiaccio, concentrati mediante centrifugazione a 1500 rpm per 2 min., lavati sei volte con S-basal freddo come il ghiaccio per rimuovere i batteri residui e quindi conservati su ghiaccio fino al momento dell’uso. Per l’estrazione delle proteine, i vermi adulti gravidi sono stati lasciati formare un pellet compatto dopo l’ultimo lavaggio con S-basal. I pellet di vermi sono stati quindi risospesi in 1 ml di tampone di estrazione freddo come il ghiaccio [20 mM fosfato di potassio, pH 7,4, 2mM EDTA, 1% Triton-X-100, inibitori delle proteasi (Sigma P2714)] e trattati immediatamente.
∼30.000 vermi adulti gravidi (corrispondenti a ∼100 mg di peso umido) sono stati sonicati su ghiaccio utilizzando un sonicatore a sonda (ad es. UP50H con micropunta MS2) al 40% di ampiezza per 10 cicli di 3 sec di attività e 30 sec di pausa, in 1 ml di tampone di estrazione freddo come il ghiaccio. (cfr. Baskharan et al. 2012)

Estrazione a ultrasuoni dei lipidi da C. elegans

Nella lipidomica, una branca della metabolomica, viene caratterizzato e analizzato l’insieme dei lipidi dei sistemi biologici. C. elegans è ampiamente utilizzato nella lipidomica per studiare l’interazione dei lipidi metabolici e i loro effetti sulla salute e sulla durata della vita.
La lisi e l’estrazione a ultrasuoni vengono utilizzate per liberare lipidi, come gli sfingolipidi, dagli embrioni, dalle larve e dai vermi adulti di C. elegans. La sonicazione viene utilizzata per preparare omogenati di vermi e successivamente estrarre i lipidi dal campione.
Protocollo di estrazione a ultrasuoni dei lipidi da C. elegans
Scongelare il pellet di C. elegans su ghiaccio e risospenderlo con 0,5 ml di ultrawater. Sonicare i campioni di C. elegans in provette da 1,5mL, mantenendoli costantemente su ghiaccio.
La sonicazione può essere eseguita utilizzando un sonicatore a sonda come UP200Ht, l’unità di preparazione dei campioni a ultrasuoni VialTweeter (sonicazione simultanea di 10 campioni) oppure UIP400MTP (per la sonicazione di piastre multipozzetto, come le piastre a 96 pozzetti). Per la lisi a ultrasuoni con UP200Ht, utilizzare la micropunta S26d2. Preimpostare la modalità dei cicli ultrasonici nel menu digitale. Impostare l’ampiezza al 10% e la modalità dei cicli di sonicazione su 20 cicli di impulsi di 2 sec, con una pausa di 30 sec. tra ciascun impulso ultrasonico.
Trasferire i surnatanti in provette di vetro con tappo a vite. Eseguire l’estrazione di Folch aggiungendo 1 ml di ultrawater a ciascuna provetta di vetro, quindi aggiungere 6 ml di miscela cloroformio/metanolo (rapporto = 2:1) a ciascuna provetta di vetro.
Agitare al vortex ciascuna provetta di vetro per 30 sec, per 4 volte. Centrifugare le provette a 1.258 x g per 15 min (Eppendorf, 5810 R) per migliorare ulteriormente la separazione delle fasi. Trasferire la frazione idrofobica inferiore in una provetta di vetro pulita mediante una pipetta Pasteur di vetro. Essiccare la frazione idrofobica inferiore sotto un flusso di azoto in un evaporatore ad azoto. Conservare il pellet essiccato in un congelatore a -80 °C fino all’uso. 


Preparazione a ultrasuoni di lisati di vermi

Lisato di vermi: i vermi allo stadio L4 sono stati raccolti e lavati tre volte con tampone M9 (42,26 mM Na₂HPO₄, 22,04 mM KH₂PO₄, 85,56 mM NaCl e 0,87 mM MgSO₄) per rimuovere tutti i batteri. Dopo aver rimosso quanto più tampone M9 possibile, i vermi sono stati risospesi in tampone di lisi: 50 mM HEPES, 50 mM KCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 5 mM β-glicerofosfato, 0,1% (v/v) Triton X-100, 50 mM fluoruro di sodio, 1 mM ortovanadato di sodio, 5 mM pirofosfato di sodio, 0,2 mM fluoruro di fenilmetansolfonile e inibitore delle proteasi. I vermi sono stati congelati in azoto liquido e scongelati a 37°C per tre volte, quindi sonicati su ghiaccio secco con un’unità a ultrasuoni VialTweeter per la preparazione simultanea di 10 provette di campioni. La sonicazione è stata eseguita al 50% di ampiezza in 10 cicli di 2 sec., con una pausa di 30 sec tra gli impulsi di sonicazione. Successivamente, i campioni sono stati centrifugati a 12.000 rpm a 4°C per 15 min. Il surnatante è stato raccolto e conservato a -70°C. Un’aliquota è stata utilizzata per la quantificazione delle proteine mediante il saggio di Bradford.
Determinazione del glutatione totale, del GSH e del GSSG: per la quantificazione del glutatione, la preparazione dei lisati e la determinazione sono state effettuate lo stesso giorno. Le larve L4 alimentate con glucosio e quelle di controllo sono state raccolte e lavate tre volte con tampone M9. Dopo aver rimosso quanto più tampone M9 possibile, i vermi sono stati risospesi in acido metafosforico freddo come il ghiaccio (5% w/v), quindi sonicati su ghiaccio con un VialTweeter a ultrasuoni al 50% di ampiezza in dieci cicli di sonicazione di 2 sec., con una pausa di 30 sec. tra ciascun ciclo. Successivamente sono stati centrifugati a 12.000 rpm a 4 ̊C per 15 min.
(cfr. Alcántar-Fernández et al., 2018)

Preparazione dei campioni di C. elegans prima dell’immunoprecipitazione e del Western blotting

In breve, per gli estratti embrionali, le larve L1 di C. elegans sono state coltivate fino all’età adulta in colture liquide su larga scala in terreno S. Gli embrioni sono stati raccolti utilizzando il metodo standard con ipoclorito e sospesi in tampone di lisi (50 mM Tris, pH 7,5, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl2, 8,7% glicerolo, 0,05% NP-40, 1􏰅 cocktail di inibitori delle proteasi e 1􏰅 cocktail di inibitori delle fosfatasi I e II), congelati rapidamente in azoto liquido e lisati mediante disgregazione cellulare a ultrasuoni utilizzando un sonicatore con micropunta come UP200Ht con S26d2 per 10 impulsi nell’arco di 10 s al 30% di ampiezza. Se occorre preparare un numero maggiore di campioni, si consiglia il sonicatore VialTweeter oppure il sonicatore multicampione UIP400MTP per piastre a pozzetti. Dopo la sonicazione, gli estratti sono stati prechiarificati mediante centrifugazione a 30.000g per 20 min a 4°C. L’estratto prechiarificato (300µg di proteine totali) è stato incubato con 40µ􏰂g di anticorpo anti-CDC-25.1 purificato per affinità (questo studio), reticolato all’agarosio-proteina A; come controllo è stata utilizzata una quantità analoga di immunoglobulina (Ig)G di coniglio reticolata all’agarosio-proteina A, in un volume totale di 200µl di tampone di lisi contenente 1% NP-40, la cui aggiunta ha ridotto il legame aspecifico delle proteine alla matrice. I campioni sono stati sottoposti a rotazione per 1 h a 4°C, le sfere sono state lavate tre volte con tampone di lisi ed eluite con 30µl di glicina/HCl e 200 mM NaCl, pH 2,2. Dopo l’immunoprecipitazione, gli eluati sono stati diluiti in 30µ􏰂l di tampone per campioni SDS, riscaldati a 95°C per 4 min e, di norma, il 3% del totale per l’input e il 30% per gli eluati sono stati caricati su SDS-PAGE, seguita da Western blotting con anticorpi anti-CDC-25.1 (1:400), anti-LIN-23 (1:750), anti-ubiquitina (1:1000), anti-GSK3􏰁 (1:500) o anti-􏰁β-actina (1:2000). Quando gli estratti non erano sottoposti a immunoprecipitazione, la stessa quantità di proteine totali derivata da tali estratti veniva risospesa in tampone per campioni SDS, riscaldata a 95°C e quindi caricata direttamente su SDS-PAGE e analizzata mediante Western blotting. (cfr. Segref et al. 2020)

Lisi a ultrasuoni con controllo preciso della temperatura

Un controllo preciso e affidabile della temperatura è fondamentale quando si manipolano campioni biologici. Le alte temperature avviano la degradazione delle proteine indotta dal calore nei campioni.
Come tutte le tecniche meccaniche di preparazione dei campioni, la sonicazione genera calore. Tuttavia, utilizzando VialTweeter, è possibile controllare efficacemente la temperatura dei campioni. Presentiamo diverse opzioni per monitorare e controllare la temperatura dei campioni durante la preparazione con VialTweeter e VialPress per l’analisi.

1. Monitoraggio della temperatura dei campioni: il processore a ultrasuoni UP200St, che aziona VialTweeter, è dotato di un software intelligente e di un sensore di temperatura collegabile. Collegare il sensore di temperatura a UP200St e inserire la punta del sensore in una delle provette dei campioni. Tramite il display digitale touch a colori, è possibile impostare nel menu di UP200St uno specifico intervallo di temperatura per la sonicazione dei campioni. Il sonicatore si arresta automaticamente al raggiungimento della temperatura massima e rimane in pausa finché la temperatura del campione non scende al valore inferiore dell’intervallo di temperatura ∆ impostato. La sonicazione riprende quindi automaticamente. Questa funzione intelligente previene la degradazione indotta dal calore.
2. Il blocco VialTweeter può essere preraffreddato. Collocare il blocco VialTweeter (solo il sonotrodo senza trasduttore!) in frigorifero o nel congelatore per preraffreddare il blocco di titanio aiuta a ritardare l’aumento della temperatura nel campione. Se possibile, anche il campione stesso può essere preraffreddato.
3. Utilizzare ghiaccio secco per il raffreddamento durante la sonicazione. Utilizzare un vassoio poco profondo riempito di ghiaccio secco e collocare VialTweeter sul ghiaccio secco, in modo che il calore possa dissiparsi rapidamente.

Trovate il disgregatore cellulare a ultrasuoni ottimale per la vostra applicazione di lisi

Hielscher Ultrasonics è un produttore con una lunga esperienza nella realizzazione di disgregatori cellulari e omogeneizzatori a ultrasuoni ad alte prestazioni per laboratori, sistemi da banco e sistemi su scala industriale. Le dimensioni della coltura di cellule batteriche, l’obiettivo di ricerca o produzione e il volume di cellule da trattare ogni ora o ogni giorno sono fattori essenziali per individuare il disgregatore cellulare a ultrasuoni adatto alla vostra applicazione.
Hielscher Ultrasonics offre diverse soluzioni per la sonicazione simultanea di più campioni (fino a 10 fiale) e per il trattamento di grandi quantità di campioni (ossia piastre per microtitolazione / piastre a 96 pozzetti), dal classico sonicatore da laboratorio a sonda con diversi livelli di potenza da 50 a 400 watt fino ai processori a ultrasuoni completamente industriali con potenze fino a 16.000watt per unità, per la disgregazione cellulare commerciale e l’estrazione delle proteine nella produzione su larga scala. Tutti i sonicatori Hielscher sono costruiti per il funzionamento 24/7/365 a pieno carico. Robustezza e affidabilità sono caratteristiche fondamentali dei nostri dispositivi a ultrasuoni.
Tutti gli omogeneizzatori a ultrasuoni digitali sono dotati di software intelligente, display touch a colori e registrazione automatica dei dati, che rendono il dispositivo a ultrasuoni un pratico strumento di lavoro nei laboratori e negli impianti di produzione.
Comunicateci quali tipi di cellule dovete trattare nei vostri campioni biologici, in quale volume, con quale frequenza e con quale obiettivo. Vi consiglieremo il disgregatore cellulare a ultrasuoni più adatto alle esigenze del vostro processo.

La tabella seguente fornisce un’indicazione della capacità di trattamento approssimativa dei nostri sistemi a ultrasuoni, dagli omogeneizzatori compatti portatili e dai sonicatori multicampione ai processori a ultrasuoni industriali per applicazioni commerciali: