Lisi a ultrasuoni di E. Coli

I batteri E. coli sono i batteri più comunemente utilizzati in microbiologia e biotecnologia.
I disgregatori cellulari a ultrasuoni forniscono risultati affidabili e riproducibili per la lisi di E. coli.
La cavitazione e le forze di taglio, intense ma controllabili con precisione, consentono una disgregazione completa e rese di estrazione elevate (ad es. proteine, DNA).

Perché la disgregazione cellulare a ultrasuoni di E. coli è il metodo preferito?

Gli omogeneizzatori a ultrasuoni o i sonicatori a sonda offrono diversi vantaggi per la lisi di E. coli, poiché gli ultrasuoni intensi disgregano efficacemente le pareti e le membrane cellulari. I sonicatori a sonda sono ampiamente utilizzati per la lisi di E. coli per i seguenti motivi:

Disgregazione efficiente delle pareti cellulari: E. coli possiede una parete cellulare semirigida composta da peptidoglicano, che può essere difficile da rompere con i metodi di lisi tradizionali. Un sonicatore a sonda genera onde ultrasoniche intense che creano bolle di cavitazione nel liquido che circonda le cellule. Quando queste bolle collassano, generano getti di liquido ad alta velocità e onde d’urto che provocano la disgregazione meccanica delle pareti cellulari, rilasciando efficacemente il contenuto cellulare, come le biomolecole.

Maggiore penetrazione: Le onde ultrasoniche generate dalla sonda / dal sonotrodo possono penetrare in profondità nel campione, raggiungendo un maggior numero di cellule di E. coli e trattandole in modo uniforme. Ciò contribuisce a garantire una lisi più uniforme in tutto il campione, con una maggiore efficienza di disgregazione cellulare.

Tempi di trattamento ridotti: L’energia erogata dal sonicatore a sonda è altamente concentrata e localizzata, consentendo una lisi cellulare rapida ed efficiente. Rispetto ad altri metodi, come la disgregazione mediante sfere o la lisi enzimatica, la sonicazione può ottenere la lisi di E. coli in pochi minuti o persino secondi. Mentre molte tecniche alternative, come il congelamento e scongelamento, richiedono diversi cicli di trattamento, la lisi a ultrasuoni apre le cellule in un’unica fase di processo.

Controllo della temperatura: I sonicatori più avanzati sono dotati di sensori di temperatura e software intelligente, che consentono di impostare una temperatura massima di processo. Il sonicatore si arresta automaticamente quando viene raggiunto il limite di temperatura e avvia il processo di sonicazione quando viene raggiunta una temperatura impostata. Raffreddare i campioni in un bagno di ghiaccio è un metodo semplice per mantenere bassa la temperatura del campione e prevenirne la degradazione indotta dal calore.

Scalabilità: I sonicatori a sonda sono disponibili in varie dimensioni, dai dispositivi portatili ai modelli industriali su larga scala. Questo li rende adatti al trattamento di piccoli volumi in laboratorio o al passaggio a una scala maggiore per applicazioni di bioprocesso più ampie, ad es. la produzione di vaccini o la biosintesi di molecole.

Versatilità: I sonicatori possono essere utilizzati per varie applicazioni oltre alla lisi cellulare, come la frammentazione del DNA mediante taglio, l’estrazione di proteine, l’omogeneizzazione dei tessuti, la dispersione di nanoparticelle e l’emulsificazione. Pertanto, investire in un sonicatore a sonda offre versatilità negli ambienti di ricerca o industriali.

I sonicatori a sonda come UP200St sono affidabili omogeneizzatori di tessuti e disgregatori cellulari, perciò sono ampiamente utilizzati per la preparazione dei campioni in genetica, ad es. per la lisi di E.coli

L’estrazione di proteine dalle cellule di E.coli viene eseguita efficacemente con la sonda a ultrasuoni UP200St

Un sonicatore a sonda offre numerosi vantaggi per la lisi di E. coli. Il controllo affidabile e preciso dei parametri del processo a ultrasuoni consente di ottimizzare i parametri operativi, come la potenza, la durata e la gestione del campione, per ottenere i risultati desiderati.

Questo tutorial spiega quale tipo di sonicatore è più adatto alle vostre attività di preparazione dei campioni, come lisi, disgregazione cellulare, isolamento delle proteine e frammentazione di DNA e RNA in laboratorio, nell’analisi e nella ricerca. Scegliete il tipo di sonicatore ideale per la vostra applicazione, il volume e il numero di campioni e la capacità di trattamento dei campioni. Hielscher Ultrasonics ha l’omogeneizzatore a ultrasuoni ideale per voi!

La frammentazione del DNA a ultrasuoni viene frequentemente utilizzata come fase di preparazione dei campioni nel sequenziamento di nuova generazione (NGS)

Analisi elettroforetiche del DNA genomico di E. coli EDL933 sottoposto a sonicazione per 0 – 15 min. L indica il marcatore di dimensioni del DNA.
(studio e immagine: ©Basselet et al. 2008)

Disgregazione cellulare mediante cavitazione ultrasonica

Gli omogeneizzatori a ultrasuoni a sonda funzionano a circa 20.000 cicli al secondo (a 20kHz) e provocano cavitazione nei liquidi o nelle sospensioni. La cavitazione acustica crea aree microscopiche con pressioni simili al vuoto e temperature elevate che disgregano le cellule. Sebbene le temperature possano raggiungere diverse migliaia di gradi Celsius, i volumi di cavitazione sono così piccoli da non riscaldare significativamente il processo. La cavitazione acustica e le forze di taglio generate dagli ultrasuoni perforano o rompono la membrana cellulare di cellule batteriche come E.coli. I sonicatori Hielscher consentono il controllo preciso di parametri di processo quali intensità ultrasonica, ampiezza, apporto energetico e temperatura. In questo modo, il processo di lisi a ultrasuoni può essere adattato in modo ottimale al tipo di cellula, alla coltura cellulare e all’obiettivo del processo.

Vantaggi della lisi a ultrasuoni

controllo preciso della lisi (intensità, ampiezza, temperatura)
risultati affidabili e riproducibili
adattamento ottimale a campioni specifici
controllo della temperatura
per campioni da molto piccoli a molto grandi (da µL a litri)
trattamento puramente meccanico
funzionamento semplice e sicuro
passaggio lineare dalla scala di laboratorio alla produzione

Il dispositivo a ultrasuoni VialTweeter consente la preparazione simultanea dei campioni in un massimo di 10 fiale nelle stesse condizioni di processo. (Fate clic per ingrandire!)

VialTweeter per la lisi a ultrasuoni

Omogeneizzatore a ultrasuoni a confronto con altre tecniche di lisi

Mentre la lisi chimica ed enzimatica possono essere problematiche – poiché la lisi chimica può alterare le strutture proteiche e introdurre problemi di purificazione, mentre la lisi enzimatica richiede lunghi tempi di incubazione e non è riproducibile – la disgregazione a ultrasuoni è un metodo di disgregazione cellulare sofisticato e rapido.
La lisi a ultrasuoni si basa esclusivamente su forze meccaniche. Non vengono aggiunte sostanze chimiche: la sonicazione rompe la parete cellulare mediante forze di taglio. La lisi chimica può alterare la struttura delle proteine e introdurre problemi di purificazione. La disgregazione enzimatica richiede lunghi tempi di incubazione e non è riproducibile. La disgregazione cellulare a ultrasuoni delle cellule batteriche di E.coli è rapida, semplice, affidabile e riproducibile. Per questo motivo, i sonicatori Hielscher vengono utilizzati nei laboratori biologici e biochimici di tutto il mondo per la preparazione dei campioni, le attività preanalitiche, la diagnostica in vitro e numerosi saggi.

Raccomandazioni generali per la lisi a ultrasuoni

La sonicazione è la tecnica più diffusa per la lisi di quantità molto piccole, medie e grandi di sospensioni cellulari – dai picolitri fino a 100L/hr (utilizzando una cella di flusso a ultrasuoni). Le cellule vengono lisate mediante il taglio nel liquido e la cavitazione. Anche il DNA viene frammentato mediante taglio durante la sonicazione, quindi non è necessario aggiungere DNasi alla sospensione cellulare.

Controllo della temperatura durante la lisi a ultrasuoni di E.coli
Preraffreddando il campione e mantenendolo su ghiaccio durante la sonicazione, è possibile prevenirne facilmente la degradazione termica.
Idealmente, i campioni dovrebbero essere mantenuti alla temperatura del ghiaccio durante la lisi, ma per la maggior parte dei campioni è sufficiente che la temperatura non superi quella della coltura o del tessuto di origine. Si raccomanda pertanto di mantenere la sospensione su ghiaccio e di effettuare la sonicazione con diversi brevi impulsi ultrasonici di 5–10 sec e pause di 10–30 sec. Durante le pause, il calore può dissiparsi per ristabilire una temperatura bassa. Per campioni cellulari più grandi, sono disponibili vari reattori con cella di flusso dotati di camicie di raffreddamento.
Leggete qui consigli e raccomandazioni dettagliati per una lisi a ultrasuoni efficace!

Protocolli per la preparazione a ultrasuoni di lisati di E. Coli

I ricercatori utilizzano gli omogeneizzatori a ultrasuoni Hielscher per la disgregazione cellulare di E.coli. Di seguito sono riportati vari protocolli testati e comprovati per la lisi di E.coli mediante omogeneizzatori a ultrasuoni Hielscher, per diverse applicazioni relative a E. coli.

Crescita cellulare, reticolazione e preparazione di estratti cellulari di E. coli mediante ultrasuoni

Per gli esperimenti ChIP-Chip di SeqA e della RNA polimerasi, E. coli MG1655 o MG1655 ΔseqA è stato coltivato a 37°C fino a un’OD₆₀₀ di circa 0,15 in 50 ml di LB (+ 0,2% di glucosio), prima di aggiungere 27 μl di formaldeide (37%) per ml di terreno (concentrazione finale 1%). La reticolazione è stata effettuata con agitazione lenta (100 rpm) a temperatura ambiente per 20 min, seguita dall’arresto della reazione con 10 ml di glicina 2,5 M (concentrazione finale 0,5 M). Per gli esperimenti di shock termico, E. coli MG1655 è stato coltivato in 65 ml di terreno LB a 30°C fino a un’OD₆₀₀ di circa 0,3. Successivamente, 30 ml di coltura sono stati trasferiti in una beuta preriscaldata a 43°C e la parte restante è stata mantenuta a 30°C. La reticolazione e l’arresto della reazione sono stati effettuati come descritto sopra, con la differenza che le cellule sono state mantenute a 30 o 43°C per 5 min prima di un’ulteriore agitazione lenta a temperatura ambiente. Le cellule sono state raccolte mediante centrifugazione e lavate due volte con TBS freddo (pH7.5). Dopo la risospensione in 1 ml di tampone di lisi (10 mM Tris (pH 8,0), 20% saccarosio, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mg/ml lisozima) e l’incubazione a 37°C per 30 min, seguita dall’aggiunta di 4 ml di tampone IP, le cellule sono state sonicate su ghiaccio con 12 cicli di 30 sec e pause di 30 sec, utilizzando il processore a ultrasuoni Hielscher UP400St con la potenza impostata al 100%. Dopo centrifugazione per 10 min a 9000 g, aliquote di 800 μl del surnatante sono state conservate a -20°C. (Waldminghaus 2010)

Sovrapproduzione e purificazione di enzimi con una sonda a ultrasuoni

Per la sovrapproduzione di proteine con tag di decaistidina (His10), E. coli BL21(DE3) è stato trasformato con costrutti pET19b. Una precoltura cresciuta durante la notte è stata raccolta mediante centrifugazione e l’1% è stato utilizzato per inoculare una coltura di espressione. Le cellule contenenti pET19mgtB sono state coltivate a 22°C fino a una densità ottica a 600 nm (OD600) di 0,7. La coltura è stata trasferita a 17°C e indotta con 100 μM IPTG. Dopo 16 h, la coltura è stata raccolta mediante centrifugazione a 7.500 × g a 4°C. Le cellule sono state risospese in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) 50 mM con 0,3 M NaCl a pH 7,4 e disgregate mediante sonicazione con un sonotrodo S2 a micropunta sul sonicatore Hielscher UP200St, con un ciclo di 0,5 e un’ampiezza del 75%.
La sovrapproduzione di GtfC con tag di decaistidina è stata indotta a 37°C a un’OD₆₀₀ di 0,6 con 100 μM IPTG. Le cellule sono state quindi incubate per 4 h, raccolte e lisate come indicato sopra per MgtB.
Gli estratti cellulari grezzi sono stati centrifugati a 15.000 × g e 4°C per sedimentare i detriti cellulari. Gli estratti chiarificati sono stati caricati su colonne HisTrap FF Crude da 1 ml utilizzando un sistema ÄKTAprime Plus. Gli enzimi sono stati purificati secondo il protocollo del produttore per l’eluizione in gradiente delle proteine con tag His. Le soluzioni proteiche eluite sono state dializzate due volte contro 1.000 volumi di PBS 50 mM, pH 7,4, con 0,3 M NaCl a 4°C. La purificazione è stata analizzata mediante SDS-PAGE al 12%. La concentrazione proteica è stata determinata con il metodo Bradford utilizzando Roti-Quant. (Rabausch et al. 2013)

Estrazione a ultrasuoni di proteine dai batteri E. coli
Una proteina esca di interesse (in questo caso, MTV1 di Arabidopsis thaliana) viene fusa con un tag GST ed espressa in cellule di Escherichia coli (E. coli) BL21.

Prelevare un pellet di GST-MTV1 e uno di GST (corrispondenti a 50 ml di coltura batterica) e risospendere ciascuno in 2,5 mL di tampone di estrazione alla temperatura del ghiaccio.
Utilizzare un sonicatore UP100H (dotato di sonotrodo MS3 a micropunta per piccoli volumi di circa 2–5mL) per disgregare le cellule batteriche fino alla lisi, indicata da una riduzione dell’opacità e da un aumento della viscosità. Questa operazione deve essere eseguita su ghiaccio e si raccomanda di effettuare la sonicazione a intervalli (ad es. 10 sec di sonicazione seguiti da 10 sec di pausa su ghiaccio e così via). Occorre fare attenzione a non effettuare la sonicazione con un’intensità troppo elevata. Se si rileva la formazione di schiuma o di un precipitato bianco, è necessario ridurre l’intensità.
Trasferire la soluzione di batteri lisati in provette da microcentrifuga da 1,5 mL e centrifugare a 4°C, 16.000 x g per 20 min.

Le sonde a ultrasuoni utilizzano le forze della cavitazione acustica per disgregare le cellule ed estrarre molecole e DNA da E.coli.

I sonicatori a sonda come UP400St sfruttano il principio di funzionamento della cavitazione acustica per la lisi efficiente di E.coli.

Analisi dell’espressione e purificazione di proteine ricombinanti mediante sonicazione

Il pellet di E. coli è stato sonicato con il sonicatore Hielscher UP100H. A tale scopo, il pellet cellulare è stato risospeso in tampone di lisi refrigerato (50 mM Tris-HCl pH=7,5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) e raffreddato su ghiaccio per 10 min. Quindi, la sospensione cellulare è stata sonicata con 10 brevi impulsi di 10 s, ciascuno seguito da un intervallo di 30 s per il raffreddamento. Infine, i detriti cellulari sono stati rimossi mediante ultracentrifugazione a 4°C per 15 min a 14.000 rpm. Per confermare l’espressione di rPR, il surnatante è stato sottoposto a elettroforesi su gel di poliacrilammide al 12% e analizzato mediante SDS-PAGE e Western blotting. La purificazione di rPR è stata effettuata utilizzando resina Ni2+-NTA (Invitrogen, USA) secondo le istruzioni del produttore. In questa fase è stato utilizzato il metodo di purificazione in condizioni native. La purezza della proteina purificata è stata valutata mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide al 12% e successiva colorazione con blu di Coomassie. La concentrazione della proteina purificata è stata misurata con il kit per il dosaggio proteico Micro BCA (PIERCE, USA). (Azarnezhad et al. 2016)

Questo video mostra il cuphorn a ultrasuoni da 200 watt per la dispersione, l’omogeneizzazione, l’estrazione o il degasaggio di campioni di laboratorio.

Omogeneizzatori a ultrasuoni per la lisi di E. coli

Hielscher Ultrasonics progetta, produce e fornisce omogeneizzatori a ultrasuoni ad alte prestazioni per la lisi affidabile ed efficiente dei batteri E. coli e di altri tipi di cellule, tessuti e colture cellulari.
L’ampia gamma di sonde a ultrasuoni e di sistemi di sonicazione indiretta ci consente di offrirvi l’omogeneizzatore di tessuti a ultrasuoni ideale per la vostra applicazione di disgregazione cellulare ed estrazione.

Progettazione, produzione e consulenza – Qualità Made in Germany

I sonicatori Hielscher sono rinomati per i loro elevatissimi standard di qualità e progettazione. Software intelligente, menu intuitivo, impostazioni programmabili e registrazione automatica dei dati sono solo alcune delle caratteristiche dei sonicatori Hielscher. La robustezza e la facilità d’uso consentono di integrare senza difficoltà i nostri sonicatori nelle strutture di ricerca e biotecnologia. I sonicatori Hielscher affrontano facilmente anche condizioni difficili e ambienti impegnativi.

Hielscher Ultrasonics è un’azienda certificata ISO e dedica particolare attenzione ai sonicatori ad alte prestazioni caratterizzati da tecnologia all’avanguardia e facilità d’uso. Naturalmente, i sonicatori Hielscher sono conformi CE e soddisfano i requisiti di UL, CSA e RoHs.

La tabella seguente fornisce un’indicazione della capacità di trattamento approssimativa dei nostri sonicatori:

Volume del lotto	Portata	Dispositivi consigliati
piastre multipozzetto / da microtitolazione	n.a.	UIP400MTP
CupHorn per fiale o becher	n.a.	CupHorn a ultrasuoni
microreattore a flusso a ultrasuoni	n.a.	GDmini2
fino a 10 fiale con volumi da 0,5 a 1,5mL	n.a.	VialTweeter
da 0,5 a 1,5mL	n.a.	VialTweeter
da 1 a 500mL	da 10 a 200mL/min	UP100H
da 10 a 2000mL	da 20 a 400mL/min	UP200Ht, UP400St
da 0,1 a 20L	da 0,2 a 4L/min	UIP2000hdT
da 10 a 100L	da 2 a 10L/min	UIP4000
n.a.	da 10 a 100L/min	UIP16000
n.a.	superiore	gruppo di UIP16000

Contattateci! / Chiedeteci informazioni!

Il video mostra il sistema di preparazione dei campioni a ultrasuoni UIP400MTP, che consente una preparazione affidabile dei campioni in qualsiasi piastra multipozzetto standard mediante ultrasuoni ad alta intensità. Le applicazioni tipiche di UIP400MTP comprendono la lisi cellulare, la frammentazione per taglio di DNA, RNA e cromatina, nonché l’estrazione delle proteine.

Ulteriori protocolli per la lisi a ultrasuoni di E. coli

Proteine modificate dall’allicina in E. coli mediante VialTweeter a ultrasuoni

Determinazione del contenuto di gruppi sulfidrilici mediante saggio con acido 5,5′-ditiobis(2-nitrobenzoico) (DTNB)
Una coltura di E. coli MG1655 cresciuta durante la notte è stata utilizzata per inoculare un terreno minimo MOPS (1:100). La coltura è stata fatta crescere in condizioni aerobiche fino al raggiungimento di un’A600 di 0,4. La coltura è stata suddivisa in tre colture da 15 ml per il trattamento di stress. Una coltura non trattata è stata utilizzata come controllo negativo. A ciascuna delle due colture rimanenti sono stati aggiunti, rispettivamente, 0,79 mM di allicina (128 μg ml-1) o 1 mM di diamide. Le colture sono state incubate per 15 min. Sono stati raccolti 5 ml di ciascuna coltura mediante centrifugazione (8.525 × g, 4°C, 10 min). Le cellule sono state lavate due volte con 1 ml di PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4, conservato in condizioni anaerobiche prima dell’uso) e centrifugate (13.000 × g, 4°C, 10 min). Le cellule sono state risospese in tampone di lisi (PBS con 6 mM di guanidinio HCl, pH 7,4) prima della disgregazione a 4°C mediante sonicazione (sonicatore VialTweeter , Hielscher GmbH, Germania) (3 × 1 min). I detriti cellulari sono stati raccolti in pellet mediante centrifugazione (13.000 × g, 4 °C, 15 min). Il surnatante è stato trasferito in una cuvetta QS-macro da 3,5 ml (10 mm) con un’ancoretta magnetica e miscelato con 1 ml di tampone di lisi. L’assorbanza dei campioni è stata monitorata a 412 nm con uno spettrofotometro Jasco V-650 dotato del portacuvette termostatato PSC-718, a temperatura ambiente. Sono stati aggiunti 100μl di una soluzione 3 mM di acido ditiobis(2-nitrobenzoico). L’assorbanza è stata monitorata fino al raggiungimento della saturazione. La concentrazione dei tioli è stata calcolata utilizzando il coefficiente di estinzione ϵ₄₁₂ = 13.700 M^-1 cm^-1 per l’acido tio-2-nitrobenzoico (TNB). Le concentrazioni cellulari dei tioli sono state calcolate sulla base di un volume delle cellule di E. coli di 6,7 × 10^-15 litri e di una densità cellulare di A600 = 0,5 (equivalente a 1 × 10⁸ cellule ml^-1 di coltura). (Müller et al. 2016)

Determinazione del glutatione in vivo mediante un disgregatore cellulare a ultrasuoni

E.coli MG1655 è stato coltivato in terreno minimo MOPS in un volume totale di 200ml fino al raggiungimento di un’A600 di 0,5. La coltura è stata suddivisa in colture da 50 ml per il trattamento di stress. Dopo 15 min di incubazione con 0,79 mM di allicina, 1 mM di diamide o dimetilsolfossido (controllo), le cellule sono state raccolte a 4.000g a 4°C per 10 min. Le cellule sono state lavate due volte con tampone KPE prima della risospensione dei pellet in 700µl di tampone KPE. Per la deproteinizzazione, sono stati aggiunti 300l di acido solfosalicilico al 10% (w/v) prima della disgregazione delle cellule mediante sonicazione (3 x 1 min; sonicatore VialTweeter ). I surnatanti sono stati raccolti dopo centrifugazione (30 min, 13.000g, 4°C). Le concentrazioni di acido solfosalicilico sono state ridotte all’1% mediante l’aggiunta di 3 volumi di tampone KPE. Le misurazioni del glutatione totale e del GSSG sono state eseguite come descritto sopra. Le concentrazioni cellulari di glutatione sono state calcolate sulla base di un volume delle cellule di E. coli di 6,7×10^-15 litri e di una densità cellulare di A600 0,5 (equivalente a 1×10⁸ cellule ml^-1 di coltura). Le concentrazioni di GSH sono state calcolate sottraendo 2[GSSG] dal glutatione totale. (Müller et al. 2016)

Espressione di mAspAT umana in E. coli mediante un omogeneizzatore a ultrasuoni

La singola colonia di E. coli BL21 (DE3) contenente il vettore di espressione è stata posta in 30 mL di terreno Luria-Bertani (LB) contenente 100μg/mL di ampicillina e quindi coltivata a 37ºC fino a quando la densità ottica (OD₆₀₀) ha raggiunto 0,6. Le cellule sono state raccolte mediante centrifugazione a 4.000 × g per 10 min e risospese in 3L di terreno LB fresco contenente 100μg/mL di ampicillina.
Successivamente, l’espressione proteica è stata indotta con 1 mM di isopropil β-ᴅ-1-tiogalattopiranoside (IPTG) per 20 h a 16ºC. Le cellule sono state raccolte mediante centrifugazione a 8.000 × g per 15 min e lavate con tampone A (20 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, pH 7,4). Da 3 L di coltura sono stati ottenuti circa 45g (peso umido) di cellule. Dopo centrifugazione, i pellet cellulari sono stati risospesi in 40 mL (per 1 L di coltura) di tampone di estrazione A alla temperatura del ghiaccio e lisati mediante sonicazione alla temperatura del ghiaccio utilizzando il disgregatore cellulare a ultrasuoni Hielscher UP400St. Il lisato cellulare è stato centrifugato a 12.000 rpm per 15 min per separare le frazioni solubili (surnatante) e precipitate (pellet). (Jiang et al. 2015)

Argomenti correlati

Informazioni utili

E.coli

Escherichia coli (E. coli) è un batterio coliforme del genere Escherichia, gram-negativo, anaerobio facoltativo e a forma di bastoncello, comunemente presente nel tratto inferiore dell’intestino degli organismi a sangue caldo (endotermi). Esistono numerosi ceppi (o sottotipi) di E. coli con caratteristiche diverse. La maggior parte dei ceppi di E. coli è innocua per l’uomo, ad es. i ceppi B e K-12, comunemente utilizzati per applicazioni di ricerca nei laboratori. Tuttavia, alcuni ceppi sono nocivi e possono causare gravi malattie.
E. coli svolge un ruolo importante nella moderna ingegneria biologica e nella microbiologia industriale, poiché il batterio è facile da manipolare. Tra le comuni applicazioni di laboratorio che spesso comportano l’uso di E. coli vi sono, ad es., la creazione di acido desossiribonucleico (DNA) ricombinante e l’impiego come organismo modello.
E. coli è un ospite molto versatile per la produzione di proteine eterologhe e sono disponibili numerosi sistemi di espressione proteica per produrre proteine ricombinanti in E. coli. Utilizzando plasmidi che consentono elevati livelli di espressione proteica, è possibile introdurre geni nei batteri, permettendo di produrre tali proteine in grandi quantità nei processi di fermentazione industriale.
E.coli viene utilizzato come fabbrica cellulare per produrre insulina. Ulteriori applicazioni comprendono l’uso di cellule di E. coli modificate per sviluppare e produrre vaccini ed enzimi immobilizzati, per produrre biocarburanti e per il biorisanamento.
Il ceppo K-12 è una forma mutante di E. coli che sovraesprime l’enzima fosfatasi alcalina (ALP). Questa mutazione si verifica a causa di un difetto nel gene che codifica costantemente per l’enzima. Se un gene produce un prodotto senza alcuna inibizione, si parla di attività costitutiva. Questa specifica forma mutante viene utilizzata per l’isolamento e la purificazione dell’enzima ALP.
I batteri E. coli sono inoltre ampiamente utilizzati come fabbriche cellulari. I microrganismi ingegnerizzati (ad es. batteri) e le cellule vegetali possono essere utilizzati come cosiddette fabbriche cellulari. Queste cellule geneticamente modificate producono molecole, sostanze chimiche, polimeri, proteine e altre sostanze, utilizzate ad esempio nell’industria farmaceutica, alimentare e chimica. Per rilasciare le molecole prodotte all’interno di tali cellule bioingegnerizzate, la lisi a ultrasuoni è un metodo comune per disgregare le pareti cellulari e trasferire le sostanze bersaglio nel liquido circostante. Scoprite di più sulla lisi delle cellule bioingegnerizzate!

Frammentazione del DNA mediante taglio a ultrasuoni

Le forze di taglio ultrasoniche sono un metodo comunemente utilizzato per rilasciare molecole, organelli e proteine dall’interno delle cellule e per rompere i filamenti di DNA in frammenti. La cavitazione acustica rompe le pareti e le membrane cellulari per estrarre il DNA dalle cellule e generare frammenti di circa 600 – 800 bp di lunghezza, ideali per l’analisi.
Fate clic qui per saperne di più sugli omogeneizzatori a ultrasuoni per la frammentazione del DNA!

Bibliografia / Riferimenti

Azarnezhad A., Sharifi Z., Seyedabadi R., Hosseini A., Johari B., Sobhani Fard M. (2016): Cloning and Expression of Soluble Recombinant HIV-1 CRF35 Protease-HP Thioredoxin Fusion Protein. Avicenna J Med Biotechnol. 8(4), 2016. 175–181.
Jiang X., Wang J., Chang H.; Zhou Y. (2016): Recombinant expression, purification and crystallographic studies of the mature form of human mitochondrial aspartate aminotransferase. BioScience Trends 2016.
Müller A., Eller J., Albrecht F., Prochnow P., Kuhlmann K., Bandow J.E., Slusarenko A.J., Leichert L.I.O. (2016): Allicin Induces Thiol Stress in Bacteria through S-Allylmercapto Modification of Protein Cysteines. Journal of Biological Chemistry Vol. 291, No. 22, 2016. 11477–11490.
Rabausch U., Juergensen J., Ilmberger N., Böhnke S., Fischer S., Schubach B., Schulte M., Streit W. R. (2013): Functional Screening of Metagenome and Genome Libraries for Detection of Novel Flavonoid-Modifying Enzymes. Applied and Environmental Microbiology 79(15), 2013. 4551–4563.
Sauer M. (2014): MTV1 Pull-down Assay in Arabidopsis. bio-protocol Vol 4, Iss 12, Jun 20, 2014.
Waldminghaus T., Skarstad K. (2010): ChIP on Chip: surprising results are often artifacts. BMC Genomics 11, 2010. 414.

Ultrasuoni ad alte prestazioni! La gamma di prodotti Hielscher copre l’intero spettro, dal sonicatore compatto da laboratorio alle unità da banco fino ai sistemi a ultrasuoni completamente industriali.

Hielscher Ultrasonics produce omogeneizzatori a ultrasuoni ad alte prestazioni, dalla scala di laboratorio a quella industriale.