Lisi ultrasonica di E. Coli

  • I batteri dell'E. coli sono i batteri più comunemente usati in microbiologia e biotecnologia.
  • I distruttori cellulari ad ultrasuoni forniscono risultati affidabili e riproducibili per la lisi dell'E. coli.
  • Forze di cavitazione e di taglio intense, ma controllabili con precisione, provocano un'interruzione completa e alti rendimenti di estrazione (ad es. proteine, DNA).

Perché la distruzione cellulare di E. coli con gli ultrasuoni è il metodo preferito?

Gli omogeneizzatori a ultrasuoni o gli ultrasuoni a sonda offrono diversi vantaggi per la lisi di E. coli, in quanto gli ultrasuoni intensi disgregano efficacemente le pareti e le membrane cellulari. Gli ultrasonici a sonda sono ampiamente utilizzati per la lisi di E. coli per i seguenti motivi:

  • Efficace disgregazione delle pareti cellulari: L'E. coli ha una parete cellulare semirigida composta da peptidoglicano, che può essere difficile da rompere con i metodi di lisi tradizionali. Un ultrasuonatore a sonda genera onde ultrasoniche intense che creano bolle di cavitazione nel liquido che circonda le cellule. Quando queste bolle collassano, generano getti di liquido ad alta velocità e onde d'urto che provocano la rottura meccanica delle pareti cellulari, liberando efficacemente i contenuti cellulari come le biomolecole.
  • Penetrazione migliorata: Le onde ultrasoniche generate dalla sonda/sonotrodo possono penetrare in profondità nel campione, raggiungendo un maggior numero di cellule di E. coli e trattandole in modo uniforme. Ciò contribuisce a garantire una lisi più uniforme in tutto il campione, con conseguente maggiore efficienza di disgregazione cellulare.
  • Riduzione dei tempi di elaborazione: L'energia erogata dall'ultrasuonatore a sonda è altamente concentrata e localizzata, per una lisi cellulare rapida ed efficiente. Rispetto ad altri metodi, come il bead beating o la lisi enzimatica, la sonicazione può ottenere la lisi di E. coli in pochi minuti o addirittura in pochi secondi. Mentre molte tecniche alternative, come il congelamento-scongelamento, richiedono diversi cicli di trattamento, la lisi ultrasonica apre le cellule in un'unica fase del processo.
  • Controllo della temperatura: Gli ultrasonori di ultima generazione sono dotati di sensori di temperatura e di un software intelligente che consente di impostare una temperatura massima di processo. L'ultrasonorizzatore si ferma automaticamente quando viene raggiunto il limite di temperatura e avvia il processo di sonicazione quando viene raggiunto il punto di temperatura impostato. Il raffreddamento dei campioni in un bagno di ghiaccio è un metodo semplice per mantenere bassa la temperatura del campione e prevenire la degradazione del campione indotta dal calore.
  • Scalabilità: Gli ultrasuonatori a sonda sono disponibili in varie dimensioni, dai dispositivi portatili ai modelli industriali su larga scala. Ciò li rende adatti alla lavorazione di piccoli volumi in laboratorio o alla scalabilità per applicazioni di bioprocesso più ampie, ad esempio la produzione di vaccini o la biosintesi di molecole.
  • Versatilità: Gli ultrasuoni possono essere utilizzati per diverse applicazioni oltre alla lisi cellulare, come la lacerazione del DNA, l'estrazione di proteine, l'omogeneizzazione dei tessuti, la dispersione di nanoparticelle e l'emulsificazione. Pertanto, l'investimento in un ultrasuonatore a sonda offre versatilità nella ricerca e nell'industria.
  • Gli ultrasuoni a sonda, come l'UP200St, sono omogeneizzatori di tessuti e frantumatori di cellule affidabili, quindi ampiamente utilizzati per la preparazione dei campioni in genetica, ad esempio per la lisi di E.coli.

    L'estrazione di proteine da cellule di E.coli viene effettuata in modo efficiente con il sistema Sonda a ultrasuoni UP200St

    L'ultrasuonatore a sonda offre molti vantaggi per la lisi di E. coli. Il controllo affidabile e preciso dei parametri del processo a ultrasuoni consente di ottimizzare i parametri operativi come la potenza, la durata e la manipolazione del campione per ottenere i risultati desiderati.
     

    Richiesta informazioni





     

    Questo tutorial spiega qual è il tipo di sonicatore migliore per le attività di preparazione dei campioni, come la lisi, la disgregazione delle cellule, l'isolamento delle proteine, la frammentazione del DNA e dell'RNA nei laboratori, nelle analisi e nella ricerca. Scegliete il tipo di sonicatore ideale per la vostra applicazione, il volume del campione, il numero di campioni e la produttività. Hielscher Ultrasonics ha l'omogeneizzatore a ultrasuoni ideale per voi!

    Come trovare il sonicatore perfetto per la disgregazione cellulare e l'estrazione di proteine in ambito scientifico e analitico

    Miniatura del video

    La frammentazione ultrasonica del DNA è frequentemente utilizzata come fase di preparazione del campione nel Next Generation Sequencing (NGS)

    Analisi elettroforetiche del DNA genomico di E. coli EDL933 sottoposto a ultrasuoni da 0 a 15 minuti. L indica la DNA Ladder.
    (studio e immagine: ©Basselet et al. 2008)

    Distruzione cellulare mediante cavitazione a ultrasuoni

    Gli omogeneizzatori a ultrasuoni funzionano con circa 20.000 cicli al secondo (a 20 kHz) e provocano la cavitazione nei liquidi o nelle sospensioni. La cavitazione acustica crea aree microscopiche di pressioni simili al vuoto e temperature elevate che lacerano le cellule. Sebbene le temperature possano raggiungere diverse migliaia di gradi Celsius, i volumi di cavitazione sono così piccoli da non riscaldare il processo in modo significativo. La cavitazione acustica e le forze di taglio generate dagli ultrasuoni perforano o rompono la membrana cellulare di cellule batteriche come l'E.coli. Gli ultrasuonatori Hielscher consentono un controllo preciso dei parametri di processo, come l'intensità degli ultrasuoni, l'ampiezza, l'energia immessa e la temperatura. In questo modo, il processo di lisi a ultrasuoni può essere regolato in modo ottimale in base al tipo di cellula, alla coltura cellulare e all'obiettivo del processo.
     

    Vantaggi della lisi ultrasonica

    • controllo preciso della lisi (intensità, ampiezza, temperatura)
    • risultati affidabili e riproducibili
    • adattamento ottimale a campioni specifici
    • controllo della temperatura
    • per campioni da molto piccoli a molto grandi (da µL a litri)
    • Trattamento puramente meccanico
    • Funzionamento facile e sicuro
    • scale-up lineare dal laboratorio alla produzione
    Il dispositivo ad ultrasuoni VialTweeter consente la preparazione simultanea di campioni fino a 10 cuvette nelle stesse condizioni di processo. (Clicca per ingrandire!)

    VialTweeter per la lisi ad ultrasuoni

    Richiesta informazioni





    Omogeneizzatore a ultrasuoni vs altre tecniche di lisi

    Mentre la lisi chimica ed enzimatica può risultare problematica – poiché la lisi chimica può alterare le strutture proteiche e introdurre problemi di purificazione e la lisi enzimatica richiede lunghi tempi di incubazione e non è riproducibile. – l'interruzione ultrasonica è un metodo sofisticato e veloce di interruzione cellulare.
    La lisi a ultrasuoni si basa esclusivamente su forze meccaniche. Non vengono aggiunte sostanze chimiche, la sonicazione rompe la parete cellulare mediante forze di taglio. La lisi chimica può alterare la struttura delle proteine e creare problemi di purificazione. La disgregazione enzimatica richiede lunghi tempi di incubazione e non è riproducibile. L'interruzione cellulare a ultrasuoni delle cellule del batterio E.coli è rapida, semplice, affidabile e riproducibile. Per questo motivo gli ultrasonici Hielscher sono utilizzati nei laboratori biologici e biochimici di tutto il mondo per la preparazione dei campioni, la preanlisi, la diagnostica in vitro e i numerosi saggi.

    Raccomandazioni generali per la lisi a ultrasuoni

    L'sonicazione è la tecnica più diffusa per la lisi di piccole, medie e grandi quantità di sospensioni cellulari. – da pico-litri fino a 100L/ora (utilizzando una cella a flusso ultrasonico). Le cellule sono lisate da taglio liquido e cavitazione. Il DNA viene tosato anche durante la sonicazione, quindi non è necessario aggiungere DNasi alla sospensione cellulare.
     

    Controllo della temperatura durante la lisi ultrasonica di E.coli
    Distruttore cellulare a ultrasuoni UP100H (100W) per la distruzione delle cellule e l'estrazione di composti vegetali.Pre-raffreddando il campione e mantenendo il campione durante la sonicazione su ghiaccio, la degradazione termica del campione può essere facilmente prevenuta.
    Idealmente, i campioni dovrebbero essere mantenuti freddi come il ghiaccio durante la lisi, ma per la maggior parte dei campioni è sufficiente che la temperatura non superi quella della coltura o del tessuto di partenza. Pertanto, si raccomanda di mantenere la sospensione in ghiaccio e di sonicare con brevi impulsi ultrasonici di 5-10 secondi e pause di 10-30 secondi. Durante le pause, il calore può essere dissipato per ristabilire una bassa temperatura. Per campioni cellulari più grandi, sono disponibili vari reattori a cella a flusso con camicie di raffreddamento.
    Leggete qui i consigli e le raccomandazioni dettagliate per una lisi ad ultrasuoni di successo!

    Protocolli per la preparazione a ultrasuoni di lisati di E. Coli

    I ricercatori utilizzano gli omogeneizzatori a ultrasuoni Hielscher per la lisi delle cellule di E. coli. Di seguito sono riportati vari protocolli testati e collaudati per la lisi di E.coli utilizzando gli omogeneizzatori a ultrasuoni Hielscher per varie applicazioni relative all'E.coli.
     

    Questo videoclip mostra l'omogeneizzatore a ultrasuoni UP100H di Hielscher, un apparecchio ad ultrasuoni ampiamente utilizzato per la preparazione dei campioni nei laboratori.

    Omogeneizzatore a ultrasuoni UP100H

    Miniatura del video

    Crescita cellulare, reticolazione e preparazione di estratti cellulari di E. coli con gli ultrasuoni

    Per la polimerasi SeqA e RNA polimerasi ChIP-Chip E. coli MG1655 o MG1655 ΔseqA è stato coltivato a 37°C fino ad una DO600 di circa 0,15 in 50 ml di LB (+ 0,2% di glucosio) prima di aggiungere 27 μl di formaldeide (37%) per ml di terreno (concentrazione finale 1%). Il crosslinking è stato eseguito ad agitazione lenta (100 giri/min.) a temperatura ambiente per 20 minuti e successivamente raffreddato con 10 ml di glicina 2,5 M (concentrazione finale 0,5 M). Per esperimenti di shock termico, l'E. coli MG1655 è stato coltivato in 65 ml di terreno LB a 30°C fino ad una OD600 di circa 0,3. Successivamente, 30 ml di coltura sono stati trasferiti in una fiasca preriscaldata a 43°C e il resto è stato tenuto a 30°C. La reticolazione e il quenching sono avvenuti come descritto sopra, tranne che per il fatto che le cellule sono state mantenute a 30 o 43°C per 5 minuti prima di un ulteriore agitazione lenta a temperatura ambiente. Le cellule sono state raccolte per centrifugazione e lavate due volte con TBS freddo (pH7,5). Dopo la risospensione in 1 ml di tampone di lisi (10 mM Tris (pH 8.0), 20% saccarosio, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mg/ml lisozima) e l'incubazione a 37°C per 30 minuti, seguita dall'aggiunta di 4 ml di tampone IP, le cellule sono state sonicate in ghiaccio con 12 pause di 30 sec e 30 sec utilizzando il processore a ultrasuoni Hielscher UP400St al 100% di potenza. Dopo la centrifugazione per 10 minuti a 9000 g, aliquote da 800 μl del surnatante sono state conservate a -20°C. (Waldminghaus 2010)
     

    Sovrapproduzione e purificazione di enzimi con una sonda a ultrasuoni

    L'Ultrasuonatore UP100H è un omogeneizzatore da laboratorio spesso utilizzato per la preparazione dei campioni delle piastre di coltura cellulare.Per la sovrapproduzione di proteine marcate con decahistidina (His10), E. coli BL21(DE3) è stata trasformata con i costrutti pET19b. Una precultura di una notte è stata raccolta mediante centrifugazione e l'1% è stato utilizzato per inoculare una coltura di espressione. Le cellule portatrici di pET19mgtB sono state coltivate a 22°C fino a raggiungere una densità ottica a 600 nm (OD600) pari a 0,7. La coltura è stata trasferita a 17°C e indotta con 100 μM di IPTG. Dopo 16 ore, la coltura è stata raccolta tramite centrifugazione a 7.500 × g a 4°C. Le cellule sono state risospese in una soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) 50 mM con 0,3 M NaCl a pH 7,4 e disgregate mediante ultrasuoni con un sonotrodo S2 micro-tip all'ultrasuonatore Hielscher UP200St a un ciclo di 0,5 e un'ampiezza del 75%.
    La sovrapproduzione di GtfC marcato con decahistidina è stata indotta a 37°C ad una DO600 di 0,6 con 100 μM IPTG. Le cellule sono state poi incubate per 4 ore, raccolte e lisate come indicato sopra per il MgtB.
    Gli estratti cellulari grezzi sono stati centrifugati a 15.000 × g e a 4°C per sedimentare i detriti cellulari. Gli estratti chiarificati sono stati caricati su colonne HisTrap FF Crude da 1 ml utilizzando un sistema ÄKTAprime Plus. Gli enzimi sono stati purificati secondo il protocollo del produttore per l'eluizione a gradiente delle proteine His-tagged. Le soluzioni proteiche eluite sono state dializzate due volte con 1.000 volumi di PBS 50 mM, pH 7,4, con 0,3 M NaCl a 4 °C. La purificazione è stata analizzata mediante SDS-PAGE al 12%. La concentrazione di proteine è stata determinata con il metodo Bradford utilizzando Roti-Quant. (Rabausch et al. 2013)
     

    Estrazione a ultrasuoni di proteine da batteri di E. coli
    Una proteina di interesse (in questo caso, MTV1 di Arabidopsis thaliana) viene fusa in un tag GST ed espressa in cellule di Escherichia coli (E. coli) BL21.

    1. Prelevare un pellet di GST-MTV1 e GST (corrispondente a 50 ml di coltura batterica) e risospendere ciascuno in 2,5 mL di tampone di estrazione freddo.
    2. Utilizzare un ultrasuonatore UP100H (dotato di microtip-sonotrodo MS3 per piccoli volumi di circa 2-5mL) per disgregare le cellule batteriche fino alla loro lisazione, indicata dalla riduzione dell'opacità e dall'aumento della viscosità. Questa operazione deve essere eseguita con ghiaccio e si raccomanda di sonicare a intervalli (ad es. 10 secondi di sonicazione seguiti da 10 secondi di pausa con ghiaccio e così via). Bisogna fare attenzione a non sonicare con un'intensità troppo elevata. Se si rileva la formazione di schiuma o di un precipitato bianco, è necessario ridurre l'intensità.
    3. Trasferire la soluzione batterica lisata in provette da microcentrifuga da 1,5 mL e centrifugare a 4°C, 16.000 x g per 20 minuti.

     

    Le sonde a ultrasuoni utilizzano le forze della cavitazione acustica per disgregare le cellule ed estrarre molecole e DNA da E.coli.

    Gli ultrasuonatori a sonda, come l'UP400St utilizzano il principio di funzionamento della cavitazione acustica per l'efficiente lisi di E.coli.

    Analisi dell'espressione e purificazione della proteina ricombinante mediante sonicazione

    Il pellet di E. coli è stato sonicato con l'ultrasuonatore Hielscher UP100H. A questo scopo, il pellet cellulare è stato risospeso in un tampone di lisi raffreddato (50 mM Tris-HCl pH=7,5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) e raffreddato in ghiaccio per 10 minuti. Quindi, la sospensione cellulare è stata sonicata con 10 brevi raffiche di 10 s seguite da un intervallo di 30 s per il raffreddamento. Infine, i detriti cellulari sono stati rimossi mediante ultracentrifugazione a 4°C per 15 minuti a 14000 rpm. Per confermare l'espressione di rPR, il surnatante è stato fatto scorrere su gel di poliacrilammide al 12% e analizzato mediante SDS-PAGE e Western blotting. La purificazione di rPR è stata effettuata utilizzando la resina Ni2+-NTA (Invitrogen, USA) secondo la guida del produttore. In questa fase è stato utilizzato il metodo di purificazione nativa. La purezza della proteina purificata è stata valutata mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide al 12% e successiva colorazione con blu di Coomassie. La concentrazione della proteina purificata è stata misurata con il kit Micro BCA protein assay (PIERCE, USA). (Azarnezhad et al. 2016)
     

    Questo video mostra il corno a ultrasuoni da 200 watt per la dispersione, l'omogeneizzazione, l'estrazione o il degassamento di campioni di laboratorio.

    Cuphorn a ultrasuoni (200 Watt)

    Miniatura del video

    Omogeneizzatori a ultrasuoni per la lisi di E. coli

    Hielscher Ultrasonics progetta, produce e fornisce omogeneizzatori a ultrasuoni ad alte prestazioni per la lisi affidabile ed efficiente di batteri E. coli e altri tipi di cellule, tessuti e colture cellulari.
    L'ampia gamma di sonde a ultrasuoni e di sistemi di sonicazione indiretta ci consente di offrire l'omogeneizzatore di tessuti a ultrasuoni ideale per le vostre applicazioni di disgregazione ed estrazione cellulare.

    Progettazione, produzione e consulenza – Qualità Made in Germany

    Gli ultrasuonatori Hielscher possono essere controllati a distanza tramite un controllo via browser. I parametri di sonicazione possono essere monitorati e regolati con precisione in base ai requisiti del processo.Gli ultrasuoni Hielscher sono noti per i loro elevati standard di qualità e progettazione. Il software intelligente, il menu intuitivo, le impostazioni programmabili e il protocollaggio automatico dei dati sono solo alcune delle caratteristiche degli ultrasonori Hielscher. La robustezza e la facilità d'uso consentono un'agevole integrazione dei nostri ultrasonori nelle strutture di ricerca e biotecnologiche. Gli ultrasuonatori Hielscher sono in grado di gestire senza problemi anche le condizioni più difficili e gli ambienti più impegnativi.

    Hielscher Ultrasonics è un'azienda certificata ISO e pone particolare enfasi sugli ultrasuonatori ad alte prestazioni, caratterizzati da tecnologia all'avanguardia e facilità d'uso. Naturalmente, gli ultrasuoni Hielscher sono conformi alla normativa CE e soddisfano i requisiti UL, CSA e RoH.

    La tabella seguente fornisce un'indicazione della capacità di lavorazione approssimativa dei nostri ultrasuoni:

    Volume di batch Portata Dispositivi raccomandati
    piastre multipozzetto / microtitolazione n.a. UIP400MTP
    CupHorn per fiale o becher n.a. CupHorn ad ultrasuoni
    reattore a microflusso a ultrasuoni n.a. GDmini2
    fino a 10 fiale da 0,5 a 1,5 ml n.a. VialTweeter
    0,5-1,5 mL n.a. VialTweeter
    1 - 500mL 10 - 200mL/min UP100H
    10 - 2000mL 20 - 400mL/min UP200Ht, UP400St
    0,1 - 20L 0,2 - 4L/min UIP2000hdT
    10 - 100L 2 - 10L/min UIP4000
    n.a. 10 - 100L/min UIP16000
    n.a. più grande cluster di UIP16000

    Contattaci! / Chiedi a noi!

    Richiedi maggiori informazioni

    Utilizzate il modulo sottostante per richiedere ulteriori informazioni sugli omogeneizzatori di tessuti e i frantumatori di cellule a ultrasuoni, sulle applicazioni di lisi e sui prezzi. Saremo lieti di discutere con voi il vostro processo e di offrirvi un omogeneizzatore a ultrasuoni che soddisfi le vostre esigenze!









    Si prega di notare il nostro informativa sulla privacy.


    Il video mostra il sistema di preparazione del campione ad ultrasuoni UIP400MTP, che permette la preparazione affidabile del campione di qualsiasi piastra standard a più pozzetti utilizzando ultrasuoni ad alta intensità. Le applicazioni tipiche dell'UIP400MTP comprendono la lisi delle cellule, il taglio di DNA, RNA e cromatina e l'estrazione delle proteine.

    Ultrasuonatore UIP400MTP per la sonicazione di piastre a più pozzetti

    Miniatura del video

    Protocolli aggiuntivi per la lisi di E. coli a ultrasuoni

    Proteine modificate con l'allicina in E. coli utilizzando un VialTweeter a ultrasuoni

    VialTweeter al processore a ultrasuoni UP200STDeterminazione del contenuto di sulfidrilico per mezzo di 5,5′-ditiobis(acido 2-nitrobenzoico) (DTNB) Dosaggio
    Una coltura notturna di E. coli MG1655 è stata utilizzata per inoculare il terreno minimo MOPS (1:100). La coltura è stata fatta crescere in modo aerobico fino a raggiungere un A600 di 0,4. La coltura è stata divisa in tre colture da 15 ml per il trattamento di stress. Una coltura non trattata è servita come controllo negativo. A una delle due colture rimanenti sono stati aggiunti 0,79 mM di allicina (128 μg ml-1) o 1 mM di diamide. Le colture sono state incubate per 15 minuti. 5 ml di ciascuna coltura sono stati raccolti mediante centrifugazione (8.525 × g, 4°C, 10 min). Le cellule sono state lavate due volte con 1 ml di PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4, conservato in anaerobiosi prima dell'uso) e centrifugate (13.000 × g, 4°C, 10 min). Le cellule sono state risospese in tampone di lisi (PBS con 6 mM di guanidinio HCl, pH 7,4) prima di essere disgregate a 4°C mediante ultrasuoni (VialTweeter ultrasuoni, Hielscher GmbH, Germania) (3 × 1 min). I detriti cellulari sono stati eliminati mediante centrifugazione (13.000 × g, 4 °C, 15 min). Il surnatante è stato trasferito in una cuvetta QS-macro da 3,5 ml (10 mm) con una barra di agitazione magnetica e miscelato con 1 ml di tampone di lisi. L'estinzione dei campioni è stata monitorata a 412 nm con uno spettrofotometro Jasco V-650 dotato di portacelle a temperatura controllata PSC-718 a temperatura ambiente. Sono stati aggiunti 100μl di una soluzione di acido ditiobis(2-nitrobenzoico) 3 mM. L'estinzione è stata monitorata fino a raggiungere la saturazione. Il calcolo della concentrazione di tiolo è stato eseguito utilizzando il coefficiente di estinzione ϵ412 = 13,700 M-1 cm-1 per l'acido tio-2-nitrobenzoico (TNB). Le concentrazioni cellulari di tiolo sono state calcolate sulla base di un volume di cellule di E. coli di 6,7 × 10-15 litro e una densità cellulare di A600 = 0,5 (equivalente a 1 × 108 cellule ml-1 cultura). (Müller et al. 2016)
     

    Determinazione del glutatione in vivo con un frantumatore di cellule a ultrasuoni

    E.coli MG1655 è stata coltivata in terreno minimo MOPS in un volume totale di 200 ml fino al raggiungimento di un A600 di 0,5. La coltura è stata divisa in colture da 50 ml per il trattamento di stress. Dopo 15 minuti di incubazione con allicina 0,79 mM, diamide 1 mM o dimetilsolfossido (controllo), le cellule sono state raccolte a 4.000g a 4°C per 10 minuti. Le cellule sono state lavate due volte con tampone KPE prima di risospendere il pellet in 700µl di tampone KPE. Per la deproteinizzazione, sono stati aggiunti 300l di acido solfosalicilico al 10% (w/v) prima della rottura delle cellule mediante ultrasuoni (3 x 1 min; VialTweeter ultrasuoni). I surnatanti sono stati raccolti dopo la centrifugazione (30 min, 13.000 g, 4°C). Le concentrazioni di acido solfosalicilico sono state ridotte all'1% con l'aggiunta di 3 volumi di tampone KPE. Le misurazioni del glutatione totale e del GSSG sono state eseguite come sopra descritto. Le concentrazioni cellulari di glutatione sono state calcolate sulla base di un volume di cellule di E. coli del 6,7×10-15 litro e una densità cellulare di A600 0,5 (equivalente a 1×108 cellule ml-1 cultura). Le concentrazioni di GSH sono state calcolate per sottrazione di 2[GSSG] dal glutatione totale. (Müller et al. 2016)

    Espressione di mAspAT umano in E. coli mediante un omogeneizzatore a ultrasuoni

    Interruttore cellulare ad ultrasuoni UP400St (400W) per l'estrazione di materia intracellulare (es. proteine, organelli, DNA, RNA ecc.)La singola colonia di E. coli BL21 (DE3) che ospita il vettore di espressione in 30 mL di Luria-Bertani (LB) mezzo contenente 100μg/mL di ampicillina, e poi coltivata a 37ºC fino alla densità ottica (OD).600) ha raggiunto lo 0,6. Le cellule sono state raccolte mediante centrifugazione a 4.000 × g per 10 minuti e risospese in un terreno fresco LB da 3L contenente 100μg/mL di ampicillina.
    Successivamente, l'espressione proteica è stata indotta con 1 mM di isopropile β-ᴅ-1-tiogalattopiranoside (IPTG) per 20 ore a 16ºC. Le cellule sono state raccolte mediante centrifugazione a 8.000 × g per 15 minuti e lavate con il tampone A (20 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, pH 7,4). Da una coltura di 3 L sono stati ottenuti circa 45 g di cellule (peso umido). Dopo la centrifugazione, il pellet cellulare è stato risospeso in 40 mL (per 1 L di coltura) di tampone di estrazione A ghiacciato e lisato mediante ultrasuoni a temperatura ghiacciata utilizzando il frantumatore cellulare a ultrasuoni Hielscher UP400St. La lisi cellulare è stata centrifugata a 12.000 rpm per 15 minuti per separare le frazioni solubili (surnatante) e precipitate (pellet). (Jiang et al. 2015)
     



    Particolarità / Cose da sapere

    E.coli

    L'Escherichia coli (E. coli) è un batterio gram-negativo, facoltativamente anaerobico, a forma di bastone, del genere Escherichia che si trova comunemente nell'intestino inferiore degli organismi a sangue caldo (endotermidi). Esiste un gran numero di ceppi (o sottotipi) di E. coli con caratteristiche diverse. La maggior parte dei ceppi di E. coli sono innocui per l'uomo, ad esempio i ceppi B e K-12 che sono comunemente usati per applicazioni di ricerca in laboratorio. Tuttavia, alcuni ceppi sono dannosi e possono causare gravi malattie.
    L'E. coli svolge un ruolo importante nella moderna ingegneria biologica e nella microbiologia industriale, poiché i batteri sono facili da manipolare. Applicazioni di laboratorio comuni che spesso comportano l'uso di E. coli, ad esempio per creare acido desossiribonucleico ricombinante (DNA) o per agire come organismo modello.
    L'E. coli è un ospite molto versatile per la produzione di proteine eterologhe e sono disponibili molteplici sistemi di espressione proteica per la produzione di proteine ricombinanti in E. coli. Utilizzando plasmidi che consentono un'elevata espressione proteica, i geni possono essere introdotti nei batteri, il che permette di produrre tali proteine in grandi quantità nei processi di fermentazione industriale.
    Gli E. coli sono utilizzati come fabbriche di cellule per produrre insulina. Altre applicazioni includono l'uso di cellule di E. coli modificate per sviluppare e produrre vaccini ed enzimi immobilizzati, per produrre biocarburanti e per il biorisanamento.
    Il ceppo K-12 è una forma mutante di E. coli che sovraesprime l'enzima Fosfatasi alcalina (ALP). Questa mutazione si verifica a causa di un difetto del gene che codifica costantemente l'enzima. Se un gene produce un prodotto senza alcuna inibizione, questa è nota come attività costitutiva. Questa specifica forma mutante viene utilizzata per l'isolamento e la purificazione dell'enzima ALP.
    Anche i batteri E. coli sono ampiamente usati come fabbriche cellulari. Microbi ingegnerizzati (per esempio, batteri) e cellule vegetali possono essere usati come cosiddette fabbriche cellulari. Queste cellule geneticamente modificate producono molecole, prodotti chimici, polimeri, proteine e altre sostanze, che sono usate per esempio nell'industria farmaceutica, alimentare e chimica. Per rilasciare le molecole prodotte all'interno di tali cellule bioingegnerizzate, la lisi ultrasonica è un metodo comune per rompere le pareti cellulari e trasferire le sostanze target nel liquido circostante. Leggi di più sulla lisi delle cellule bioingegnerizzate!

    Taglio del DNA ad ultrasuoni

    Le forze di taglio ultrasoniche sono un metodo comunemente usato per liberare molecole, organelli e proteine dall'interno della cellula e per rompere i filamenti di DNA in pezzi. La cavitazione acustica rompe le pareti cellulari e le membrane per estrarre il DNA dalle cellule e generare frammenti di circa 600 – 800 bp di lunghezza, ideale per l'analisi.
    Clicca qui per saperne di più sugli omogeneizzatori ad ultrasuoni per la frammentazione del DNA!

    Letteratura / Referenze


    Ultrasuoni ad alte prestazioni! La gamma di prodotti Hielscher copre l'intero spettro dagli ultrasuoni da laboratorio compatti alle unità da banco fino ai sistemi a ultrasuoni industriali completi.

    Hielscher Ultrasonics produce omogeneizzatori a ultrasuoni ad alte prestazioni da laboratorio a dimensione industriale.


    Saremo lieti di discutere il vostro processo.

    Mettiamoci in contatto.