Lisi ultrasonica di E. Coli

• I batteri dell'E. coli sono i batteri più comunemente usati in microbiologia e biotecnologia.
• I distruttori cellulari ad ultrasuoni forniscono risultati affidabili e riproducibili per la lisi dell'E. coli.
• Forze di cavitazione e di taglio intense, ma controllabili con precisione, provocano un'interruzione completa e alti rendimenti di estrazione (ad es. proteine, DNA).

Interruzione cellulare da cavitazione

Gli omogeneizzatori a sonde ad ultrasuoni funzionano con circa 20.000 cicli al secondo (a 20 kHz) e causano cavitazione in liquidi o sovradimensionamenti. Aree microscopiche di cavitazione acustica di pressioni simili al vuoto e alte temperature che lacerano le cellule. Anche se le temperature possono raggiungere diverse migliaia di gradi Celsius, i volumi di cavitazione sono così piccoli che non riscaldano il processo in modo significativo. L'ultrasuono generato cavitazione acustica e le forze di taglio perforano o rompono la membrana cellulare di E.coli – a seconda dell'impostazione del dispositivo dell'omogeneizzatore ad ultrasuoni.

Vantaggi della lisi ultrasonica

• controllo preciso della lisi (intensità, ampiezza, temperatura)
• adattamento ottimale a campioni specifici
• controllo della temperatura
• per campioni da molto piccoli a molto grandi (da µL a litri)
• trattamento meccanico puro
• scale-up lineare dal laboratorio alla produzione

Mentre la lisi chimica ed enzimatica può essere problematica. – poiché la lisi chimica può alterare le strutture proteiche e introdurre problemi di purificazione e la lisi enzimatica richiede lunghi tempi di incubazione e non è riproducibile. – l'interruzione ultrasonica è un metodo sofisticato e veloce di interruzione cellulare.
La lisi ad ultrasuoni si basa esclusivamente su forze meccaniche. Non vengono aggiunte sostanze chimiche, la sonicazione rompe la parete cellulare con forze di taglio. La lisi chimica può alterare la struttura delle proteine e introdurre problemi di purificazione. la perturbazione enzimatica richiede lunghi tempi di incubazione e non è riproducibile.

Raccomandazioni generali

L'sonicazione è la tecnica più diffusa per la lisi di piccole, medie e grandi quantità di sospensioni cellulari. – da pico-litri fino a 100L/ora (utilizzando una cella a flusso ultrasonico). Le cellule sono lisate da taglio liquido e cavitazione. Il DNA viene tosato anche durante la sonicazione, quindi non è necessario aggiungere DNasi alla sospensione cellulare.
Controllo della temperatura:
Pre-raffreddando il campione e mantenendo il campione durante la sonicazione su ghiaccio, la degradazione termica del campione può essere facilmente prevenuta.
Idealmente, i campioni dovrebbero essere mantenuti freddi durante la lisi, ma per la maggior parte dei campioni è sufficiente che la temperatura non superi la temperatura della coltura o della fonte tissutale. Si raccomanda, quindi, di mantenere la sospensione su ghiaccio e di sonicare con diversi brevi impulsi ultrasonici di 5-10 sec. e pause di 10-30 sec. Durante le pause, il calore può dissipare per ristabilire una bassa temperatura. Per campioni di celle più grandi, sono disponibili vari reattori con camicie di raffreddamento.

Protocolli per la preparazione dei lisati di E. Coli

Analisi dell'espressione e purificazione delle proteine ricombinanti

Il pallino di E. coli è stato sonicato con un sistema ad ultrasuoni. UP100H E' stato un piacere conoscerti. A questo scopo, il pellet di cellule è stato risospeso in tampone di lisi raffreddato (50 mM Tris-HCl pH=7.5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) e raffreddato su ghiaccio per 10 min. Poi, la sospensione cellulare è stata sonicizzata con 10 brevi raffiche di 10 s seguite da un intervallo di 30 s per il raffreddamento. Infine, i detriti cellulari sono stati rimossi mediante ultracentrifugazione a 4°C per 15 minuti a 14000 rpm. Per confermare l'espressione di rPR, il surnatante è stato eseguito su gel di poliacrilammide al 12% e analizzato da SDS-PAGE e Western blotting. Purificazione di rPR è stato fatto utilizzando Ni²⁺-Resina NTA (Invitrogen, USA) secondo la guida del produttore. In questa fase è stato utilizzato il metodo di purificazione nativo. La purezza della proteina purificata è stata valutata mediante elettroforesi sul gel di poliacrilammide al 12% e successiva colorazione blu Coomassie. La concentrazione proteica purificata è stata misurata con il kit per il dosaggio delle proteine Micro BCA (PIERCE, USA). (Azarnezhad et al. 2016)

Crescita cellulare, reticolazione e preparazione degli estratti cellulari di E. coli Cell Extracts

Per la polimerasi SeqA e RNA polimerasi ChIP-Chip E. coli MG1655 o MG1655 ΔseqA è stato coltivato a 37°C fino ad una DO₆₀₀ di circa 0,15 in 50 ml di LB (+ 0,2% di glucosio) prima di aggiungere 27 μl di formaldeide (37%) per ml di terreno (concentrazione finale 1%). Il crosslinking è stato eseguito ad agitazione lenta (100 giri/min.) a temperatura ambiente per 20 minuti e successivamente raffreddato con 10 ml di glicina 2,5 M (concentrazione finale 0,5 M). Per esperimenti di shock termico, l'E. coli MG1655 è stato coltivato in 65 ml di terreno LB a 30°C fino ad una OD₆₀₀ di circa 0,3. Successivamente 30 ml di coltura sono stati trasferiti in un pallone pre-riscaldato a 43°C e il resto conservato a 30°C. La reticolazione e il raffreddamento sono stati descritti sopra, tranne che le cellule sono state tenute a 30 o 43°C per 5 minuti prima di un'ulteriore e lenta agitazione a temperatura ambiente. Le cellule sono state raccolte per centrifugazione e lavate due volte con TBS freddo (pH 7,5). Dopo risospensione in 1 ml di tampone di lisi (10 mM Tris (pH 8.0), 20% di saccarosio, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mg/ml di lisozima) e incubazione a 37°C per 30 minuti seguita dall'aggiunta di 4 ml di tampone IP, le cellule sono state sonicate su ghiaccio con 12 volte 30 sec e 30 sec si rompe a una UP400St processore ad ultrasuoni (Hielscher Ultrasonics GmbH) con potenza al 100%. Dopo la centrifugazione per 10 minuti a 9000 g, sono state conservate a -20°C aliquote di 800 μl del surnatante. (Waldminghaus 2010)

Sovrapproduzione e purificazione degli enzimi.

Per la sovrapproduzione di proteine contrassegnate con decahistidina (His10), l'E. coli BL21(DE3) è stato trasformato con costrutti pET19b. Una precoltura notturna è stata raccolta per centrifugazione e l'1% è stato utilizzato per inoculare una coltura di espressione. Le cellule che trasportano pET19mgtB sono state coltivate a 22°C fino ad una densità ottica a 600 nm (OD₆₀₀) di 0,7. La coltura è stata trasferita a 17°C e indotta da 100 μM IPTG. Dopo 16 ore, la coltura è stata raccolta per centrifugazione a 7.500 × g a 4°C. Cellule sono stati risospesi in 50 mM fosfato tamponato salina (PBS) con 0,3 M NaCl a pH 7,4 e interrotto da ultrasuoni con un S2 micropunta sonotrodo al UP200St ultrasuoni (Hielscher, Teltow, Germania) ad un ciclo di 0,5 e un'ampiezza del 75%.
La sovrapproduzione di GtfC marcato con decahistidina è stata indotta a 37°C ad una DO₆₀₀ di 0,6 con 100 μM IPTG. Le cellule sono state poi incubate per 4 ore, raccolte e lisate come indicato sopra per il MgtB.
Gli estratti cellulari grezzi sono stati centrifugati a 15.000 × g e 4°C per sedimentare i detriti cellulari. Gli estratti chiarificati sono stati caricati su colonne da 1 ml di HisTrap FF Crude con un sistema ÄKTAprime Plus (GE Healthcare). Gli enzimi sono stati purificati secondo il protocollo del produttore per l'eluizione del gradiente delle sue proteine contrassegnate. Le soluzioni proteiche elusive sono state dializzate due volte contro 1.000 volumi di 50 mM PBS, pH 7.4, con 0.3 M NaCl a 4°C. La purificazione è stata analizzata al 12% di SDS-PAGE. La concentrazione di proteine è stata determinata con il metodo Bradford utilizzando Roti-Quant (Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germania). (Rabausch et al. 2013)

Estrazione di proteine dai batteri di E. coli
Una proteina di interesse (in questo caso, MTV1 di Arabidopsis thaliana) viene fusa in un tag GST ed espressa in cellule di Escherichia coli (E. coli) BL21.
1. Prendere un pellet di GST-MTV1 e GST (corrispondente a 50 ml di coltura batterica) e risospendere ciascuno in 2,5 ml di tampone di estrazione a freddo.
2. Utilizzare un ultrasuoni UP100H (dotato di MS3 microtip-sonotrodo per piccoli volumi (2-5mL)) per distruggere le cellule batteriche fino alla lisi, che è indicata dalla ridotta opacità e dall'aumento della viscosità. Questo deve essere eseguito su ghiaccio, e si raccomanda di sonicare a intervalli di tempo (es. 10 secondi di sonicazione seguiti da 10 secondi su ghiaccio e così via). Bisogna fare attenzione a non sonicare con intensità troppo elevata. Se si rileva la formazione di schiuma o la formazione di un precipitato bianco, l'intensità deve essere abbassata.
3. Trasferire la soluzione batterica lisata in provette per microcentrifuga da 1,5 ml e centrifugare a 4°C, 16.000 x g per 20 min.

Proteine modificate allicina in E. coli

Determinazione del contenuto di sulfidrilico per mezzo di 5,5′-ditiobis(acido 2-nitrobenzoico) (DTNB) Dosaggio
Una coltura notturna E. coli MG1655 è stata utilizzata per inoculare MOPS minimum medium (1:100). La coltura è stata coltivata aerobicamente fino a raggiungere un A600 di 0,4. La cultura è stata divisa in tre culture da 15 ml per il trattamento dello stress. Una cultura non trattata è servita come controllo negativo. 0,79 mM allicina (128 μg ml^-1) o 1 mM diamide è stato aggiunto ad una delle due colture rimanenti. Le colture sono state incubate per 15 min. 5 ml di ciascuna coltura sono stati raccolti per centrifugazione (8,525 × g, 4°C, 10 min). Le cellule sono state lavate due volte con 1 ml di PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 2 mM KH₂PO₄pH 7,4, conservato in condizioni anaerobiche prima dell'uso) e centrifugato (13.000 × g, 4°C, 10 min). Le cellule sono state risospese in tampone di lisi (PBS con 6 mM guanidinio HCl, pH 7.4) prima della rottura a 4°C per ultrasuoni (VialTweeter ultrasuoni, Hielscher GmbH, Germania) (3 × 1 min). I detriti cellulari sono stati pellettizzati mediante centrifugazione (13.000 × g, 4 °C, 15 min). Il surnatante è stato trasferito in una cuvetta QS-macro da 3,5 ml (10 mm) con barra di agitazione magnetica e miscelato con 1 ml di tampone di lisi. L'estinzione dei campioni è stata monitorata a 412 nm con uno spettrofotometro Jasco V-650 equipaggiato con il supporto cella a temperatura controllata PSC-718 (Jasco) a temperatura ambiente. Sono stati aggiunti 100 μl di una soluzione di ditiobis(acido 2-nitrobenzoico) di 3 mM. L'estinzione è stata monitorata fino al raggiungimento della saturazione. Il calcolo della concentrazione di tiolo è stato effettuato utilizzando il coefficiente di estinzione ϵ₄₁₂ = 13,700 M^-1 cm^-1 per l'acido tio-2-nitrobenzoico (TNB). Le concentrazioni cellulari di tiolo sono state calcolate sulla base di un volume di cellule di E. coli di 6,7 × 10^-15 litro e una densità cellulare di A₆₀₀ = 0,5 (equivalente a 1 × 10⁸ cellule ml^-1 cultura). (Müller et al. 2016)

Determinazione del glutatione in vivo

E.coli MG1655 è stato coltivato in MOPS mezzo minimo in un volume totale di 200 ml fino a quando un A₆₀₀ di 0,5 è stato raggiunto. La cultura è stata divisa in culture da 50 ml per il trattamento dello stress. Dopo 15 minuti di incubazione con 0,79 mM allicina, 1 mM diamide, o dimetil solfossido (controllo), le cellule sono state raccolte a 4.000 g a 4°C per 10 min. Le cellule sono state lavate due volte con tampone KPE prima della risospensione dei pellet in 700 µl di tampone KPE. Per la deproteinizzazione, 300l di acido solfosalicilico al 10% (w/v) sono stati aggiunti prima della rottura delle cellule mediante ultrasuoni (3 x 1 min; VialTweeter ultrasuoni). I surnatanti sono stati raccolti dopo la centrifugazione (30 min, 13.000 g, 4°C). Le concentrazioni di acido solfosalicilico sono state ridotte all'1% con l'aggiunta di 3 volumi di tampone KPE. Le misurazioni del glutatione totale e del GSSG sono state eseguite come sopra descritto. Le concentrazioni cellulari di glutatione sono state calcolate sulla base di un volume di cellule di E. coli del 6,7×10^-15 litro e una densità cellulare di A₆₀₀ 0.5 (equivalente a 1×10⁸ cellule ml^-1 cultura). Le concentrazioni di GSH sono state calcolate per sottrazione di 2[GSSG] dal glutatione totale. (Müller et al. 2016)

Espressione di mAspAT umano in E. coli

La singola colonia di E. coli BL21 (DE3) che ospita il vettore di espressione in 30 mL di Luria-Bertani (LB) mezzo contenente 100μg/mL di ampicillina, e poi coltivata a 37ºC fino alla densità ottica (OD).₆₀₀) ha raggiunto lo 0,6. Le cellule sono state raccolte mediante centrifugazione a 4.000 × g per 10 minuti e risospese in un terreno fresco LB da 3L contenente 100μg/mL di ampicillina.
Successivamente, l'espressione proteica è stata indotta con 1 mM isopropil β-ᴅ-1-tiogalattopiranoside (IPTG) per 20 ore a 16ºC. Le cellule sono state raccolte mediante centrifugazione a 8.000 × g per 15 minuti e lavate con tampone A (20 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, pH 7,4). Circa 45 g di cellule (peso umido) sono state ottenute da 3 L di coltura. Dopo la centrifugazione, il pellet cellulare è stato risospeso in 40 mL (per 1 L di coltura) tampone di estrazione a freddo A, e lisato per ultrasuoni a temperatura fredda come da UP400St (Dr. Hielscher GmbH, Germania). La lisi cellulare è stata centrifugata a 12.000 rpm per 15 minuti per separare le frazioni solubili (surnatante) e precipitate (pellet). (Jiang et al. 2015)

La tabella seguente fornisce un'indicazione della capacità di lavorazione approssimativa dei nostri ultrasuoni: