Lisi a ultrasuoni di cellule bioingegnerizzate nella produzione industriale

Specie batteriche bioingegnerizzate come E. coli, così come tipi di cellule di mammifero e vegetali geneticamente modificati, sono ampiamente utilizzati nelle biotecnologie per esprimere molecole. Per rilasciare queste biomolecole sintetizzate, è necessaria una tecnica affidabile di disgregazione cellulare. La sonicazione ad alte prestazioni è un metodo comprovato per una lisi cellulare efficiente e affidabile – facilmente scalabile a elevate capacità di trattamento. Hielscher Ultrasonics offre apparecchiature a ultrasuoni ad alte prestazioni per una lisi cellulare efficace, al fine di produrre grandi volumi di biomolecole di alta qualità.

Estrazione di molecole dalle fabbriche cellulari

Per la produzione di un’ampia gamma di biomolecole, diversi microrganismi ingegnerizzati e cellule vegetali possono essere utilizzati come fabbriche cellulari microbiche, tra cui Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Streptomyces, Corynebacterium glutamicum, Lactococcus lacti, Cyanobacteria, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Nicotiana benthamiana e alghe, oltre a molti altri. Queste fabbriche cellulari possono produrre proteine, lipidi, composti biochimici, polimeri, biocarburanti e prodotti oleochimici, utilizzati come alimenti o materie prime per applicazioni industriali. Le cellule utilizzate come fabbriche cellulari vengono coltivate in bioreattori chiusi, dove possono raggiungere un’elevata efficienza e specificità con un basso fabbisogno energetico.
Per isolare le molecole bersaglio dalle colture cellulari bioingegnerizzate, le cellule devono essere disgregate affinché il materiale intracellulare venga rilasciato. I disgregatori cellulari a ultrasuoni rappresentano una tecnica consolidata, altamente affidabile ed efficiente per la disgregazione cellulare e il rilascio dei composti.

Le fabbriche cellulari microbiche sono cellule ingegnerizzate a livello metabolico utilizzate per la sintesi di diversi composti di valore. La disgregazione cellulare a ultrasuoni è un metodo efficiente e affidabile per rilasciare i composti di valore dall’interno delle cellule.
studio e grafico: ©Villaverde, 2010.

Vantaggi dei disgregatori cellulari a ultrasuoni

Essendo una tecnologia non termica, delicata e al contempo altamente efficiente, i disgregatori a ultrasuoni vengono utilizzati in laboratorio e nell’industria per lisare le cellule e produrre estratti di alta qualità, impiegati ad esempio per isolare molecole dalle fabbriche cellulari.

Ultrasuoni di potenza per la disgregazione efficiente delle fabbriche cellulari microbiche

Meccanismo ed effetti dei disgregatori cellulari a ultrasuoni:
La disgregazione cellulare a ultrasuoni sfrutta la potenza delle onde ultrasoniche. L’omogeneizzatore a ultrasuoni / disgregatore cellulare è dotato di una sonda (detta anche sonotrodo) in lega di titanio che oscilla a una frequenza elevata di circa 20 kHz. Ciò significa che la sonda a ultrasuoni accoppia 20.000 vibrazioni al secondo al liquido sottoposto a sonicazione. Le onde ultrasoniche accoppiate al liquido sono caratterizzate da cicli alternati di alta pressione / bassa pressione. Durante un ciclo di bassa pressione, il liquido si espande e si formano minuscole bolle di vuoto. Queste piccolissime bolle crescono nel corso di diversi cicli alternati di pressione, finché non possono più assorbire energia. A questo punto, le bolle di cavitazione implodono violentemente e creano localmente un ambiente con una straordinaria densità energetica. Questo fenomeno è noto come cavitazione acustica ed è caratterizzato localmente da temperature molto elevate, pressioni molto elevate e forze di taglio. Questi sforzi di taglio rompono efficacemente le pareti cellulari e aumentano il trasferimento di massa tra l’interno della cellula e il solvente circostante. Essendo una tecnica puramente meccanica, l’impiego delle forze di taglio generate dagli ultrasuoni è ampiamente diffuso e costituisce la procedura raccomandata per la disgregazione delle cellule batteriche e per l’isolamento delle proteine. Come metodo semplice e rapido di disgregazione cellulare, la sonicazione è ideale per l’isolamento da volumi piccoli, medi e grandi. I sonicatori digitali Hielscher sono dotati di un menu di impostazioni chiaro per un controllo preciso della sonicazione. Tutti i dati di sonicazione vengono memorizzati automaticamente su una scheda SD integrata e sono facilmente accessibili. Durante il processo di disgregazione a ultrasuoni, opzioni sofisticate di dissipazione del calore, come il raffreddamento esterno, la sonicazione in modalità pulsata ecc., garantiscono il mantenimento della temperatura ideale del processo e quindi l’integrità dei composti termosensibili estratti.

La ricerca evidenzia i punti di forza della disgregazione cellulare e dell’estrazione a ultrasuoni

Il prof. Chemat et al. (2017) riassumono nel loro studio che “l’estrazione assistita da ultrasuoni è un’alternativa ecologica ed economicamente sostenibile alle tecniche convenzionali per alimenti e prodotti naturali. I principali vantaggi sono la riduzione dei tempi di estrazione e trattamento, della quantità di energia e solventi utilizzati, delle operazioni unitarie e delle emissioni di CO₂ .”
Gabig-Ciminska et al. (2014) hanno utilizzato nel loro studio un omogeneizzatore ad alta pressione e un disgregatore cellulare a ultrasuoni per la lisi delle spore al fine di rilasciare il DNA. Confrontando entrambi i metodi di disgregazione cellulare, il gruppo di ricerca conclude che, per quanto riguarda la lisi cellulare per ottenere il DNA delle spore, “l’analisi è stata eseguita utilizzando lisati cellulari ottenuti mediante omogeneizzazione ad alta pressione. Successivamente, ci siamo resi conto che la disgregazione cellulare a ultrasuoni presenta vantaggi eccezionali per questo scopo. È piuttosto rapida e può essere effettuata su piccoli volumi di campione.” (Gabig-Ciminska et al., 2014)

Biomolecole dalle fabbriche cellulari per la produzione alimentare

Le fabbriche cellulari microbiche costituiscono una metodologia produttiva praticabile ed efficiente che utilizza organismi microbici per produrre elevate quantità di metaboliti nativi e non nativi mediante la bioingegneria metabolica di microrganismi quali batteri, lieviti, funghi ecc. Gli enzimi prodotti su larga scala vengono ad esempio ottenuti utilizzando microrganismi come Aspergillus oryzae, funghi e batteri. Questi enzimi vengono utilizzati nella produzione di alimenti e bevande, nonché in agricoltura, nella bioenergia e nella cura della casa.
Alcuni batteri, come Acetobacter xylinum e Gluconacetobacter xylinus, producono cellulosa durante il processo di fermentazione, nel quale le nanofibre vengono sintetizzate mediante un processo dal basso verso l’alto. La cellulosa batterica (nota anche come cellulosa microbica) è chimicamente equivalente alla cellulosa vegetale, ma presenta un elevato grado di cristallinità e un’elevata purezza (è priva di lignina, emicellulosa, pectina e altri componenti biogeni), oltre a una struttura unica costituita da una rete reticolata tridimensionale (3D) di nanofibre di cellulosa intrecciate. (cfr. Zhong, 2020) Rispetto alla cellulosa di origine vegetale, la cellulosa batterica è più sostenibile e la cellulosa prodotta è pura e non richiede complesse fasi di purificazione. La sonicazione e l’estrazione con solvente utilizzando NaOH o SDS (sodio dodecil solfato) sono molto efficaci per isolare la cellulosa batterica dalle cellule batteriche.

Biomolecole dalle fabbriche cellulari per la produzione di farmaci e vaccini

Uno dei prodotti farmaceutici più importanti derivati dalle fabbriche cellulari è l’insulina umana. Per la produzione di insulina mediante bioingegneria vengono utilizzati prevalentemente E. coli e Saccharomyces cerevisiae. Poiché le molecole biosintetizzate di dimensioni nanometriche offrono un’elevata biocompatibilità, le nanoparticelle biologiche come la ferritina sono vantaggiose per numerose applicazioni di bioproduzione. Inoltre, la produzione mediante microrganismi ingegnerizzati a livello metabolico è spesso significativamente più efficace in termini di rese ottenute. Ad esempio, la produzione di acido artemisinico, resveratrolo e licopene è aumentata da dieci a diverse centinaia di volte ed è già consolidata o in fase di sviluppo per la produzione su scala industriale. (cfr. Liu et al.; Microb. Cell Fact. 2017)
Ad esempio, le biomolecole proteiche di dimensioni nanometriche con proprietà di autoassemblaggio, come la ferritina e le particelle simil-virali, sono particolarmente interessanti per lo sviluppo di vaccini, poiché imitano sia le dimensioni sia la struttura dei patogeni e si prestano alla coniugazione superficiale di antigeni per favorire l’interazione con le cellule immunitarie. Queste molecole vengono espresse nelle cosiddette fabbriche cellulari (ad esempio ceppi ingegnerizzati di E. coli), che producono una determinata molecola bersaglio.

Protocollo per la lisi a ultrasuoni di E. coli BL21 per il rilascio della ferritina

La ferritina è una proteina la cui funzione principale è l’immagazzinamento del ferro. La ferritina mostra potenzialità promettenti sotto forma di nanoparticelle autoassemblanti nei vaccini, nei quali viene utilizzata come veicolo di somministrazione vaccinale (ad esempio per le proteine spike di SARS-Cov-2). La ricerca scientifica di Sun et al. (2016) mostra che la ferritina ricombinante può essere rilasciata in forma solubile da Escherichia coli a basse concentrazioni di NaCl (≤50 mmol/L). Per esprimere la ferritina in E. coli BL21 e rilasciarla, è stato applicato con successo il seguente protocollo. Il plasmide ricombinante pET-28a/ferritin è stato introdotto mediante trasformazione nel ceppo E coli BL21 (DE3). Le cellule E coli BL21 (DE3) produttrici di ferritina sono state coltivate in terreni di crescita LB con 0,5% di kanamicina a 37°C e indotte a un’OD600 di 0,6 con 0,4% di isopropil-β-D-tiogalattopiranoside per 3 ore a 37°C. La coltura finale è stata quindi raccolta mediante centrifugazione a 8000g per 10 minuti a 4°C e il pellet è stato recuperato. Il pellet è stato poi risospeso rispettivamente in terreno LB (1% NaCl, 1% Typone, 0,5% estratto di lievito)/tampone di lisi (20 mmol/L Tris, 50 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, pH 7,6) e in soluzioni di NaCl a diverse concentrazioni (0, 50, 100, 170 e 300 mmol/L). Per la lisi delle cellule batteriche, è stata applicata la sonicazione in modalità pulsata: ad esempio, utilizzando il sonicatore UP400St al 100% di ampiezza con un ciclo di lavoro di 5 secondi ON, 10 secondi OFF, per 40 cicli), seguita da centrifugazione a 10 000g per 15 minuti a 4°C. Il surnatante e il precipitato sono stati analizzati mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide con sodio dodecil solfato (SDS-PAGE). Tutti i gel colorati con sodio dodecil solfato sono stati acquisiti con uno scanner ad alta risoluzione. Le immagini dei gel sono state analizzate utilizzando il software Magic Chemi 1D. Per una chiarezza ottimale, le bande proteiche sono state rilevate regolando i parametri. I dati relativi alle bande sono stati generati da triplicati tecnici. (cfr. Sun et al., 2016)

Disgregatori cellulari a ultrasuoni per la lisi industriale delle fabbriche cellulari

La lisi e l’estrazione a ultrasuoni costituiscono un metodo affidabile e pratico per rilasciare metaboliti dalle fabbriche cellulari, contribuendo così a una produzione efficace delle molecole bersaglio. I disgregatori cellulari a ultrasuoni sono disponibili in dimensioni da laboratorio fino a quelle industriali e i processi possono essere scalati in modo completamente lineare.
Hielscher Ultrasonics è il vostro partner competente per disgregatori a ultrasuoni ad alte prestazioni e vanta una lunga esperienza nell’implementazione di sistemi a ultrasuoni in configurazioni da banco e industriali.
Per quanto riguarda hardware e software sofisticati, i sistemi di disgregazione cellulare Hielscher Ultrasonics soddisfano tutti i requisiti per un controllo ottimale del processo, un funzionamento semplice e la facilità d’uso. I clienti e gli utilizzatori dei sonicatori Hielscher apprezzano il vantaggio offerto dai disgregatori cellulari e dagli estrattori a ultrasuoni Hielscher, che consentono un monitoraggio e un controllo precisi del processo – tramite display digitale touch e controllo remoto via browser. Tutti i dati importanti della sonicazione (ad esempio energia netta, energia totale, ampiezza, durata, temperatura, pressione) vengono memorizzati automaticamente come file CSV su una scheda SD integrata. Questo aiuta a ottenere risultati riproducibili e ripetibili e facilita la standardizzazione del processo e il rispetto delle buone pratiche di fabbricazione (cGMP).
Naturalmente, i processori a ultrasuoni Hielscher sono progettati per funzionare 24/7 a pieno carico e possono quindi essere utilizzati in modo affidabile negli ambienti di produzione industriale. Grazie all’elevata robustezza e alla ridotta manutenzione, i tempi di fermo delle apparecchiature a ultrasuoni sono molto brevi. Le funzioni CIP (pulizia in loco) e SIP (sterilizzazione in loco) riducono al minimo le operazioni di pulizia laboriose, soprattutto perché tutte le parti a contatto con il liquido presentano superfici metalliche lisce (senza orifizi o ugelli nascosti).

La tabella seguente fornisce un’indicazione della capacità di trattamento approssimativa dei nostri sonicatori: