Le specie di batteri bioingegnerizzati come l'E. coli, così come i tipi di cellule di mammiferi e di piante geneticamente modificate, sono ampiamente utilizzate nelle biotecnologie per esprimere molecole. Al fine di rilasciare queste biomolecole sintetizzate, è necessaria una tecnica affidabile di distruzione delle cellule. L'ultrasuonazione ad alte prestazioni è un metodo collaudato per una lisi cellulare efficiente e affidabile – facilmente scalabile per grandi produzioni. Hielscher Ultrasonics vi offre attrezzature a ultrasuoni ad alte prestazioni per una lisi cellulare efficace al fine di produrre grandi volumi di biomolecole di alta qualità.

Estrazione di molecole dalle fabbriche di cellule

Per la produzione di una vasta gamma di biomolecole, vari microbi ingegnerizzati e cellule vegetali possono essere utilizzati come fabbriche cellulari microbiche, tra cui Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Streptomyces, Corynebacterium glutamicum, Lactococcus lacti, Cyanobacteria, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Nicotiana benthamiana e alghe, tra molti altri. Queste fabbriche cellulari possono produrre proteine, lipidi, prodotti biochimici, polimeri, biocarburanti e prodotti oleochimici, che vengono utilizzati come cibo o materia prima per applicazioni industriali. Le cellule utilizzate come fabbriche cellulari sono coltivate in bioreattori chiusi, dove possono raggiungere un'alta efficienza, specificità e bassi requisiti energetici.
Per isolare le molecole target dalle colture cellulari bioingegnerizzate, le cellule devono essere disgregate in modo che il materiale intracellulare venga rilasciato. I distruttori cellulari a ultrasuoni sono ben consolidati come tecnica altamente affidabile ed efficiente per la disintegrazione delle cellule e il rilascio del composto.

Le fabbriche di cellule microbiche sono cellule metabolicamente ingegnerizzate utilizzate per la sintesi di vari composti di valore. La distruzione cellulare a ultrasuoni è un metodo efficiente e affidabile per rilasciare i composti di valore dall'interno delle cellule.
studio e grafica: ©Villaverde, 2010.

Vantaggi dei distruttori cellulari a ultrasuoni

Essendo una tecnologia non termica, delicata, ma altamente efficiente, i distruttori a ultrasuoni sono utilizzati in laboratorio e nell'industria per lisare le cellule e produrre estratti di alta qualità, ad esempio utilizzati per l'isolamento di molecole dalle fabbriche di cellule.

Power-Ultrasound per la distruzione efficiente delle fabbriche di cellule microbiche

Meccanismo ed effetti dei distruttori cellulari a ultrasuoni:
La distruzione cellulare a ultrasuoni utilizza la potenza delle onde ultrasoniche. L'omogeneizzatore/disgregatore cellulare a ultrasuoni è dotato di una sonda (alias sonotrodo) in lega di titanio che oscilla a un'alta frequenza di circa 20 kHz. Ciò significa che la sonda ultrasonica accoppia 20.000 vibrazioni al secondo nel liquido sonicato. Le onde ultrasoniche accoppiate nel liquido sono caratterizzate da cicli alternati di alta pressione / bassa pressione. Durante un ciclo di bassa pressione, il liquido si espande e si formano piccole bolle di vuoto. Queste piccolissime bolle crescono per diversi cicli di pressione alternati fino a quando non possono più assorbire energia. A questo punto, le bolle di cavitazione implodono violentemente e creano localmente un ambiente straordinariamente denso di energia. Questo fenomeno è noto come cavitazione acustica ed è caratterizzato da temperature localmente molto alte, pressioni molto elevate e forze di taglio. Queste sollecitazioni di taglio rompono in modo efficiente le pareti delle cellule e aumentano il trasferimento di massa tra l'interno delle cellule e il solvente circostante. Come tecnica puramente meccanica, le forze di taglio generate dagli ultrasuoni sono ampiamente utilizzate e la procedura raccomandata per la distruzione delle cellule batteriche, così come per l'isolamento delle proteine. Come metodo di rottura cellulare semplice e rapido, la sonicazione è ideale per l'isolamento di volumi di piccole, medie e grandi dimensioni. Gli ultrasuonatori digitali della Hielscher sono dotati di un chiaro menu di impostazioni per un controllo preciso della sonicazione. Tutti i dati di sonicazione sono memorizzati automaticamente su una scheda SD integrata e sono facilmente accessibili. Sofisticate opzioni di dissipazione del calore come il raffreddamento esterno, la sonicazione in modalità puls, ecc. durante il processo di disintegrazione a ultrasuoni assicurano il mantenimento della temperatura ideale del processo e quindi l'integrità dei composti termosensibili estratti.

La ricerca sottolinea i punti di forza della distruzione ed estrazione cellulare a ultrasuoni

Il Prof. Chemat et al. (2017) riprende nel loro studio che "l'estrazione assistita da ultrasuoni è un'alternativa verde ed economicamente valida alle tecniche convenzionali per i prodotti alimentari e naturali. I principali vantaggi sono la diminuzione del tempo di estrazione e di lavorazione, la quantità di energia e di solventi utilizzati, le operazioni unitarie e le emissioni di CO₂ ".
Gabig-Ciminska et al. (2014) hanno utilizzato un omogeneizzatore ad alta pressione e un dsintegratore cellulare ad ultrasuoni nel loro studio per la lisi delle spore al fine di rilasciare il DNA. Confrontando entrambi i metodi di distruzione cellulare, il team di ricerca conclude che per quanto riguarda la lisi cellulare per il DNA delle spore, "l'analisi è stata fatta utilizzando lisati cellulari dall'omogeneizzazione ad alta pressione. In seguito, ci siamo resi conto che una rottura cellulare ad ultrasuoni ha vantaggi eccezionali per questo scopo. È piuttosto veloce e può essere elaborato per piccoli volumi di campione." (Gabig-Ciminska et al., 2014)

Biomolecole dalle fabbriche di cellule per la produzione alimentare

Le fabbriche di cellule microbiche sono una metodologia di produzione praticabile ed efficiente che utilizza organismi microbici per produrre alti rendimenti di metaboliti nativi e non nativi attraverso la bioingegneria metabolica di microrganismi microbici come batteri, lieviti, funghi ecc. Gli enzimi sfusi sono per esempio prodotti usando microrganismi come Aspergillus oryzae, funghi e batteri. Questi enzimi sfusi sono utilizzati per la produzione di alimenti e bevande, così come in agricoltura, bioenergia e cura della casa.
Alcuni batteri come Acetobacter xylinum e Gluconacetobacter xylinus producono cellulosa durante il processo di fermentazione, dove le nanofibre sono sintetizzate in un processo bottom-up. La cellulosa batterica (conosciuta anche come cellulosa microbica) è chimicamente equivalente alla cellulosa vegetale, ma ha un alto grado di cristallinità e un'elevata purezza (priva di lignina, emicellulosa, pectina e altri componenti biogenici), nonché una struttura unica di rete tridimensionale (3D) reticolata di nanofibre di cellulosa. (cfr. Zhong, 2020) Rispetto alla cellulosa di origine vegetale, la cellulosa batterica è più sostenibile e la cellulosa prodotta è pura e non richiede complesse fasi di purificazione. L'ultrasuonazione e l'estrazione con solvente usando NaOH o SDS (sodio dodecil solfato) sono molto efficaci per l'isolamento della cellulosa batterica dalle cellule batteriche.

Biomolecole dalle fabbriche di cellule per la produzione di farmaci e vaccini

Uno dei prodotti farmaceutici più importanti derivati da fabbriche di cellule è l'insulina umana. Per la produzione di insulina bioingegnerizzata, vengono utilizzati prevalentemente E. coli e Saccharomyces cerevisiae. Poiché le molecole di dimensioni nano bio-sintetizzate offrono un'elevata biocompatibilità, le nanoparticelle biologiche come la ferritina sono vantaggiose per numerose applicazioni di bioproduzione. Inoltre, la produzione in microbi ingegnerizzati metabolicamente è spesso significativamente più efficace nelle rese ottenute. Per esempio, la produzione di acido artemisinico, resveratrolo e licopene è aumentata da dieci a diverse centinaia di volte, ed è già stabilita o è in sviluppo per la produzione su scala industriale. (cfr. Liu et al.; Microb. Cell Fact. 2017)
Per esempio, le biomolecole di dimensioni nano basate sulle proteine con proprietà auto-assemblanti come la ferritina e le particelle simili ai virus sono particolarmente interessanti per lo sviluppo del vaccino, poiché imitano sia la dimensione che la struttura degli agenti patogeni e sono adatte alla coniugazione superficiale degli antigeni per promuovere l'interazione con le cellule immunitarie. Tali molecole sono espresse nelle cosiddette fabbriche di cellule (per esempio, ceppi di E. coli ingegnerizzati), che producono una certa molecola target.

Protocollo per la lisi ad ultrasuoni e di E. coli BL21 per il rilascio di ferritina

La ferritina è una proteina la cui funzione primaria è l'immagazzinamento del ferro. La ferritina mostra capacità promettenti come nanoparticelle auto-assemblanti nei vaccini, dove è usata come veicolo di consegna del vaccino (per esempio le proteine spike della SARS-Cov-2). La ricerca scientifica di Sun et. al. (2016) mostra che la ferritina ricombinante può essere rilasciata come forma solubile da Escherichia coli a basse concentrazioni di NaCl (≤50 mmol/L). Per esprimere la ferritina in E. coli BL21 e rilasciare la ferritina, è stato applicato con successo il seguente protocollo. Il plasmide ricombinante pET-28a/ferritina è stato trasformato nel ceppo E coli BL21 (DE3). Le cellule di E coli BL21 (DE3) con ferritina sono state coltivate in mezzi di crescita LB con lo 0,5% di kanamicina a 37°C e indotte a una OD600 di 0,6 con lo 0,4% di isopropil-β-D-tiogalattopiranoside per 3 ore a 37°C. La cultura finale è stata poi raccolta mediante centrifugazione a 8000g per 10 minuti a 4°C, e il pellet è stato raccolto. Poi, il pellet è stato risospeso in mezzo LB (1% NaCl, 1% Typone, 0,5% estratto di lievito)/tampone di lisi (20 mmol/L Tris, 50 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, pH 7.6) e diverse concentrazioni di soluzione NaCl (0, 50, 100, 170, e 300 mmol/L), rispettivamente. Per la lisi delle cellule batteriche, la sonicazione è stata applicata in modalità a impulsi: ad es. ultrasuonatore UP400St al 100% di ampiezza con un duty cycle di 5 secondi ON, 10 secondi OFF, per 40 cicli) e poi centrifugato a 10 000g per 15 minuti a 4°C. Il surnatante e il precipitato sono stati analizzati mediante elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato di poliacrilammide (SDS-PAGE). Tutti i gel colorati con dodecilsolfato di sodio sono stati scansionati con uno scanner ad alta risoluzione. Le immagini del gel sono state analizzate utilizzando il software Magic Chemi 1D. Per una chiarezza ottimale, le bande proteiche sono state rilevate regolando i parametri. I dati delle bande sono stati generati da triplicati tecnici. (cfr. Sun et al., 2016)

Distruttori cellulari a ultrasuoni per la lisi industriale delle fabbriche di cellule

La lisi e l'estrazione a ultrasuoni è un metodo affidabile e comodo per rilasciare i metaboliti dalle fabbriche di cellule, favorendo così una produzione efficace di molecole target. I distruttori cellulari a ultrasuoni sono disponibili dal laboratorio alle dimensioni industriali e i processi possono essere scalati in modo completamente lineare.
Hielscher Ultrasonics è il vostro partner competente per i disgregatori a ultrasuoni ad alte prestazioni e ha una lunga esperienza nel campo dell'impianto di sistemi a ultrasuoni in ambienti da banco e industriali.
Quando si tratta di hardware e software sofisticati, i sistemi di distruzione delle celle Hielscher Ultrasonics soddisfano tutti i requisiti per un controllo ottimale del processo, un funzionamento semplice e la facilità d'uso. I clienti e gli utenti degli ultrasuoni Hielscher apprezzano il vantaggio che i distruttori ed estrattori di cellule ad ultrasuoni Hielscher consentono il monitoraggio e il controllo preciso del processo – tramite un display digitale a sfioramento e un controllo remoto tramite browser. Tutti i dati di sonicazione importanti (per esempio energia netta, energia totale, ampiezza, durata, temperatura, pressione) sono memorizzati automaticamente come file CSV su una scheda SD integrata. Questo aiuta a ottenere risultati riproducibili e ripetibili e facilita la standardizzazione del processo e l'adempimento delle buone pratiche di produzione (cGMP).
Naturalmente, i processori a ultrasuoni Hielscher sono costruiti per un funzionamento 24 ore su 24, 7 giorni su 7, a pieno carico e possono quindi essere utilizzati in modo affidabile in ambienti di produzione industriale. Grazie all'elevata robustezza e alla bassa manutenzione, il tempo di inattività delle apparecchiature a ultrasuoni è davvero basso. Le funzioni CIP (clean-in-place) e SIP (sterilize-in-place) minimizzano la pulizia laboriosa, soprattutto perché tutte le parti bagnate sono superfici metalliche lisce (nessun orifizio o ugello nascosto).

La tabella seguente fornisce un'indicazione della capacità di lavorazione approssimativa dei nostri ultrasuoni: