Lisi ultrasonica di cellule bioingegnerizzate nella produzione industriale

Le specie batteriche bioingegnerizzate come l'E. coli e i tipi di cellule geneticamente modificate di mammiferi e piante sono ampiamente utilizzate nelle biotecnologie per esprimere molecole. Per rilasciare queste biomolecole sintetizzate, è necessaria una tecnica affidabile di disgregazione cellulare. L'ultrasuonazione ad alte prestazioni è un metodo collaudato per una lisi cellulare efficiente e affidabile. – facilmente scalabile per grandi produzioni. Hielscher Ultrasonics offre apparecchiature a ultrasuoni ad alte prestazioni per una lisi cellulare efficace al fine di produrre grandi volumi di biomolecole di alta qualità.

Estrazione di molecole dalle fabbriche cellulari

Per la produzione di un'ampia gamma di biomolecole, si possono utilizzare come fabbriche di cellule microbiche vari microbi e cellule vegetali ingegnerizzati, tra cui Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Streptomyces, Corynebacterium glutamicum, Lactococcus lacti, Cyanobacteria, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Nicotiana benthamiana e alghe, tra molti altri. Queste fabbriche di cellule possono produrre proteine, lipidi, prodotti biochimici, polimeri, biocarburanti e prodotti oleochimici, che vengono utilizzati come alimenti o materie prime per applicazioni industriali. Le cellule utilizzate come fabbriche cellulari sono coltivate in bioreattori chiusi, dove possono raggiungere un'elevata efficienza, specificità e bassi requisiti energetici.
Per isolare le molecole target dalle colture cellulari bioingegnerizzate, le cellule devono essere disgregate in modo da rilasciare il materiale intracellulare. I disgregatori cellulari a ultrasuoni sono una tecnica molto affidabile ed efficiente per la disintegrazione delle cellule e il rilascio dei composti.

Le fabbriche di cellule microbiche sono cellule ingegnerizzate dal punto di vista metabolico utilizzate per la sintesi di vari composti di valore. L'interruzione cellulare a ultrasuoni è un metodo efficiente e affidabile per rilasciare i composti preziosi dall'interno della cellula.
studio e grafica: ©Villaverde, 2010.

Vantaggi dei distruttori cellulari a ultrasuoni

Come tecnologia non termica, delicata ma altamente efficiente, i disgregatori a ultrasuoni sono utilizzati in laboratorio e nell'industria per lisare le cellule e produrre estratti di alta qualità, ad esempio per l'isolamento di molecole dalle fabbriche di cellule.

Ultrasuoni di potenza per l'interruzione efficiente delle fabbriche di cellule microbiche

Meccanismo ed effetti dei disgregatori cellulari a ultrasuoni:
La disgregazione cellulare a ultrasuoni sfrutta la potenza delle onde ultrasonore. L'omogeneizzatore/disgregatore cellulare a ultrasuoni è dotato di una sonda (detta anche sonotrodo) in lega di titanio che oscilla a una frequenza elevata di circa 20 kHz. Ciò significa che la sonda a ultrasuoni trasmette 20.000 vibrazioni al secondo al liquido sonicato. Le onde ultrasonore accoppiate al liquido sono caratterizzate da cicli alternati di alta pressione e bassa pressione. Durante un ciclo di bassa pressione, il liquido si espande e si formano minuscole bolle di vuoto. Queste piccolissime bolle crescono per diversi cicli di pressione alternati fino a quando non possono più assorbire energia. A questo punto, le bolle di cavitazione implodono violentemente e creano localmente un ambiente straordinariamente denso di energia. Questo fenomeno è noto come cavitazione acustica ed è caratterizzato da temperature localmente molto elevate, pressioni molto alte e forze di taglio. Queste forze di taglio rompono in modo efficiente le pareti cellulari e aumentano il trasferimento di massa tra l'interno della cellula e il solvente circostante. Come tecnica puramente meccanica, le forze di taglio generate dagli ultrasuoni sono ampiamente utilizzate e sono la procedura raccomandata per la rottura delle cellule batteriche e per l'isolamento delle proteine. Come metodo semplice e rapido di disgregazione cellulare, la sonicazione è ideale per l'isolamento di volumi piccoli, medi e grandi. Gli ultrasuonatori digitali Hielscher sono dotati di un chiaro menu di impostazioni per un controllo preciso della sonicazione. Tutti i dati di sonicazione vengono automaticamente memorizzati su una scheda SD integrata e sono facilmente accessibili. Le sofisticate opzioni di dissipazione del calore, come il raffreddamento esterno, la sonicazione in modalità puls, ecc. durante il processo di disintegrazione a ultrasuoni, garantiscono il mantenimento della temperatura ideale del processo e quindi l'integrità dei composti estratti sensibili al calore.

Una ricerca sottolinea i punti di forza dell'interruzione e dell'estrazione cellulare a ultrasuoni

Il Prof. Chemat et al. (2017) riassumono nel loro studio che "l'estrazione assistita da ultrasuoni è un'alternativa verde ed economicamente valida alle tecniche convenzionali per gli alimenti e i prodotti naturali. I principali vantaggi sono la riduzione dei tempi di estrazione e lavorazione, la quantità di energia e solventi utilizzati, le operazioni unitarie e le emissioni di CO₂ emissioni".
Gabig-Ciminska et al. (2014) hanno utilizzato un omogeneizzatore ad alta pressione e un dsintegratore cellulare a ultrasuoni nel loro studio per la lisi delle spore al fine di rilasciare il DNA. Confrontando entrambi i metodi di disgregazione cellulare, il team di ricerca conclude che, per quanto riguarda la lisi cellulare per il DNA delle spore, "l'analisi è stata effettuata utilizzando lisati cellulari provenienti dall'omogeneizzazione ad alta pressione. In seguito, ci siamo resi conto che l'interruzione cellulare a ultrasuoni presenta notevoli vantaggi per questo scopo. È piuttosto veloce e può essere elaborata per piccoli volumi di campione". (Gabig-Ciminska et al., 2014)

Biomolecole dalle fabbriche di cellule per la produzione alimentare

Le fabbriche di cellule microbiche sono una metodologia di produzione valida ed efficiente che utilizza organismi microbici per produrre elevate rese di metaboliti nativi e non nativi mediante la bioingegneria metabolica di microrganismi microbici come batteri, lieviti, funghi ecc. Gli enzimi di massa sono prodotti, ad esempio, utilizzando microrganismi come Aspergillus oryzae, funghi e batteri. Questi enzimi sfusi sono utilizzati per la produzione di alimenti e bevande, oltre che in agricoltura, nella bioenergia e nella cura della casa.
Alcuni batteri come Acetobacter xylinum e Gluconacetobacter xylinus producono cellulosa durante il processo di fermentazione, dove le nanofibre vengono sintetizzate in un processo bottom-up. La cellulosa batterica (nota anche come cellulosa microbica) è chimicamente equivalente alla cellulosa vegetale, ma presenta un alto grado di cristallinità e un'elevata purezza (priva di lignina, emicellulosa, pectina e altri componenti biogeni), nonché una struttura unica di nanofibre di cellulosa a rete tridimensionale (3D) reticolata. (cfr. Zhong, 2020) Rispetto alla cellulosa di origine vegetale, la cellulosa batterica è più sostenibile e la cellulosa prodotta è pura e non richiede complesse fasi di purificazione. L'ultrasonicazione e l'estrazione con solvente utilizzando NaOH o SDS (sodio dodecil solfato) sono molto efficaci per l'isolamento della cellulosa batterica dalle cellule batteriche.

Biomolecole da fabbriche di cellule per la produzione di farmaci e vaccini

Uno dei prodotti farmaceutici più importanti derivati dalle fabbriche di cellule è l'insulina umana. Per la produzione di insulina bioingegnerizzata si utilizzano prevalentemente E. coli e Saccharomyces cerevisiae. Poiché le molecole nanometriche biosintetizzate offrono un'elevata biocompatibilità, le nanoparticelle biologiche come la ferritina sono vantaggiose per numerose applicazioni di biomanifattura. Inoltre, la produzione in microbi ingegnerizzati dal punto di vista metabolico è spesso molto più efficace nei rendimenti ottenuti. Ad esempio, la produzione di acido artemisinico, resveratrolo e licopene è decuplicata o centuplicata ed è già consolidata o in fase di sviluppo per la produzione su scala industriale. (cfr. Liu et al.; Microb. Cell Fact. 2017)
Ad esempio, le biomolecole di dimensioni nanometriche a base proteica con proprietà auto-assemblanti, come la ferritina e le particelle simil-virali, sono particolarmente interessanti per lo sviluppo di vaccini, in quanto imitano sia le dimensioni che la struttura degli agenti patogeni e si prestano alla coniugazione in superficie di antigeni per promuovere l'interazione con le cellule immunitarie. Tali molecole sono espresse nelle cosiddette fabbriche di cellule (ad esempio, ceppi di E. coli ingegnerizzati), che producono una determinata molecola bersaglio.

Protocollo per la lisi a ultrasuoni e di E. coli BL21 per il rilascio di ferritina

La ferritina è una proteina la cui funzione principale è l'immagazzinamento del ferro. La ferritina mostra capacità promettenti come nanoparticelle autoassemblanti nei vaccini, dove viene utilizzata come veicolo di somministrazione del vaccino (ad esempio le proteine spike della SARS-Cov-2). La ricerca scientifica di Sun et. al. (2016) dimostra che la ferritina ricombinante può essere rilasciata in forma solubile da Escherichia coli a basse concentrazioni di NaCl (≤50 mmol/L). Per esprimere la ferritina in E. coli BL21 e rilasciarla, è stato applicato con successo il seguente protocollo. Il plasmide ricombinante pET-28a/ferritina è stato trasformato nel ceppo E coli BL21 (DE3). Le cellule di E coli BL21 (DE3) con ferritina sono state coltivate in terreno di crescita LB con lo 0,5% di kanamicina a 37°C e indotte a una OD600 di 0,6 con lo 0,4% di isopropil-β-D-tiogalattopiranoside per 3 ore a 37°C. La coltura finale è stata poi raccolta mediante centrifugazione a 8000g per 10 minuti a 4°C e il pellet è stato raccolto. Quindi, il pellet è stato risospeso in terreno LB (1% NaCl, 1% Typone, 0,5% estratto di lievito)/tampone di lisi (20 mmol/L Tris, 50 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, pH 7,6) e diverse concentrazioni di soluzione di NaCl (0, 50, 100, 170 e 300 mmol/L), rispettivamente. Per la lisi delle cellule batteriche, la sonicazione è stata applicata in modalità impulsiva: ad esempio, utilizzando il ultrasuonatore UP400St al 100% di ampiezza con un ciclo di lavoro di 5 secondi ON, 10 secondi OFF, per 40 cicli) e poi centrifugato a 10 000g per 15 minuti a 4°C. Il surnatante e il precipitato sono stati analizzati mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide sodio dodecil solfato (SDS-PAGE). Tutti i gel colorati con sodio dodecil solfato sono stati scansionati con uno scanner ad alta risoluzione. Le immagini dei gel sono state analizzate con il software Magic Chemi 1D. Per una chiarezza ottimale, le bande proteiche sono state rilevate regolando i parametri. I dati delle bande sono stati generati da triplicati tecnici. (cfr. Sun et al., 2016)

Disgregatori cellulari a ultrasuoni per la lisi industriale di fabbriche di cellule

La lisi e l'estrazione a ultrasuoni sono un metodo affidabile e comodo per liberare i metaboliti dalle fabbriche cellulari, favorendo così una produzione efficace di molecole target. I disgregatori cellulari a ultrasuoni sono disponibili dalle dimensioni di laboratorio a quelle industriali e i processi possono essere scalati in modo completamente lineare.
Hielscher Ultrasonics è il vostro partner competente per i disgregatori a ultrasuoni ad alte prestazioni e vanta una lunga esperienza nel campo dell'impianto di sistemi a ultrasuoni in ambienti da banco e industriali.
Quando si tratta di hardware e software sofisticati, i sistemi di disostruzione cellulare Hielscher Ultrasonics soddisfano tutti i requisiti per un controllo ottimale del processo, un funzionamento semplice e la facilità d'uso. I clienti e gli utenti degli ultrasuonatori Hielscher apprezzano il vantaggio che i disgregatori ed estrattori di cellule a ultrasuoni Hielscher consentono di monitorare e controllare con precisione il processo. – attraverso il display digitale touch e il telecomando del browser. Tutti i dati di sonicazione più importanti (ad esempio, energia netta, energia totale, ampiezza, durata, temperatura, pressione) vengono automaticamente memorizzati come file CSV su una scheda SD integrata. Questo aiuta a ottenere risultati riproducibili e ripetibili e facilita la standardizzazione dei processi e l'adempimento delle buone pratiche di fabbricazione (cGMP).
Naturalmente, i processori a ultrasuoni Hielscher sono costruiti per funzionare 24 ore su 24 e 7 giorni su 7 a pieno carico e possono quindi essere utilizzati in modo affidabile in ambienti di produzione industriale. Grazie all'elevata robustezza e alla bassa manutenzione, i tempi di inattività delle apparecchiature a ultrasuoni sono davvero ridotti. Le funzioni CIP (clean-in-place) e SIP (sterilize-in-place) riducono al minimo le operazioni di pulizia, soprattutto perché tutte le parti umide sono superfici metalliche lisce (senza orifizi o ugelli nascosti).

La tabella seguente fornisce un'indicazione della capacità di lavorazione approssimativa dei nostri ultrasonori: