Produzione biosintetica di oligosaccaridi del latte umano

La biosintesi degli oligosaccaridi del latte umano (HMO) mediante fermentazione o reazioni enzimatiche è un processo complesso, dispendioso e spesso a bassa resa. Il trattamento a ultrasuoni aumenta il trasferimento di massa tra il substrato e le fabbriche cellulari e stimola la crescita e il metabolismo cellulare. In questo modo, la sonicazione intensifica la fermentazione e i processi biochimici, consentendo una produzione di HMO più rapida ed efficiente.

Oligosaccaridi del latte umano

Gli oligosaccaridi del latte umano (HMO), noti anche come glicani del latte umano, sono molecole di zucchero appartenenti al gruppo degli oligosaccaridi. Tra gli esempi più significativi di HMO figurano il 2’-fucosillattosio (2′-FL), il latto-N-neotetraosio (LNnT), il 3’-galattosillattosio (3′-GL) e il difucosillattosio (DFL).
Sebbene il latte materno umano contenga più di 150 diverse strutture di HMO, attualmente solo il 2′-fucosillattosio (2′-FL) e il latto-N-neotetraosio (LNnT) sono prodotti su scala commerciale e utilizzati come additivi nutrizionali nelle formule per lattanti.
Gli oligosaccaridi del latte umano (HMO) sono noti per la loro importanza nell’alimentazione dei lattanti. Gli oligosaccaridi del latte umano sono un tipo unico di nutrienti che agiscono come prebiotici, antimicrobici antiadesivi e immunomodulatori nell’intestino del lattante e contribuiscono in modo sostanziale allo sviluppo cerebrale. Gli HMO si trovano esclusivamente nel latte materno umano; il latte di altri mammiferi (ad es. mucca, capra, pecora, cammello ecc.) non contiene queste specifiche forme di oligosaccaridi.
Gli oligosaccaridi del latte umano sono il terzo componente solido più abbondante nel latte umano e possono essere presenti in forma disciolta, emulsionata o sospesa in acqua. Il lattosio e gli acidi grassi sono i solidi più abbondanti presenti nel latte umano. Gli HMO sono presenti a una concentrazione di 0,35–0,88 once (9,9–24,9 g)/ L. Sono noti circa 200 oligosaccaridi del latte umano strutturalmente diversi. L’oligosaccaride predominante nell’80% delle donne è il 2′-fucosillattosio, presente nel latte materno umano a una concentrazione di circa 2,5 g/ L.
Poiché gli HMO non vengono digeriti, non apportano calorie all’alimentazione. Essendo carboidrati indigeribili, funzionano da prebiotici e vengono fermentati selettivamente dalla microflora intestinale benefica, in particolare dai bifidobatteri.

Biosintesi degli oligosaccaridi del latte umano

Le fabbriche cellulari e i sistemi enzimatici / chemioenzimatici sono tecnologie attualmente utilizzate per la sintesi degli HMO. Per la produzione di HMO su scala industriale, la fermentazione mediante fabbriche cellulari microbiche, la sintesi biochimica e diverse reazioni enzimatiche rappresentano modalità praticabili di bioproduzione degli HMO. Per ragioni economiche, la biosintesi mediante fabbriche cellulari microbiche è attualmente l’unica tecnica utilizzata per la produzione industriale degli HMO.

Fermentazione degli HMO mediante fabbriche cellulari microbiche

E.coli, Saccharomyces cerevisiae e Lactococcus lactis sono comunemente utilizzati come fabbriche cellulari per la bioproduzione di molecole biologiche come gli HMO. La fermentazione è un processo biochimico che utilizza microrganismi per convertire un substrato nelle molecole biologiche desiderate. Le fabbriche cellulari microbiche utilizzano zuccheri semplici come substrato e li convertono in HMO. Poiché gli zuccheri semplici (ad es. il lattosio) sono un substrato abbondante ed economico, il processo di biosintesi rimane economicamente efficiente.
La crescita e la velocità di bioconversione sono influenzate principalmente dal trasferimento di massa dei nutrienti (substrato) ai microrganismi. La velocità di trasferimento di massa è uno dei principali fattori che influenzano la sintesi del prodotto durante la fermentazione. È noto che il trattamento a ultrasuoni favorisce il trasferimento di massa.
Durante la fermentazione, le condizioni nel bioreattore devono essere costantemente monitorate e regolate affinché le cellule possano crescere il più rapidamente possibile per poi produrre le biomolecole desiderate (ad es. oligosaccaridi come gli HMO; insulina; proteine ricombinanti). In teoria, la formazione del prodotto inizia non appena la coltura cellulare comincia a crescere. Tuttavia, soprattutto nelle cellule geneticamente modificate, come i microrganismi ingegnerizzati, viene solitamente indotta in seguito aggiungendo al substrato una sostanza chimica che aumenta l’espressione della biomolecola desiderata. I bioreattori a ultrasuoni (sonobioreattori) possono essere controllati con precisione e consentono una stimolazione specifica dei microrganismi. Ciò si traduce in una biosintesi accelerata e in rese più elevate.
Lisi ed estrazione a ultrasuoni: la fermentazione degli HMO complessi può essere limitata da bassi titoli di fermentazione e dalla permanenza dei prodotti all’interno delle cellule. La lisi e l’estrazione a ultrasuoni vengono utilizzate per rilasciare il materiale intracellulare prima della purificazione e dei processi a valle.

Fermentazione favorita dagli ultrasuoni

La velocità di crescita di microrganismi come Escherichia coli, E.coli ingegnerizzato, Saccharomyces cerevisiae e Lactococcus lactis può essere aumentata incrementando la velocità di trasferimento di massa e la permeabilità della parete cellulare mediante l’applicazione controllata di ultrasuoni a bassa frequenza. Come tecnica di trattamento delicata e non termica, il trattamento a ultrasuoni applica forze puramente meccaniche al brodo di fermentazione.
Cavitazione acustica: il principio di funzionamento della sonicazione si basa sulla cavitazione acustica. La sonda a ultrasuoni (sonotrodo) accoppia onde ultrasoniche a bassa frequenza al mezzo. Le onde ultrasoniche si propagano attraverso il liquido, creando cicli alternati di alta pressione (compressione) / bassa pressione (rarefazione). La compressione e l’espansione del liquido in cicli alternati generano minuscole bolle di vuoto. Queste piccole bolle di vuoto crescono nel corso di diversi cicli fino a raggiungere una dimensione alla quale non possono assorbire ulteriore energia. A questo punto di massima crescita, la bolla di vuoto implode violentemente e genera localmente condizioni estreme, note come fenomeno della cavitazione. Nel “punto caldo” della cavitazione si possono osservare elevati differenziali di pressione e temperatura e intense forze di taglio, con getti di liquido fino a 280m/sec. Questi effetti della cavitazione consentono un efficace trasferimento di massa e la sonoporazione (la perforazione delle pareti cellulari e delle membrane cellulari). I nutrienti del substrato vengono convogliati verso le cellule vive integre e al loro interno, così che le fabbriche cellulari siano nutrite in modo ottimale e siano accelerate sia la crescita sia le velocità di conversione. I bioreattori a ultrasuoni rappresentano una strategia semplice ma altamente efficace per trattare la biomassa in un processo di biosintesi in un unico recipiente.
È noto che una sonicazione delicata e controllata con precisione intensifica i processi di fermentazione.
La sonicazione migliora “la produttività di molti bioprocessi che coinvolgono cellule vive attraverso un maggiore assorbimento del substrato, un aumento della produzione o della crescita grazie all’incremento della porosità cellulare e, potenzialmente, un maggiore rilascio dei componenti cellulari.” (Naveena et al. 2015)
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Naveena et al. (2015) hanno riscontrato che l’intensificazione mediante ultrasuoni offre diversi vantaggi durante il biotrattamento, tra cui bassi costi operativi rispetto ad altre opzioni di trattamento volte a migliorare il processo, semplicità d’uso e requisiti di potenza contenuti.

Reattori a ultrasuoni ad alte prestazioni per la fermentazione

I processi di fermentazione coinvolgono microrganismi vivi, come batteri o lieviti, che fungono da fabbriche cellulari. Quando la sonicazione viene applicata per favorire il trasferimento di massa e aumentare la crescita e la velocità di conversione dei microrganismi, è fondamentale controllare con precisione l’intensità degli ultrasuoni per evitare la distruzione delle fabbriche cellulari.
Hielscher Ultrasonics è specializzata nella progettazione, produzione e distribuzione di sonicatori ad alte prestazioni, che possono essere controllati e monitorati con precisione per garantire rese di fermentazione superiori.

Il controllo del processo è essenziale per ottenere rese elevate e una qualità superiore e consente inoltre di ripetere e riprodurre i risultati. In particolare, nella stimolazione delle fabbriche cellulari, l’adattamento dei parametri di sonicazione alle specifiche cellule è essenziale per ottenere rese elevate e prevenire la degradazione cellulare. Pertanto, tutti i modelli digitali dei sonicatori Hielscher sono dotati di un software intelligente che consente di regolare, monitorare e rivedere i parametri di sonicazione. I parametri del processo a ultrasuoni, come ampiezza, temperatura, pressione, durata della sonicazione, cicli di lavoro ed energia immessa, sono essenziali per favorire la produzione di HMO mediante fermentazione.
Il software intelligente dei sonicatori Hielscher registra automaticamente tutti i parametri importanti del processo sulla scheda SD integrata. La registrazione automatica dei dati del processo di sonicazione costituisce la base per la standardizzazione del processo e per la riproducibilità / ripetibilità, richieste dalle buone pratiche di fabbricazione (GMP).

Reattori a ultrasuoni per la fermentazione

Hielscher offre sonde a ultrasuoni di varie dimensioni, lunghezze e geometrie, utilizzabili per trattamenti sia in batch sia a flusso continuo. I reattori a ultrasuoni, noti anche come sonobioreattori, sono disponibili per qualsiasi volume e coprono il biotrattamento a ultrasuoni dai piccoli campioni di laboratorio alla scala pilota e alla produzione pienamente commerciale.
È noto che la posizione del sonotrodo a ultrasuoni nel recipiente di reazione influenza la distribuzione della cavitazione e dei microflussi nel mezzo. Il sonotrodo e il reattore a ultrasuoni devono essere scelti in base al volume del brodo cellulare da trattare. Sebbene la sonicazione possa essere eseguita sia in batch sia in modalità continua, per volumi di produzione elevati si raccomanda l’uso di un impianto a flusso continuo. Passando attraverso una cella di flusso a ultrasuoni, tutto il mezzo cellulare riceve esattamente la stessa esposizione alla sonicazione, garantendo il trattamento più efficace. L’ampia gamma di sonde a ultrasuoni e reattori con celle di flusso di Hielscher Ultrasonics consente di assemblare la configurazione ideale per il biotrattamento a ultrasuoni.

Hielscher Ultrasonics – Dal laboratorio alla scala pilota e alla produzione

Hielscher Ultrasonics copre l’intera gamma di apparecchiature a ultrasuoni, offrendo omogeneizzatori a ultrasuoni compatti e portatili per la preparazione dei campioni, sistemi da banco e pilota, nonché potenti unità industriali a ultrasuoni che trattano agevolmente carichi equivalenti a quelli di più camion ogni ora. Grazie alla versatilità e alla flessibilità delle opzioni di installazione e montaggio, i sonicatori Hielscher possono essere facilmente integrati in tutti i tipi di reattori batch, fed-batch o sistemi a flusso continuo.
Vari accessori e componenti personalizzati consentono di adattare in modo ottimale la configurazione a ultrasuoni ai requisiti del vostro processo.
Progettati per il funzionamento 24/7 a pieno carico e per impieghi gravosi in condizioni impegnative, i processori a ultrasuoni Hielscher sono affidabili e richiedono poca manutenzione.
La tabella seguente fornisce un’indicazione della capacità di trattamento approssimativa dei nostri sonicatori: