Produzione biosintetica di oligosaccaridi del latte umano

La biosintesi degli oligosaccaridi del latte umano (HMO) tramite fermentazione o reazioni enzimatiche è un processo complesso, dispendioso e spesso a bassa resa. Gli ultrasuoni aumentano il trasferimento di massa tra il substrato e le cellule e stimolano la crescita e il metabolismo cellulare. In questo modo, la sonicazione intensifica la fermentazione e i processi biochimici, accelerando e rendendo più efficiente la produzione di HMO.

oligosaccaridi del latte umano

Gli oligosaccaridi del latte umano (HMO), noti anche come glicani del latte umano, sono molecole di zucchero che fanno parte del gruppo degli oligosaccaridi. Esempi importanti di HMO sono il 2'-fucosilattosio (2′-FL), latto-N-neotetraosio (LNnT), 3'-galattosilattosio (3′-GL) e difucosilattosio (DFL).
Mentre il latte materno umano è composto da oltre 150 strutture HMO diverse, solo il 2′-fucosilattosio (2′-FL) e il latto-N-neotetraosio (LNnT) sono attualmente prodotti a livello commerciale e utilizzati come additivi nutrizionali negli alimenti per lattanti.
Gli oligosaccaridi del latte umano (HMO) sono noti per la loro importanza nell'alimentazione del bambino. Gli oligosaccaridi del latte umano sono un tipo unico di nutrienti che agiscono come prebiotici, antimicrobici antiadesivi e immunomodulatori nell'intestino del bambino e contribuiscono in modo sostanziale allo sviluppo del cervello. Gli HMO si trovano esclusivamente nel latte materno umano; gli altri latti di mammiferi (come quello di mucca, di capra, di pecora, di cammello, ecc.) non presentano questa forma specifica di oligosaccaridi.
Gli oligosaccaridi del latte umano sono il terzo componente solido più abbondante del latte umano, che può essere presente sia in forma disciolta che emulsionata o sospesa in acqua. Il lattosio e gli acidi grassi sono i solidi più abbondanti presenti nel latte umano. Gli OMO sono presenti in una concentrazione di 0,35-0,88 once (9,9-24,9 g)/L. Sono noti circa 200 oligosaccaridi del latte umano strutturalmente diversi. L'oligosaccaride dominante nell'80% di tutte le donne è il 2′-Il fucosilattosio, che è presente nel latte materno umano in una concentrazione di circa 2,5 g/l.
Poiché gli HMO non vengono digeriti, non apportano alcun contributo calorico alla nutrizione. Essendo carboidrati indigeribili, funzionano come prebiotici e vengono fermentati selettivamente dalla microflora intestinale desiderabile, in particolare dai bifidobatteri.

Biosintesi degli oligosaccaridi del latte umano

Le fabbriche di cellule e i sistemi enzimatici/chemoenzimatici sono le tecnologie attualmente utilizzate per la sintesi degli HMO. Per la produzione di HMO su scala industriale, la fermentazione di fabbriche di cellule microbiche, la sintesi biochimica e le diverse reazioni enzimatiche sono metodi praticabili di bioproduzione di HMO. Per motivi economici, la biosintesi attraverso fabbriche di cellule microbiche è attualmente l'unica tecnica utilizzata a livello di produzione industriale di HMO.

Fermentazione di HMO utilizzando fabbriche di cellule microbiche

E.coli, Saccharomyces cerevisiae e Lactococcus lactis sono fabbriche di cellule comunemente utilizzate per la bioproduzione di molecole biologiche come gli HMO. La fermentazione è un processo biochimico che utilizza microrganismi per convertire un substrato in molecole biologiche mirate. Le fabbriche di cellule microbiche utilizzano come substrato zuccheri semplici, che convertono in HMO. Poiché gli zuccheri semplici (ad esempio il lattosio) sono un substrato abbondante ed economico, il processo di biosintesi è efficiente dal punto di vista dei costi.
La crescita e il tasso di bioconversione sono influenzati principalmente dal trasferimento di massa dei nutrienti (substrato) ai microrganismi. La velocità di trasferimento di massa è un fattore principale che influenza la sintesi dei prodotti durante la fermentazione. È noto che gli ultrasuoni favoriscono il trasferimento di massa.
Durante la fermentazione, le condizioni nel bioreattore devono essere costantemente monitorate e regolate in modo che le cellule possano crescere il più rapidamente possibile per poi produrre le biomolecole desiderate (ad esempio, oligosaccaridi come gli HMO; insulina; proteine ricombinanti). In teoria, la formazione del prodotto inizia non appena la coltura cellulare inizia a crescere. Tuttavia, soprattutto nelle cellule geneticamente modificate, come i microrganismi ingegnerizzati, la formazione del prodotto viene solitamente indotta in un secondo momento, aggiungendo una sostanza chimica al substrato, che regola l'espressione della biomolecola desiderata. I bioreattori a ultrasuoni (sono-bioreattori) possono essere controllati con precisione e consentono una stimolazione specifica dei microbi. Ciò si traduce in una biosintesi accelerata e in rese più elevate.
Lisi ed estrazione a ultrasuoni: La fermentazione di HMO complessi può essere limitata da bassi titoli di fermentazione e da prodotti che rimangono intracellulari. La lisi e l'estrazione a ultrasuoni vengono utilizzate per liberare il materiale intracellulare prima della purificazione e dei processi a valle.

Fermentazione promossa dagli ultrasuoni

Il tasso di crescita di microbi come Escherichia coli, E.coli ingegnerizzato, Saccharomyces cerevisiae e Lactococcus lactis può essere accelerato aumentando il tasso di trasferimento di massa e la permeabilità della parete cellulare mediante l'applicazione di ultrasuoni controllati a bassa frequenza. Essendo una tecnica di lavorazione blanda e non termica, l'ultrasuonazione applica forze puramente meccaniche al brodo di fermentazione.
Cavitazione acustica: Il principio di funzionamento della sonicazione si basa sulla cavitazione acustica. La sonda a ultrasuoni (sonotrodo) accoppia onde ultrasonore a bassa frequenza al liquido. Le onde ultrasonore attraversano il liquido creando cicli alternati di alta pressione (compressione) e bassa pressione (rarefazione). Comprimendo e stirando il liquido in cicli alternati, si formano minuscole bolle di vuoto. Queste piccole bolle di vuoto crescono per diversi cicli fino a raggiungere una dimensione tale da non poter assorbire ulteriore energia. A questo punto di massima crescita, la bolla di vuoto implode violentemente e genera condizioni localmente estreme, note come fenomeno di cavitazione. Nel "punto caldo" della cavitazione si possono osservare elevati differenziali di pressione e temperatura e intense forze di taglio con getti di liquido fino a 280 m/sec. Grazie a questi effetti cavitazionali, si ottiene un trasferimento di massa completo e la sonoporazione (la perforazione delle pareti e delle membrane cellulari). Le sostanze nutritive del substrato vengono trasportate verso e dentro le cellule intere vive, in modo da nutrire in modo ottimale le fabbriche cellulari e accelerare la crescita e i tassi di conversione. I bioreattori a ultrasuoni sono una strategia semplice, ma molto efficace per trattare la biomassa in un processo di biosintesi one-pot.
È noto che una leggera sonicazione controllata con precisione intensifica i processi di fermentazione.
La sonicazione migliora "la produttività di molti bioprocessi che coinvolgono cellule vive attraverso il potenziamento dell'assorbimento del substrato, l'aumento della produzione o della crescita grazie all'incremento della porosità cellulare e, potenzialmente, il rilascio di componenti cellulari". (Naveena et al. 2015)
Per saperne di più sulla fermentazione assistita da ultrasuoni!

Naveena et al. (2015) hanno scoperto che l'intensificazione a ultrasuoni offre diversi vantaggi durante il bioprocesso, tra cui costi operativi ridotti rispetto ad altre opzioni di trattamento migliorativo, semplicità di funzionamento e requisiti energetici modesti.

Reattori di fermentazione a ultrasuoni ad alte prestazioni

I processi di fermentazione coinvolgono microrganismi viventi come batteri o lieviti, che funzionano come fabbriche di cellule. Sebbene la sonicazione venga applicata per promuovere il trasferimento di massa e aumentare il tasso di crescita e conversione dei microrganismi, è fondamentale controllare con precisione l'intensità degli ultrasuoni per evitare la distruzione delle fabbriche cellulari.
Hielscher Ultrasonics è specializzata nella progettazione, produzione e distribuzione di ultrasuonatori ad alte prestazioni, che possono essere controllati e monitorati con precisione per garantire rese di fermentazione superiori.

Il controllo del processo non solo è essenziale per ottenere rese elevate e una qualità superiore, ma consente anche di ripetere e riprodurre i risultati. Soprattutto quando si tratta di stimolare le fabbriche di cellule, l'adattamento dei parametri di sonicazione specifici per ogni cellula è essenziale per ottenere rese elevate e prevenire la degradazione delle cellule. Per questo motivo, tutti i modelli digitali di ultrasuonatori Hielscher sono dotati di un software intelligente che consente di regolare, monitorare e rivedere i parametri di sonicazione. I parametri del processo a ultrasuoni, come l'ampiezza, la temperatura, la pressione, la durata della sonicazione, i cicli di lavoro e l'apporto di energia, sono essenziali per promuovere la produzione di HMO tramite fermentazione.
Il software intelligente degli ultrasuonatori Hielscher registra automaticamente tutti i parametri di processo più importanti sulla scheda SD integrata. La registrazione automatica dei dati del processo di sonicazione è alla base della standardizzazione del processo e della riproducibilità/ripetibilità, necessarie per le buone pratiche di fabbricazione (GMP).

Rettori a ultrasuoni per la fermentazione

Hielscher offre sonde a ultrasuoni di varie dimensioni, lunghezze e geometrie, che possono essere utilizzate sia per trattamenti in batch che in flusso continuo. I reattori a ultrasuoni, noti anche come sono-bioreattori, sono disponibili per qualsiasi volume che copra il bioprocesso a ultrasuoni da piccoli campioni di laboratorio a livello di produzione pilota e completamente commerciale.
È noto che la posizione del sonotrodo a ultrasuoni nel recipiente di reazione influenza la distribuzione della cavitazione e dei microflussi nel mezzo. Il sonotrodo e il reattore a ultrasuoni devono essere scelti in base al volume di trattamento del brodo cellulare. Sebbene la sonicazione possa essere eseguita sia in batch che in modalità continua, per volumi di produzione elevati si raccomanda l'uso di un impianto a flusso continuo. Passando attraverso una cella a flusso di ultrasuoni, tutto il terreno cellulare riceve esattamente la stessa esposizione alla sonicazione, garantendo il trattamento più efficace. L'ampia gamma di sonde a ultrasuoni e reattori a celle a flusso di Hielscher Ultrasonics consente di assemblare l'impianto di bioprocesso a ultrasuoni ideale.

Hielscher Ultrasonics – Dal laboratorio al pilota alla produzione

Hielscher Ultrasonics copre l'intero spettro delle apparecchiature a ultrasuoni, offrendo omogeneizzatori a ultrasuoni compatti e portatili per la preparazione dei campioni, sistemi da banco e sistemi pilota, nonché potenti unità industriali a ultrasuoni che trattano facilmente carichi di camion all'ora. Grazie alla versatilità e alla flessibilità delle opzioni di installazione e montaggio, gli ultrasonori Hielscher possono essere facilmente integrati in tutti i tipi di reattori batch, fed-batches o configurazioni a flusso continuo.
Vari accessori e parti personalizzate consentono di adattare in modo ideale l'impianto a ultrasuoni alle esigenze del processo.
Costruiti per funzionare 24 ore su 24, 7 giorni su 7, a pieno carico e in condizioni difficili, i processori a ultrasuoni Hielscher sono affidabili e richiedono una manutenzione minima.
La tabella seguente fornisce un'indicazione della capacità di lavorazione approssimativa dei nostri ultrasonori: