Sintesi peptidica in fase solida – Più efficiente con la sonicazione
La sintesi peptidica in fase solida (SPPS) è il metodo comunemente utilizzato per la sintesi dei peptidi. Il trattamento a ultrasuoni è uno strumento affidabile per intensificare la sintesi peptidica in fase solida, ottenendo rese più elevate, una maggiore purezza, l’assenza di racemizzazione e una velocità di reazione significativamente maggiore. Hielscher Ultrasonics offre diverse soluzioni a ultrasuoni per la sintesi, la scissione e la dissoluzione dei peptidi.
Sintesi peptidica in fase solida mediante ultrasuoni
Il trattamento a ultrasuoni è già ampiamente utilizzato come metodo di intensificazione nella sintesi organica ed è ben noto per i suoi vantaggi, quali tempi di reazione drasticamente ridotti, rese più elevate, minore formazione di sottoprodotti, attivazione di vie di reazione non realizzabili con altri metodi e/o maggiore selettività. Si possono ottenere grandi benefici anche applicando la sonicazione alle reazioni di sintesi peptidica. I risultati della ricerca hanno dimostrato che la sintesi peptidica assistita da ultrasuoni consente di ottenere rese ottimizzate di peptidi ad alta purezza, senza racemizzazione, in tempi di reazione brevi.
- Elevate rese di peptidi
- Sintesi significativamente più rapida
- Maggiore purezza dei peptidi
- Assenza di racemizzazione
- Sintesi parallela di diversi peptidi
- Scalabile a qualsiasi volume
Cuphorn a ultrasuoni per la sonicazione uniforme di più recipienti di reazione, per migliorare la sintesi peptidica.
Schema che illustra la sintesi peptidica in fase solida di Merrifield. Il trattamento a ultrasuoni viene utilizzato per favorire e potenziare la reazione di sintesi, nonché per la scissione dei peptidi sintetizzati dalla resina.
Schema: ©Conejos-Sanchez et al., 2014)
| Studio | Peptide/i studiato/i | Tempo di reazione (metodo classico vs US-SPPS) | Purezza del prodotto grezzo (metodo classico vs US-SPPS) | Racemizzazione e reazioni collaterali | Risultati principali |
|---|---|---|---|---|---|
| Wołczański et al. (2019) | Met-encefalina, UB33-43-OCam, TAT48-60-NH2, B2m58-69-NH2, ACP65-74-NH2, β-endorfina | 600–1920 min → 48–284 min | 24,2–71,3% → 60,6–89,9% | Nessuna osservata per Cys/His, anche a 70°C | Sintesi ~7–12 volte più rapida; notevoli miglioramenti della purezza, soprattutto per sequenze soggette ad aggregazione come TAT. |
| Silva et al. (2021) | Pep1 (12 residui), Pep2 (9 residui), Pep3 (25 residui) | >3515/365 min → ~250/85 min (Pep1/Pep2); Pep3: 347 min (solo US) | 73–84% → 72–82% (Pep1/Pep2) | Non valutate; rilevato un lieve calo della purezza di Pep2 | Tempo ridotto di un fattore 14 per Pep1; rese del prodotto grezzo significativamente aumentate. |
| Merlino et al. (2019) | Pentapeptidi modello, peptidi fino a 44 residui, “sequenze difficili” (Aβ 1-42, ACP 65-74) | 60 min → 30 min (modello) | 84% → 93% (modello); significativamente superiore rispetto al riscaldamento termico (~45°C) | Nessun aumento significativo degli enantiomeri di Cys/His | Altamente efficace per sequenze difficili/soggette ad aggregazione; consente di ridurre l’eccesso di reagenti mantenendo un’elevata purezza. |
Sintesi peptidica in fase solida migliorata con gli ultrasuoni
La sintesi peptidica in fase solida (SPPS) è una reazione chimica che consente di assemblare una catena peptidica attraverso reazioni successive di derivati amminoacidici su un supporto poroso insolubile. Tuttavia, la sintesi peptidica in fase solida tradizionale è un processo relativamente inefficiente e lento. Pertanto, l’intensificazione della sintesi peptidica mediante ultrasuoni è uno strumento molto apprezzato per una sintesi dei peptidi più efficace e rapida.
Silva et al. (2021) hanno confrontato la sintesi peptidica in fase solida (SPPS) “classica” basata sul fluorenilmetossicarbonile (Fmoc) con la SPPS assistita da ultrasuoni (US), preparando tre peptidi: Pep1 (VSPPLTLGQLLS-NH2), specifico per il recettore 3 del fattore di crescita dei fibroblasti (FGFR3), e i nuovi peptidi Pep2 (RQMATADEA-NH2) e Pep3 (AAVALLPAVLLALLAPRQMATADEA-NH2).
La SPPS assistita da US ha ridotto il tempo di assemblaggio dei peptidi di un fattore 14 (Pep1) e di un fattore 4 (Pep2) rispetto al metodo “classico”. È interessante osservare che la SPPS assistita da ultrasuoni ha prodotto Pep1 con una purezza maggiore (82%) rispetto alla SPPS “classica” (73%). La significativa riduzione dei tempi, combinata con l’elevata purezza del peptide grezzo ottenuto, ha spinto il gruppo di ricerca ad applicare la SPPS assistita da US al peptide di grandi dimensioni Pep3, che presenta un elevato numero di amminoacidi idrofobici e sequenze omooligomeriche. Degno di nota è il fatto che la sintesi di questo peptide di 25 residui sia stata completata in meno di 6 ore (347 min), con una purezza moderata (circa 49%).
Sintesi peptidica più rapida mediante sintesi peptidica in fase solida con agitazione a ultrasuoni.
(Studio e analisi: Wołczański et al., 2019)
Anche Merlino et al. (2019) hanno condotto uno studio approfondito degli effetti degli ultrasuoni sulla sintesi peptidica in fase solida basata su Fmoc, che ha consentito di sintetizzare diversi peptidi biologicamente attivi (fino a 44 residui), con un notevole risparmio di materiale e di tempo di reazione. Hanno dimostrato che il trattamento a ultrasuoni non aggravava le principali reazioni collaterali e migliorava la sintesi di peptidi con “sequenze difficili”, collocando la sintesi peptidica in fase solida promossa dagli ultrasuoni (US-SPPS) tra le attuali strategie di sintesi peptidica ad alta efficienza.
La disponibilità di sistemi ad alte prestazioni per la sintesi dei peptidi mediante ultrasuoni (sonicazione) consente di migliorare significativamente la velocità di sintesi e di aumentare la purezza dei prodotti grezzi. (cfr. Wołczański et al., 2019)
Indagine sulla racemizzazione. Confronto degli spettri 1H NMR significativi di peptidi modello sintetizzati manualmente con l’approccio classico a temperatura ambiente e con il metodo a ultrasuoni a temperatura elevata. Gli spostamenti chimici dei protoni α di His e Cys e del gruppo metilenico di Acm (pannelli a sinistra), nonché dei protoni del gruppo ɣ-metilico di Val (pannelli a destra), mostrano che la sonicazione a 70°C non provoca racemizzazione.
(Studio e analisi: Wołczański et al., 2019)
Scissione dei peptidi mediante ultrasuoni
Dopo la sintesi peptidica in fase solida (SPPS), i peptidi sintetizzati devono essere scissi dalle resine polimeriche. Questa fase è nota anche come deprotezione. Confrontando l’agitazione convenzionale e il trattamento a ultrasuoni per la scissione dei peptidi dalla resina, il metodo con agitazione richiede circa 1 ora, mentre la scissione mediante ultrasuoni può essere completata in 15–20 min. La scissione peptidica mediante ultrasuoni può essere applicata alla scissione di amminoacidi e peptidi protetti legati a resine di polistirene tramite legami esterei benzilici.
La scissione dei peptidi dalla resina di polistirene mediante ultrasuoni consente di ottenere elevate rese di peptidi ad alta purezza, senza racemizzazione, con una procedura rapida.
(studio e schema: ©Anuradha e Ravindranath, 1995)
Reattore con agitazione a ultrasuoni per una sintesi peptidica migliore e più rapida. L’immagine mostra il sonicatore UP200St in un reattore in vetro con agitazione.
Sonicatori ad alte prestazioni per la sintesi peptidica
Hielscher Ultrasonics offre diverse soluzioni a ultrasuoni per la sonicazione diretta e indiretta. Processori a ultrasuoni potenti e controllabili con precisione forniscono al recipiente di reazione esattamente la quantità di energia ultrasonica necessaria. Che si utilizzino siringhe, provette, piastre multipozzetto o reattori in vetro come recipienti di sintesi, Hielscher Ultrasonics offre il sonicatore più adatto alla vostra applicazione peptidica.
- peptidi personalizzati
- produzione di peptidi su larga scala
- librerie peptidiche
Molte sintesi peptidiche vengono eseguite in siringhe (ad esempio, reattori a siringa con setto poroso). L’agitatore a ultrasuoni per siringhe di Hielscher sottopone a sonicazione la soluzione peptidica, accoppiando le onde ultrasoniche al liquido attraverso la parete della siringa. L’agitatore a ultrasuoni per siringhe è una delle soluzioni a ultrasuoni più diffuse per la sintesi dei peptidi assistita da ultrasuoni.
Il cuphorn a ultrasuoni è uno strumento adatto alla sonicazione di un massimo di 5 recipienti di reazione, mentre il VialTweeter può ospitare fino a dieci provette di reazione e altri cinque recipienti più grandi mediante un accessorio con fissaggio a morsetto.
Per altri tipi di reattori, come il reattore in fase solida di Merrifield o di Kamysz, e per altri recipienti e reattori in polipropilene o borosilicato, Hielscher offre sonicatori per la sonicazione indiretta e diretta con montaggio a morsetto personalizzato o flangia.
Naturalmente, i reattori in vetro con agitazione di dimensioni maggiori, ad esempio per la sintesi in fase liquida, possono essere facilmente dotati di sonde a ultrasuoni (note anche come sonotrodi o corni a ultrasuoni) di qualsiasi dimensione.
- diversi tipi di sonicatori
- sonicazione diretta e indiretta
- controllo preciso dell’intensità
- controllo preciso della temperatura
- ultrasuoni continui o pulsati
- funzioni intelligenti, dispositivi programmabili
- disponibili per qualsiasi volume
- scalabilità lineare
Per la sintesi peptidica in fase solida in piastre multipozzetto/da microtitolazione, UIP400MTP è il dispositivo ideale. La cavitazione ultrasonica viene accoppiata indirettamente e uniformemente ai numerosi pozzetti contenenti i campioni, migliorando il trasferimento di massa e la reazione di sintesi. Guardate il video qui sotto per vedere il sonicatore per micropiastre UIP400MTP in azione!
Contattateci! / Chiedeteci informazioni!
Hielscher Ultrasonics produce omogeneizzatori a ultrasuoni ad alte prestazioni per applicazioni di miscelazione, dispersione, emulsificazione ed estrazione su scala di laboratorio, pilota e industriale.
Informazioni utili sulla sintesi peptidica mediante ultrasuoni
Che cosa sono i peptidi?
I peptidi sono composti in cui più amminoacidi sono uniti tramite legami ammidici, detti legami peptidici. Quando sono organizzati in strutture complesse – tipicamente costituite da 50 o più amminoacidi –, queste grandi strutture peptidiche vengono chiamate proteine. I peptidi sono elementi costitutivi essenziali della vita e svolgono numerose funzioni nell’organismo.
Come funziona la sintesi peptidica?
In chimica organica, biologia molecolare e scienze della vita, la sintesi peptidica è il processo di produzione dei peptidi. I peptidi vengono sintetizzati chimicamente mediante una reazione di condensazione tra il gruppo carbossilico di un amminoacido e il gruppo amminico di un altro amminoacido. Solitamente si utilizzano strategie basate su gruppi protettori (detti anche gruppi di protezione) per evitare reazioni collaterali indesiderate con le diverse catene laterali degli amminoacidi.
La sintesi peptidica chimica (in vitro) inizia generalmente con l’accoppiamento del gruppo carbossilico dell’amminoacido in ingresso (estremità C-terminale) all’estremità N-terminale della catena peptidica in crescita. A differenza di questa sintesi da C a N, la biosintesi proteica naturale di peptidi lunghi negli organismi viventi avviene nella direzione opposta. Ciò significa che, nella biosintesi, l’estremità N-terminale dell’amminoacido in ingresso viene legata all’estremità C-terminale della catena proteica (da N a C).
La maggior parte dei protocolli di ricerca e sviluppo per la sintesi peptidica si basa su metodi in fase solida, mentre i metodi di sintesi in fase liquida sono utilizzati nella produzione industriale di peptidi su larga scala.
Qual è l’attuale stato dell’arte nella sintesi peptidica?
SUS-SPPS (SPPS sostenibile assistita da ultrasuoni) ha dimostrato di ridurre il processo a soli due passaggi per ciclo (accoppiamento/capping/deprotezione combinati + un singolo lavaggio), riducendo significativamente il consumo di solventi e i tempi. (cfr. Mottola et al., 2025)
TAPS assistita da ultrasuoni è una combinazione emergente che ha dimostrato risultati positivi nelle sintesi totali (ad esempio, della lipobactina) ed è oggetto di studio da parte delle CDMO per la produzione di principi attivi farmaceutici (API).
Scoprite i vantaggi della sintesi peptidica TAGGING assistita da ultrasuoni!
Il trattamento in continuo viene studiato come ulteriore miglioramento – sono state descritte piattaforme di sintesi continua one-pot assistita da tag sililati.
Il settore si sta orientando verso i principi della chimica verde, con gli ultrasuoni e la TAPS che contribuiscono entrambi a ridurre l’uso di solventi e le quantità di reagenti, migliorando la sostenibilità.
Bibliografia / Riferimenti
- Merlino, F., Tomassi, S., Yousif, A. M., Messere, A., Marinelli, L., Grieco, P., Novellino, E., Cosconati, S., Di Maro, S. (2019): Boosting Fmoc Solid-Phase Peptide Synthesis by Ultrasonication. Organic Letters, 21(16), 2019. 6378–6382.
- Andrew M. Bray; Liana M. Lagniton; Robert M. Valerio; N.Joe Maeji (1994): Sonication-assisted cleavage of hydrophobic peptides. Application in multipin peptide synthesis. Tetrahedron Letters 35(48), 1994. 9079–9082.
- Silva, R., Franco Machado, J., Gonçalves, K., Lucas, F. M., Batista, S., Melo, R., Morais, T. S., & Correia, J. (2021): Ultrasonication Improves Solid Phase Synthesis of Peptides Specific for Fibroblast Growth Factor Receptor and for the Protein-Protein Interface RANK-TRAF6. Molecules (Basel, Switzerland), 26(23), 7349.
- Conejos-Sanchez, Inmaculada; Duro Castaño, Aroa; Vicent, María (2014): Peptide-Based Polymer Therapeutics. Polymers. 6. 515-551.
- Raheem, Shvan J; Schmidt, Benjamin W; Solomon, Viswas Raja; Salih, Akam K; Price, Eric W (2020): Ultrasonic-Assisted Solid-Phase Peptide Synthesis of DOTA-TATE and DOTA-linker-TATE Derivatives as a Simple and Low-Cost Method for the Facile Synthesis of Chelator-Peptide Conjugates. ACS Bioconjugate Chemistry, 2020.
- Salvatore Mottola, Alessandra Del Bene, Vincenzo Mazzarella, Roberto Cutolo, Ida Boccino, Francesco Merlino, Sandro Cosconati, Salvatore Di Maro, Anna Messere (2015): Sustainable Ultrasound-Assisted Solid-Phase peptide synthesis (SUS-SPPS): Less Waste, more efficiency. Ultrasonics Sonochemistry, Volume 114, 2025.
- M.V. Anuradha, B. Ravindranath (1995): Ultrasound in peptide synthesis. 4: Rapid cleavage of polymer-bound protected peptides by alkali and alkanolamines. Tetrahedron Volume 51, Issue 19, 1995. 5675-5680.
- Wołczański, G., Płóciennik, H., Lisowski, M., Stefanowicz, P. (2019): The faster peptide synthesis on the solid phase using ultrasonic agitation. Tetrahedron Letters, 2019.
Hielscher Ultrasonics produce omogeneizzatori a ultrasuoni ad alte prestazioni, dalle dimensioni per laboratorio a quelle per uso industriale.