Sintesi di peptidi in fase solida – Maggiore efficienza grazie alla sonicazione
La sintesi di peptidi in fase solida (SPPS) è il metodo comune per la sintesi di peptidi. L'ultrasuonazione è uno strumento affidabile per intensificare la sintesi di peptidi in fase solida, ottenendo rese più elevate, una maggiore purezza, l'assenza di racemizzazione e una velocità di reazione notevolmente accelerata. Hielscher Ultrasonics offre diverse soluzioni a ultrasuoni per la sintesi, la scissione e la dissoluzione dei peptidi.
Sintesi di peptidi in fase solida mediante ultrasuoni
L'ultrasonicazione è già ampiamente applicata come metodo di intensificazione nella sintesi organica ed è ben nota per i suoi vantaggi, come la drastica riduzione dei tempi di reazione, le rese più elevate, la riduzione dei sottoprodotti, l'avvio di percorsi che non potrebbero essere ottenuti in altri modi e/o una migliore selettività. Grandi vantaggi si ottengono anche quando la sonicazione viene associata alle reazioni di sintesi peptidica. I risultati della ricerca hanno dimostrato che la sintesi peptidica assistita da ultrasuoni consente di ottenere una resa ottimizzata di peptidi con elevata purezza, senza racemizzazione in tempi di reazione brevi.
- Elevata resa di peptidi
- Sintesi significativamente più veloce
- Maggiore purezza dei peptidi
- Nessuna racemizzazione
- Sintesi parallela di vari peptidi
- Adattabile a qualsiasi volume
Coppella a ultrasuoni per la sonicazione uniforme di diversi recipienti del reattore per una migliore sintesi dei peptidi.
Figura che illustra la sintesi peptidica in fase solida secondo il metodo di Merrifield. L'ultrasonicazione viene utilizzata per favorire e potenziare la reazione di sintesi, nonché per la scissione dei peptidi sintetizzati dalla resina.
Grafico: ©Conejos-Sanchez et al., 2014)
| Studio | Peptide(i) oggetto dello studio | Tempo di reazione (metodo classico vs US-SPPS) | Purezza del greggio (metodo classico vs US-SPPS) | Racemizzazione e reazioni collaterali | Punti chiave |
|---|---|---|---|---|---|
| Wołczański et al. (2019) | Met-encefalina, UB33-43-OCam, TAT48-60-NH₂, B2m58-69-NH₂, ACP65-74-NH₂, β-endorfina | 600–1920 min → 48–284 min | 24,2–71,3% → 60,6–89,9% | Nessuna osservata per Cys/His, nemmeno a 70 °C | ~7–12 volte più veloce nella sintesi; notevoli miglioramenti in termini di purezza, soprattutto per sequenze soggette ad aggregazione come TAT. |
| Silva et al. (2021) | Pep1 (12-mero), Pep2 (9-mero), Pep3 (25-mero) | >3515/365 min → ~250/85 min (Pep1/Pep2); Pep3: 347 min (solo negli Stati Uniti) | 73–84% → 72–82% (Pep1/Pep2) | Non testato; si è riscontrato un leggero calo di purezza nel Pep2 | Riduzione dei tempi di 14 volte per Pep1; le rese grezze sono aumentate in modo significativo. |
| Merlino et al. (2019) | Pentapeptidi modello, peptidi fino a 44-mer, “sequenze difficili” (Aβ 1-42, ACP 65-74) | 60 min → 30 min (modello) | 84% → 93% (modello); significativamente superiore rispetto al riscaldamento termico (~45 °C) | Nessun aumento significativo per gli enantiomeri Cys/His | Estremamente efficace per sequenze difficili o soggette ad aggregazione; consente di ridurre l’eccesso di reagente mantenendo un elevato grado di purezza. |
Sintesi di peptidi in fase solida migliorata con gli ultrasuoni
La sintesi di peptidi in fase solida (SPPS) è una reazione chimica che permette di assemblare una catena peptidica attraverso reazioni successive di derivati di amminoacidi su un supporto poroso insolubile. Tuttavia, la tradizionale sintesi di peptidi in fase solida è un processo relativamente inefficiente e lento. Pertanto, l'intensificazione a ultrasuoni della sintesi peptidica è uno strumento molto apprezzato per una sintesi più efficace e rapida dei peptidi.
Silva et al. (2021) hanno messo a confronto “classico” sintesi peptidica in fase solida (SPPS) con fluorenilmetossicarbonile (Fmoc) assistita da ultrasuoni (US) basata sulla preparazione di tre peptidi, ovvero il peptide Pep1 (VSPPLTLGQLLS-NH2) specifico per il recettore 3 del fattore di crescita dei fibroblasti (FGFR3) e i nuovi peptidi Pep2 (RQMATADEA-NH2) e Pep3 (AAVALLPAVLLALLAPRQMATADEA-NH2).
L'SPPS assistito dagli Stati Uniti ha portato a una riduzione dei tempi di assemblaggio dei peptidi di 14 volte (Pep1) e di 4 volte (Pep2) rispetto al “classico” metodo. È interessante notare che la SPPS assistita da ultrasuoni ha prodotto Pep1 con una purezza superiore (82%) rispetto alla “classico” SPPS (73%). La significativa riduzione dei tempi, unita all’elevata purezza del peptide grezzo ottenuta, ha spinto il gruppo di ricerca ad applicare la SPPS assistita da ultrasuoni al peptide di grandi dimensioni Pep3, che presenta un elevato numero di aminoacidi idrofobici e di omooligosecvenze. È degno di nota il fatto che la sintesi di questo peptide a 25 mer sia stata completata in meno di 6 ore (347 min) con una purezza moderata (circa il 49%).
Sintesi di peptidi più veloce attraverso la sintesi di peptidi in fase solida con agitazione a ultrasuoni.
(Studio e analisi: Wołczański et al., 2019)
Anche Merlino et al. (2019) hanno condotto uno studio approfondito sugli effetti degli ultrasuoni sulla sintesi peptidica in fase solida basata su Fmoc, che ha consentito la sintesi di diversi peptidi biologicamente attivi (fino a 44-mer), con un notevole risparmio in termini di materiale e tempo di reazione. Hanno dimostrato che l’ultrasonicazione non ha esacerbato le principali reazioni collaterali e ha migliorato la sintesi di peptidi dotati di “sequenze difficili”, collocando la sintesi di peptidi in fase solida promossa dagli ultrasuoni (US-SPPS) tra le attuali strategie di sintesi di peptidi ad alta efficienza.
La disponibilità di sistemi ad alte prestazioni per la sintesi ultrasonica (sonica) di peptidi consente di migliorare notevolmente i tassi di sintesi e di aumentare la purezza dei prodotti grezzi. (cfr. Wołczański et al., 2019)
L'indagine sulla racemizzazione. Confronto tra gli spettri 1H NMR significativi di peptidi modello sintetizzati manualmente con l'approccio classico a temperatura ambiente rispetto al metodo a ultrasuoni a temperatura elevata. Gli spostamenti chimici dei protoni α di His e Cys e del gruppo metilenico di Acm (pannelli di sinistra), dei protoni ɣ-metilici di Val (pannelli di destra) mostrano che la sonicazione a 70°C non causa racemizzazione.
(Studio e analisi: Wołczański et al., 2019)
Scissione ultrasonica dei peptidi
Dopo la sintesi di peptidi in fase solida (SPPS), i peptidi sintetizzati devono essere scissi dalle resine polimeriche. Questa fase è nota anche come deprotezione. Se si confrontano i metodi di agitazione e di ultrasuoni per la scissione dei peptidi dalla resina, il metodo di agitazione richiede circa 1 ora, mentre la scissione a ultrasuoni può essere effettuata in 15-20 minuti. La scissione peptidica a ultrasuoni può essere applicata alla scissione di aminoacidi protetti e di peptidi legati a resine di polistirene attraverso legami estere benzilici.
La scissione a ultrasuoni dei peptidi dalla resina di polistirene fornisce rese elevate di peptidi in elevata purezza, senza racemizzazione, con una procedura rapida.
(studio e grafica: ©Anuradha e Ravindranath, 1995)
Reattore agitato a ultrasuoni per una sintesi peptidica migliorata e accelerata. L'immagine mostra il ultrasuonatore UP200St in un reattore di vetro agitato.
Ultrasuonatori ad alte prestazioni per la sintesi dei peptidi
Hielscher Ultrasonics offre diverse soluzioni a ultrasuoni per la sonicazione diretta e indiretta. I processori a ultrasuoni, potenti e controllabili con precisione, forniscono esattamente la giusta quantità di energia a ultrasuoni al recipiente di reazione. Sia che si utilizzino siringhe, provette, piastre a pozzetti multipli o reattori in vetro come recipiente di sintesi, Hielscher Ultrasonics offre l'ultrasuonatore più adatto per la vostra applicazione peptidica.
- peptidi personalizzati
- produzione di peptidi su larga scala
- librerie di peptidi
Molte sintesi peptidiche vengono eseguite in siringhe (ad esempio, reattori a siringa fritta). L'agitatore a ultrasuoni per siringhe di Hielscher sonorizza la soluzione peptidica accoppiando le onde ultrasonore attraverso la parete della siringa nel liquido. L'agitatore a siringa a ultrasuoni è una delle soluzioni a ultrasuoni più diffuse per la sintesi di peptidi assistita da ultrasuoni.
Il corno a tazza a ultrasuoni è uno strumento adatto a sonicare fino a 5 recipienti del reattore, mentre il VialTweeter può contenere fino a dieci provette di reazione e in aggiunta cinque recipienti più grandi tramite un accessorio a morsetto.
Per altri tipi di reattori, come i reattori a fase solida Merrifield o Kamysz e altri recipienti e reattori in polipropilene o borosilicato, Hielscher offre sonicatori per la sonicazione indiretta e diretta con montaggio a morsetto o flangia personalizzati.
Naturalmente, i reattori in vetro con agitazione di dimensioni maggiori, ad esempio quelli destinati alla sintesi in fase liquida, possono essere facilmente dotati di sonde a ultrasuoni (note anche come sonotrodi o corni a ultrasuoni) di qualsiasi dimensione.
- vari tipi di ultrasuoni
- sonicazione diretta e indiretta
- controllo preciso dell'intensità
- controllo preciso della temperatura
- ultrasuoni continui o pulsati
- funzioni intelligenti, dispositivi programmabili
- Disponibile per qualsiasi volume
- Scalabilità lineare
Per la sintesi di peptidi in fase solida su piastre multipozzetto/da microtitolazione, l’UIP400MTP è il dispositivo ideale. La cavitazione ultrasonica viene accoppiata indirettamente e in modo uniforme nei numerosi pozzetti dei campioni, garantendo un trasferimento di massa e una reazione di sintesi ottimali. Guarda il video qui sotto per vedere il Il sonicatore per micropiastre UIP400MTP in azione!
Contattateci! / Chiedi a noi!
Hielscher Ultrasonics produce omogeneizzatori a ultrasuoni ad alte prestazioni per applicazioni di miscelazione, dispersione, emulsione ed estrazione su scala di laboratorio, pilota e industriale.
Informazioni utili sulla sintesi ultrasonica dei peptidi
Cosa sono i peptidi?
I peptidi sono composti in cui più amminoacidi sono legati da legami ammidici, i cosiddetti legami peptidici. Quando sono legati in strutture complesse – Queste grandi strutture peptidiche, tipicamente composte da 50 o più aminoacidi, sono definite proteine. I peptidi sono un elemento essenziale della vita e svolgono numerose funzioni nell'organismo.
Come funziona la sintesi dei peptidi?
In chimica organica, biologia molecolare e scienze biologiche, la sintesi peptidica è il processo di produzione dei peptidi. I peptidi sono sintetizzati chimicamente attraverso la reazione di condensazione del gruppo carbossilico di un amminoacido con il gruppo amminico di un altro amminoacido. Per evitare reazioni collaterali indesiderate con le varie catene laterali degli amminoacidi si utilizzano solitamente strategie di gruppi di protezione (anche gruppi protettivi).
La sintesi chimica (in vitro) dei peptidi inizia il più delle volte con l'accoppiamento del gruppo carbossilico dell'amminoacido in ingresso (C-terminus) all'N-terminus della catena peptidica in crescita. Al contrario di questa sintesi da C a N, la biosintesi naturale di peptidi lunghi negli organismi viventi avviene in direzione opposta. Ciò significa che nella biosintesi l'N-terminale dell'amminoacido in entrata è collegato al C-terminale della catena proteica (N-to-C).
La maggior parte dei protocolli di ricerca e sviluppo per la sintesi dei peptidi si basa su metodi in fase solida, mentre i metodi di sintesi in fase solutiva sono presenti nella produzione industriale di peptidi su larga scala.
Qual è lo stato dell'arte attuale nella sintesi dei peptidi?
SUS-SPPS (SPPS sostenibile assistita da ultrasuoni) È stato dimostrato che questo metodo riduce il processo a sole due fasi per ciclo (accoppiamento/capping/deprotezione combinati + singolo lavaggio), riducendo in modo significativo il consumo di solvente e i tempi di lavorazione. (cfr. Mottola et al., 2025)
TAPS assistito da ultrasuoni è una combinazione emergente che ha dimostrato la propria efficacia nelle sintesi totali (ad esempio, la lipobactina) e che viene attualmente studiata dalle CDMO per la produzione di principi attivi farmaceutici (API).
Scopri i vantaggi della sintesi di peptidi TAGGING assistita da ultrasuoni!
lavorazione continua è oggetto di studio come ulteriore miglioramento – Sono state descritte piattaforme di sintesi continua “one-pot” assistita da tag sililati.
Il settore si sta orientando verso i principi della chimica verde, con gli ultrasuoni e il TAPS che contribuiscono entrambi a ridurre l'uso di solventi, a diminuire il carico di reagenti e a migliorare la sostenibilità.
Letteratura / Riferimenti
- Merlino, F., Tomassi, S., Yousif, A. M., Messere, A., Marinelli, L., Grieco, P., Novellino, E., Cosconati, S., Di Maro, S. (2019): Boosting Fmoc Solid-Phase Peptide Synthesis by Ultrasonication. Organic Letters, 21(16), 2019. 6378–6382.
- Andrew M. Bray; Liana M. Lagniton; Robert M. Valerio; N.Joe Maeji (1994): Sonication-assisted cleavage of hydrophobic peptides. Application in multipin peptide synthesis. Tetrahedron Letters 35(48), 1994. 9079–9082.
- Silva, R., Franco Machado, J., Gonçalves, K., Lucas, F. M., Batista, S., Melo, R., Morais, T. S., & Correia, J. (2021): Ultrasonication Improves Solid Phase Synthesis of Peptides Specific for Fibroblast Growth Factor Receptor and for the Protein-Protein Interface RANK-TRAF6. Molecules (Basel, Switzerland), 26(23), 7349.
- Conejos-Sanchez, Inmaculada; Duro Castaño, Aroa; Vicent, María (2014): Peptide-Based Polymer Therapeutics. Polymers. 6. 515-551.
- Raheem, Shvan J; Schmidt, Benjamin W; Solomon, Viswas Raja; Salih, Akam K; Price, Eric W (2020): Ultrasonic-Assisted Solid-Phase Peptide Synthesis of DOTA-TATE and DOTA-linker-TATE Derivatives as a Simple and Low-Cost Method for the Facile Synthesis of Chelator-Peptide Conjugates. ACS Bioconjugate Chemistry, 2020.
- Salvatore Mottola, Alessandra Del Bene, Vincenzo Mazzarella, Roberto Cutolo, Ida Boccino, Francesco Merlino, Sandro Cosconati, Salvatore Di Maro, Anna Messere (2015): Sustainable Ultrasound-Assisted Solid-Phase peptide synthesis (SUS-SPPS): Less Waste, more efficiency. Ultrasonics Sonochemistry, Volume 114, 2025.
- M.V. Anuradha, B. Ravindranath (1995): Ultrasound in peptide synthesis. 4: Rapid cleavage of polymer-bound protected peptides by alkali and alkanolamines. Tetrahedron Volume 51, Issue 19, 1995. 5675-5680.
- Wołczański, G., Płóciennik, H., Lisowski, M., Stefanowicz, P. (2019): The faster peptide synthesis on the solid phase using ultrasonic agitation. Tetrahedron Letters, 2019.
Hielscher Ultrasonics produce omogeneizzatori a ultrasuoni ad alte prestazioni da laboratorio a dimensioni industriali.