Taglio del DNA a ultrasuoni

Durante il taglio del DNA e dell'RNA, le lunghe molecole di DNA vengono frammentate in pezzi più piccoli, una fase cruciale nella preparazione dei campioni per la costruzione di librerie di sequenziamento di prossima generazione (NGS). La tranciatura del DNA a ultrasuoni impiega forze di cavitazione acustica per rompere il DNA o l'RNA in frammenti che vanno da 100 bp a 5 kb. Questo metodo consente un controllo preciso sulle dimensioni dei frammenti, facilitando la personalizzazione della lunghezza del DNA desiderata per ottenere risultati di sequenziamento ottimali.

Taglio del DNA mediante ultrasuoni

Hielscher Ultrasonics offre diverse soluzioni basate sugli ultrasuoni per il taglio di DNA, RNA e cromatina. Scegliete tra gli ultrasuonatori a sonda (ad esempio UP100H) per la sonicazione diretta con un micropuntale, oppure utilizzate il VialTweeeter o il cuphorn a ultrasuoni per la preparazione indiretta del DNA di vari campioni contemporaneamente. Hielscher offre il dispositivo ideale in base alle vostre esigenze: sia che abbiate 1 o fino a 10 campioni, sia che abbiate volumi da microlitri a litri. – I sonicatori Hielscher soddisfano le vostre esigenze per preparare frammenti di DNA, RNA e cromatina della giusta lunghezza. Riproducibilità, facilità d'uso e controllo preciso consentono di ottenere una libreria affidabile per il sequenziamento di prossima generazione.
A differenza della frammentazione enzimatica del DNA, la tranciatura a ultrasuoni applica forze di taglio meccaniche pure, senza l'aggiunta di sostanze chimiche. Grazie alla precisa impostazione dei parametri di processo, la tranciatura a ultrasuoni produce frammenti di DNA ad alto peso molecolare (DNA plasmidico e genomico).
Gli acidi nucleici purificati possono essere amplificati prima o dopo una fase di frammentazione.
I parametri di sonicazione (potenza, ciclo di impulsi/burst, tempo e temperatura) possono essere controllati in modo sicuro tramite impostazioni software.

Protocolli per il taglio del DNA a ultrasuoni

Per il saggio di immunoprecipitazione della cromatina

In breve, le cellule sono state piastrate in piatti di 60 mm di diametro (400.000 per piatto) e trasfettate con RhoA siRNA (come descritto); dopo 72 ore, sono state incubate con formaldeide (concentrazione finale, 1%) per 10 minuti a 37°C per reticolare le proteine al DNA. La reazione di reticolazione è stata spenta con l'aggiunta di un decimo di volume di glicina 1,25 mol/L, per una concentrazione finale di 125 mmol/L. Le cellule sono state lavate due volte con PBS freddo, risospese in un tampone per il saggio di radioimmunoprecipitazione [150 mmol/L NaCl, 1% NP40, 0,5% deossicolato, 0,1% SDS, 5 mmol/L EDTA, 50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)] contenente 1 mmol/L fenilmetilsulfonilfluoruro, 1 Ag/mL aprotinina e 1 Ag/mL pepstatina A e mantenute in ghiaccio per 30 minuti. Successivamente, i lisati cellulari sono stati sonicati in ghiaccio con un Hielscher UP200S (3 x 40 s, ampiezza 40%, ciclo 1; Hielscher Ultrasonics GmbH) fino a quando le cromatine reticolate sono state tagliate per ottenere frammenti di DNA tra 200 e 1.000 bp. Un decimo dell'intero lisato è stato utilizzato per quantificare la quantità di DNA presente nei diversi campioni e considerato come “DNA totale in ingresso”. I sopranatanti sono stati incubati con DNA di salmone/agarosio proteico al 50% per ridurre il background aspecifico. L'immunoprecipitazione è stata quindi effettuata per una notte a 4°C con 5 Ag di anti-NF-nB p65 (Upstate) o senza anticorpo (controllo negativo). Questi surnatanti sono stati integrati con 5 mol/L NaCl e riscaldati per una notte a 65°C per invertire i legami incrociati proteina-DNA. Gli immunocomplessi sono stati ulteriormente trattati con proteinasi K priva di DNasi e RNasi e il DNA è stato purificato mediante estrazione con fenolo/cloroformio e precipitazione con etanolo. La PCR è stata eseguita con primer specifici corrispondenti a una sequenza all'interno della regione promotrice del gene iNOS umano (primer p1: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; primer p2: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et al., 2008)

Studi di espressione di EGFP

Per gli studi di espressione, il ceppo ricombinante L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat#12 (Jena Bioscience, Germania) con il gene per EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein), cromosomicamente integrato in ssu, è stato coltivato nei vari terreni di coltura come descritto in precedenza e in aggiunta integrato con 100 mg l^-1 Nourseothricin (Jena Bioscience, Germania). Durante la coltivazione, sono stati prelevati campioni da 1 ml, centrifugati (2000 × g, 20°C, 10 min) e lavati con una soluzione di NaCl allo 0,9%. Il pellet è stato risospeso in un tampone (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) e disintegrato mediante sonificazione con un processore a ultrasuoni. UP400S (applicazione di energia ∼ 400 Ws). I detriti cellulari sono stati rimossi mediante centrifugazione (6000 × g, 4°C, 5 min) e analizzati mediante elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato e poliacrilammide (SDS-PAGE) in condizioni riducenti secondo il metodo di Laemmli (1970) con gel di poliacrilammide al 12,5%. L'espressione di EGFP è stata esaminata in coltura agitata. (Fritsche et al. 2007)

Immunoprecipitazione della cromatina

Il saggio di immunoprecipitazione della cromatina è stato eseguito utilizzando il ChIP-IT^TM Express (Active Motif, Carlsbad, CA, USA) secondo le istruzioni del produttore con alcune modifiche. In breve, i podociti umani differenziati sono stati reticolati con formaldeide all'1% per 10 minuti a temperatura ambiente. Le cellule sono state lavate con PBS ghiacciato e la reazione di fissazione è stata interrotta aggiungendo 0,125 M di glicina per 5 minuti a temperatura ambiente. Le celle sono state lavate di nuovo con PBS ghiacciato e raschiate dal piatto. Le cellule sono state pellettate mediante centrifugazione e risospese nel tampone di lisi. Dopo la centrifugazione, i nuclei pellettati sono stati risospesi nel tampone di taglio, incubati su ghiaccio per 30 minuti e la cromatina è stata tranciata mediante sonicazione, ad es. UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Germania) al 25% di potenza per 5 impulsi di 20 secondi ciascuno, in ghiaccio, in frammenti di circa 200-600 bp. La cromatina tagliata è stata poi centrifugata e il surnatante è stato raccolto. Per le immunoprecipitazioni, 60 μl di cromatina sono stati incubati con 1 μg di anticorpi Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, UK) o NF-κB p50 (Abcam) o con IgG di coniglio (Zymed Laboratories), come controllo negativo, per una notte a 4°C con una leggera rotazione. Gli immunocomplessi legati alle microsfere magnetiche sono stati raccolti con un supporto magnetico, lavati abbondantemente e i legami incrociati proteina/DNA sono stati invertiti e il DNA eluito per l'analisi PCR in tempo reale. (Ristola et al. 2009)

Preparazione del DNA di EHEC per l'analisi con chip array

Disposizione dei lisati cellulari e dei DNA estratti
I pellet batterici sospesi in PBS alla concentrazione finale desiderata sono stati trattati con Distruttore a ultrasuoni UP100H (Hielscher GmbH, Germania) dotato di un microtip MS1 (1 mm di diametro). La frequenza operativa era di 30 kHz e la potenza di uscita effettiva di 100 W. Durante l'operazione, i campioni sono stati raffreddati in un bagno di acqua e ghiaccio, mescolati e centrifugati. I campioni sono stati utilizzati per gli studi di citometria a flusso, mentre per la successiva manipolazione sono stati sottoposti a un trattamento termico (95°C, 5 min). I lisati cellulari grezzi sono stati trattati con una miscela di fenolo:cloroformio:alcool isoamilico (25:24:1). Un volume uguale di questa miscela è stato aggiunto al campione di lisato, la soluzione è stata agitata vigorosamente per 15 s e centrifugata a 15.000 x g per 2 min a temperatura ambiente (RT) intorno ai 22°C. La fase acquosa superiore contenente il DNA genomico è stata accuratamente separata e raccolta in una nuova provetta Eppendorf sterile.
Successivamente, i campioni sono stati sonicati per frammentare il DNA. La fase di sonicazione è stata realizzata nelle stesse condizioni descritte sopra. Per valutare gli effetti della frammentazione sul DNA genomico, i campioni sono stati analizzati mediante elettroforesi su gel di agarosio.
(…I campioni precedentemente sonicati per 2,5 minuti sono stati sottoposti a una fase di estrazione dopo il trattamento termico e la centrifugazione. Il DNA rilasciato è stato estratto due volte con una miscela di fenolo:cloroformio:alcool isoamilico e successivamente sottoposto a una seconda sonicazione per 0 - 15 min. L'elettroforesi su gel di agarosio è stata utilizzata per determinare la distribuzione dimensionale del DNA sottoposto a frammentazione ultrasonica post-estrazione (Fig. in alto a destra). Il DNA altamente frammentato era evidente dalla presenza di uno striscio di DNA piuttosto che di bande ad alto peso molecolare che venivano eliminate dai campioni sonicati per 2,5 minuti o più. Una sonicazione più lunga ha gradualmente ridotto la lunghezza dei frammenti a circa 150-600 bp e la sonicazione per 15 minuti ha ulteriormente degradato questi frammenti, come si può vedere soprattutto nella parte superiore dello striscio. Pertanto, la dimensione media dei frammenti di DNA è diminuita gradualmente con il tempo di ultrasonicazione e il trattamento di 5 minuti ha permesso di ottenere le dimensioni dei frammenti di DNA più adatte per i saggi con chip array. Infine, è stata stabilita la procedura di preparazione dell'analita DNA che comprende i primi 2 minuti di trattamento a ultrasuoni, l'estrazione del DNA (2×) e la successiva sonicazione di 5 minuti. (Basselet et al. 2008)

Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP)

Le cellule HEK293 sono state coltivate come descritto sopra e fissate con disuccinimidil-glutarato 2 mM per 45 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, le cellule sono state lavate due volte con PBS. La cromatina è stata reticolata per 10 minuti a temperatura ambiente con formaldeide all'1% (v/v) e lavata due volte con PBS freddo. La reazione di reticolazione è stata interrotta mediante incubazione con glicina a una concentrazione finale di 0,125 M per 5 minuti a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione con tripsina, le cellule sono state raschiate dal piatto di coltura cellulare e lavate due volte con PBS. Il pellet cellulare è stato risospeso in un tampone di lisi (5 mM Pipes, pH 8.0, 85 mM KCl e 0,5% (v/v) Nonidet P-40), incubato in ghiaccio per 10 minuti e omogeneizzato con un omogeneizzatore Dounce. Successivamente, i nuclei sono stati pellettati mediante centrifugazione (3500 x g, 5 min, 4 °C) e risospesi in tampone nuclei (50 mM Tris-HCl, pH 8.1, 10 mM EDTA e 1% (w/v) SDS). I nuclei sono stati disgregati mediante sonicazione con tre impulsi di 20 secondi in un Sonicatore UP50H (Hielscher Ultraschall Technologie) con un'impostazione di ciclo 0,5 e ampiezza 30%, ottenendo frammenti di DNA genomico con dimensioni di 200-1000 bp. Per la ChIP, 50 g di DNA sono stati diluiti 4 volte in tampone di immunoprecipitazione (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA, 1,1% (v/v) Triton X-100 e 0,01% (w/v) SDS) (Weiske et al. 2006).

Analisi delle modificazioni istoniche mediante immunoprecipitazione della cromatina (ChIP)

Brevemente, 6 x 10⁶ le cellule sono state lavate due volte con PBS e reticolate sulla piastra di coltura per 15 minuti a temperatura ambiente in presenza di formaldeide allo 0,5%. La reazione di reticolazione è stata arrestata aggiungendo glicina 0,125 M. Tutte le fasi successive sono state eseguite a 48°C. Tutti i tamponi sono stati pre-raffreddati e contenevano inibitori delle proteasi (Complete Mini, Roche). Le cellule sono state lavate due volte con PBS e poi raschiate. I pellet raccolti sono stati disciolti in 1 ml di tampone di lisi (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) e sono stati sonicati in un bagno di etanolo freddo per 10 cicli al 100% di ampiezza utilizzando un Sonicatore UP50H (Hielscher, Teltow, Germania). La frammentazione della cromatina è stata visualizzata in un gel di agarosio all'1%. I frammenti ottenuti erano compresi nell'intervallo 200-500pb. La cromatina solubile è stata ottenuta centrifugando i campioni sonicati a 14.000g per 10 min a 48°C. La frazione solubile è stata diluita 1/10 in tampone di diluizione (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl), quindi aliquotata e conservata a 80°C fino al momento dell'uso. (Rodriguez et al. 2008)