Frammentazione del DNA mediante taglio a ultrasuoni

Durante la frammentazione del DNA e dell’RNA mediante taglio, le lunghe molecole di DNA vengono frammentate in segmenti più piccoli, un passaggio fondamentale nella preparazione dei campioni per la costruzione di librerie per il sequenziamento di nuova generazione (NGS). La frammentazione del DNA mediante taglio a ultrasuoni sfrutta le forze della cavitazione acustica per suddividere il DNA o l’RNA in frammenti di dimensioni comprese tra 100 bp e 5 kb. Questo metodo consente un controllo preciso delle dimensioni dei frammenti, facilitando l’adattamento alla lunghezza desiderata del DNA per ottenere risultati di sequenziamento ottimali.

Frammentazione del DNA mediante taglio a ultrasuoni

Hielscher Ultrasonics offre diverse soluzioni basate sugli ultrasuoni per la frammentazione mediante taglio del DNA, dell’RNA e della cromatina. Scegliete un sonicatore a sonda (ad es. UP100H) per la sonicazione diretta con una micropunta, oppure utilizzate VialTweeeter o il cuphorn a ultrasuoni per la preparazione indiretta del DNA di più campioni contemporaneamente. Hielscher offre il dispositivo ideale per le vostre esigenze: che abbiate 1 o fino a 10 campioni, con volumi dai microlitri ai litri – i sonicatori Hielscher soddisferanno le vostre esigenze di preparazione di frammenti di DNA, RNA e cromatina della lunghezza corretta. Riproducibilità, facilità d’uso e controllo preciso consentono di ottenere una libreria affidabile per il sequenziamento di nuova generazione.
A differenza della frammentazione enzimatica del DNA, il taglio a ultrasuoni applica forze di taglio puramente meccaniche senza aggiungere sostanze chimiche. Grazie alla precisa impostazione dei parametri di processo, il taglio a ultrasuoni produce frammenti di DNA ad alto peso molecolare (DNA plasmidico e genomico).
Gli acidi nucleici purificati possono essere amplificati prima o dopo una fase di frammentazione.
I parametri di sonicazione (potenza, ciclo degli impulsi / sequenze di impulsi, tempo e temperatura) possono essere controllati in modo sicuro tramite le impostazioni del software.

Protocolli per la frammentazione del DNA mediante taglio a ultrasuoni

Per il saggio di immunoprecipitazione della cromatina

In breve, le cellule sono state seminate in piastre di 60mm di diametro (400.000 per piastra) e trasfettate con siRNA di RhoA (come descritto); dopo 72 h, sono state incubate con formaldeide (concentrazione finale, 1%) per 10 min a 37°C per reticolare le proteine al DNA. La reazione di reticolazione è stata arrestata aggiungendo un decimo del volume di glicina 1,25 mol/L, ottenendo una concentrazione finale di 125 mmol/L. Le cellule sono state lavate due volte con PBS raffreddato in ghiaccio, risospese in tampone per il saggio di radioimmunoprecipitazione [150 mmol/L NaCl, 1% NP40, 0,5% desossicolato, 0,1% SDS, 5 mmol/L EDTA, 50 mmol/L Tris-HCl (pH 8,0)] contenente 1 mmol/L di fluoruro di fenilmetilsolfonile, 1 Ag/mL di aprotinina e 1 Ag/mL di pepstatina A, e mantenute in ghiaccio per 30 min. Successivamente, i lisati cellulari sono stati sonicati in ghiaccio con un Hielscher UP200S , sonicatore a ultrasuoni (3 x 40 s, ampiezza 40%, ciclo 1; Hielscher Ultrasonics GmbH), fino a frammentare mediante taglio la cromatina reticolata e ottenere frammenti di DNA compresi tra 200 e 1.000 bp. Un decimo del lisato totale è stato utilizzato per quantificare la quantità di DNA presente nei diversi campioni ed è stato considerato come “DNA totale in ingresso”. I surnatanti sono stati incubati con una sospensione al 50% di DNA di sperma di salmone/proteina-agarosio per ridurre il fondo aspecifico. L’immunoprecipitazione è stata quindi eseguita durante la notte a 4°C con 5 Ag di anti-NF-nB p65 (Upstate) oppure senza anticorpo (controllo negativo). A questi surnatanti è stato aggiunto NaCl 5 mol/L e sono stati riscaldati durante la notte a 65°C per invertire la reticolazione proteina-DNA. Gli immunocomplessi sono stati ulteriormente trattati con proteinasi K priva di DNasi e RNasi, e il DNA è stato purificato mediante estrazione con fenolo/cloroformio e precipitazione con etanolo. La PCR è stata eseguita con primer specifici corrispondenti a una sequenza all’interno della regione promotrice del gene iNOS umano (primer p1: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; primer p2: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et al., 2008)

Studi sull’espressione di EGFP

Per gli studi di espressione, il ceppo ricombinante L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat#12 (Jena Bioscience, Germania), con il gene per EGFP (proteina fluorescente verde potenziata) integrato nel sito ssu cromosomico, è stato coltivato nei diversi terreni come descritto in precedenza, con l’ulteriore aggiunta di 100 mg l^-1 di Nourseothricin (Jena Bioscience, Germania). Durante la coltivazione, sono stati prelevati campioni di 1 ml, centrifugati (2000 × g, 20°C, 10 min) e lavati con una soluzione di NaCl allo 0,9%. Il pellet è stato risospeso in tampone (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) e disgregato mediante sonicazione con il processore a ultrasuoni UP400S (applicazione di energia ∼ 400 Ws). I detriti cellulari sono stati rimossi mediante centrifugazione (6000 × g, 4°C, 5 min) e analizzati mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide con sodio dodecilsolfato (SDS-PAGE) in condizioni riducenti secondo il metodo di Laemmli (1970), con gel di poliacrilammide al 12,5%. L’espressione di EGFP è stata esaminata in coltura sotto agitazione. (Fritsche et al. 2007)

Immunoprecipitazione della cromatina

Il saggio di immunoprecipitazione della cromatina è stato eseguito utilizzando ChIP-IT^TM Express (Active Motif, Carlsbad, CA, USA) secondo le istruzioni del produttore, con alcune modifiche. In breve, i podociti umani differenziati sono stati reticolati con formaldeide all’1% per 10 min a temperatura ambiente. Le cellule sono state lavate con PBS raffreddato in ghiaccio e la reazione di fissazione è stata arrestata aggiungendo glicina 0,125 M per 5 min a temperatura ambiente. Le cellule sono state nuovamente lavate con PBS raffreddato in ghiaccio e raschiate dalla piastra. Le cellule sono state raccolte in pellet mediante centrifugazione e risospese nel tampone di lisi. Dopo la centrifugazione, i nuclei raccolti in pellet sono stati risospesi nel tampone di frammentazione mediante taglio, incubati in ghiaccio per 30 min e la cromatina è stata frammentata mediante sonicazione, ad es. con UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Germania) al 25% della potenza, con 5 impulsi di 20 sec ciascuno in ghiaccio, ottenendo frammenti di circa 200–600 bp. La cromatina frammentata è stata quindi centrifugata e il surnatante è stato raccolto. Per le immunoprecipitazioni, 60 μl di cromatina sono stati incubati con 1 μg di anticorpi contro Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, Regno Unito) o NF-κB p50 (Abcam), oppure con IgG di coniglio (Zymed Laboratories) come controllo negativo, durante la notte a 4°C con rotazione delicata. Gli immunocomplessi legati alle sfere magnetiche sono stati raccolti utilizzando un supporto magnetico, lavati accuratamente, e la reticolazione proteina/DNA è stata invertita; il DNA è stato eluito per l’analisi mediante PCR in tempo reale. (Ristola et al. 2009)

Preparazione del DNA di EHEC per l’analisi su microarray

Preparazione dei lisati cellulari e dei DNA estratti
I pellet batterici sospesi in PBS alla concentrazione finale desiderata sono stati trattati con il disgregatore a ultrasuoni UP100H (Hielscher GmbH, Germania) dotato di una micropunta MS1 (1mm di diametro). La frequenza operativa era di 30 kHz e la potenza effettiva in uscita era di 100 W. Durante l’operazione, i campioni sono stati raffreddati in un bagno di acqua e ghiaccio, miscelati e centrifugati. I campioni sono stati utilizzati per studi di citometria a flusso, mentre per le manipolazioni successive sono stati sottoposti a un trattamento termico (95°C, 5 min). I lisati cellulari grezzi sono stati trattati con una miscela di fenolo:cloroformio:alcol isoamilico (25:24:1). Al campione di lisato è stato aggiunto un volume uguale di questa miscela; la soluzione è stata agitata vigorosamente su vortex per 15 s e centrifugata a 15.000 x g per 2 min a temperatura ambiente (RT), circa 22°C. La fase acquosa superiore contenente il DNA genomico è stata separata con cura e raccolta in una nuova provetta Eppendorf sterile.
Successivamente, i campioni sono stati sonicati per frammentare il DNA. La fase di sonicazione è stata eseguita nelle stesse condizioni descritte sopra. Per valutare gli effetti della frammentazione sul DNA genomico, i campioni sono stati analizzati mediante elettroforesi su gel di agarosio.
(…) I campioni precedentemente sonicati per 2,5 min sono stati sottoposti a una fase di estrazione dopo il trattamento termico e la centrifugazione. Il DNA rilasciato è stato estratto due volte con una miscela di fenolo:cloroformio:alcol isoamilico e successivamente sottoposto a una seconda sonicazione per 0 – 15 min. L’elettroforesi su gel di agarosio è stata utilizzata per determinare la distribuzione dimensionale del DNA sottoposto a frammentazione a ultrasuoni dopo l’estrazione (Fig. in alto a destra). La presenza di DNA altamente frammentato era evidente da una strisciata diffusa di DNA anziché da bande ad alto peso molecolare, che erano state eliminate dai campioni sonicati per 2,5 min o più. Una sonicazione più lunga ha ridotto gradualmente la lunghezza dei frammenti a circa 150 – 600 bp, e la sonicazione per 15 min ha ulteriormente degradato questi frammenti, come si può osservare soprattutto nella parte superiore della strisciata. Pertanto, le dimensioni medie dei frammenti di DNA sono diminuite gradualmente con il tempo di sonicazione e il trattamento di 5 min ha consentito di ottenere le dimensioni dei frammenti di DNA più adatte ai saggi su microarray. Infine, è stata definita la procedura di preparazione dell’analita DNA, comprendente inizialmente 2 min di trattamento a ultrasuoni, l’estrazione del DNA (2×) e una successiva sonicazione di 5 min. (Basselet et al. 2008)

Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP)

Le cellule HEK293 sono state coltivate come descritto sopra e fissate con glutarato di disuccinimidile 2 mM per 45 min a temperatura ambiente. Successivamente, le cellule sono state lavate due volte con PBS. La cromatina è stata reticolata per 10 min a temperatura ambiente utilizzando formaldeide all’1% (v/v) e lavata due volte con PBS raffreddato in ghiaccio. La reazione di reticolazione è stata arrestata mediante incubazione con glicina a una concentrazione finale di 0,125 M per 5 min a temperatura ambiente. Dopo l’incubazione con tripsina, le cellule sono state raschiate dalla piastra di coltura cellulare e lavate due volte con PBS. Il pellet cellulare è stato risospeso in tampone di lisi (5 mM Pipes, pH 8,0, 85 mM KCl e 0,5% (v/v) Nonidet P-40), incubato in ghiaccio per 10 min e omogeneizzato con un omogeneizzatore Dounce. Successivamente, i nuclei sono stati raccolti in pellet mediante centrifugazione (3500 x g, 5 min, 4 °C) e risospesi in tampone per nuclei (50 mM Tris-HCl, pH 8,1, 10 mM EDTA e 1% (w/v) SDS). I nuclei sono stati disgregati mediante sonicazione con tre impulsi di 20 s in un sonicatore UP50H (Hielscher Ultraschall Technologie), impostando il ciclo a 0,5 e l’ampiezza al 30%, ottenendo frammenti di DNA genomico prevalentemente di dimensioni comprese tra 200 – 1000 bp. Per la ChIP, 50g di DNA sono stati diluiti 4 volte in tampone di immunoprecipitazione (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA, 1,1% (v/v) Triton X-100 e 0,01% (w/v) SDS). (Weiske et al. 2006)

Analisi delle modificazioni degli istoni mediante immunoprecipitazione della cromatina (ChIP)

In breve, 6 x 10⁶ cellule sono state lavate due volte con PBS e reticolate sulla piastra di coltura per 15 min a temperatura ambiente in presenza di formaldeide allo 0,5%. La reazione di reticolazione è stata arrestata aggiungendo glicina 0,125 M. Tutte le fasi successive sono state eseguite a 48°C. Tutti i tamponi erano stati preraffreddati e contenevano inibitori delle proteasi (Complete Mini, Roche). Le cellule sono state lavate due volte con PBS e poi raschiate. I pellet raccolti sono stati sciolti in 1 ml di tampone di lisi (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) e sonicati in un bagno di etanolo freddo per 10 cicli al 100% di ampiezza utilizzando un sonicatore UP50H (Hielscher, Teltow, Germania). La frammentazione della cromatina è stata visualizzata su gel di agarosio all’1%. I frammenti ottenuti erano nell’intervallo 200–500pb. La cromatina solubile è stata ottenuta centrifugando i campioni sonicati a 14.000g per 10 min a 48°C. La frazione solubile è stata diluita 1/10 in tampone di diluizione (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl), quindi suddivisa in aliquote e conservata a 80°C fino all’uso. (Rodriguez et al. 2008)