• Durante il taglio del DNA e dell'RNA, le molecole di DNA vengono spezzate in pezzi più piccoli. La frammentazione del DNA / RNA è una delle importanti fasi di preparazione del campione necessarie per creare librerie per il sequenziamento di prossima generazione (NGS).
• Il taglio ultrasonico del DNA utilizza le forze della cavitazione acustica per rompere il DNA o l'RNA in pezzi di 100 – 5kb bp.
• Il taglio ad ultrasuoni consente una precisa frammentazione del DNA e l'adattamento alla lunghezza del DNA desiderata.

Taglio del DNA tramite ultrasuoni

Hielscher Ultrasonics offre varie soluzioni a ultrasuoni per il taglio del DNA, dell'RNA e della cromatina. Scegliere tra una sonda ad ultrasuoni (ad es. UP100H) per la sonicazione diretta mediante micropunta, oppure utilizzare il VialTweeeter o il cuphorn ad ultrasuoni per la preparazione indiretta del DNA di diversi campioni contemporaneamente. Hielscher offre il dispositivo ideale in base alle tue esigenze: sia che tu abbia 1 o fino a 10 campioni, volumi da microlitri a volumi da litro. – I processori ad ultrasuoni Hielscher sono disponibili per soddisfare le vostre esigenze per preparare frammenti di DNA, RNA e cromatina alla giusta lunghezza. Riproducibilità, facilità d'uso e controllo preciso consentono di disporre di una libreria affidabile per il sequenziamento di nuova generazione.
A differenza della frammentazione enzimatica del DNA, il taglio ad ultrasuoni applica forze di taglio puramente meccaniche senza l'aggiunta di sostanze chimiche. Grazie alla precisa impostazione dei parametri di processo, la cesoiatura ad ultrasuoni produce frammenti di DNA ad alto peso molecolare (DNA plasmide e genomico).
Gli acidi nucleici purificati possono essere amplificati prima o dopo una fase di frammentazione.
I parametri di sonicazione (potenza, ciclo di impulsi/interventi, tempo e temperatura) possono essere controllati in modo sicuro tramite le impostazioni software.

Protocolli per il taglio del DNA ad ultrasuoni

Per il test di immunoprecipitazione della cromatina

In breve, le cellule sono state placcate in piatti di 60 mm di diametro (400.000 per piatto) e trasfettate con RhoA siRNA (come descritto); dopo 72 ore, sono state incubate con formaldeide (concentrazione finale, 1%) per 10 minuti a 37°C per reticolare le proteine al DNA. La reazione di reticolazione è stata placata con l'aggiunta di un decimo di volume di 1,25 mol/L di glicina, dando una concentrazione finale di 125 mmol/L. Le cellule sono state lavate due volte con PBS ghiacciato, risospese in tampone per il test di radioimmunoprecipitazione [150 mmol/L NaCl, 1% NP40, 0,5% desossicolato, 0,1% SDS, 5 mmol/L EDTA, 50 mmol/L Tris-HCl (pH 8,0)] contenente 1 mmol/L fenilmetilsulfonil fluoruro, 1 Ag/mL aprotinina, e 1 Ag/mL pepstatina A, e tenute in ghiaccio per 30 min. Poi, i lisati cellulari sono stati sonicati su ghiaccio con un Hielscher UP200S ecografia sonicator (3 x 40 s, ampiezza 40%, ciclo 1; Hielscher Ultrasonics GmbH) fino a quando le cromatine reticolate sono state tosate per produrre frammenti di DNA tra 200 e 1.000 bp. Un decimo del lisato intero è stato utilizzato per quantificare la quantità di DNA presente in diversi campioni e considerato come “DNA totale in ingresso”. I surnatanti sono stati incubati con DNA degli spermatozoi di salmone / proteine agarosio -50% slurry per ridurre il background non specifico. L'immunoprecipitazione è stata poi effettuata durante la notte a 4°C con 5 Ag di anti-NF-nB-nB p65 (Upstate) o senza anticorpi (controllo negativo). Questi surnatanti sono stati integrati con 5 mol/L NaCl e riscaldati per una notte a 65°C per ripristinare i cross-link proteina-DNA. Gli immunocomplessi sono stati ulteriormente trattati con proteinasi K priva di DNasi e RNasi, mentre il DNA è stato purificato mediante estrazione fenolo/cloroforme e precipitazione di etanolo. La PCR è stata effettuata con primer specifici corrispondenti ad una sequenza all'interno della regione promotrice del gene umano iNOS (p1 primer: 5¶-GAGGGGGCTTTTTCCCCCA- GAACCAAG-3¶; p2 primer: GCTGGGGGCTGACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et al., 2008)

Studi di espressione dell'EGFP

Per gli studi sull'espressione, il ceppo ricombinante L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat#12 (Jena Bioscience, Germania) con il gene per EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein), ssu cromosomico integrato, è stato coltivato nei vari terreni come descritto in precedenza e ulteriormente integrato con 100 mg l^-1 Nourseothricin (Jena Bioscience, Germania). Durante la coltivazione sono stati prelevati 1 ml di campioni, centrifugati (2000 × g, 20°C, 10 min) e lavati con soluzione di NaCl allo 0,9%. Il pellet è stato risospeso in tampone (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) e disintegrato mediante sonificazione con il processore ad ultrasuoni. UP400S (applicazione di energia ∼ 400 Ws). I detriti cellulari sono stati rimossi mediante centrifugazione (6000 × g, 4°C, 5 min) e analizzati con elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato di poliacrilammide (SDS-PAGE) in condizioni riducenti secondo il metodo di Laemmli (1970) con gel di poliacrilammide al 12,5%. EGFP-espressione è stata esaminata in cultura agitata. (Fritsche et al. 2007)

Immunoprecipitazione cromatina

Il test di immunoprecipitazione della cromatina è stato eseguito utilizzando il ChIP-IT^TM Express (Active Motif, Carlsbad, CA, USA) secondo le istruzioni del produttore con alcune modifiche. Brevemente, i podociti umani differenziati sono stati reticolati con 1% di formaldeide per 10 minuti a temperatura ambiente. Le cellule sono state lavate con PBS ghiacciato e la reazione di fissazione è stata fermata aggiungendo 0,125 M di glicina per 5 minuti a temperatura ambiente. Le cellule sono state lavate di nuovo con PBS ghiacciato e raschiate dal piatto. Le cellule sono state pellettate mediante centrifugazione e risospese nel tampone di lisi. Dopo la centrifugazione, i nuclei pellettizzati sono stati risospesi nel tampone di taglio, incubati su ghiaccio per 30 minuti e la cromatina è stata tosata mediante sonicazione, ad es. UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Germania) al 25% di potenza 5 impulsi di 20 secondi ciascuno su ghiaccio in frammenti di circa 200-600 bp. La cromatina tosata è stata poi centrifugata e il surnatante è stato raccolto. Per le immunoprecipitazioni, 60 μl di cromatina sono stati incubati con 1 μg di anticorpi Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, UK) o NF-κB p50 (Abcam) o con coniglio IgG (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA, USA), come controllo negativo, per una notte a 4°C con rotazione dolce. Immunocomplessi legati a perle magnetiche sono stati raccolti utilizzando un supporto magnetico, lavati a lungo, e i legami incrociati proteina / DNA sono stati invertiti e DNA eluito per l'analisi PCR in tempo reale. (Ristola et al. 2009)

Preparazione del DNA EHEC per l'analisi del chip array

Disposizione dei lisati cellulari e dei DNA estratti
I pellet batterici sospesi in PBS alla concentrazione finale desiderata sono stati trattati con perturbatore ad ultrasuoni UP100H (Hielscher GmbH, Germania) dotata di un micropunta MS1 (1 mm di diametro). La frequenza operativa era di 30 kHz e la potenza di uscita effettiva era di 100 W. Durante l'operazione, i campioni sono stati raffreddati in un bagno di acqua ghiacciata, miscelati e centrifugati. I campioni sono stati utilizzati per studi di citometria a flusso, mentre per la successiva manipolazione, i campioni sono stati sottoposti ad un trattamento termico (95°C, 5 min). I lisati cellulari grezzi sono stati trattati con una miscela di fenolo:cloroformio:alcool isoamilico (25:24:1). Un volume uguale di questa miscela è stato aggiunto al campione di lisato, la soluzione è stata vortexata vigorosamente per 15 s e centrifugata a 15.000 x g per 2 minuti a temperatura ambiente (RT) intorno ai 22°C. La fase acquosa superiore contenente il DNA genomico è stata accuratamente separata e raccolta in una nuova provetta sterile Eppendorf.
Successivamente, i campioni sono stati sonicati per frammentare il DNA. La fase di sonicazione è stata realizzata nelle stesse condizioni sopra descritte. Per valutare gli effetti di frammentazione sul DNA genomico, i campioni sono stati analizzati utilizzando l'elettroforesi su gel di agarosio.
(…I campioni sonicati in precedenza per 2,5 minuti sono stati sottoposti ad una fase di estrazione dopo trattamento termico e centrifugazione. Il DNA rilasciato è stato estratto due volte con una miscela di fenolo:cloroformio:alcool isoamilico, e successivamente sottoposto a seconda sonicazione per 0 - 15 min. L'elettroforesi su gel di agarosio è stata utilizzata per determinare la distribuzione dimensionale del DNA sottoposto a frammentazione ultrasonica post-estrattiva (Fig. in alto a destra). Il DNA altamente frammentato era evidente dalla presenza di uno striscio di DNA piuttosto che di bande ad alto peso molecolare che sono state eliminate da campioni sonicati per 2,5 minuti o più a lungo. Una sonicazione più lunga ha gradualmente ridotto la lunghezza dei frammenti a circa 150 - 600 bp, e la sonicazione per 15 minuti ha ulteriormente degradato questi frammenti, come si può vedere soprattutto dalla parte superiore dello striscio. Così, la dimensione media dei frammenti di DNA è gradualmente diminuita con il tempo di ultrasonicazione e il trattamento di 5 minuti ha permesso di ottenere le dimensioni dei frammenti di DNA più adatte per i test chip array. Infine, è stata stabilita la procedura di preparazione dell'analita del DNA che comprende i primi 2 minuti di trattamento ad ultrasuoni, l'estrazione del DNA (2×) e la successiva sonicazione di 5 minuti. (Basselet et al. 2008)

Immunoprecipitazione cromatina (ChIP)

Le cellule HEK293 sono state coltivate come descritto sopra e fissate con 2 mM di disuccinimidilglutarato per 45 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, le cellule sono state lavate due volte con PBS. La cromatina è stata reticolata per 10 minuti a temperatura ambiente utilizzando 1% (v/v) di formaldeide e lavata due volte con PBS ghiacciato. La reazione di reticolazione è stata fermata mediante incubazione con glicina ad una concentrazione finale di 0,125 M per 5 minuti a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione con tripsina, le cellule sono state raschiate dal piatto di coltura cellulare e lavate due volte con PBS. Il pellet cellulare è stato risospeso in tampone di lisi (5 mM Pipes, pH 8.0, 85 mM KCl, e 0.5% (v/v) Nonidet P-40), incubato su ghiaccio per 10 minuti e omogeneizzato con un omogeneizzatore Dounce. Successivamente, i nuclei sono stati pellettizzati mediante centrifugazione (3500 x g, 5 min, 4 °C) e risospesi in tampone nuclei (50 mM Tris-HCl, pH 8.1, 10 mM EDTA, e 1% (w/v) SDS). Nuclei sono stati interrotti da sonicazione con tre 20-s impulsi in un Sonicatore UP50H (Hielscher Ultraschall Technologie) con un'impostazione di ciclo 0,5 e ampiezza 30%, producendo frammenti di DNA genomico con una dimensione di massa di 200 - 1000 bp. Per ChIP, 50 g di DNA sono stati diluiti 4 volte in tampone di immunoprecipitazione (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA, 1,1% (v/v) Triton X-100, e 0,01% (w/v) SDS). (Weiske et al. 2006)

Analisi delle modificazioni istoniche mediante immunoprecipitazione cromatina (ChIP)

Brevemente, 6 x 10⁶ cellule sono state lavate due volte con PBS e reticolate sulla piastra di coltura per 15 minuti a temperatura ambiente in presenza di 0,5% di formaldeide. La reazione di reticolazione è stata fermata aggiungendo 0,125 M di glicina. Tutte le fasi successive sono state eseguite a 48°C. Tutti i tamponi erano pre-refrigerati e contenevano inibitori delle proteasi (Complete Mini, Roche). Le cellule sono state lavate due volte con la PBS e poi raschiate. Pellet raccolti sono stati sciolti in 1 ml di tampone di lisi (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) e sono stati sonicati in un bagno di etanolo freddo per 10 cicli al 100% di ampiezza utilizzando un Sonicatore UP50H (Hielscher, Teltow, Germania). La frammentazione della cromatina è stata visualizzata in un gel di agarosio all'1%. I frammenti ottenuti erano nell'intervallo 200-500pb. La cromatina solubile è stata ottenuta centrifugando i campioni sonicati a 14.000 g per 10 minuti a 48°C per 10 minuti. La frazione solubile è stata diluita 1/10 in tampone di diluizione (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl), quindi aliquotare e conservare a 80°C fino all'uso. (Rodriguez et al. 2008)