Preparazione dei plasmidi mediante ultrasuoni

Il trattamento a ultrasuoni è una tecnica affidabile per frammentare il DNA plasmidico. L’ampiezza controllabile con precisione, la modalità pulsata e il controllo della temperatura sono le caratteristiche più importanti di un sonicatore per la frammentazione dei plasmidi senza danneggiamento. Inoltre, l’impiego di determinati agenti contribuisce a proteggere i plasmidi dalla degradazione. Hielscher Ultrasonics offre diverse soluzioni per la frammentazione controllata dei plasmidi, dal trattamento di singole fiale alla sonicazione simultanea di numerosi campioni e di piastre multipozzetto. Scoprite di più sulla frammentazione efficace dei plasmidi mediante ultrasuoni!

Frammentazione dei plasmidi mediante taglio a ultrasuoni

Quando i campioni di DNA vengono sottoposti a onde ultrasoniche, le vibrazioni generate dagli ultrasuoni producono cavitazione acustica nel liquido, che frammenta per taglio o rompe le molecole di DNA ad alto peso molecolare mediante forze meccaniche. La sonicazione è il metodo più utilizzato negli esperimenti di frammentazione per taglio del DNA in massa, comprese applicazioni come l’immunoprecipitazione della cromatina (ChIP), per le quali frammenti di piccole dimensioni sono assolutamente cruciali per ottenere un’elevata risoluzione. (cfr. Tseng et al., 2012)
Il DNA plasmidico (pDNA) è una forma specifica di DNA, caratterizzata dalla sua struttura ad anello, e si trova nei batteri e in alcuni eucarioti.
Il pDNA superavvolto è la forma desiderata di DNA plasmidico, poiché offre i migliori risultati nei processi a valle, come il sequenziamento automatizzato e la trasfezione. Il trattamento a ultrasuoni è adatto a frammentare efficacemente il pDNA, compreso il pDNA superavvolto.
Thompson et al. (2008) hanno dimostrato che la sonicazione dei plasmidi, nota per frammentare il DNA superavvolto, è un metodo efficace per migliorare le lunghezze di lettura delle sequenze phred20 fino a renderle non significativamente diverse da quelle ottenute con lo stampo di controllo di Beckman Coulter o con plasmidi linearizzati enzimaticamente.

Uso dei vettori plasmidici

I plasmidi vengono spesso utilizzati come strumenti per clonare, trasferire e manipolare i geni. Quando i plasmidi vengono utilizzati sperimentalmente per questi scopi, sono chiamati vettori. Frammenti di DNA o geni possono essere inseriti in un vettore plasmidico, creando un cosiddetto plasmide ricombinante. I vettori plasmidici vengono utilizzati come veicoli per introdurre il DNA ricombinante in una cellula ospite e sono una componente fondamentale della clonazione molecolare.
“I vettori non virali sono oggetto di studi approfonditi per il loro potenziale impiego nella terapia genica per trattare diverse malattie complesse. I vettori non virali proteggono il DNA plasmidico dalla degradazione fisica, chimica ed enzimatica e trasportano la molecola di DNA al sito bersaglio. Ad esempio, i liposomi cationici, il chitosano e altre nanoparticelle con carica positiva formano complessi con il DNA plasmidico attraverso interazioni elettrostatiche. Tuttavia, i complessi liposomi cationici/DNA plasmidico, che si formano facilmente, sono relativamente grandi (ossia 300–400 nm) ed eterogenei per natura, il che ne rende difficile l’impiego nelle applicazioni farmaceutiche. I complessi grandi ed eterogenei di DNA plasmidico/liposomi, DNA plasmidico/aerosol e DNA plasmidico/peptidi possono essere ridotti a particelle più piccole e omogenee mediante il trattamento a ultrasuoni.” (Sarker et al., 2019)
Un esempio rilevante dell’uso dei vettori plasmidici è CRISPR–Cas9. Il sistema CRISPR–Cas9 viene generalmente introdotto nelle cellule sotto forma di un unico plasmide di grandi dimensioni o di più plasmidi più piccoli che codificano una sequenza bersaglio, una guida CRISPR e Cas9.

Preparazione mediante ultrasuoni di nanoparticelle di PLGA caricate con DNA tramite nanoprecipitazione

Jo et al. (2020) hanno utilizzato il poli(acido lattico-co-glicolico) (PLGA) per formare un veicolo nanoparticellare destinato al trasporto di un plasmide modello CRISPR–Cas9 in macrofagi primari derivati dal midollo osseo. Per la nanoprecipitazione delle nanoparticelle di PLGA è stato utilizzato PLGA con due diversi gruppi terminali (gruppi estere e amminici), con l’obiettivo che i gruppi terminali amminici con carica positiva aumentassero l’efficienza di incapsulamento e il carico grazie alle interazioni di carica con lo scheletro del DNA caricato negativamente. In una provetta conica da centrifuga in polipropilene da 50 mL, 100 mg di Pluronic F127 sono stati disciolti in 20 mL di acqua deionizzata sterilizzata in autoclave mediante miscelazione vortex, seguita da 30 min di sonicazione delicata in un bagno a ultrasuoni (vedere CupHorn). È stata aggiunta un’ancoretta magnetica sterilizzata in autoclave e la soluzione è stata miscelata a 600 RPM per 30 min mentre venivano preparate le altre soluzioni. Durante l’intera procedura è stato utilizzato materiale da laboratorio in plastica anziché in vetro per ridurre al minimo l’adsorbimento aspecifico del DNA. Sono state preparate separatamente soluzioni di PLGA disciolto in DMF (44,48 mg/ ml) e di TIPS pentacene disciolto in THF (0,667 mg/ml). Il PLGA è stato lasciato a riposo a bagnarsi nel DMF per 30 min prima di essere sottoposto a sonicazione per 30 min. (per il protocollo completo vedere Jo et al., 2020)

Protezione del DNA plasmidico durante la sonicazione

Il DNA, compresi i plasmidi e i plasmidi superavvolti, è altamente sensibile alla degradazione. Tutti i metodi di frammentazione disponibili presentano determinati svantaggi noti. La frammentazione del DNA mediante ultrasuoni è uno dei metodi preferiti, poiché la sonicazione controllata, combinata con misure protettive, consente di ridurre il danneggiamento dei filamenti di DNA indotto dal taglio e dal calore.
Oltre alle impostazioni di bassa ampiezza, alla modalità pulsata e al controllo della temperatura durante la frammentazione per taglio del DNA mediante ultrasuoni, l’impiego di determinati agenti ha mostrato un significativo effetto protettivo contro la degradazione del DNA. Ad esempio, diversi polimeri, peptidi e lipidi proteggono il DNA plasmidico durante il trattamento a ultrasuoni.

La stabilità del DNA plasmidico e dei nanocomplessi DNA plasmidico/IL rispetto alle sollecitazioni di taglio ultrasoniche è stata studiata mediante un saggio di elettroforesi su gel di agarosio. Sia il DNA plasmidico sia i nanocomplessi DNA plasmidico/IL sono stati sottoposti a sollecitazioni di taglio ultrasoniche per durate diverse. Il DNA plasmidico è stato esposto a sollecitazioni di taglio ultrasoniche per 0, 10, 20, 30 e 40 minuti. I nanocomplessi DNA plasmidico/IL, invece, sono stati esposti a sollecitazioni di taglio ultrasoniche per 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 e 120 minuti.
(studio e immagine: ©Sarker et al., 2019)

Sarker et al. (2019) hanno dimostrato che, quando le nanostrutture DNA plasmidico / liquido ionico (pDNA/IL) sono state sottoposte a sollecitazioni di taglio ultrasoniche per 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 e 120 min e complessate con l’agente cationico per il trasporto genico lipofectamine, disponibile in commercio, le percentuali di cellule positive alla fluorescenza erano rispettivamente 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65% e 50% (vedere il grafico sottostante). La percentuale di cellule positive alla fluorescenza è aumentata quando le nanostrutture sono state sottoposte a sollecitazioni di taglio ultrasoniche per 10 e 20 min, per poi diminuire lentamente.

Influenza del liquido ionico [Bmim][PF6] sul trasporto del DNA plasmidico nelle cellule COS7. I nanocomplessi DNA plasmidico/IL (liquido ionico) sono stati sottoposti a sollecitazioni di taglio ultrasoniche per un massimo di 120 minuti e complessati con LA prima di essere introdotti nelle cellule COS7. I dati mostrano il numero medio (%) di cellule HeLa positive alla GFP contate in 10 diversi campi microscopici e l’esperimento è stato eseguito più volte in tre giorni diversi. (Studio e grafico: ©Sarker et al., 2019)

Preparazione del lisato mediante ultrasuoni

Protocollo di lisi cellulare mediante ultrasuoni
Iniziate con un campione arricchito di cellule preparato mediante un metodo di separazione cellulare (ad esempio separazione cellulare immunomagnetica, separazione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS), centrifugazione in gradiente di densità, isolamento cellulare per immunodensità).
I campioni cellulari devono contenere un volume di tampone di lisi adeguato all’obiettivo sperimentale e al sonicatore a sonda.
Sono preferibili tamponi ipotonici, poiché favoriscono la lisi cellulare mediante ultrasuoni. È importante che gli additivi e la concentrazione salina siano utilizzati in modo appropriato.
Selezionate il dispositivo per la lisi a ultrasuoni: per la sonicazione indiretta delle fiale sono consigliati VialTweeter o CupHorn. Per le piastre multipozzetto, UIP400MTP è il sonicatore ideale. Per la sonicazione classica a sonda, sono particolarmente adatti omogeneizzatori a ultrasuoni come UP100H o UP200Ht con una micropunta.
Protocollo per la sonicazione a sonda: Inserite la sonda del sonicatore nel volume del campione contenuto in una provetta da microcentrifuga e sottoponete a sonicazione per circa 10 secondi. A seconda del campione di DNA, la sonicazione può essere ripetuta ancora una o due volte. L’apporto di energia ultrasonica necessario (Ws/mL) dipende dalla viscosità del campione e dal tipo di DNA. Il raffreddamento mediante un bagno di ghiaccio e la modalità pulsata del sonicatore contribuiscono a prevenire la degradazione termica del campione.
Dopo la lisi a ultrasuoni, il campione viene centrifugato per separare i detriti nel pellet (contenenti cellule non lisate, nuclei e organelli non lisati).
Se il campione non viene immediatamente sottoposto a ulteriori lavorazioni, può essere conservato a una temperatura appropriata per preservarne la vitalità.

Sonicatori per la frammentazione del DNA

Hielscher Ultrasonics offre diverse piattaforme basate sugli ultrasuoni per la frammentazione di DNA, RNA e cromatina. Queste diverse piattaforme comprendono sonde a ultrasuoni (sonotrodi), soluzioni di sonicazione indiretta per la preparazione simultanea di campioni in più provette o piastre multipozzetto (ad esempio piastre a 96 pozzetti, piastre per microtitolazione), sonoreattori e cuphorn a ultrasuoni. Tutte le piattaforme per la frammentazione per taglio del DNA sono alimentate da processori a ultrasuoni ad alte prestazioni con frequenza sintonizzata, controllabili con precisione e in grado di fornire risultati riproducibili.

Processori a ultrasuoni per qualsiasi numero e dimensione dei campioni

Con i sonicatori multicampione Hielscher VialTweeter (per un massimo di 10 provette) e UIP400MTP (per micropiastre/ piastre multipozzetto), è facile ridurre il tempo di trattamento dei campioni grazie a un trattamento a ultrasuoni intenso e controllabile con precisione, ottenendo al contempo la distribuzione dimensionale e la resa desiderate dei frammenti di DNA. La frammentazione del DNA mediante ultrasuoni rende le fasi di preparazione dei plasmidi efficienti, affidabili e scalabili. I protocolli possono essere scalati linearmente da uno a numerosi campioni applicando parametri ultrasonici costanti.
I sonicatori a sonda con uno fino a cinque elementi a dito sono ideali per la preparazione di un numero ridotto di campioni. I sonicatori da laboratorio Hielscher sono disponibili con diversi livelli di potenza, così da poter scegliere il disgregatore a ultrasuoni ideale per la vostra applicazione relativa al DNA.