L'ultrasonicazione è una tecnica affidabile per frammentare il DNA plasmidico. L'ampiezza controllabile con precisione, la modalità di pulsazione e il controllo della temperatura sono le caratteristiche più importanti di un ultrasuonatore per una frammentazione non dannosa del plasmide. Inoltre, l'uso di determinati agenti aiuta a proteggere dalla degradazione del plasmide. Hielscher Ultrasonics offre diverse soluzioni per la frammentazione controllata dei plasmidi da singole fiale, la sonicazione simultanea di numerosi campioni e piastre a più pozzetti. Per saperne di più sul successo della frammentazione plasmidica a ultrasuoni!

Taglio del plasmide mediante ultrasuoni

Quando i campioni di DNA sono sottoposti a onde ultrasoniche, le vibrazioni generate dagli ultrasuoni creano una cavitazione acustica nel liquido che trancia o rompe le molecole di DNA ad alto peso molecolare mediante forze meccaniche. La sonicazione è il metodo più utilizzato per gli esperimenti di taglio del DNA in massa, comprese le applicazioni, come l'immunoprecipitazione della cromatina (ChIP), per le quali le piccole dimensioni dei frammenti sono assolutamente cruciali per ottenere un'alta risoluzione. (cfr. Tseng et al., 2012)
Il DNA plasmidico (pDNA) è una forma specifica di DNA, caratterizzata dalla forma ad anello e presente nei batteri e in alcuni eucarioti.
Il pDNA superavvolto è la forma desiderata di DNA plasmidico, poiché mostra i migliori risultati nei processi a valle, come il sequenziamento automatico e la trasfezione. Gli ultrasuoni sono adatti a frammentare il pDNA, compreso il pDNA superavvolto, con successo.
Thompson et al. (2008) hanno dimostrato che la sonicazione del plasmide, che notoriamente frammenta il DNA superavvolto, è un modo efficace per migliorare le lunghezze di lettura della sequenza phred20 al punto che non sono significativamente diverse dal template di controllo di Beckman Coulter o dai plasmidi linearizzati enzimaticamente.

Uso di vettori plasmidici

I plasmidi sono spesso utilizzati come strumenti per clonare, trasferire e manipolare i geni. Quando i plasmidi sono usati sperimentalmente per questi scopi, sono chiamati vettori. Frammenti di DNA o geni possono essere inseriti in un vettore plasmidico, creando un cosiddetto plasmide ricombinante. I vettori plasmidici sono utilizzati come veicoli per introdurre il DNA ricombinante in una cellula ospite e sono una componente chiave della clonazione molecolare.
“I vettori non virali sono in fase di studio per il loro potenziale utilizzo nella terapia genica per il trattamento di diverse malattie complicate. I vettori non virali proteggono il DNA plasmidico dalla degradazione fisica, chimica ed enzimatica e trasportano la molecola di DNA al sito bersaglio. Ad esempio, i liposomi cationici, il chitosano e altre nanoparticelle con carica positiva formano complessi con il DNA plasmidico attraverso interazioni elettrostatiche. Tuttavia, i complessi liposomi cationici/DNA plasmidico che si formano facilmente sono relativamente grandi (cioè 300-400 nm) e di natura eterogenea, il che ne rende difficile l'uso nelle applicazioni farmaceutiche. I complessi DNA plasmidico/liposomi, DNA plasmidico/aerosol e DNA plasmidico/peptidi, grandi ed eterogenei, possono essere ridotti in particelle più piccole e omogenee utilizzando gli ultrasuoni.” (Sarker et al., 2019)
Un esempio importante dell'uso di vettori plasmidici è il sistema CRISPR-Cas9. Il sistema CRISPR-Cas9 viene tipicamente distribuito alle cellule sotto forma di un singolo plasmide di grandi dimensioni o di più plasmidi più piccoli che codificano una sequenza bersaglio, una guida CRISPR e Cas9.

Preparazione a ultrasuoni di nanoparticelle di PLGA caricate con DNA mediante nanoprecipitazione

Jo et al. (2020) hanno utilizzato l'acido poli(lattico-co-glicolico) (PLGA) per formare un vettore di nanoparticelle per il rilascio di un plasmide CRISPR-Cas9 nei macrofagi primari derivati dal midollo osseo. Per la nanoprecipitazione delle nanoparticelle di PLGA, sono stati utilizzati PLGA con due diversi gruppi terminali (gruppi estere e amminici), con l'obiettivo che i gruppi terminali amminici, carichi positivamente, aumentino l'efficienza di incapsulamento e il carico grazie alle interazioni di carica tra essi e la spina dorsale del DNA, carica negativamente. In una provetta da centrifuga conica di polipropilene da 50 mL, 100 mg di Pluronic F127 sono stati disciolti in 20 mL di acqua DI sterilizzata in autoclave mediante miscelazione con vortex, seguita da 30 minuti di sonicazione delicata con un bagno a ultrasuoni (vedere CupHorn). È stata aggiunta una barra di agitazione magnetica autoclavata e la soluzione è stata mescolata a 600 giri al minuto per 30 minuti mentre venivano preparate le altre soluzioni. Per ridurre al minimo l'adsorbimento aspecifico del DNA, è stata utilizzata una vetreria di plastica al posto di quella di vetro. Le soluzioni di PLGA sciolto in DMF (44,48 mg/ml) e di TIPS pentacene sciolto in THF (0,667 mg/ml) sono state preparate separatamente. Il PLGA è stato lasciato a bagnare in DMF per 30 minuti prima di essere sonicato per 30 minuti (per il protocollo completo si veda Jo et al., 2020).

Protezione del DNA plasmidico durante la sonicazione

Il DNA, compresi i plasmidi e i plasmidi superavvolti, è altamente sensibile alla degradazione. Tutti i metodi di frammentazione disponibili presentano alcuni svantaggi. La frammentazione del DNA con ultrasuoni è uno dei metodi preferiti, poiché la sonicazione controllata in combinazione con misure di protezione consente di ridurre il danneggiamento dei filamenti di DNA indotto dal taglio e dal calore.
Oltre alle impostazioni di bassa ampiezza, alla modalità di pulsazione e al controllo della temperatura durante la tranciatura del DNA a ultrasuoni, l'uso di alcuni agenti ha mostrato un significativo effetto protettivo contro la degradazione del DNA. Ad esempio, vari polimeri, peptidi e lipidi proteggono il DNA plasmidico durante l'ultrasuonizzazione.

La stabilità del DNA plasmidico e dei nanocomplessi DNA plasmidico/IL contro lo stress da taglio ultrasonico è stata studiata utilizzando il saggio di elettroforesi su gel di agarosio. Sia il DNA plasmidico che i nanocomplessi DNA plasmidico/IL sono stati sottoposti a stress da taglio ultrasonico per diversi periodi di tempo. Il DNA plasmidico è stato esposto allo stress da taglio ultrasonico per 0, 10, 20, 30 e 40 minuti. I nanocomplessi DNA plasmidico/IL sono stati invece esposti a stress da taglio ultrasonico per 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 e 120 minuti.
(studio e immagine: ©Sarker et al., 2019)

Sarker et al. (2019) hanno dimostrato che quando le nanostrutture di DNA plasmidico/liquido ionico (pDNA/IL) sono state sottoposte a stress da taglio ultrasonico per 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 e 120 minuti e complessate con l'agente cationico per il rilascio di geni disponibile in commercio, la percentuale di cellule positive alla fluorescenza è stata rispettivamente dell'80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65% e 50% (vedere il grafico sottostante). La percentuale di cellule positive alla fluorescenza è aumentata quando le nanostrutture sono state sottoposte a stress da taglio ultrasonico per 10 e 20 minuti, per poi diminuire lentamente.

Influenza del liquido ionico [Bmim][PF6] sul rilascio di DNA plasmidico alle cellule COS7. I nanocomplessi DNA plasmidico/IL (liquido ionico) sono stati sottoposti a stress di taglio ultrasonico per un massimo di 120 minuti e complessati con LA prima di essere consegnati a cellule COS7. I dati mostrano il numero medio (%) di cellule HeLa positive alla GFP contate in 10 diversi campi microscopici e l'esperimento è stato eseguito più volte in tre giorni diversi. (Studio e grafico: ©Sarker et al., 2019)

Preparazione del lisato a ultrasuoni

Protocollo di lisi cellulare a ultrasuoni
Iniziare con un campione arricchito di cellule preparato con un metodo di separazione cellulare (ad esempio, separazione cellulare immunomagnetica, selezione cellulare attivata da fluorescenza (FACS), centrifugazione a gradiente di densità, isolamento cellulare a immunodensità).
I campioni di cellule devono presentare un volume di tampone di lisi adeguato all'obiettivo sperimentale e all'ultrasuonatore a sonda.
I tamponi ipotonici sono da preferire in quanto migliorano la lisi cellulare ad ultrasuoni. È importante che gli additivi e la concentrazione di sale siano utilizzati in modo appropriato.
Selezionare il dispositivo di lisi a ultrasuoni: Per la sonicazione indiretta di fiale, si consiglia il VialTweeter o il CupHorn. Per le piastre multipozzetto, l'UIP400MTP è l'ultrasuonatore ideale. Per la classica sonicazione a sonda, un omogeneizzatore a ultrasuoni come UP100H o UP200Ht con micropunta è il più adatto.
Protocollo per la sonicazione a sonda: Posizionare la sonda a ultrasuoni nel volume del campione in una provetta da microcentrifuga e sonicare per circa 10 secondi. A seconda del campione di DNA, la sonicazione può essere ripetuta una o due volte. L'energia ultrasonica necessaria (Ws/mL) dipende dalla viscosità del campione e dal tipo di DNA. Il raffreddamento tramite bagno di ghiaccio e la modalità di pulsazione dell'ultrasuonatore aiutano a prevenire la degradazione termica del campione.
Dopo la lisi a ultrasuoni, il campione viene centrifugato per separare i residui del pellet (contenenti cellule non lisciate, nuclei e organuli non lisciati).
Se il campione non viene processato immediatamente, può essere conservato a una temperatura adeguata per preservarne la vitalità.

Ultrasuonatori per la frammentazione del DNA

Hielscher Ultrasonics offre diverse piattaforme basate sugli ultrasuoni per la frammentazione di DNA, RNA e cromatina. Queste diverse piattaforme includono sonde a ultrasuoni (sonotrodi), soluzioni di sonicazione indiretta per la preparazione simultanea di campioni in più provette o piastre a più pozzetti (ad esempio, piastre a 96 pozzetti, piastre per microtitolazione), sonoreattori e coppelle a ultrasuoni. Tutte le piattaforme per il taglio del DNA sono alimentate da processori a ultrasuoni ad alte prestazioni con regolazione di frequenza, che sono controllabili con precisione e forniscono risultati riproducibili.

Processori a ultrasuoni per qualsiasi numero e dimensione di campioni

Con gli ultrasuonatori multi-campione VialTweeter (per un massimo di 10 provette) e UIP400MTP (per micropiastre/piastre multipozzetto) di Hielscher è possibile ridurre facilmente i tempi di lavorazione dei campioni grazie a un'ultrasonicazione intensa e controllabile con precisione, ottenendo al contempo la distribuzione dimensionale dei frammenti di DNA e la resa desiderate. La frammentazione del DNA a ultrasuoni rende le fasi di preparazione dei plasmidi efficienti, affidabili e scalabili. I protocolli possono essere scalati linearmente da uno a numerosi campioni applicando parametri ultrasonici costanti.
Gli ultrasuonatori a sonda da uno a cinque dita sono ideali per la preparazione di un numero ridotto di campioni. Gli ultrasuonatori da laboratorio Hielscher sono disponibili con diversi livelli di potenza, in modo da poter scegliere il disgregatore a ultrasuoni ideale per la vostra applicazione sul DNA.