La preparazione del campione prima dell'analisi può richiedere vari processi pre-analitici come l'omogeneizzazione dei tessuti, la lisi, l'estrazione di proteine, DNA, RNA, organuli e altre sostanze intracellulari, la dissoluzione e il degassamento. Il VialTweeter è un dispositivo ad ultrasuoni unico nel suo genere che prepara più provette di campioni simultaneamente in condizioni esattamente identiche. Grazie alla sonicazione indiretta delle provette chiuse, si evitano la contaminazione crociata e la perdita di campioni.

Preparazione del campione ad ultrasuoni

L'ecografia è una tecnica comune di trattamento del campione per preparare il campione per analisi come la reazione a catena dei polimeri (PCR), Western Blots, saggi, sequenziamento molecolare, cromatografia, ecc. L'ultrasonicazione è una tecnica ampiamente utilizzata nei laboratori per il trattamento pre-analitico dei campioni. Uno dei principali vantaggi della sonicazione è che il principio di funzionamento degli ultrasuoni si basa su forze puramente meccaniche. La lisi ad ultrasuoni e l'alterazione delle cellule si ottiene con forze di taglio sonomeccaniche, il che dà all'ecografia il vantaggio che i solventi utilizzati per l'estrazione delle proteine possono essere utilizzati anche durante la lisi. Gli ultrasuoni perturbatori cellulari come il VialTweeter rompono le pareti cellulari / membrane e favoriscono il trasferimento di massa tra l'interno della cellula e il solvente. In questo modo, l'analita (ad esempio DNA, RNA, proteine, organuli, ecc.) viene trasferito in modo efficiente dalla matrice cellulare al solvente. Ciò significa che le fasi di tempra e di estrazione si sovrappongono al processo di distruzione delle cellule ad ultrasuoni, che rende la lisi ad ultrasuoni molto efficace. Inoltre, la preparazione del campione ad ultrasuoni non richiede detergenti e altri reagenti di lisi, che potrebbero alterare e distruggere la struttura del lisato ed è noto per i successivi problemi di purificazione. Un altro metodo di lisi, il disturbo enzimatico richiede lunghi tempi di incubazione e fornisce risultati spesso non riproducibili. La preparazione del campione ad ultrasuoni supera i problemi comuni nella preparazione del campione come l'omogeneizzazione dei tessuti, la rottura delle cellule, la lisi, l'estrazione delle proteine e la solubilizzazione del lisato. Poiché l'intensità del trattamento ad ultrasuoni può essere esattamente controllata e adattata al campione biologico, la degradazione e la perdita del campione sono evitate. La temperatura del campione monitorata e controllata automaticamente, la modalità di pulsazione e la durata della sonicazione garantiscono risultati ottimali.

Il VialTweeter è particolarmente comodo per i lavori di laboratorio che richiedono la preparazione simultanea di più campioni nelle stesse condizioni. Il VialTweeter è un sonotrodo a blocco ultrasonico che può contenere fino a 10 fiale (ad esempio Eppendorf, centrifuga, provette NUNC, crioviali) e li sonicizza intensamente in condizioni controllate con precisione. Poiché l'energia ultrasonica viene accoppiata attraverso le pareti delle fiale nel mezzo del campione, le fiale rimangono chiuse durante il trattamento. In questo modo si evitano completamente la perdita del campione e la contaminazione crociata.

Fiale e tubi per il montaggio del VialTweeter

Il VialTweeter è adatto a contenere 10 comuni tubi conici o a fondo tondo come Eppendorf, centrifuga, crio-vialette e vari tipi di fiale NUNC, ma i fori possono essere personalizzati per altre dimensioni di fiale e tubi su richiesta. Fateci sapere quale tipo di provetta volete utilizzare, in modo che possiamo modificare il vostro VialTweeter di conseguenza. Per provette più grandi come le provette Falcon e altri contenitori di prova, becher e recipienti, il VialPress è una soluzione conveniente.

Il VialTweeter con VialPress

Mentre il VialTweeter stesso con i suoi 10 fori per tubi è già un dispositivo ad ultrasuoni unico e altamente funzionale, l'add-on VialPress rende il VialTweeter ancora più versatile e flessibile per il funzionamento. Il VialPress è un accessorio per il VialTweeter che consiste in una barra di fissaggio che permette di fissare le provette più grandi come le provette Falcon o altre provette di piccole e medie dimensioni sul frontale del VialTweeter. L'immagine a sinistra mostra il VialTweeter con 10 fiale Eppendorf nel blocco, mentre il VialPress fissa una provetta più grande sul lato anteriore per la sonicazione. Il VialPress è in grado di contenere fino a 5 provette più grandi per una sonicazione intensa.

Protocolli di preparazione del campione del VialTweeter

Il VialTweeter è ampiamente utilizzato per sonicare campioni biologici. Prima dell'analisi, i campioni devono essere preparati per analisi e saggi biochimici o biofisici, ad esempio mediante lisi, omogeneizzazione dei tessuti, estrazione di proteine, tosatura del DNA / RNA, degassamento, ecc. Il VialTweeter soddisfa questi processi ad ultrasuoni in modo affidabile e fornisce risultati riproducibili. Un'applicazione comune del VialTweeter è la lisi / interruzione delle cellule dei tessuti di mammiferi (umani e animali), così come le cellule di batteri e particelle virali. I campioni biologici trattati con successo con VialTweeter includono cellule epiteliali del polmone umano, cellule staminali ematopoietiche, cellule della leucemia mieloide, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillo antracide, Francisella tularensis, Yersinia pestis, Streptococco piogeno, Caulobacter crescentus, Mycoplasma pneumoniae, micobatteri / Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC) e molte altre cellule batteriche, botaniche e microbiche.
Di seguito sono riportati alcuni protocolli selezionati con il VialTweeter.

Lisi di E.Coli con VialTweeter per la determinazione in vivo del glutatione

I batteri Escherichia coli del ceppo MG1655 sono stati coltivati in terreno minimo MOPS in un volume totale di 200 ml fino a raggiungere un A600 di 0,5. La coltura è stata suddivisa in colture da 50 ml per il trattamento dello stress. Dopo 15 minuti di incubazione con 0,79 mM di allicina, 1 mM di diametro, o dimetilsolfossido (controllo), le cellule sono state raccolte a 4.000g a 4°C per 10 minuti. Le cellule sono state lavate due volte con tampone KPE prima della risospensione del pellet in 700µl di tampone KPE. Per la deproteinizzazione, 300µl di acido solfosalicilico al 10% (p/v) sono stati aggiunti prima della rottura delle cellule mediante ultrasuoni (3 x 1 min; VialTweeter ultrasonatore). I surnatanti sono stati raccolti dopo la centrifugazione (30 min, 13.000g, 4°C). Concentrazioni di acido solfosalicilico sono stati ridotti all'1% con l'aggiunta di 3 volumi di tampone KPE. Le misurazioni del glutatione totale e del GSSG sono state effettuate come descritto sopra. Concentrazioni di glutatione cellulare sono state calcolate sulla base di un volume di cellule di E. coli di 6,7 × 10-15 litri e una densità cellulare di A600 0,5 (equivalente a 1 × 108 cellule ml-1 coltura ml-1). Concentrazioni di GSH sono stati calcolati per sottrazione di 2[GSSG] dal glutatione totale. (Müller et al. 2016)

Lisi delle cellule con VialTweeter prima della spettrometria ad assorbimento atomico del forno a grafite

Bacillus subtilis 168 (trpC2) sono stati esposti a 15 minuti di stress antibiotico, poi le cellule sono state raccolte a 3.320 x g, lavate cinque volte con 100 mM Tris/1 mM EDTA, pH 7,5, risospese in 10 mM Tris, pH 7,5 e interrotte da ultrasuoni in uno strumento Hielscher VialTweeter. (Wenzel et al. 2014)

VialTweeter Preparazione del campione prima della spettrometria di massa

I pellet di cellule liofilizzate di cellule staminali ematopoietiche umane CD34/progenitrici sono stati risospesi in 10µl (200µl per la preparazione di HEK293 alla rinfusa per la serie di diluizione peptidica) di 8 M di urea in 100 mM di carbonato acido di ammonio e lisati aiutati da sonicazione con il VialTweeter Hielscher ad un'ampiezza del 60%, un ciclo del 60% e una durata di 20s per tre volte con raffreddamento intermedio su ghiaccio. (Amon et al. 2019)

Protocolli di preparazione del campione con il VialPress

La lattuga fresca (Lactuca sativa) è stata omogeneizzata in un tampone HEPES da 0,5 M (pH 8, KOH regolato) in un rapporto di 1 g di pianta (peso fresco) a 200, 100, 50 o 20 mL di soluzione tampone. Il rapporto tra la massa della pianta e il volume della soluzione tampone è stato variato per mantenere il volume totale omogeneizzato tra 3,5 e 12 mL. Il rapporto tra massa della pianta e volume della soluzione tampone è stato variato per mantenere il volume totale dell'omogeneizzato tra 3,5 e 12 mL, consentendo l'omogeneizzazione con la sonda. Gli omogeneizzati sono stati poi sottoposti a ultrasuoni indiretti utilizzando un UP200St con VialTweeter dotato di 200xt VialPress (Hielscher Ultrasonics GmbH, Germania) per 3 min (80% di impulso e 100% di potenza). L'utilizzo di questo dispositivo ha evitato la contaminazione. (Laughton et al. 2019)

Controllo affidabile della temperatura durante la sonicazione con il VialTweeter

La temperatura è un fattore cruciale che influenza il processo e che è particolarmente importante per il trattamento dei campioni biologici. Come tutte le tecniche di preparazione meccanica del campione, la sonicazione crea calore. Tuttavia, la temperatura dei campioni può essere ben controllata quando si utilizza il VialTweeter. Vi presentiamo varie opzioni per monitorare e controllare la temperatura dei vostri campioni mentre li preparate con il VialTweeter e il VialPress per l'analisi.

1. Monitoraggio della temperatura del campione: Il processore ad ultrasuoni UP200St, che pilota il VialTweeter, è dotato di un software intelligente e di un sensore di temperatura collegabile. Inserire il sensore di temperatura nel UP200St e inserire la punta del sensore di temperatura in uno dei tubi campione. Tramite il display digitale a colori touch-display, è possibile impostare nel menu dell'UP200St un intervallo di temperatura specifico per la sonicazione del campione. L'ecografo si arresta automaticamente al raggiungimento della temperatura massima e si mette in pausa fino a quando la temperatura del campione non scende al valore inferiore della temperatura impostata ∆. Poi la sonicazione ricomincia automaticamente. Questa funzione intelligente previene la degradazione indotta dal calore.
2. Il blocco VialTweeter può essere pre-raffreddato. Mettere il blocco VialTweeter (solo il sonotrodo senza trasduttore!) nel frigorifero o nel congelatore per pre-raffreddare il blocco di titanio aiuta a posticipare l'aumento di temperatura nel campione. Se possibile, anche il campione stesso può essere pre-raffreddato.
3. Utilizzare ghiaccio secco per raffreddare durante la sonicazione. Utilizzare una vaschetta poco profonda riempita di ghiaccio secco e posizionare il VialTweeter sul ghiaccio secco in modo che il calore possa dissiparsi rapidamente.

I clienti di tutto il mondo utilizzano il VialTweeter e il VialPress per il loro lavoro quotidiano di preparazione dei campioni nei laboratori biologici, biochimici, medici e clinici. Il software intelligente e il controllo della temperatura del processore UP200St, la temperatura è controllata in modo affidabile e si evita la degradazione del campione indotta dal calore. La preparazione del campione ad ultrasuoni con il VialTweeter e il VialPress fornisce risultati altamente affidabili e riproducibili!

Dettagli tecnici del VialTweeter

Il VialTweeter è un sonotrodo a blocco in titanio che può contenere fino a 10 fiale nei fori all'interno del blocco. Inoltre, è possibile fissare fino a 5 provette più grandi al VialTweeter con il VialPress. Il VialTweeter è progettato in modo che l'energia di ultrasonicazione sia distribuita uniformemente in ogni fiala inserita per garantire risultati di sonicazione affidabili e uniformi. Un piccolo perno regola il sonotrodo del VialTweeter su un terreno irregolare e allinea le provette verticalmente.

I vantaggi del VialTweeter in sintesi

• Sonicazione intensa fino a 10 flaconcini contemporaneamente
• Sonicazione indiretta ad alta intensità ultrasonica attraverso la parete del recipiente nel campione
• La sonicazione indiretta evita la contaminazione incrociata e la perdita di campioni
• Risultati riproducibili grazie all'ampiezza di sonicazione regolabile e controllabile
• Il VialPress consente di sonicare tubi più grandi
• Ampiezza regolabile dal 20 al 100%
• Modalità impulso regolabile da 0 a 100%.
• autoclavabile

Il VialTweeter è alimentato dal UP200Stun potente processore ad ultrasuoni da 200 watt. L'UP200St è dotato di un software intelligente che permette il controllo preciso di tutti i parametri importanti del processo a ultrasuoni come l'ampiezza, il tempo di sonicazione, le pulsazioni e la temperatura. Questo rende il VialTweeter uno strumento affidabile per risultati di processo riproducibili di successo nei laboratori biologici e biochimici.
L'ampiezza può essere regolata tra il 20 e il 100% e permette quindi di adattare l'intensità ultrasonica al vostro campione. Per esempio, il taglio e la frammentazione del DNA e dell'RNA richiede un'ampiezza più blanda per evitare la produzione di frammenti di DNA troppo piccoli, l'omogeneizzazione dei tessuti del cervello del topo ha bisogno di una sonicazione ad alta intensità. Scegliete l'ampiezza ideale, l'intensità e la durata della sonicazione tramite il menu intelligente e intuitivo del processore UP200St. Il menu e le impostazioni sono facilmente accessibili e gestibili tramite un display touchscreen a colori. Nelle impostazioni è possibile preimpostare i parametri di sonicazione come l'ampiezza, la modalità pulsazioni/ciclo, la durata della sonicazione, l'energia totale in ingresso e i limiti di temperatura. Nella ricerca e nella produzione, la ripetibilità delle prove e dei risultati dei test è cruciale. Ciò significa che la registrazione precisa delle condizioni di processo e dei protocolli di sonicazione è assolutamente importante. Il protocollo automatico dei dati scrive tutti i dati di sonicazione in un file CSV su una scheda SD integrata, in modo da poter controllare e confrontare facilmente le varie esecuzioni di sonicazione. Tutti i dati di processo a ultrasuoni possono essere facilmente accessibili e condivisi come file CSV.
Hielscher Ultrasonics si impegna a fornirvi una tecnologia avanzata per facilitare e migliorare il vostro lavoro di ricerca!