Lisi ad ultrasuoni di campioni di Drosophila melanogaster

La Drosophila melanogaster è ampiamente utilizzata nei laboratori come organismo modello. Pertanto, le fasi di preparazione pre-analitica come la lisi, la rottura delle cellule, l'estrazione delle proteine e la tranciatura del DNA dei campioni di Drosophila melanogaster devono essere effettuate frequentemente. I dismembratori ad ultrasuoni sono affidabili ed efficienti e possono essere utilizzati per eseguire vari compiti come la lisi, l'estrazione delle proteine o la frammentazione del DNA a proprio agio regolando solo i parametri di processo ad ultrasuoni. Gli omogeneizzatori ad ultrasuoni sono quindi strumenti flessibili con una vasta gamma di applicazioni.

Lisi ad ultrasuoni ed estrazione di proteine

Drosophila melanogaster is widely used as model organism in biological labs. Find here protocols for lysis, protein extracion and DNA shearing of D. melanogaster samples.Lisi, solubilizzazione delle cellule, omogeneizzazione dei tessuti ed estrazione delle proteine sono compiti tipici dei dismembratori ad ultrasuoni nei laboratori biologici. I dismembratori ad ultrasuoni e i disgregatori cellulari sono adatti per omogeneizzare i tessuti animali, gli insetti (ad esempio, Drosophila melanogaster, C. elegans) o i campioni di piante. Le applicazioni successive di ultrasuoni sono la lisi di sospensioni cellulari e pellets così come l'estrazione di proteine intracellulari.
La lisi ad ultrasuoni e l'estrazione delle proteine sono processi altamente affidabili e riproducibili, che possono essere eseguiti sulla base di protocolli stabiliti. Poiché l'intensità del processo a ultrasuoni può essere esattamente regolata tramite parametri di sonicazione come l'ampiezza, il ciclo / modalità di impulso, la temperatura e il volume del campione, una volta che i protocolli collaudati possono essere ripetuti con lo stesso risultato più e più volte.

Vantaggi della preparazione del campione a ultrasuoni

  • altamente efficiente
  • Regolabile su materiale campione specifico
  • Adatto a qualsiasi volume
  • Trattamento non termico
  • risultati riproducibili
  • Semplice e sicuro

Frammentazione di DNA e RNA a ultrasuoni

Dopo la lisi cellulare e l'estrazione delle proteine, un passo comune richiesto nella preparazione del campione è la tosatura e la frammentazione del DNA, RNA e cromatina, ad esempio prima della immunoprecipitazione della cromatina (ChIP). La frammentazione del DNA e dell'RNA può essere ottenuta in modo affidabile rompendo i legami covalenti che tengono insieme il DNA con forze fisiche. Utilizzando la tosatura fisica come la sonicazione, in un primo momento i fili di DNA sono rotti, poi il DNA viene frammentato in pezzi più piccoli.
La frammentazione ad ultrasuoni del DNA è affidabile ed efficiente nel taglio del DNA ad una lunghezza mirata, ad esempio 500bp (coppie di base). I principali vantaggi della frammentazione ultrasonica del DNA includono il controllo preciso dei parametri di processo e dell'intensità degli ultrasuoni. I parametri di processo ad ultrasuoni possono essere regolati regolando con precisione l'intensità della sonicazione, i cicli e il tempo. Questo permette di creare le dimensioni del DNA desiderate e di produrre e riprodurre in modo affidabile la lunghezza di DNA desiderata. La tranciatura ad ultrasuoni del DNA è anche ideale per creare frammenti di DNA ad alto peso molecolare.

Ultrasonicator UP200Ht with microtip S26d2 for ultrasonic lysis of Drosophila samples

ultrasonoro UP200Ht con micropuntale da 2 mm S26d2 per la sonicazione di campioni di Drosophila

Richiesta informazioni





Protocolli per la lisi ad ultrasuoni della Drosophila melanogaster

Qui sotto potete trovare vari protocolli per la lisi assistita ad ultrasuoni, l'estrazione delle proteine e la frammentazione del DNA o della cromatina dei campioni di Drosophila.

Lisi ad ultrasuoni per il test di immunoprecipitazione a reticolazione (CLIP)

Il test CLIP è stato eseguito come precedentemente riportato con alcune modifiche. Circa 20 mg di ovaie da 0 a 1 giorno di vita delle femmine wild-type sono stati reticolati UV (3 × 2000 μJ/cm2), omogeneizzati su ghiaccio in 1 mL RCB tampone (50 mM HEPES pH 7,4, 200 mM NaCl, 2.5 mM MgCl2, 0,1% Triton X-100, 250 mM saccarosio, 1 mM DTT, 1× EDTA-free Complete Protease Inhibitors, 1 mM PMSF) integrato con 300 U RNAseOUT e posto su ghiaccio per 30 min. L'omogeneizzato è stato sonicato su ghiaccio, all'80% di potenza, cinque volte in 20 s di raffiche con un riposo di 60 s nel mezzo usando il processore ad ultrasuoni Hielscher UP100H (100 W, 30 kHz) e centrifugato (16000 × g per 5 min a 4°C). L'estratto solubile è stato prelevata con 20 μl di dinabeadi di Proteina-G per 20 minuti a 4°C. Dopo la rimozione dei campioni per l'immunoblotting e la quantificazione di RNA in ingresso (1%), HP1 è stato immunoprecipitato con anticorpo anti-HP1 9A9 da 450 microlitri di estratto precleared da incubazione per 4 h con 50 microlitri di Protein-G dinabeadi. Immunoprecipitati sono stati lavati 4 volte con RCB. Per eluire gli RNA immunoprecipitati, le perle pellettate sono state bollite in 100 μl di acqua trattata con UltraPure DEPC per 5 min. 900 μl di Reagente Qiazol Reagente è stato aggiunto al supernatante recuperato per la preparazione di RNA. L'RNA purificato è stato utilizzato come modello per sintetizzare cDNA utilizzando oligo dT, esametri casuali e SuperScript trascriptasi inversa SuperScript III secondo il protocollo del produttore.
(Cassale et al. 2019)

Lisi ad ultrasuoni per il test di immunoprecipitazione della cromatina

L'immunoprecipitazione della cromatina è stata eseguita secondo il metodo descritto da Menet con piccole modifiche. Circa 20 mg di ovaie da 0 a 1 giorno di vita delle femmine wild-type sono stati omogeneizzati in 1 mL di tampone NEB (10 mM HEPES-Na a pH 8,0, 10 mM NaCl, 0,1 mM EGTA-Na a pH 8, 0.5 mM EDTA-Na a pH 8, 1 mM DTT, 0,5% NP-40, 0,5 mM Spermidina, 0,15 mM Spermidina, 1× inibitori di proteasi completi privi di EDTA) con un omogeneizzatore / dispersore ad immersione 1 min (a 3000 rpm). L'omogeneizzato è stato trasferito in un dounce di vetro pre-raffreddato e 15 colpi completi sono stati applicati con un pestello stretto. I nuclei liberi sono stati poi centrifugati a 6000xg per 10 minuti a 4°C. I nuclei contenenti pellet sono stati risospesi in 1 mL di NEB e centrifugati a 20000 × g per 20 minuti sul gradiente di saccarosio (0,65 mL di saccarosio 1,6 M in NEB, 0,35 mL di saccarosio 0,8 M in NEB). Il pellet è stato risospeso in 1 mL di NEB e formaldeide ad una concentrazione finale dell'1%. I nuclei sono stati reticolati per 10 minuti a temperatura ambiente e spenti con l'aggiunta di 1/10 vol di 1,375 M glicina. I nuclei sono stati raccolti per centrifugazione a 6000 × g per 5 min. I nuclei sono stati lavati due volte in 1 mL di NEB e risospesi in 1 mL di tampone di lisi (15 mM HEPES-Na a pH 7,6, 140 mM NaCl, 0,5 mM EGTA, 1 mM EDTA a pH 8, 1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 0,1% Na Desossicolato, 0,1% SDS, 0,1% N-lauroylsarcosina, 0,5% N-lauroylsarcosina e 1× EDTA-free inibitori della proteasi completa). I nuclei sono stati sonicati utilizzando un processore ad ultrasuoni Hielscher UP100H (100 W, 30 kHz) sei volte per 20 s di seguito e 1 minuto sul ghiaccio. I nuclei sonici sono stati centrifugati a 13000 × g per 4 minuti a 4°C. La maggior parte della cromatina sonicata era di 500-1000 coppie di basi (bp) in lunghezza. Per ogni immunoprecipitazione, 15 μg di cromatina è stato incubato in presenza di 10 μg di anticorpo monoclonale HP1 9A9 (3 h a 4°C in una ruota rotante). Poi, 50 μl di proteina G dynabeads è stato aggiunto e l'incubazione è stata continuata per tutta la notte a 4 ° C. I supernatanti sono stati scartati e campioni sono stati lavati due volte in Lysis Buffer (ogni lavaggio 15 min a 4 ° C) e due volte in TE Buffer (1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl a pH 8). La cromatina è stata eluita da perle in due fasi; prima in 100 μl di Tampone Eluition 1 (10 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM TrisHCl a pH 8) a 65 ° C per 15 min, seguita da centrifugazione e recupero del surnatante. Il materiale delle perle è stato ri-estratto in 100 μl di TE + 0,67% SDS. L'eluato combinato (200 μl) è stato incubato durante la notte a 65°C per invertire i cross-link e trattato con 50 μg/ml RNaseA per 15 minuti a 65°C e con 500 μg/ml Proteinasi K per 3 h a 65°C. I campioni sono stati estratti fenolo-cloroformio e l'etanolo precipitato. Il DNA è stato risospeso in 25 μl di acqua. Per massimizzare le analisi molecolari con DNA immunoprecipitato, i geni candidati sono stati amplificati a coppie attraverso un protocollo ottimizzato duplex-PCR utilizzando due diversi set di primer con temperature di fusione simili in una singola reazione.
(Casale et al. 2019)

UP200St TD_CupHorn per la sonicazione indiretta dei campioni

UP200St TD_CupHorn per la sonicazione indiretta di campioni come la tranciatura del DNA e della cromatina

Disgregatori cellulari ad ultrasuoni ad alte prestazioni per campioni biologici

Hielscher Ultrasonics è il vostro partner di lunga esperienza quando si tratta di ultrasuoni ad alte prestazioni per la distruzione delle cellule, la lisi, l'estrazione delle proteine, il DNA, l'RNA e la frammentazione della cromatina, così come altre fasi di preparazione del campione pre-analitico. Offrendo un portafoglio completo di omogeneizzatori a ultrasuoni da laboratorio e unità di preparazione del campione, Hielscher ha il dispositivo a ultrasuoni ideale per la vostra applicazione biologica e le vostre esigenze.
Insonificatore a sonda UP200St per lisiClassico ultrasuonatore a sonda con micropunta come il UP200St (200W; vedi foto a sinistra) o una delle unità di preparazione del campione ad ultrasuoni VialTweeter o UP200St_TD_CupHorn con VialHolder sono i modelli preferiti nei laboratori di ricerca e di analisi. La classica sonda ad ultrasuoni è ideale, quando si prepara un minor numero di campioni deve essere lisato, estratto o frammentato. Le unità di preparazione del campione VialTweeter e UP200St_TD_CupHorn consentono la sonicazione simultanea di un massimo di 10 o 5 fiale, rispettivamente.
Se è necessario elaborare un numero elevato di campioni (ad es. piastre a 96 pozzetti, piastre per microtitolazione, ecc. UIP400MTP è la configurazione ideale per la sonicazione. L'UIP400MTP funziona come un cuphorn più grande, che è riempito d'acqua e ha abbastanza spazio per contenere micropiastre per pozzetti. Alimentato da un potente processore ad ultrasuoni da 400 watt, l'UIP400MTP offre una sonicazione molto uniforme e intensa di piastre a più pozzetti per disturbare le cellule, lisare i campioni, solubilizzare i pellet, estrarre le proteine o tagliare il DNA.

Controllo preciso tramite software intelligente

I processori industriali Hielscher della serie hdT possono essere comodi e facili da usare tramite il telecomando del browser.Tutte le soluzioni di sonicazione Hielscher a partire da 200 watt sono dotate di un touch-screen digitale a colori e di un software intelligente. Tramite il protocollo dati intelligente tutti i parametri di processo ad ultrasuoni vengono automaticamente salvati come file CSV su una scheda SD integrata non appena l'ecografo viene avviato. Ciò rende la ricerca e la protocollazione molto più conveniente. Dopo le prove di sonicazione o la preparazione del campione, si possono semplicemente rivedere i parametri di sonicazione di ogni esecuzione di sonicazione e confrontarli.
Tramite il menu intuitivo è possibile preimpostare numerosi parametri prima della sonicazione: Per esempio, per controllare la temperatura nel campione e per evitare la sua degradazione termica, si può impostare un limite superiore di temperatura del campione. Un sensore di temperatura collegabile, fornito con l'unità ad ultrasuoni, fornisce al processore ad ultrasuoni un feedback sulla temperatura di sonicazione effettiva. Quando viene raggiunto il limite superiore di temperatura, l'apparecchio ad ultrasuoni si ferma fino a quando non viene raggiunto il limite inferiore del ∆T impostato e ricomincia automaticamente a sonicare.
Se è richiesta una sonicazione con un input di energia specifico, è possibile preimpostare l'energia ultrasonica finale della corsa di sonicazione. Naturalmente anche la pulsazione ultrasonica e la modalità di ciclo possono essere impostate individualmente.
Per riutilizzare i parametri di sonicazione di maggior successo, è possibile salvare diverse modalità di sonicazione (ad es. tempo di sonicazione, intensità, modalità di ciclo ecc.) come modalità preimpostate, in modo che possano essere facilmente e rapidamente riavviate.
Per una maggiore comodità operativa, tutte le unità digitali a ultrasuoni possono essere azionate tramite il telecomando del browser in qualsiasi browser comune (ad es. InternetExplorer, Safari, Chrome ecc.). La connessione LAN è una semplice configurazione plug-n-play e non richiede l'installazione di software aggiuntivo.
Noi di Hielscher sappiamo che la sonicazione di campioni biologici richiede precisione e ripetibilità. Per questo motivo, abbiamo progettato i nostri ultrasuoni come dispositivi intelligenti con tutte le caratteristiche che consentono una preparazione del campione efficiente, affidabile, riproducibile e conveniente.

Contattateci ora e comunicateci i vostri campioni biologici e le fasi di preparazione necessarie. Vi proporremo il dispositivo di preparazione dei campioni ad ultrasuoni più adatto e vi assisteremo con informazioni aggiuntive come protocolli e raccomandazioni.

La tabella sottostante fornisce un'indicazione della capacità di elaborazione approssimativa dei nostri sistemi ad ultrasuoni, dai micropunti ad ultrasuoni e dai classici omogeneizzatori ad ultrasuoni agli ultrasuoni MultiSample per la preparazione comoda e affidabile di numerosi campioni:

Volume di batch Portata Dispositivi raccomandati
Piastre a 96 pozzetti / microtitolatori n.a. UIP400MTP
10 fiale da 0,5 a 1,5 ml n.a. VialTweeter a UP200St
CupHorn per la sonicazione indiretta, ad esempio fino a 5 fiale n.a. UP200St_TD_CupHorn
0.01 a 250mL Da 5 a 100mL/min UP50H
0.01 a 500mL 10 - 200mL/min UP100H
0.02 a 1L 20 - 400mL/min UP200Ht / UP200St
10 - 2000mL 20 - 400mL/min UP200Ht, UP400St
0.25 a 5L 0.05 a 1L/min UIP500hdT

Contattaci! / Chiedi a noi!

Richiedi maggiori informazioni

Si prega di utilizzare il modulo sottostante per richiedere ulteriori informazioni sui processori ad ultrasuoni, le applicazioni e il prezzo. Saremo lieti di discutere il vostro processo con voi e di offrirvi un sistema ad ultrasuoni che soddisfi le vostre esigenze!









Si prega di notare il nostro informativa sulla privacy.


The VialTweeter is a MultiSample Ultraonicator that allows for reliable sample preparation under precisely controlled temperature conditions.

L'unità di preparazione multi-campione a ultrasuoni VialTweeter consente la sonicazione simultanea di un massimo di 10 fiale. Con il dispositivo a pinza VialPress è possibile premere fino a 4 tubi aggiuntivi nella parte anteriore per un'intensa sonicazione.

Letteratura / Referenze



Hielscher Ultrasonics supplies high-performance ultrasonic homogenizers from lab to industrial size.

Ultrasuoni ad alte prestazioni! La gamma di prodotti Hielscher copre l'intero spettro, dal compatto ecografo da laboratorio alle unità da banco fino ai sistemi ad ultrasuoni completamente industriali.


Particolarità / Cose da sapere

Metabolomica

La metabolomica è lo studio di piccole molecole, note come metaboliti, presenti all'interno di cellule, biofluidi, tessuti o organismi. Queste piccole molecole e le loro interazioni all'interno di un sistema biologico sono riassunte sotto il termine ombrello "metaboloma" e il campo di ricerca è chiamato metabolomica. La ricerca sul metaboloma è strettamente connessa con il campo emergente della medicina di precisione. La comprensione del metaboloma e la sua relazione con varie malattie aiuta a sviluppare la prevenzione delle malattie e le strategie di cura clinica, mentre la variabilità individuale nell'ambiente, nello stile di vita, nella genetica e nel fenotipo molecolare. Al fine di liberare le molecole di metaboliti dalle cellule, l'ecografia è spesso utilizzata nei laboratori biologici per la preparazione di campioni preanalitici come la distruzione delle cellule, la lisi e l'estrazione di proteine, lipidi e altre molecole.