Lisi ad ultrasuoni di campioni di Drosophila Melanogaster

La Drosophila melanogaster è ampiamente utilizzata nei laboratori come organismo modello. Pertanto, le fasi di preparazione pre-analitica, come la lisi, la disgregazione cellulare, l'estrazione delle proteine e la frammentazione del DNA dei campioni di Drosophila melanogaster, devono essere eseguite frequentemente. I dismembratori a ultrasuoni sono affidabili ed efficienti e possono essere utilizzati per eseguire varie operazioni come la lisi, l'estrazione di proteine o la frammentazione del DNA con facilità, regolando solo i parametri del processo a ultrasuoni. Gli omogeneizzatori a ultrasuoni sono quindi strumenti flessibili con un'ampia gamma di applicazioni.

Lisi ultrasonica ed estrazione di proteine

La lisi, la solubilizzazione delle cellule, l'omogeneizzazione dei tessuti e l'estrazione delle proteine sono compiti tipici dei dismembratori a ultrasuoni nei laboratori biologici. I dismembratori e i disgregatori cellulari a ultrasuoni sono adatti per omogeneizzare tessuti animali, insetti (ad esempio, Drosophila melanogaster, C. elegans) o campioni vegetali. Le applicazioni successive degli ultrasuoni sono la lisi di sospensioni e pellet cellulari e l'estrazione di proteine intracellulari.
La lisi ad ultrasuoni e l'estrazione di proteine sono processi altamente affidabili e riproducibili, che possono essere eseguiti sulla base di protocolli consolidati. Poiché l'intensità del processo a ultrasuoni può essere regolata esattamente tramite parametri di sonicazione quali ampiezza, modalità di ciclo/impulso, temperatura e volume del campione, i protocolli una volta collaudati possono essere ripetuti più volte con lo stesso risultato.

Frammentazione ultrasonica di DNA e RNA

Dopo la lisi cellulare e l'estrazione delle proteine, una fase comunemente richiesta nella preparazione dei campioni è la frammentazione di DNA, RNA e cromatina, ad esempio prima dell'immunoprecipitazione della cromatina (ChIP). La frammentazione del DNA e dell'RNA può essere ottenuta in modo affidabile rompendo i legami covalenti che tengono insieme il DNA mediante forze fisiche. Utilizzando una forza fisica di taglio come la sonicazione, dapprima si rompono i filamenti di DNA, poi il DNA viene frammentato in pezzi più piccoli.
La frammentazione del DNA a ultrasuoni è affidabile ed efficiente nel tagliare il DNA a una lunghezza mirata, ad esempio 500 bp (coppie di basi). I principali vantaggi della frammentazione del DNA a ultrasuoni includono il controllo preciso dei parametri e dell'intensità del processo a ultrasuoni. I parametri del processo a ultrasuoni possono essere regolati regolando con precisione l'intensità, i cicli e il tempo di sonicazione. In questo modo è possibile creare le dimensioni desiderate del DNA e la lunghezza del DNA desiderata può essere prodotta e riprodotta in modo affidabile. La tranciatura del DNA a ultrasuoni è ideale anche per creare frammenti di DNA ad alto peso molecolare.

Protocolli per la lisi ultrasonica di Drosophila melanogaster

Di seguito sono riportati vari protocolli per la lisi assistita da ultrasuoni, l'estrazione di proteine e la frammentazione del DNA o della cromatina di campioni di Drosophila.

Lisi a ultrasuoni per il saggio di immunoprecipitazione a reticolazione (CLIP)

Il saggio CLIP è stato eseguito come precedentemente riportato con alcune modifiche. Circa 20 mg di ovaie di femmine wild-type di 0-1 giorno di età sono state reticolate con raggi UV (3 × 2000 μJ/cm2), omogeneizzate con ghiaccio in 1 mL di tampone RCB (50 mM HEPES pH 7,4, 200 mM NaCl, 2,5 mM MgCl2, 0,1% Triton X-100, 250 mM saccarosio, 1 mM DTT, 1× EDTA-free Complete Complete Complete Complete DTT).5 mM MgCl2, 0,1% Triton X-100, 250 mM saccarosio, 1 mM DTT, 1× EDTA-free Complete Protease Inhibitors, 1 mM PMSF) integrato con 300 U RNAseOUT e posto in ghiaccio per 30 minuti. L'omogenato è stato sonicato con ghiaccio, all'80% della potenza, per cinque volte in raffiche di 20 s con un riposo di 60 s tra l'una e l'altra, utilizzando il processore a ultrasuoni Hielscher. UP100H (100 W, 30 kHz) e centrifugato (16000 × g per 5 min a 4°C). L'estratto solubile è stato prechiarificato con 20 μl di dynabeads Protein-G per 20 minuti a 4°C. Dopo la rimozione dei campioni per l'immunoblotting e la quantificazione dell'RNA in ingresso (1%), HP1 è stato immunoprecipitato con anticorpo anti-HP1 9A9 da 450 μl di estratto precleared mediante incubazione per 4 ore con 50 μl di dynabeads Protein-G. Gli immunoprecipitati sono stati lavati 4 volte con RCB. Per eluire gli RNA immunoprecipitati, le perle pellettate sono state bollite in 100 μl di acqua trattata con DEPC UltraPure per 5 minuti. 900 μl di reagente qiazolo sono stati aggiunti al surnatante recuperato per la preparazione dell'RNA. L'RNA purificato è stato utilizzato come stampo per sintetizzare il cDNA utilizzando oligo dT, esameri casuali e trascrittasi inversa SuperScript III secondo il protocollo del produttore.
(Cassale et al. 2019)

Lisi a ultrasuoni per il saggio di immunoprecipitazione della cromatina

L'immunoprecipitazione della cromatina è stata eseguita secondo il metodo descritto da Menet con piccole modifiche. Circa 20 mg di ovaie di femmine wild-type di 0-1 giorno di età sono state omogenizzate in 1 mL di tampone NEB (10 mM HEPES-Na a pH 8.0, 10 mM NaCl, 0.1 mM EGTA-Na a pH 8, 0. 5 mM EDTA-Na a pH 8, 1 mM DTT, 0.5% NP-40, 0.5 mM EDTA-Na a pH 8).5 mM EDTA-Na a pH 8, 1 mM DTT, 0,5% NP-40, 0,5 mM Spermidina, 0,15 mM Spermina, 1× EDTA- free Complete Protease Inhibitors) con un omogeneizzatore/dispersore a immersione per 1 minuto (a 3000 rpm). L'omogenato è stato trasferito in una dozzina di vetro pre-raffreddata e sono stati applicati 15 colpi completi con un pestello stretto. I nuclei liberi sono stati quindi centrifugati a 6000xg per 10 minuti a 4°C. Il pellet contenente i nuclei è stato risospeso in 1 mL di NEB e centrifugato a 20000 × g per 20 minuti su gradiente di saccarosio (0,65 mL di saccarosio 1,6 M in NEB, 0,35 mL di saccarosio 0,8 M in NEB). Il pellet è stato risospeso in 1 mL di NEB e formaldeide a una concentrazione finale dell'1%. I nuclei sono stati reticolati per 10 minuti a temperatura ambiente e spenti aggiungendo 1/10 vol. di glicina 1,375 M. I nuclei sono stati raccolti mediante centrifugazione a 6000 × g per 5 minuti. I nuclei sono stati lavati due volte in 1 mL di NEB e risospesi in 1 mL di tampone di lisi (15 mM HEPES-Na a pH 7,6, 140 mM NaCl, 0,5 mM EGTA, 1 mM EDTA a pH 8, 1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 0,1% Na desossicolato, 0,1% SDS, 0,5% N-laurosarcosina e 1× inibitori completi delle proteasi senza EDTA). I nuclei sono stati sonicati con un processore a ultrasuoni Hielscher. UP100H (100 W, 30 kHz) sei volte per 20 s su e 1 min su ghiaccio. I nuclei sonicati sono stati centrifugati a 13000 × g per 4 minuti a 4°C. La maggior parte della cromatina sonicata aveva una lunghezza compresa tra 500 e 1000 coppie di basi (bp). Per ogni immunoprecipitazione, 15 μg di cromatina sono stati incubati in presenza di 10 μg di anticorpo monoclonale HP1 9A9 (3 ore a 4°C in una ruota rotante). Quindi, sono stati aggiunti 50 μl di dynabeads proteina G e l'incubazione è proseguita per tutta la notte a 4°C. I surnatanti sono stati scartati e i campioni sono stati lavati due volte in tampone di lisi (ogni lavaggio 15 minuti a 4 °C) e due volte in tampone TE (1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl a pH 8). La cromatina è stata eluita dalle microsfere in due fasi: la prima in 100 μl di tampone di eluizione 1 (10 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM TrisHCl a pH 8) a 65°C per 15 minuti, seguita da centrifugazione e recupero del surnatante. Il materiale delle microsfere è stato riestratto in 100 μl di TE + 0,67% SDS. L'eluato combinato (200 μl) è stato incubato per una notte a 65°C per invertire i legami crociati e trattato con 50 μg/ml di RNaseA per 15 min a 65°C e con 500 μg/ml di Proteinasi K per 3 h a 65°C. I campioni sono stati estratti con fenolo-cloroformio e precipitati con etanolo. Il DNA è stato risospeso in 25 μl di acqua. Per massimizzare le analisi molecolari con il DNA immunoprecipitato, i geni candidati sono stati amplificati a coppie attraverso un protocollo di duplex-PCR ottimizzato, utilizzando due diverse serie di primer con temperature di fusione simili in una singola reazione.
(Casale et al. 2019)
 

Distruttori cellulari a ultrasuoni ad alte prestazioni per campioni biologici

Hielscher Ultrasonics è il vostro partner di lunga esperienza quando si tratta di ultrasuonatori ad alte prestazioni per la disgregazione delle cellule, la lisi, l'estrazione delle proteine, la frammentazione del DNA, dell'RNA e della cromatina, nonché per altre fasi di preparazione pre-analitica dei campioni. Offrendo un portafoglio completo di omogeneizzatori da laboratorio a ultrasuoni e unità di preparazione dei campioni, Hielscher ha il dispositivo a ultrasuoni ideale per le vostre applicazioni e requisiti biologici.
Ultrasuonatore classico a sonda con micropunta, come il modello UP200St (200W; vedi immagine a sinistra) o una delle unità di preparazione del campione a ultrasuoni VialTweeter o UP200ST_TD_Corno a tazza con VialHolder sono i modelli preferiti nei laboratori di ricerca e di analisi. La classica sonda a ultrasuoni è ideale quando è necessario lisare, estrarre o frammentare un numero ridotto di campioni. Le unità di preparazione dei campioni VialTweeter e UP200St_TD_CupHorn consentono di sonicare simultaneamente fino a 10 o 5 fiale, rispettivamente.
Se è necessario trattare un numero elevato di campioni (ad es. piastre a 96 pozzetti, piastre per microtitolazione, ecc. UIP400MTP è la configurazione ideale per la sonicazione. L'UIP400MTP funziona come un corno di tazza più grande, riempito d'acqua e con spazio sufficiente per contenere piastre a micropozzetti. Alimentato da un potente processore a ultrasuoni da 400 watt, l'UIP400MTP garantisce una sonicazione molto uniforme e intensa di piastre a più pozzetti per disgregare le cellule, lisare i campioni, solubilizzare i pellet, estrarre le proteine o tagliare il DNA.

Controllo preciso tramite software intelligente

Tutte le soluzioni di sonicazione Hielscher a partire da 200 watt sono dotate di un touch-screen digitale a colori e di un software intelligente. Grazie al protocolling intelligente dei dati, tutti i parametri del processo a ultrasuoni vengono salvati automaticamente come file CSV su una scheda SD integrata non appena l'ultrasuonatore viene avviato. Questo rende la ricerca e la protocollatura molto più conveniente. Dopo le prove di sonicazione o la preparazione dei campioni, è possibile rivedere semplicemente i parametri di sonicazione di ciascun ciclo di sonicazione e confrontarli.
Tramite il menu intuitivo, è possibile preimpostare numerosi parametri prima della sonicazione: Ad esempio, per controllare la temperatura del campione e prevenirne la degradazione termica, è possibile impostare un limite superiore di temperatura del campione. Un sensore di temperatura collegabile, fornito con l'unità a ultrasuoni, fornisce al processore a ultrasuoni un feedback sulla temperatura effettiva di sonicazione. Quando viene raggiunto il limite superiore di temperatura, il dispositivo a ultrasuoni si ferma fino al raggiungimento del limite inferiore del ∆T impostato e ricomincia a sonicare automaticamente.
Se è richiesta una sonicazione con un'energia specifica, è possibile preimpostare l'energia ultrasonica finale del ciclo di sonicazione. Naturalmente, anche la pulsazione degli ultrasuoni e la modalità di ciclo possono essere impostate individualmente.
Per riutilizzare i parametri di sonicazione più efficaci, è possibile salvare varie modalità di sonicazione (ad es. tempo di sonicazione, intensità, modalità di ciclo ecc.) come modalità preimpostate, in modo da poterle riavviare facilmente e rapidamente.
Per una maggiore comodità operativa, tutte le unità digitali a ultrasuoni possono essere gestite tramite il telecomando del browser in qualsiasi browser comune (ad esempio, InternetExplorer, Safari, Chrome ecc.). La connessione LAN è una semplice configurazione plug-n-play e non richiede l'installazione di software aggiuntivi.
Noi di Hielscher sappiamo che il successo della sonicazione dei campioni biologici richiede precisione e ripetibilità. Per questo motivo, abbiamo progettato i nostri ultrasuonatori come dispositivi intelligenti dotati di tutte le caratteristiche che consentono una preparazione dei campioni efficiente, affidabile, riproducibile e conveniente.

La tabella seguente fornisce un'indicazione della capacità di trattamento approssimativa dei nostri sistemi a ultrasuoni, dalle micropunte a ultrasuoni e dai classici omogeneizzatori a ultrasuoni agli ultrasuoni MultiSample per la preparazione comoda e affidabile di numerosi campioni: