Lisi a ultrasuoni di campioni di Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster è ampiamente utilizzata nei laboratori come organismo modello. Pertanto, è necessario eseguire frequentemente fasi di preparazione preanalitica quali la lisi, la disgregazione cellulare, l’estrazione delle proteine e il taglio del DNA di campioni di Drosophila melanogaster. I disgregatori a ultrasuoni sono affidabili ed efficienti e consentono di svolgere facilmente diverse operazioni, quali la lisi, l’estrazione delle proteine o la frammentazione del DNA, semplicemente regolando i parametri del processo a ultrasuoni. Gli omogeneizzatori a ultrasuoni sono quindi strumenti flessibili con un’ampia gamma di applicazioni.

Lisi a ultrasuoni ed estrazione delle proteine

La lisi, la solubilizzazione cellulare, l’omogeneizzazione dei tessuti e l’estrazione delle proteine sono operazioni tipiche dei disgregatori a ultrasuoni nei laboratori biologici. I disgregatori a ultrasuoni e i disgregatori cellulari sono particolarmente adatti all’omogeneizzazione di tessuti animali, insetti (ad esempio Drosophila melanogaster, C. elegans) o campioni vegetali. Ulteriori applicazioni degli ultrasuoni sono la lisi di sospensioni cellulari e pellet, nonché l’estrazione delle proteine intracellulari.
La lisi a ultrasuoni e l’estrazione delle proteine sono processi altamente affidabili e riproducibili, che possono essere eseguiti sulla base di protocolli consolidati. Poiché l’intensità del processo a ultrasuoni può essere regolata con precisione mediante parametri di sonicazione quali l’ampiezza, la modalità a cicli / impulsi, la temperatura e il volume del campione, i protocolli, una volta convalidati, possono essere ripetuti più volte con lo stesso risultato.

Frammentazione a ultrasuoni di DNA e RNA

Dopo la lisi cellulare e l’estrazione delle proteine, una fase comunemente richiesta nella preparazione dei campioni è il taglio e la frammentazione di DNA, RNA e cromatina, ad esempio prima dell’immunoprecipitazione della cromatina (ChIP). La frammentazione di DNA e RNA può essere ottenuta in modo affidabile rompendo, mediante forze fisiche, i legami covalenti che tengono unito il DNA. Utilizzando il taglio fisico, come nella sonicazione, vengono dapprima spezzati i filamenti di DNA, quindi il DNA viene frammentato in pezzi più piccoli.
La frammentazione del DNA a ultrasuoni è affidabile ed efficiente nel tagliare il DNA fino a una lunghezza prestabilita, ad esempio 500bp (coppie di basi). I principali vantaggi della frammentazione del DNA a ultrasuoni comprendono il controllo preciso dei parametri e dell’intensità del processo a ultrasuoni. I parametri del processo a ultrasuoni possono essere regolati impostando con precisione l’intensità, i cicli e il tempo di sonicazione. Ciò consente di ottenere le dimensioni desiderate del DNA e di produrre e riprodurre in modo affidabile la lunghezza prestabilita. Il taglio del DNA a ultrasuoni è ideale anche per ottenere frammenti di DNA ad alto peso molecolare.

Protocolli per la lisi a ultrasuoni di Drosophila melanogaster

Di seguito sono disponibili diversi protocolli per la lisi, l’estrazione delle proteine e la frammentazione del DNA o della cromatina di campioni di Drosophila assistite da ultrasuoni.

Lisi a ultrasuoni per il saggio di immunoprecipitazione con reticolazione (CLIP)

Il saggio CLIP è stato eseguito come riportato in precedenza, con alcune modifiche. Circa 20 mg di ovaie di femmine di tipo selvatico di età compresa tra 0 e 1 giorno sono stati sottoposti a reticolazione con UV (3 × 2000 μJ/cm2), omogeneizzati su ghiaccio in 1 mL di tampone RCB (50 mM HEPES pH 7,4, 200 mM NaCl, 2,5 mM MgCl2, 0,1% Triton X-100, 250 mM saccarosio, 1 mM DTT, 1× Complete Protease Inhibitors senza EDTA, 1 mM PMSF) integrato con 300 U di RNAseOUT e mantenuti su ghiaccio per 30 min. L’omogenato è stato sonicato su ghiaccio, all’80% della potenza, cinque volte con impulsi di 20 s intervallati da pause di 60 s utilizzando il processore a ultrasuoni Hielscher UP100H (100 W, 30 kHz) e centrifugato (16.000 × g per 5 min a 4°C). L’estratto solubile è stato prechiarificato con 20 μl di Protein-G dynabeads per 20 min a 4°C. Dopo il prelievo di campioni per l’immunoblotting e la quantificazione dell’RNA iniziale (1%), HP1 è stata immunoprecipitata con l’anticorpo anti-HP1 9A9 da 450 μl di estratto prechiarificato mediante incubazione per 4 h con 50 μl di Protein-G dynabeads. Gli immunoprecipitati sono stati lavati 4 volte con RCB. Per eluire gli RNA immunoprecipitati, le sfere sedimentate sono state portate a ebollizione in 100 μL di UltraPure DEPC-treated Water per 5 min. Al surnatante recuperato per la preparazione dell’RNA sono stati aggiunti 900 μL di Qiazol Reagent. L’RNA purificato è stato utilizzato come stampo per sintetizzare cDNA utilizzando oligo dT, esameri casuali e la trascrittasi inversa SuperScript III secondo il protocollo del produttore.
(Cassale et al. 2019)

Lisi a ultrasuoni per il saggio di immunoprecipitazione della cromatina

L’immunoprecipitazione della cromatina è stata eseguita secondo il metodo descritto da Menet, con lievi modifiche. Circa 20 mg di ovaie di femmine di tipo selvatico di età compresa tra 0 e 1 giorno sono stati omogeneizzati in 1 mL di tampone NEB (10 mM HEPES-Na a pH 8,0, 10 mM NaCl, 0,1 mM EGTA-Na a pH 8, 0,5 mM EDTA-Na a pH 8, 1 mM DTT, 0,5% NP-40, 0,5 mM spermidina, 0,15 mM spermina, 1× Complete Protease Inhibitors senza EDTA) con un omogeneizzatore / dispersore a immersione per 1 min (a 3000 rpm). L’omogenato è stato trasferito in un omogeneizzatore Dounce in vetro preraffreddato e sono state eseguite 15 corse complete con un pestello a gioco ridotto. I nuclei liberi sono stati quindi centrifugati a 6000xg per 10 min a 4°C. I pellet contenenti i nuclei sono stati risospesi in 1 mL di NEB e centrifugati a 20.000 × g per 20 min su un gradiente di saccarosio (0,65 mL di saccarosio 1,6 M in NEB, 0,35 mL di saccarosio 0,8 M in NEB). Il pellet è stato risospeso in 1 mL di NEB con formaldeide a una concentrazione finale dell’1%. I nuclei sono stati reticolati per 10 min a temperatura ambiente e la reazione è stata arrestata aggiungendo 1/10 vol di glicina 1,375 M. I nuclei sono stati raccolti mediante centrifugazione a 6000 × g per 5 min. I nuclei sono stati lavati due volte in 1 mL di NEB e risospesi in 1 mL di tampone di lisi (15 mM HEPES-Na a pH 7,6, 140 mM NaCl, 0,5 mM EGTA, 1 mM EDTA a pH 8, 1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 0,1% desossicolato di Na, 0,1% SDS, 0,5% N-lauroilsarcosina e 1× Complete Protease Inhibitors senza EDTA). I nuclei sono stati sonicati utilizzando un processore a ultrasuoni Hielscher UP100H (100 W, 30 kHz) sei volte con 20 s di sonicazione e 1 min su ghiaccio. I nuclei sonicati sono stati centrifugati a 13.000 × g per 4 min a 4°C. La maggior parte della cromatina sonicata aveva una lunghezza compresa tra 500 e 1000 coppie di basi (bp). Per ogni immunoprecipitazione, 15 μg di cromatina sono stati incubati in presenza di 10 μg di anticorpo monoclonale HP1 9A9 (3 h a 4°C su una ruota rotante). Successivamente, sono stati aggiunti 50 μl di dynabeads protein G e l’incubazione è proseguita per tutta la notte a 4°C. I surnatanti sono stati scartati e i campioni sono stati lavati due volte in tampone di lisi (ogni lavaggio per 15 min a 4 °C) e due volte in tampone TE (1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl a pH 8). La cromatina è stata eluita dalle sfere in due fasi: dapprima in 100 μl di tampone di eluizione 1 (10 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM TrisHCl a pH 8) a 65°C per 15 min, seguiti da centrifugazione e recupero del surnatante. Il materiale delle sfere è stato nuovamente estratto in 100 μl di TE + 0,67% SDS. L’eluato combinato (200 μl) è stato incubato per tutta la notte a 65°C per invertire la reticolazione e trattato con 50 μg/ml di RNaseA per 15 min a 65°C e con 500 μg/ml di proteinasi K per 3 h a 65°C. I campioni sono stati sottoposti a estrazione con fenolo–cloroformio e precipitazione con etanolo. Il DNA è stato risospeso in 25 μl di acqua. Per massimizzare le analisi molecolari con il DNA immunoprecipitato, i geni candidati sono stati amplificati a coppie mediante un protocollo duplex-PCR ottimizzato, utilizzando in un’unica reazione due diversi set di primer con temperature di fusione simili.
(Casale et al. 2019)
 

Disgregatori cellulari a ultrasuoni ad alte prestazioni per campioni biologici

Hielscher Ultrasonics è il vostro partner con una lunga esperienza nei sonicatori ad alte prestazioni per la disgregazione cellulare, la lisi, l’estrazione delle proteine, la frammentazione di DNA, RNA e cromatina, nonché per altre fasi di preparazione preanalitica dei campioni. Grazie a una gamma completa di omogeneizzatori a ultrasuoni da laboratorio e unità di preparazione dei campioni, Hielscher dispone del dispositivo a ultrasuoni ideale per la vostra applicazione biologica e le vostre esigenze.
Un classico sonicatore a sonda con micropunta, come UP200St (200W; vedere l’immagine a sinistra), oppure una delle unità di preparazione dei campioni a ultrasuoni VialTweeter o UP200ST_TD_CupHorn con VialHolder sono tra i modelli preferiti nei laboratori di ricerca e di analisi. La classica sonda a ultrasuoni è ideale quando occorre sottoporre a lisi, estrazione o frammentazione un numero ridotto di campioni. Le unità di preparazione dei campioni VialTweeter e UP200St_TD_CupHorn consentono la sonicazione simultanea rispettivamente di un massimo di 10 o 5 fiale.
Se è necessario trattare un numero elevato di campioni (ad esempio piastre a 96 pozzetti, piastre per microtitolazione ecc.), UIP400MTP è il sistema di sonicazione ideale. UIP400MTP funziona come un cuphorn di maggiori dimensioni, riempito d’acqua e con spazio sufficiente per ospitare piastre a micropozzetti. Alimentato da un potente processore a ultrasuoni da 400 watt, UIP400MTP fornisce una sonicazione molto uniforme e intensa delle piastre multipozzetto per disgregare le cellule, lisare i campioni, solubilizzare i pellet, estrarre le proteine o tagliare il DNA.

Controllo preciso mediante software intelligente

Tutte le soluzioni di sonicazione Hielscher da 200 watt in su sono dotate di un touchscreen digitale a colori e di un software intelligente. Grazie alla registrazione intelligente dei dati, tutti i parametri del processo a ultrasuoni vengono salvati automaticamente come file CSV su una scheda SD integrata non appena il sonicatore viene avviato. Ciò rende la ricerca e la registrazione dei dati molto più pratiche. Dopo le prove di sonicazione o la preparazione dei campioni, è possibile esaminare e confrontare facilmente i parametri di ogni ciclo di sonicazione.
Tramite il menu intuitivo è possibile preimpostare numerosi parametri prima della sonicazione: ad esempio, per controllare la temperatura del campione e prevenirne la degradazione termica, è possibile impostare un limite superiore della temperatura del campione. Un sensore di temperatura collegabile, fornito con l’unità a ultrasuoni, comunica al processore a ultrasuoni la temperatura effettiva di sonicazione. Quando viene raggiunto il limite superiore di temperatura, il dispositivo a ultrasuoni si arresta fino al raggiungimento del limite inferiore del ∆T impostato, quindi riprende automaticamente la sonicazione.
Se è richiesta una sonicazione con un apporto energetico specifico, è possibile preimpostare l’energia ultrasonica finale del ciclo di sonicazione. Naturalmente, anche la pulsazione ultrasonica e la modalità a cicli possono essere impostate individualmente.
Per riutilizzare i parametri di sonicazione che hanno dato i risultati migliori, è possibile salvare diverse modalità di sonicazione (ad esempio tempo di sonicazione, intensità, modalità a cicli ecc.) come modalità preimpostate, così da poterle riavviare facilmente e rapidamente.
Per una maggiore praticità operativa, tutte le unità digitali a ultrasuoni possono essere azionate tramite controllo remoto via browser in qualsiasi browser comune (ad esempio InternetExplorer, Safari, Chrome ecc.). La connessione LAN si configura semplicemente in modalità plug-n-play e non richiede l’installazione di software aggiuntivo.
Noi di Hielscher sappiamo che una sonicazione efficace dei campioni biologici richiede precisione e ripetibilità. Per questo abbiamo progettato i nostri sonicatori come dispositivi intelligenti dotati di tutte le funzionalità necessarie per una preparazione dei campioni efficiente, affidabile, riproducibile e pratica.

La tabella seguente fornisce un’indicazione della capacità di trattamento approssimativa dei nostri sistemi a ultrasuoni, dalle micropunte a ultrasuoni e dai classici omogeneizzatori a ultrasuoni ai sonicatori MultiSample, per la preparazione pratica e affidabile di numerosi campioni: