Tecnologia ad ultrasuoni Hielscher

Protocollo per l'inattivazione del Coronavirus SARS-CoV-2 con Sonication

L'Hielscher VialTweeter è un'unità di preparazione multi-campione a ultrasuoni unica nel suo genere, che viene utilizzata per inattivare il coronavirus SARS-COV-2. Il VialTweeter consente di preparare fino a 10 fiale di campioni contemporaneamente ed è quindi l'unità ideale per l'elaborazione di campioni di massa.

Inattivazione del Coronavirus SARS-CoV-2 con il VialTweeter

Dopo aver rimosso il fissativo, i monostrato sono stati lavati tre volte con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) prima di raschiare le cellule in 1mL MEM/5% FBS e sonicati (3 × 10 secondi acceso, 10 secondi spento al 100% di potenza e ampiezza) utilizzando il processore ad ultrasuoni Hielscher UP200St con VialTweeter l'attaccamento. I surnatanti sono stati chiariti mediante centrifugazione a 3000 × g per 10 minuti. Leggete qui il protocollo completo per l'inattivazione del coronavirus SARS-CoV-2 da Welch et al. (2020) qui sotto:

Cellule e virus

Le cellule Vero E6 (Vero C1008; ATCC CRL-1586) sono state coltivate in un mezzo essenziale minimo di Eagle modificato (MEM) integrato con il 10% (v/v) di siero fetale di vitello (FCS). Il virus utilizzato è stato il ceppo SARS-CoV-2 hCOV-19/England/2/2020, isolato da PHE dal primo gruppo di pazienti nel Regno Unito il 29/01/2020. Questo virus è stato ottenuto al passaggio 1 e utilizzato per studi di inattivazione al passaggio 2 o 3.
Per i reagenti e le sostanze chimiche utilizzate per l'inattivazione della SARS-CoV-2 e per la rimozione della citotossicità dei reagenti, consultare il rapporto scientifico di Welch et al. (2020).

The ultrasonic sample preparation unit VialTweeter is used for the inactivation of SARS-CoV-2 coronavirus

Inattivazione del virus da parte dei detersivi – Protocollo di inattivazione del Coronavirus SARS-CoV-2 di Welch et al. 2020

Inattivazione della SARS-CoV-2

Per prodotti commerciali, preparazioni di virus (fluido di coltura tissutale, titoli a partire da 1 × 106 a 1 × 108 I PFU/ml) sono stati trattati in triplice copia con reagenti a concentrazioni e per tempi di contatto raccomandati nelle istruzioni per l'uso dei produttori, se disponibili, o per concentrazioni e tempi specificamente richiesti dai laboratori di analisi. Nel caso in cui il produttore abbia fornito una gamma di concentrazioni, è stato testato il rapporto più basso tra prodotto e campione (cioè la più bassa concentrazione consigliata di prodotto da testare). I reagenti delle provette di trasporto dei campioni sono stati analizzati utilizzando un rapporto di un volume di fluido di coltura tissutale per dieci volumi di reagente, a meno che il produttore non abbia specificato un rapporto di volume del fluido del campione rispetto al reagente. Detergenti, fissativi e solventi sono stati testati alle concentrazioni indicate per i tempi indicati. Tutte le fasi di inattivazione sono state eseguite a temperatura ambiente (18 - 25°C). Per l'analisi di tipi di campione alternativi, il virus è stato inserito nella matrice del campione indicato con un rapporto di 1:9, quindi trattato con i reagenti del test come sopra. Tutti gli esperimenti includevano campioni di controllo in triplice copia trattati in modo simulato con un volume equivalente di PBS al posto del reagente del test. Immediatamente dopo il tempo di contatto richiesto, 1mL di campione trattato è stato trattato utilizzando la matrice di filtrazione opportunamente selezionata. La rimozione del reagente per il test di inattivazione è stata effettuata in un formato di colonna di centrifuga più grande utilizzando le colonne di centrifuga di rimozione del detergente Pierce 4mL (Thermo Fisher), o riempiendo le colonne di centrifuga vuote di capacità 10mL Pierce 10mL (Thermo Fisher) con Bio-Beads SM2, Sephacryl S-400HR o Sephadex LH-20 per dare 4mL di perle/resina confezionate. Per la purificazione con filtri Amicon, 2 × 500μl campioni sono stati purificati con due filtri centrifughi con il metodo descritto in precedenza, poi riuniti insieme. Per la formaldeide e formaldeide con rimozione della glutaraldeide, un filtro è stato utilizzato con 1 × 500μl volume di campione 500μl, risospeso dopo l'elaborazione in 500μl PBS, e aggiunto a 400ul MEM / 5% FBS. Per l'inattivazione di infetti VialTweeter at the ultrasonic processor UP200STmonostrato, 12,5 cm2 fiaschi di celle Vero E6 (2,5 × 106 cellule / fiaschetta in 2,5 ml MEM / 5% FBS) sono stati infettati a MOI 0,001 e incubati a 37 ° C / 5% di CO2 per 24 ore. Il surnatante è stato rimosso e le cellule sono state fissate con 5mL di formaldeide, o formaldeide e glutaraldeide a temperatura ambiente per 15 o 60 minuti. Il fissativo è stato rimosso, e monostrato lavato tre volte con PBS prima di raschiettare le cellule in 1mL MEM/5% FBS e sonicato (3 × 10 secondi acceso, 10 secondi spento al 100% di potenza e ampiezza) utilizzando un UP200St con attacco VialTweeter (Hielscher Ultrasound Technology). I surnatanti sono stati chiariti mediante centrifugazione a 3000 × g per 10 minuti.

VialTweeter per l'intensa sonicazione di fiale chiuse

VialTweeter per la sonicazione intensa di fiale chiuse

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Various reagents have been tested for the inactivation of the SARS-CoV-2 coronavirus using the ultrasonic sample prep unit VialTweeter.

Dettagli del reagente utilizzato per l'inattivazione del coronavirus SARS-CoV-2 con il VialTweeter a ultrasuoni secondo il protocollo di Welch et al. 2020

Il protocollo completo, compreso l'uso del VialTweeter Hielscher, si trova qui:
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

The multi-sample ultrasonicator VialTweeter allows for simultaneous sample preparation of up to 10 vials under same process conditions. The VialTweeter is an established ultrasonic device used for the inactivation of corona virus SARS-CoV-2 (Click to enlarge!)

VialTweeter per l'inattivazione del virus a ultrasuoni

I vantaggi del VialTweeter in sintesi

  • Sonicazione fino a 10 fiale contemporaneamente
  • Nessuna contaminazione incrociata
  • Nessuna perdita di campione
  • Registrazione automatica dei dati
  • Facile e sicuro da usare
Il VialTweeter viene utilizzato anche per

  • Lisi cellulare
  • Interruzione delle particelle virali
  • Estrazione dell'acido nucleico: Isolamento del DNA/RNA
  • Frammentazione del DNA/RNA
  • Solubilizzazione del lisato
  • Sofisticati demembratori ad ultrasuoni e distruttori cellulari

    Il VialTweeter ad ultrasuoni multi-campione è solo una delle tante soluzioni ad ultrasuoni per la preparazione dei campioni nei laboratori biologici, biochimici e clinici. Hielscher Ultrasonics offre il dismembratore ad ultrasuoni ideale per la vostra applicazione, ad esempio per la lisi delle cellule, l'estrazione delle cellule, l'omogeneizzazione dei tessuti, la solubilizzazione del lisato, la dissoluzione, il degasaggio del campione, ecc.
    Fateci sapere quanti campioni dovete processare all'ora e al giorno, se preferite la sonicazione diretta o indiretta e qual è l'obiettivo del trattamento a ultrasuoni. Vi consiglieremo l'unità ad ultrasuoni più adatta alla vostra routine lavorativa quotidiana!
    I processori digitali ad ultrasuoni Hielscher Ultrasonics sono dotati di software intelligente, registrazione automatica dei dati, opzioni di facile preimpostazione per il controllo della temperatura, durata della sonicazione, modalità ciclo/impulso, nonché illuminazione del campione e controllo remoto del browser. Ci sforziamo di rendere i nostri dispositivi a ultrasuoni il più intelligente possibile, in modo che la vostra routine di ricerca e di lavoro diventi il più conveniente e di successo possibile.
    Fare clic qui, per trovare altre applicazioni, compresi i protocolli di preparazione del campione a ultrasuoni con il VialTweeter!

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    Ultrasonic high-shear homogenizers are used in lab, bench-top, pilot and industrial processing.

    Hielscher Ultrasonics produce omogeneizzatori ad ultrasuoni ad alte prestazioni per applicazioni di miscelazione, dispersione, emulsificazione ed estrazione in laboratorio, pilota e su scala industriale.

    Letteratura / Referenze



    Particolarità / Cose da sapere

    Cosa sono le Vero Cellule?

    Vero E6, noto anche come Vero C1008 (ATCC No. CRL-1586) è una linea di cellule clonate di Vero 76 ed è utilizzato nella ricerca dei coronavirus SARS-CoV e SARS-CoV-2. Le cellule Vero sono una linea di cellule utilizzate nelle colture cellulari. Il 'Vero’ Lignaggio è stato isolato da cellule epiteliali renali estratte da una scimmia verde africana (Chlorocebus sp.).
    Le cellule Vero E6 mostrano una certa inibizione del contatto, quindi sono adatte a propagare virus che si replicano lentamente. Le linee cellulari Vero E6 sono comunemente usate per studiare la citopatologia dei coronavirus SARS-CoV e SARS-CoV-2 come cellule Vero (cellule renali di scimmia verde africana) mostrano un'abbondante espressione di recettori dell'enzima di conversione dell'angiotensina 2 (ACE2). I recettori ACE2 sono un importante sito di aggancio per il coronavirus SARS-CoV-2.
    Ad esempio, Ogando et al. (2020) hanno scoperto che la SARS-CoV-2 – in confronto alla SARS-CoV – generato livelli più elevati di RNA virale intracellulare, ma sorprendentemente circa 50 volte meno infettiva progenie virale è stato recuperato dal mezzo di coltura. Inoltre, hanno determinato che la sensibilità dei due virus a tre inibitori stabiliti della replicazione del coronavirus (Remdesivir, Alisporivir e clorochina) è molto simile, ma che l'infezione da SARS-CoV-2 era sostanzialmente più sensibile al pretrattamento delle cellule con interferone alfa peghilato. Una differenza importante tra i due virus è il fatto che – al passaggio in celle Vero E6 – SARS-CoV-2 apparentemente è sotto forte pressione di selezione per acquisire mutazioni adattive nel suo gene della proteina spike. Queste mutazioni cambiare o eliminare un putativo 'sito di scissione furin-like' nella regione che collega i domini S1 e S2 e portare ad un cambiamento fenotipico molto prominente nei saggi della placca.