Protocollo per l’inattivazione del coronavirus SARS-CoV-2 mediante sonicazione

Hielscher VialTweeter è un’unità unica per la preparazione di più campioni mediante ultrasuoni, utilizzata per inattivare il coronavirus SARS-COV-2. VialTweeter consente di preparare fino a 10 fiale di campioni contemporaneamente ed è quindi l’unità ideale per il trattamento di campioni su larga scala.

Inattivazione del coronavirus SARS-CoV-2 con VialTweeter

Dopo la rimozione del fissativo, i monostrati sono stati lavati tre volte con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), prima di raccogliere le cellule mediante raschiamento in 1mL di MEM/5% FBS e sottoporle a sonicazione (3 × 10 secondi di attivazione, 10 secondi di pausa, con potenza e ampiezza al 100%) utilizzando il processore a ultrasuoni Hielscher UP200St con VialTweeter come accessorio. I surnatanti sono stati chiarificati mediante centrifugazione a 3000 × g per 10 minuti.

Di seguito è riportato il protocollo completo di Welch et al. (2020) per l’inattivazione del coronavirus SARS-CoV-2:

Cellule e virus

Le cellule Vero E6 (Vero C1008; ATCC CRL-1586) sono state coltivate in terreno minimo essenziale di Eagle modificato (MEM), integrato con il 10% (v/v) di siero fetale bovino (FCS). Il virus utilizzato era il ceppo SARS-CoV-2 hCOV-19/England/2/2020, isolato da PHE dal primo gruppo di pazienti nel Regno Unito il 29/01/2020. Questo virus è stato ottenuto al passaggio 1 e utilizzato per gli studi di inattivazione al passaggio 2 o 3.
Per i reagenti e le sostanze chimiche utilizzati per l’inattivazione di SARS-CoV-2, nonché per la rimozione della citotossicità dei reagenti, consultare il rapporto scientifico di Welch et al. (2020).

Inattivazione del virus mediante detergenti – Protocollo di inattivazione del coronavirus SARS-CoV-2 di Welch et al. 2020

Inattivazione di SARS-CoV-2


Per i prodotti commerciali, le preparazioni virali (liquido di coltura tissutale, con titoli compresi tra 1 × 10⁶ e 1 × 10⁸ PFU/ml) sono state trattate in triplicato con reagenti alle concentrazioni e per i tempi di contatto raccomandati nelle istruzioni per l’uso del produttore, ove disponibili, oppure alle concentrazioni e per i tempi specificamente richiesti dai laboratori di analisi. Quando il produttore indicava un intervallo di concentrazioni, è stato testato il rapporto più basso tra prodotto e campione (ossia la concentrazione minima raccomandata del prodotto da testare). I reagenti delle provette per il trasporto dei campioni sono stati testati utilizzando un rapporto di un volume di liquido di coltura tissutale per dieci volumi di reagente, salvo quando il produttore specificava un rapporto volumetrico tra liquido del campione e reagente. Detergenti, fissativi e solventi sono stati testati alle concentrazioni indicate per i tempi indicati. Tutte le fasi di inattivazione sono state eseguite a temperatura ambiente (18 – 25°C). Per testare tipi di campione alternativi, il virus è stato aggiunto alla matrice del campione indicata in un rapporto di 1:9, quindi trattato con i reagenti da testare come descritto sopra. Tutti gli esperimenti comprendevano campioni di controllo in triplicato sottoposti a un trattamento simulato con un volume equivalente di PBS al posto del reagente da testare. Immediatamente dopo il tempo di contatto richiesto, 1mL di campione trattato è stato processato utilizzando la matrice di filtrazione opportunamente selezionata. La rimozione dei reagenti per le prove di inattivazione è stata effettuata in un formato di colonna centrifuga più grande utilizzando Pierce 4mL Detergent Removal Spin Columns (Thermo Fisher), oppure riempiendo colonne centrifughe Pierce vuote da 10mL (Thermo Fisher) con SM2 Bio-Beads, Sephacryl S-400HR o Sephadex LH-20, fino a ottenere 4mL di sfere/resina impaccate. Per la purificazione con filtri Amicon, 2 × 500μl di campioni sono stati purificati utilizzando due filtri centrifughi secondo il metodo descritto in precedenza, quindi riuniti. Per la rimozione della formaldeide e della formaldeide con glutaraldeide, è stato utilizzato un filtro con un volume di campione di 1× 500μl; dopo il trattamento, il campione è stato risospeso in 500μl di PBS e aggiunto a 400ul di MEM/5% FBS. Per l’inattivazione dei monostrati infetti, fiasche da 12,5 cm² di cellule Vero E6 (2,5 × 10⁶ cellule/fiasca in 2,5mL di MEM/5% FBS) sono state infettate a una MOI di 0,001 e incubate a 37°C/5% CO₂ per 24 ore. Il surnatante è stato rimosso e le cellule sono state fissate utilizzando 5mL di formaldeide, oppure formaldeide e glutaraldeide, a temperatura ambiente per 15 o 60 minuti. Il fissativo è stato rimosso e i monostrati sono stati lavati tre volte con PBS, prima di raccogliere le cellule mediante raschiamento in 1mL di MEM/5% FBS e sottoporle a sonicazione (3 × 10 secondi di attivazione, 10 secondi di pausa, con potenza e ampiezza al 100%) utilizzando un UP200St con l’accessorio VialTweeter (Hielscher Ultrasound Technology). I surnatanti sono stati chiarificati mediante centrifugazione a 3000 × g per 10 minuti.


Dettagli del reagente utilizzato per l’inattivazione del coronavirus SARS-CoV-2 con VialTweeter a ultrasuoni secondo il protocollo di Welch et al. 2020

Il protocollo completo, che include l’uso di Hielscher VialTweeter, è disponibile qui:
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

Disgregatori a ultrasuoni e disgregatori cellulari avanzati

Il sonicatore per più campioni VialTweeter è solo una delle numerose soluzioni a ultrasuoni per la preparazione dei campioni nei laboratori biologici, biochimici e clinici. Hielscher Ultrasonics offre il disgregatore a ultrasuoni ideale per la vostra applicazione, ad esempio lisi cellulare, estrazione cellulare, omogeneizzazione dei tessuti, solubilizzazione dei lisati, dissoluzione, degasaggio dei campioni ecc.
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