Protocollo per l'inattivazione del coronavirus SARS-CoV-2 con la sonicazione

Il VialTweeter di Hielscher è un'unità di preparazione multi-campione a ultrasuoni unica nel suo genere, utilizzata per inattivare il coronavirus SARS-COV-2. Il VialTweeter consente di preparare fino a 10 fiale di campione contemporaneamente ed è quindi l'unità ideale per l'elaborazione di campioni di massa.

Inattivazione del coronavirus SARS-CoV-2 con il VialTweeter

Dopo aver rimosso il fissativo, i monostrati sono stati lavati tre volte con soluzione fisiologica tamponata con fosfato (PBS) prima di raschiare le cellule in 1mL di MEM/5% FBS e sonicare (3 × 10 secondi di accensione, 10 secondi di spegnimento al 100% della potenza e dell'ampiezza) utilizzando il processore a ultrasuoni Hielscher. UP200St con VialTweeter attaccamento. I sovranatanti sono stati chiariti centrifugando a 3000 × g per 10 minuti. Leggete qui il protocollo completo per l'inattivazione del coronavirus SARS-CoV-2 di Welch et al. (2020):

Cellule e virus

Le cellule Vero E6 (Vero C1008; ATCC CRL-1586) sono state coltivate in terreno minimo essenziale di Eagle modificato (MEM) integrato con il 10% (v/v) di siero fetale di vitello (FCS). Il virus utilizzato era il ceppo SARS-CoV-2 hCOV-19/Inghilterra/2/2020, isolato dal PHE dal primo cluster di pazienti nel Regno Unito il 29/01/2020. Il virus è stato ottenuto al passaggio 1 e utilizzato per gli studi di inattivazione al passaggio 2 o 3.
Per i reagenti e le sostanze chimiche utilizzate per l'inattivazione del SARS-CoV-2 e per la rimozione della citotossicità dei reagenti si rimanda alla relazione scientifica di Welch et al. (2020).

Inattivazione del virus da parte dei detergenti – Protocollo di inattivazione del coronavirus SARS-CoV-2 di Welch et al. 2020

Inattivazione del SARS-CoV-2

Per i prodotti commerciali, le preparazioni virali (liquido di coltura tissutale, titoli che vanno da 1 × 10⁶ a 1 × 10⁸ PFU/ml) sono stati trattati in triplo con i reagenti alle concentrazioni e per i tempi di contatto raccomandati nelle istruzioni per l'uso dei produttori, se disponibili, o per concentrazioni e tempi specificamente richiesti dai laboratori di analisi. Quando il produttore ha indicato un intervallo di concentrazioni, è stato testato il rapporto più basso tra prodotto e campione (cioè la concentrazione più bassa raccomandata del prodotto in esame). I reagenti delle provette per il trasporto dei campioni sono stati testati utilizzando un rapporto di un volume di liquido di coltura tissutale per dieci volumi di reagente, a meno che il produttore non abbia specificato un rapporto di volume tra liquido del campione e reagente. I detergenti, i fissativi e i solventi sono stati testati alle concentrazioni indicate per i tempi indicati. Tutte le fasi di inattivazione sono state eseguite a temperatura ambiente (18-25°C). Per testare tipi di campioni alternativi, il virus è stato introdotto nella matrice di campione indicata in un rapporto di 1:9, quindi trattato con i reagenti di prova come sopra. Tutti gli esperimenti includevano campioni di controllo in triplicato trattati in modo simulato con un volume equivalente di PBS al posto del reagente di prova. Subito dopo il tempo di contatto richiesto, 1 mL di campione trattato è stato trattato utilizzando la matrice di filtrazione opportunamente selezionata. La rimozione del reagente per i test di inattivazione è stata effettuata in un formato di colonna spin più grande, utilizzando le colonne spin Pierce 4mL Detergent Removal (Thermo Fisher), oppure riempiendo le colonne centrifughe Pierce vuote da 10mL (Thermo Fisher) con SM2 Bio-Beads, Sephacryl S-400HR o Sephadex LH-20 per ottenere 4mL di perline/resina. Per la purificazione con filtri Amicon, 2 × 500μl di campioni sono stati purificati utilizzando due filtri centrifughi con il metodo precedentemente descritto, quindi sono stati riuniti in pool. Per la rimozione della formaldeide e della formaldeide con glutaraldeide, è stato utilizzato un filtro con un volume di campione di 1× 500μl, risospeso dopo il trattamento in 500μl di PBS e aggiunto a 400ul di MEM/5% FBS. Per l'inattivazione delle cellule infette monostrati, 12,5 cm² fiasche di cellule Vero E6 (2,5 × 10⁶ cellule/flask in 2,5mL MEM/5% FBS) sono state infettate a MOI 0,001 e incubate a 37°C/5% CO₂ per 24 ore. Il sovranatante è stato rimosso e le cellule sono state fissate con 5 mL di formaldeide o formaldeide e glutaraldeide a temperatura ambiente per 15 o 60 minuti. Il fissativo è stato rimosso e i monostrati sono stati lavati tre volte con PBS prima di raschiare le cellule in 1mL di MEM/5% FBS e sonicare (3 × 10 secondi di accensione, 10 secondi di spegnimento al 100% di potenza e ampiezza) utilizzando un UP200St con attacco VialTweeter (Hielscher Ultrasound Technology). I sovranatanti sono stati chiariti centrifugando a 3000 × g per 10 minuti.

Dettagli del reagente utilizzato per l'inattivazione del coronavirus SARS-CoV-2 con il VialTweeter a ultrasuoni secondo il protocollo di Welch et al. 2020

Il protocollo completo, che include l'uso del VialTweeter Hielscher, è disponibile qui:
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

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