Lisi delle cellule BL21 mediante ultrasuoni

Le cellule BL21 appartengono a un ceppo di E. coli ampiamente utilizzato nei laboratori di ricerca, nella biotecnologia e nella produzione industriale grazie alla loro capacità di esprimere proteine con elevata efficienza. La disgregazione cellulare, la lisi e l’estrazione delle proteine mediante ultrasuoni costituiscono il metodo comunemente utilizzato per isolare e raccogliere le proteine bersaglio dall’interno delle cellule BL21. Il trattamento a ultrasuoni disgrega completamente la cellula e rilascia tutte le proteine intrappolate, rendendo disponibile il 100% delle proteine.

Cellule BL21 per l’espressione proteica

BL21 è un ceppo batterico di E. coli chimicamente competente, adatto alla trasformazione e all’espressione proteica ad alto livello mediante un sistema di induzione RNA polimerasi T7-IPTG. Le cellule BL21 consentono l’espressione proteica ad alta efficienza di qualsiasi gene sotto il controllo di un promotore T7. Il ceppo di E. coli BL21(DE3) è un ceppo per la produzione di proteine basato sulla RNA polimerasi T7, abbinato a vettori di espressione basati sul promotore T7, ed è ampiamente utilizzato nei laboratori e nell’industria per produrre proteine ricombinanti. In BL21(DE3), l’espressione del gene che codifica la proteina ricombinante viene trascritta dalla RNA polimerasi T7 (T7 RNAP) codificata a livello cromosomico, che trascrive otto volte più velocemente della RNAP convenzionale di E. coli. Ciò rende il ceppo BL21(DE3) altamente efficiente e lo rende uno dei sistemi cellulari preferiti per l’espressione proteica.

Protocollo per la lisi a ultrasuoni e l’estrazione delle proteine dalle cellule BL21

La lisi delle cellule BL21 viene eseguita principalmente mediante ultrasuoni in combinazione con lauroil sarcosinato di sodio (noto anche come sarkosyl) come tampone di lisi. I vantaggi della disgregazione cellulare e dell’estrazione delle proteine mediante ultrasuoni risiedono nell’affidabilità, nella riproducibilità e nel funzionamento semplice, sicuro e rapido dei sonicatori. Il protocollo seguente fornisce istruzioni passo dopo passo per la lisi a ultrasuoni delle cellule BL21:

• Per rimuovere le proteine chaperone, i pellet batterici BL21 sono stati risospesi in 50 ml di tampone sodio-Tris-EDTA (STE) freddo come il ghiaccio (costituito da 10 mM Tris-HCL, pH 8,0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, con l’aggiunta di 100 mM PMSF).
• Quindi si aggiungono 500 ul di lisozima (10 mg/ ml) e si incubano le cellule su ghiaccio per 15 min.
• Successivamente si aggiungono 500 ul di DTT e 7 ml di sarkosyl (10% (w/v) preparato in tampone STE).
• È essenziale mantenere tutti i tamponi di purificazione freddi come il ghiaccio e tenere sempre i campioni su ghiaccio. Se possibile, tutte le fasi di purificazione devono essere eseguite in una camera fredda.



• Per la lisi a ultrasuoni e l’estrazione delle proteine, i campioni vengono sottoposti a sonicazione nel sonicatore multicampione VialTweeter per 4 x 30 sec al 100% di ampiezza, con un intervallo di 2 min tra una sonicazione e l’altra. In alternativa, si può utilizzare un omogeneizzatore a ultrasuoni a sonda con micropunta, ad esempio UP200Ht con S26d2 (3 x 30 sec, pausa di 2 min. tra i cicli a ultrasuoni, ampiezza dell’80%).
• Per le successive fasi di purificazione, i campioni devono essere mantenuti su ghiaccio oppure conservati a -80°C fino all’ulteriore trattamento.

Lisi a ultrasuoni con controllo preciso della temperatura

Un controllo preciso e affidabile della temperatura è fondamentale quando si manipolano campioni biologici. Le temperature elevate innescano la degradazione delle proteine nei campioni indotta dal calore.
Come tutte le tecniche meccaniche di preparazione dei campioni, la sonicazione genera calore. Tuttavia, utilizzando VialTweeter, la temperatura dei campioni può essere controllata efficacemente. Vi presentiamo diverse opzioni per monitorare e controllare la temperatura dei vostri campioni durante la preparazione con VialTweeter e VialPress per l’analisi.

1. Monitoraggio della temperatura del campione: il processore a ultrasuoni UP200St, che aziona VialTweeter, è dotato di un software intelligente e di un sensore di temperatura collegabile. Collegate il sensore di temperatura a UP200St e inserite la punta del sensore in una delle provette contenenti i campioni. Tramite il display digitale touch a colori, potete impostare nel menu di UP200St un intervallo di temperatura specifico per la sonicazione dei campioni. Il sonicatore si arresta automaticamente quando viene raggiunta la temperatura massima e rimane in pausa finché la temperatura del campione non scende al valore inferiore dell’intervallo di temperatura ∆ impostato. La sonicazione riprende quindi automaticamente. Questa funzione intelligente previene la degradazione indotta dal calore.
2. Il blocco VialTweeter può essere preraffreddato. Collocate il blocco VialTweeter (solo il sonotrodo, senza trasduttore!) nel frigorifero o nel congelatore: il preraffreddamento del blocco in titanio contribuisce a ritardare l’aumento della temperatura nel campione. Se possibile, si può preraffreddare anche il campione stesso.
3. Utilizzate ghiaccio secco per raffreddare durante la sonicazione. Riempite un vassoio poco profondo con ghiaccio secco e collocate VialTweeter sul ghiaccio in modo che il calore possa dissiparsi rapidamente.

Clienti di tutto il mondo utilizzano VialTweeter e VialPress per la preparazione quotidiana dei campioni nei laboratori biologici, biochimici, medici e clinici. Grazie al software intelligente e al controllo della temperatura del processore UP200St, la temperatura viene controllata in modo affidabile e si evita la degradazione dei campioni indotta dal calore. La preparazione dei campioni a ultrasuoni con VialTweeter e VialPress offre risultati altamente affidabili e riproducibili!
 

Trovate il disgregatore a ultrasuoni ottimale per la vostra applicazione di lisi

Hielscher Ultrasonics è un produttore con una lunga esperienza nella realizzazione di disgregatori cellulari e omogeneizzatori a ultrasuoni ad alte prestazioni per laboratori, sistemi da banco e sistemi su scala industriale. Le dimensioni della vostra coltura di cellule batteriche, il vostro obiettivo di ricerca o produzione e il volume di cellule da trattare ogni ora o ogni giorno sono fattori essenziali per individuare il disgregatore cellulare a ultrasuoni adatto alla vostra applicazione.
Hielscher Ultrasonics offre diverse soluzioni per la sonicazione simultanea di più campioni (fino a 10 fiale con VialTweeter) e di campioni in grandi quantità (ossia piastre per microtitolazione / piastre ELISA con UIP400MTP), oltre al classico sonicatore da laboratorio a sonda con diversi livelli di potenza da 50 a 400 watt, fino a processori a ultrasuoni completamente industriali con una potenza fino a 16.000 watt per unità, per la disgregazione cellulare e l’estrazione delle proteine su scala commerciale in grandi impianti produttivi. Tutti i sonicatori Hielscher sono progettati per il funzionamento 24/7/365 a pieno carico. Robustezza e affidabilità sono caratteristiche fondamentali dei nostri dispositivi a ultrasuoni.
Tutti gli omogeneizzatori digitali a ultrasuoni sono dotati di software intelligente, display touch a colori e registrazione automatica dei dati, che rendono il dispositivo a ultrasuoni uno strumento di lavoro pratico nei laboratori e negli impianti di produzione.
Comunicateci quale tipo di cellule, quale volume, con quale frequenza e con quale obiettivo dovete trattare i vostri campioni biologici. Vi consiglieremo il disgregatore cellulare a ultrasuoni più adatto alle esigenze del vostro processo.

La tabella seguente fornisce un’indicazione della capacità di trattamento approssimativa dei nostri sistemi a ultrasuoni, dagli omogeneizzatori portatili compatti e dai sonicatori multicampione ai processori a ultrasuoni industriali per applicazioni commerciali:

Bibliografia / Riferimenti

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