Tecnologia ad ultrasuoni Hielscher

Lisi cellulare di BL21 Cellule per Ultrasonicazione

Le cellule BL21 sono un ceppo di E. coli che è ampiamente utilizzato nei laboratori di ricerca, nelle biotecnologie e nella produzione industriale grazie alla loro capacità di esprimere proteine altamente efficienti. La distruzione cellulare ad ultrasuoni, la lisi e l'estrazione delle proteine è il metodo comune per isolare e raccogliere le proteine mirate dall'interno cellulare delle cellule BL21. L'ultrasonicizzazione interrompe completamente la cellula e rilascia tutte le proteine intrappolate, rendendo disponibile il 100% delle proteine.

Celle BL21 per l'espressione delle proteine

E. coli bacteria such as BL21 cells are commonly lysed by ultrasonication in order to release expressed proteins, such as recombinant proteinsLa cellula BL21 è un ceppo batterico di E. coli chimicamente competente adatto per la trasformazione e l'espressione di proteine ad alto livello utilizzando un sistema di induzione T7 RNA polimerase-IPTG. Le cellule BL21 permettono l'espressione proteica ad alta efficienza di qualsiasi gene che è sotto il controllo di un promotore T7. Il ceppo E. coli BL21(DE3) è un ceppo di produzione di proteine a base di polimerasi di RNA T7 combinato con vettori di espressione basati sul promotore T7 ed è ampiamente applicato nei laboratori e nell'industria per produrre proteine ricombinanti. In BL21(DE3), l'espressione del gene che codifica la proteina ricombinante viene trascritta dalla polimerasi dell'RNA polimerasi T7 codificata cromosomicamente (T7 RNAP), che trascrivere otto volte più velocemente della convenzionale E. coli RNAP. Questo rende il ceppo BL21(DE3) altamente efficiente e lo trasforma in uno dei sistemi cellulari di espressione proteica più preferiti.

Protocollo per la lisi ad ultrasuoni e l'estrazione di proteine dalle cellule BL21

La lisi cellulare delle cellule BL21 è per lo più eseguita utilizzando l'ecografia in combinazione con il sodio lauroyl sarcosinate (noto anche come sarkosyl) come tampone di lisi. I vantaggi della disgregazione cellulare ad ultrasuoni e dell'estrazione delle proteine risiedono nell'affidabilità, nella riproducibilità e nel funzionamento semplice, sicuro e rapido degli ultrasuoni. Il protocollo sottostante fornisce una direzione passo dopo passo per la lisi a ultrasuoni delle cellule BL21:

Insonificatore a sonda UP200St per lisi

Disgregatore a ultrasuoni UP200St con micro-puntale S26d2 per la lisi e l'estrazione delle proteine

Richiesta informazioni





  • Per rimuovere le proteine chaperone, i pellet batterici BL21 sono stati risospesi in 50 ml di tampone Tris-EDTA (STE) al sodio freddo (costituito da 10 mM Tris-HCL, pH 8,0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl integrato con 100 mM PMSF).
  • Il, 500 ul di lisozima (10 mg / ml) sono aggiunti e le cellule sono incubate su ghiaccio per 15 min.
  • Successivamente si aggiungono 500 ul di DTT e 7 ml di sarkosyl (10% (p/v) costituito da buffer STE).
  • È essenziale mantenere tutti i tamponi di purificazione freddi e mantenere i campioni su ghiaccio per tutto il tempo. Tutte le fasi di purificazione devono essere effettuate, se possibile, nella cella frigorifera.
  • VialTweeter at the ultrasonic processor UP200ST

  • Per la lisi ad ultrasuoni e l'estrazione delle proteine, i campioni sono sonicati nel VialTweeter MultiSample Ultrasuonatore per 4 x 30 secondi al 100% di ampiezza con un intervallo di 2 minuti tra ogni sonicazione. In alternativa, un omogeneizzatore a ultrasuoni a sonda con micropunte, ad esempio, UP200Ht con S26d2 (3 x 30 sec, 2 min. di pausa tra un ciclo di ultrasuoni e l'altro, 80% di ampiezza).
  • Per ulteriori fasi di purificazione, i campioni devono essere tenuti in ghiaccio o, in alternativa, conservati a -80°C fino ad ulteriore lavorazione.

Lisi ad ultrasuoni sotto controllo della temperatura in anticipo

Il controllo della temperatura preciso e affidabile è cruciale quando si maneggiano campioni biologici. Le alte temperature avviano la degradazione delle proteine indotte termicamente nei campioni.
Come tutte le tecniche di preparazione meccanica del campione, la sonicazione crea calore. Tuttavia, la temperatura dei campioni può essere ben controllata quando si utilizza il VialTweeter. Vi presentiamo varie opzioni per monitorare e controllare la temperatura dei vostri campioni mentre li preparate con il VialTweeter e il VialPress per l'analisi.

  1. Monitoraggio della temperatura del campione: Il processore ad ultrasuoni UP200St, che pilota il VialTweeter, è dotato di un software intelligente e di un sensore di temperatura collegabile. Inserire il sensore di temperatura nel UP200St e inserire la punta del sensore di temperatura in uno dei tubi campione. Tramite il display digitale a colori touch-display, è possibile impostare nel menu dell'UP200St un intervallo di temperatura specifico per la sonicazione del campione. L'ecografo si arresta automaticamente al raggiungimento della temperatura massima e si mette in pausa fino a quando la temperatura del campione non scende al valore inferiore della temperatura impostata ∆. Poi la sonicazione ricomincia automaticamente. Questa funzione intelligente previene la degradazione indotta dal calore.
  2. Il blocco VialTweeter può essere pre-raffreddato. Mettere il blocco VialTweeter (solo il sonotrodo senza trasduttore!) nel frigorifero o nel congelatore per pre-raffreddare il blocco di titanio aiuta a posticipare l'aumento di temperatura nel campione. Se possibile, anche il campione stesso può essere pre-raffreddato.
  3. Utilizzare ghiaccio secco per raffreddare durante la sonicazione. Utilizzare una vaschetta poco profonda riempita di ghiaccio secco e posizionare il VialTweeter sul ghiaccio in modo che il calore possa dissiparsi rapidamente.

I clienti di tutto il mondo utilizzano il VialTweeter e il VialPress per il loro lavoro quotidiano di preparazione dei campioni nei laboratori biologici, biochimici, medici e clinici. Il software intelligente e il controllo della temperatura del processore UP200St, la temperatura è controllata in modo affidabile e si evita la degradazione del campione indotta dal calore. La preparazione del campione ad ultrasuoni con il VialTweeter e il VialPress fornisce risultati altamente affidabili e riproducibili!

Trovate il distruttore a ultrasuoni ottimale per la vostra applicazione Lysis

Hielscher's industrial processors of the hdT series can be comfortable and user-friendly operated via browser remote control.Hielscher Ultrasonics è un produttore di lunga esperienza nella produzione di disgregatori e omogeneizzatori ad ultrasuoni ad alte prestazioni per laboratori, sistemi da banco e su scala industriale. La dimensione della coltura di cellule batteriche, il vostro obiettivo di ricerca o di produzione e il volume di cellule da trattare all'ora o al giorno sono fattori essenziali per trovare il giusto distruttore di cellule a ultrasuoni per la vostra applicazione.
Hielscher Ultrasonics offre diverse soluzioni per la sonicazione simultanea di campioni multipli (fino a 10 fiale con il VialTweeter) e campioni di massa (ad esempio, piastre microtiter / piastre ELISA con l'UIP400MTP), così come il classico ultrasuonatore da laboratorio a sonde con diversi livelli di potenza da 50 a 400 watt fino a processori ad ultrasuoni completamente industriali con fino a 16.000 watt per unità per la distruzione delle cellule commerciali e l'estrazione di proteine in grandi produzioni. Tutti gli ultrasuoni Hielscher sono costruiti per il funzionamento 24/7/365 a pieno carico. La robustezza e l'affidabilità sono caratteristiche fondamentali dei nostri dispositivi a ultrasuoni.
Tutti gli omogeneizzatori digitali ad ultrasuoni sono dotati di software intelligente, display touch-screen a colori e protocollo dati automatico, che rendono il dispositivo ad ultrasuoni un comodo strumento di lavoro in laboratorio e negli impianti di produzione.
Fateci sapere, che tipo di cellule, che volume, con quale frequenza e con quale obiettivo dovete trattare i vostri campioni biologici. Vi consiglieremo il distruttore cellulare ad ultrasuoni più adatto alle vostre esigenze di processo.

La tabella sottostante fornisce un'indicazione della capacità di elaborazione approssimativa dei nostri sistemi ad ultrasuoni, dagli omogeneizzatori portatili compatti e dagli ultrasuoni MultiSample ad ultrasuoni per applicazioni commerciali:

Volume di batch Portata Dispositivi raccomandati
Piastre a 96 pozzetti / microtitolatori n.a. UIP400MTP
10 fiale da 0,5 a 1,5 ml n.a. VialTweeter a UP200St
0.01 a 250mL Da 5 a 100mL/min UP50H
0.01 a 500mL 10 - 200mL/min UP100H
10 - 2000mL 20 - 400mL/min UP200Ht, UP400St
0,1 - 20L 0,2 - 4L/min UIP2000hdT
10 - 100L 2 - 10L/min UIP4000hdT
n.a. 10 - 100L/min UIP16000
n.a. più grande cluster di UIP16000

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Si prega di utilizzare il modulo sottostante per richiedere ulteriori informazioni sui processori ad ultrasuoni, le applicazioni e il prezzo. Saremo lieti di discutere il vostro processo con voi e di offrirvi un sistema ad ultrasuoni che soddisfi le vostre esigenze!









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Ultrasonicator UP200Ht with microtip S26d2 for ultrasonic lysis of biological samples

ultrasonoro UP200Ht con micropuntale da 2 mm S26d2 per la sonicazione di piccoli campioni

Letteratura / Referenze



Particolarità / Cose da sapere

Batteri Escherichia Coli

L'Escherichia coli è un tipo di batterio, che non ha formazione di spore, Gram-negativo ed è caratterizzato dalla sua forma ad asta diritta. I batteri dell'Escherichia coli sono presenti nell'ambiente, negli alimenti e nell'intestino degli esseri umani e degli animali. E. coli è di solito mobile utilizzando flagelli peritricoli, ma ci sono anche tipi non mobili. Gli E.coli sono cosiddetti organismi chemioorganotrofi facultativamente anaerobici, il che significa che sono capaci di metabolismo sia respiratorio che fermentativo. La maggior parte dei tipi di E.coli sono benigni e svolgono funzioni utili nell'organismo, ad esempio sopprimendo la crescita di specie batteriche nocive, sintetizzando vitamine ecc.
Le cellule batteriche di Escherichia coli del cosiddetto tipo B sono una categoria speciale di ceppi di E.coli, che sono ampiamente utilizzati nella ricerca per studiare meccanismi come la sensibilità dei batteriofagi o i sistemi di modificazione delle restrizioni. Inoltre, i batteri di E.coli sono valutati come un affidabile cavallo di battaglia per l'espressione delle proteine nei laboratori di biotecnologia e scienze della vita. Ad esempio, gli E.coli sono utilizzati per sintetizzare composti come proteine e oligosaccaridi su scala industriale. A causa di caratteristiche specifiche come la carenza di proteasi, la bassa produzione di acetato ad alto livello di glucosio e la maggiore permeabilità, le cellule B di E. coli sono le cellule ospiti più frequentemente utilizzate per la produzione di proteine geneticamente modificate.

Proteina ricombinante

Le proteine ricombinanti (rProt) stanno acquisendo un'importanza significativa in molteplici settori, tra cui la produzione chimica, farmaceutica, cosmetica, medicina umana e animale, agricoltura, alimentazione e industria del trattamento dei rifiuti.
La produzione di proteine ricombinanti richiede l'uso di un sistema di espressione. Come sistemi cellulari di espressione per la produzione di DNA ricombinante, si possono utilizzare sia cellule procariotiche che eucariotiche. Mentre le cellule batteriche sono più ampiamente utilizzate per l'espressione delle proteine a causa di fattori quali il basso costo, la facile scalabilità e le semplici condizioni dei media, i mammiferi, i lieviti, le alghe, gli insetti e i sistemi privi di cellule sono alternative consolidate. Il tipo di proteina, l'attività funzionale, così come la resa richiesta di proteine espresse influenzano la selezione del sistema cellulare utilizzato per l'espressione delle proteine.
Per esprimere la proteina ricombinante, una particolare cellula deve essere trasfettata con un vettore di DNA contenente il modello di DNA ricombinante. Le cellule trasfettate con il template vengono poi messe in coltura. Come conseguenza del meccanismo cellulare, le cellule trascrivono e traducono la proteina di interesse, producendo così la proteina mirata.
Come le proteine espresse sono intrappolate nella matrice cellulare, la cellula deve essere lisata (perturbata e rotta) per rilasciare le proteine. In una successiva fase di purificazione, la proteina viene separata e purificata.
La prima proteina ricombinante utilizzata nel trattamento è stata l'insulina umana ricombinante nel 1982. Oggi, più di 170 tipi di proteine ricombinanti sono prodotte in tutto il mondo per i trattamenti medici. Le proteine ricombinanti comunemente usate in medicina sono per esempio gli ormoni ricombinanti, gli interferoni, le interleuchine, i fattori di crescita, i fattori di necrosi tumorale, i fattori di coagulazione del sangue, i farmaci trombolitici e gli enzimi per il trattamento di malattie importanti come il diabete, nanismo, infarto del miocardio, insufficienza cardiaca congestizia, apoplessia cerebrale, sclerosi multipla, neutropenia, trombocitopenia, anemia, epatite, artrite reumatoide, asma, morbo di Crohn e terapie contro il cancro. (cfr. Phuc V. Pham, in Omics Technologies and Bio-Engineering, 2018)


Hielscher Ultrasonics supplies high-performance ultrasonic homogenizers from lab to industrial size.

Ultrasuoni ad alte prestazioni! La gamma di prodotti Hielscher copre l'intero spettro, dal compatto ecografo da laboratorio alle unità da banco fino ai sistemi ad ultrasuoni completamente industriali.