Lisi cellulare di cellule BL21 mediante ultrasuoni
Le cellule BL21 sono un ceppo di E. coli ampiamente utilizzato nei laboratori di ricerca, nelle biotecnologie e nella produzione industriale grazie alla loro capacità di esprimere proteine in modo altamente efficiente. La disgregazione cellulare, la lisi e l'estrazione delle proteine con gli ultrasuoni è il metodo comune per isolare e raccogliere le proteine mirate dall'interno delle cellule BL21. L'ultrasuonoterapia disgrega completamente la cellula e rilascia tutte le proteine intrappolate, rendendo disponibile il 100% delle proteine.
Cellule BL21 per l'espressione di proteine
La cellula BL21 è un ceppo batterico di E. coli chimicamente competente, adatto alla trasformazione e all'espressione di proteine ad alto livello utilizzando un sistema di induzione T7 RNA polimerasi-IPTG. Le cellule BL21 consentono l'espressione proteica ad alta efficienza di qualsiasi gene sotto il controllo di un promotore T7. Il ceppo di E. coli BL21(DE3) è un ceppo per la produzione di proteine basato sulla RNA polimerasi T7 combinato con vettori di espressione basati su promotori T7 ed è ampiamente utilizzato nei laboratori e nell'industria per produrre proteine ricombinanti. In BL21(DE3), l'espressione del gene che codifica la proteina ricombinante viene trascritta dalla T7 RNA polimerasi (T7 RNAP) codificata a livello cromosomico, che trascrive otto volte più velocemente della RNAP convenzionale di E. coli. Questo rende il ceppo BL21(DE3) altamente efficiente e lo trasforma in uno dei sistemi cellulari per l'espressione di proteine più richiesti.
Protocollo per la lisi a ultrasuoni e l'estrazione di proteine da cellule BL21
La lisi cellulare delle cellule BL21 viene per lo più eseguita utilizzando gli ultrasuoni in combinazione con il lauroil sarcosinato di sodio (noto anche come sarkosyl) come tampone di lisi. I vantaggi della disgregazione cellulare e dell'estrazione di proteine con gli ultrasuoni risiedono nell'affidabilità, nella riproducibilità e nel funzionamento semplice, sicuro e rapido degli ultrasuonatori. Il protocollo riportato di seguito fornisce una guida passo-passo per la lisi ultrasonica di cellule BL21:
- Per rimuovere le proteine chaperone, i pellet di batteri BL21 sono stati risospesi in 50 ml di tampone Sodium Tris-EDTA (STE) freddo (composto da 10 mM Tris-HCL, pH 8.0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl integrato con 100 mM PMSF).
- Vengono aggiunti 500 ul di lisozima (10 mg/ml) e le cellule vengono incubate in ghiaccio per 15 minuti.
- Successivamente, vengono aggiunti 500 ul di DTT e 7 ml di sarkosyl (10% (w/v) in tampone STE).
- È essenziale mantenere tutti i tamponi di purificazione freddi come il ghiaccio e mantenere i campioni sempre in ghiaccio. Tutte le fasi di purificazione devono essere eseguite possibilmente nella cella frigorifera.
- Per la lisi a ultrasuoni e l'estrazione delle proteine, i campioni vengono sonicati nel Ultrasuonatore multicampione VialTweeter per 4 x 30 sec al 100% di ampiezza con un intervallo di 2 minuti tra ogni sonicazione. In alternativa, un omogeneizzatore a ultrasuoni a sonda con micropunta, ad es, UP200Ht con S26d2 (3 x 30 sec, 2 min. di pausa tra i cicli di ultrasuoni, ampiezza 80%).
- Per le ulteriori fasi di purificazione, i campioni devono essere mantenuti in ghiaccio o, in alternativa, conservati a -80°C fino alla successiva elaborazione.
Distruttore cellulare a ultrasuoni UP200St con micropuntale S26d2 per la lisi e l'estrazione delle proteine
Lisi a ultrasuoni con controllo della temperatura di prescizione
Il controllo preciso e affidabile della temperatura è fondamentale quando si maneggiano campioni biologici. Le alte temperature innescano la degradazione termica delle proteine nei campioni.
Come tutte le tecniche di preparazione meccanica dei campioni, la sonicazione genera calore. Tuttavia, la temperatura dei campioni può essere ben controllata quando si utilizza il VialTweeter. Vi presentiamo diverse opzioni per monitorare e controllare la temperatura dei vostri campioni mentre li preparate per l'analisi con VialTweeter e VialPress.
- Monitoraggio della temperatura del campione: Il processore a ultrasuoni UP200St, che pilota il VialTweeter, è dotato di un software intelligente e di un sensore di temperatura collegabile. Collegare il sensore di temperatura all'UP200St e inserire la punta del sensore di temperatura in una delle provette del campione. Tramite il display digitale a sfioramento colorato, è possibile impostare nel menu dell'UP200St un intervallo di temperatura specifico per la sonicazione dei campioni. L'ultrasuonatore si arresta automaticamente quando viene raggiunta la temperatura massima e si ferma finché la temperatura del campione non scende al valore inferiore del ∆ di temperatura impostato. A quel punto la sonicazione riprende automaticamente. Questa funzione intelligente previene la degradazione indotta dal calore.
- Il blocco VialTweeter può essere pre-raffreddato. Mettere il blocco VialTweeter (solo il sonotrodo senza trasduttore!) nel frigorifero o nel congelatore per pre-raffreddare il blocco di titanio aiuta a posticipare l'aumento di temperatura nel campione. Se possibile, anche il campione stesso può essere pre-raffreddato.
- Utilizzare ghiaccio secco per raffreddare durante la sonicazione. Utilizzare un vassoio poco profondo riempito di ghiaccio secco e posizionare il VialTweeter sul ghiaccio in modo da dissipare rapidamente il calore.
I clienti di tutto il mondo utilizzano VialTweeter e VialPress per la preparazione quotidiana dei campioni nei laboratori biologici, biochimici, medici e clinici. Grazie al software intelligente e al controllo della temperatura del processore UP200St, la temperatura viene controllata in modo affidabile e si evita la degradazione del campione indotta dal calore. La preparazione dei campioni a ultrasuoni con VialTweeter e VialPress offre risultati altamente affidabili e riproducibili!
Trova il disgregatore a ultrasuoni ottimale per la tua applicazione di lisi
Hielscher Ultrasonics è un produttore di lunga esperienza di disgregatori cellulari e omogeneizzatori a ultrasuoni ad alte prestazioni per laboratori, sistemi da banco e su scala industriale. Le dimensioni della coltura di cellule batteriche, l'obiettivo di ricerca o di produzione e il volume di cellule da trattare all'ora o al giorno sono fattori essenziali per trovare il disgregatore cellulare a ultrasuoni più adatto alla vostra applicazione.
Hielscher Ultrasonics offre diverse soluzioni per la sonicazione simultanea di campioni multipli (fino a 10 fiale con il VialTweeter) e di massa (ad esempio, piastre per microtitolazione/piastre ELISA con l'UIP400MTP), oltre al classico ultrasuonatore da laboratorio a sonda con diversi livelli di potenza, da 50 a 400 watt, fino ai processori a ultrasuoni completamente industriali, con potenze fino a 16.000 watt per unità, per la disgregazione di cellule commerciali e l'estrazione di proteine in grandi produzioni. Tutti gli ultrasonici Hielscher sono costruiti per funzionare 24/7/365 a pieno carico. Robustezza e affidabilità sono caratteristiche fondamentali dei nostri dispositivi a ultrasuoni.
Tutti gli omogeneizzatori digitali a ultrasuoni sono dotati di un software intelligente, di un display touch a colori e di un protocollatore automatico di dati, che rendono il dispositivo a ultrasuoni un comodo strumento di lavoro in laboratorio e negli impianti di produzione.
Fateci sapere che tipo di cellule, che volume, con quale frequenza e con quale obiettivo dovete trattare i vostri campioni biologici. Vi consiglieremo il distruttore cellulare a ultrasuoni più adatto alle vostre esigenze di processo.
La tabella seguente fornisce un'indicazione della capacità di trattamento approssimativa dei nostri sistemi a ultrasuoni, dagli omogeneizzatori compatti portatili e dagli ultrasonici multi-campione ai processori industriali a ultrasuoni per applicazioni commerciali:
| Volume di batch | Portata | Dispositivi raccomandati |
|---|---|---|
| Piastre da 96 pozzetti? microtiter | n.a. | UIP400MTP |
| 10 fiale da 0,5 a 1,5 ml | n.a. | VialTweeter a UP200St |
| 0Da .01 a 250 ml | Da 5 a 100mL/min | UP50H |
| 0Da .01 a 500 ml | 10 - 200mL/min | UP100H |
| 10 - 2000mL | 20 - 400mL/min | UP200Ht, UP400St |
| 0,1 - 20L | 0,2 - 4L/min | UIP2000hdT |
| 10 - 100L | 2 - 10L/min | UIP4000hdt |
| n.a. | 10 - 100L/min | UIP16000 |
| n.a. | più grande | cluster di UIP16000 |
Contattateci!? Chiedi a noi!
Sonicatore a piastra UIP400MTP per la distruzione di cellule ad alto rendimento in piastre a 96 pozzetti
ultrasuonatore UP200Ht con microtip S26d2 da 2 mm per la sonicazione di piccoli campioni
Per saperne di più su come utilizzare l'omogeneizzatore di tessuti a ultrasuoni per la preparazione efficiente e affidabile di soluzioni tampone!
Particolarità? Cose da sapere
Batteri Escherichia Coli
L'Escherichia coli è un tipo di batterio che non forma spore, è Gram-negativo e si caratterizza per la sua forma di bastoncino dritto. I batteri E.coli sono presenti nell'ambiente, negli alimenti e nell'intestino di uomini e animali. L'Escherichia coli è solitamente mobile grazie all'uso di flagelli peritrici, ma esistono anche tipi non mobili. Gli E. coli sono organismi chemioorganotrofi cosiddetti anaerobi facultativi, cioè capaci di un metabolismo sia respiratorio che fermentativo. La maggior parte dei tipi di E.coli è benigna e svolge funzioni utili nell'organismo, ad esempio sopprimendo la crescita di specie batteriche dannose, sintetizzando vitamine ecc.
Le cellule batteriche di Escherichia coli del cosiddetto tipo B sono una categoria speciale di ceppi di E.coli, ampiamente utilizzati nella ricerca per studiare meccanismi quali la sensibilità ai batteriofagi o i sistemi di restrizione-modifica. Inoltre, i batteri E.coli sono apprezzati come affidabili cavalli di battaglia per l'espressione di proteine nei laboratori di biotecnologia e scienze biologiche. Ad esempio, gli E.coli sono utilizzati per sintetizzare composti come proteine e oligosaccaridi su scala industriale. Grazie a caratteristiche specifiche come la carenza di proteasi, la bassa produzione di acetato a un livello elevato di glucosio e la maggiore permeabilità, le cellule B di E. coli sono le cellule ospiti più utilizzate per la produzione di proteine geneticamente modificate.
Proteina ricombinante
Le proteine ricombinanti (rProt) stanno acquisendo un'importanza significativa in molteplici settori, tra cui la produzione chimica, la farmaceutica, la cosmetica, la medicina umana e animale, l'agricoltura, l'alimentazione e il trattamento dei rifiuti.
La produzione di proteine ricombinanti richiede l'uso di un sistema di espressione. Come sistemi cellulari di espressione per la produzione di DNA ricombinante, possono essere utilizzate sia cellule procariotiche che eucariotiche. Sebbene le cellule batteriche siano le più utilizzate per l'espressione di proteine grazie a fattori quali il basso costo, la facile scalabilità e le semplici condizioni di terreno, i sistemi di mammiferi, lieviti, alghe, insetti e cellule libere sono alternative consolidate. Il tipo di proteina, l'attività funzionale e la resa richiesta della proteina espressa influenzano la scelta del sistema cellulare utilizzato per l'espressione delle proteine.
Per esprimere una proteina ricombinante, una particolare cellula deve essere trasfettata con un vettore di DNA contenente il modello di DNA ricombinante. Le cellule trasfettate con il modello vengono quindi coltivate. Come conseguenza del meccanismo cellulare, le cellule trascrivono e traducono la proteina di interesse, producendo così la proteina target.
Poiché le proteine espresse sono intrappolate nella matrice cellulare, la cellula deve essere lisata (disgregata e rotta) per rilasciare le proteine. In una successiva fase di purificazione, le proteine vengono separate e purificate.
La prima proteina ricombinante utilizzata nel trattamento è stata l'insulina umana ricombinante nel 1982. Oggi, più di 170 tipi di proteine ricombinanti sono prodotti in tutto il mondo per trattamenti medici. Le proteine ricombinanti comunemente usate in medicina sono ad esempio gli ormoni ricombinanti, gli interferoni, le interleuchine, i fattori di crescita, i fattori di necrosi tumorale, i fattori di coagulazione del sangue, i farmaci trombolitici e gli enzimi per il trattamento di malattie importanti come il diabete, il nanismo, l'infarto del miocardio, l'insufficienza cardiaca congestizia, l'apoplessia cerebrale, la sclerosi multipla, la neutropenia, la trombocitopenia, l'anemia, l'epatite, l'artrite reumatoide, l'asma, il morbo di Crohn e le terapie per il cancro. (cfr. Phuc V. Pham, in Tecnologie omiche e bioingegneria, 2018)
Letteratura? Riferimenti
- Cheraghi S.; Akbarzade A.; Farhangi A.; Chiani M.; Saffari Z.; Ghassemi S.; Rastegari H.; Mehrabi M.R. (2010): Improved Production of L-lysine by Over-expression of Meso-diaminopimelate Decarboxylase Enzyme of Corynebacterium glutamicum in Escherichia coli. Pak J Biol Sci. 2010 May 15; 13(10), 2010. 504-508.
- LeThanh, H.; Neubauer, P.; Hoffmann, F. (2005): The small heat-shock proteins IbpA and IbpB reduce the stress load of recombinant Escherichia coli and delay degradation of inclusion bodies. Microb Cell Fact 4, 6; 2005.
- Martínez-Gómez A.I.; Martínez-Rodríguez S.; Clemente-Jiménez J.M.; Pozo-Dengra J.; Rodríguez-Vico F.; Las Heras-Vázquez F.J. (2007): Recombinant polycistronic structure of hydantoinase process genes in Escherichia coli for the production of optically pure D-amino acids. Appl Environ Microbiol. 73(5); 2007. 1525-1531.
- Kotowska M.; Pawlik K.; Smulczyk-Krawczyszyn A.; Bartosz-Bechowski H.; Kuczek K. (2009): Type II Thioesterase ScoT, Associated with Streptomyces coelicolor A3(2) Modular Polyketide Synthase Cpk, Hydrolyzes Acyl Residues and Has a Preference for Propionate. Appl Environ Microbiol. 75(4); 2009. 887-896.
Sonicatore VialTweeter per la sonicazione simultanea di 10 campioni, ad esempio per disgregare cellule BL21
Ultrasuoni ad alte prestazioni! La gamma di prodotti Hielscher copre l'intera gamma, dall'ultrasuonatore compatto da laboratorio alle unità da banco fino ai sistemi a ultrasuoni completamente industriali.