Preparazione del campione a ultrasuoni per i test ELISA

I test come l'ELISA sono ampiamente utilizzati per la diagnostica in vitro, l'individuazione di proteine legate a malattie e il controllo di qualità (ad esempio, il monitoraggio degli allergeni alimentari). La preparazione del campione con gli ultrasuoni è una tecnica rapida, affidabile e riproducibile per lisare le cellule e isolare proteine intracellulari, DNA, RNA e organelli. Hielscher Ultrasonics offre diverse soluzioni a ultrasuoni per la comoda preparazione di campioni singoli, fiale multiple, piastre per microtitolazione e piastre a 96 pozzetti.

ELISA – Test di immunoassorbimento legato all'enzima

ELISA è l'acronimo di enzyme-linked immunosorbent assay ed è una tecnica di analisi biochimica ampiamente utilizzata nella categoria dei test di legame con i ligandi. Nell'ELISA, un campione liquido viene aggiunto a una fase solida stazionaria con particolari proprietà di legame. Normalmente, la fase solida stazionaria viene applicata come rivestimento a una piastra a pozzetti o a una piastra ELISA. Quindi, vari reagenti liquidi vengono aggiunti in sequenza, incubati e lavati, in modo che alla fine si verifichi un cambiamento ottico (ad esempio, lo sviluppo del colore da parte del prodotto di una reazione enzimatica) nel liquido finale nel pozzetto. Il cambiamento ottico consente di misurare la quantità dell'analita mediante una cosiddetta analisi quantitativa. “lettura". Per la lettura quantitativa, si utilizza uno spettrofotometro, un fluorimetro o un luminometro per rilevare e misurare l'intensità della luce trasmessa. La sensibilità del rilevamento è influenzata dall'amplificazione del segnale durante le reazioni analitiche. Poiché le reazioni enzimatiche sono processi di amplificazione ben studiati e affidabili, si utilizzano gli enzimi per creare il segnale. Gli enzimi sono collegati ai reagenti di rilevazione in proporzioni fisse per consentire una quantificazione accurata, il che spiega anche il nome di saggio immunosorbente "enzimatico".
Poiché i saggi ELISA vengono eseguiti in piastre da microtitolazione/piastre da 96 pozzetti, è nota come tecnica di dosaggio su piastra e viene utilizzata, ad esempio, nella diagnostica clinica in vitro, nella ricerca, nello sviluppo di farmaci, ecc. per rilevare e quantificare anticorpi, peptidi, proteine e ormoni.
La tecnica ELISA è spesso utilizzata come strumento diagnostico in medicina, biotecnologia, patologia vegetale ed è anche un'importante misura di controllo della qualità in diversi settori industriali.

Preparazione del campione a ultrasuoni prima dell'ELISA

Prima di poter eseguire il test ELISA, i campioni richiedono fasi di preparazione come la lisi cellulare e l'estrazione di proteine intracellulari, DNA, RNA ecc. Il vantaggio della lisi cellulare e dell'isolamento proteico a ultrasuoni è la sua elevata efficienza, affidabilità e riproducibilità. Tutti questi fattori sono importanti per ottenere risultati diagnostici e di ricerca di alta qualità.

Protocollo per la lisi cellulare ad ultrasuoni pre-ELISA

• Per le colture cellulari: Prima della lisi cellulare a ultrasuoni, centrifugare le cellule per 5 minuti a 270 x g in una microcentrifuga. Rimuovere il surnatante mediante aspirazione e risospendere le cellule in 30-100 μL di tampone RIPA. Incubare quindi il pellet cellulare in ghiaccio per 30 minuti.
• Ora il campione di cellule è pronto per la lisi a ultrasuoni:
  Utilizzare un ultrasuonatore a sonda (ad es. UP200Ht con sonda S26d2) o un dispositivo multicampione a ultrasuoni (ad esempio VialTweeter per la sonicazione simultanea di un massimo di 10 fiale o UIP400MPT per piastre da microtitolazione/piastre da 96 pozzetti) a seconda della quantità di campioni da preparare.
  Per la sonicazione a sonda di un singolo campione, porre le cellule in provette da 1,5 mL per microcentrifuga.
• Preimpostare la durata degli ultrasuoni, l'energia totale immessa, la modalità di ciclo e/o i limiti di temperatura nel menu digitale dell'ultrasuonatore. Ciò garantisce una sonicazione e una ripetibilità altamente affidabili.
• Inserire il sonotrodo e accendere il dispositivo a ultrasuoni. Muovere delicatamente la micropunta della sonda a ultrasuoni attraverso il campione per sonicarlo uniformemente.
  Per la maggior parte delle cellule, la lisi ultrasonica sarà completata dopo 2 - 4 cicli di sonicazione di 10 secondi.
• Dopo la sonicazione, rimuovere il sonotrodo dal campione. I campioni devono essere incubati in ghiaccio per 5 minuti. Quindi, centrifugare a 10.000 x g per 20 minuti per pellettizzare i detriti. Trasferire i surnatanti in una nuova provetta da microcentrifuga. Etichettare gli analiti e conservare a -20°C.
• Il sonotrodo a ultrasuoni può essere pulito pulendolo adeguatamente con alcol o sonicandolo in un becher riempito di alcol, ad esempio etanolo al 70%. Tutte le sonde a ultrasuoni in titanio sono sterilizzabili in autoclave.

• Sciacquare il tessuto con PBS freddo (0,01M, pH=7,4) per rimuovere accuratamente il sangue ematico in eccesso.
• Pesare il tessuto (rene, cuore, polmone, milza ecc.) e macerarlo in piccoli pezzi, che vengono omogeneizzati in PBS. Il volume di PBS necessario è legato al peso del tessuto. Come regola generale, 1 g di tessuto richiede circa 9 ml di PBS. Si consiglia di aggiungere al PBS un inibitore di proteasi. (In alternativa si può usare il RIPA o il tampone di lisi ipotonico contenente cocktail di inibitori di proteasi e fosfatasi).
• A seconda delle dimensioni del tessuto, può essere utile un breve trattamento con vortice (circa 1-2 min. in impulsi di 15 sec.) per pre-trattare il tessuto.
• Montare un micropuntale, ad esempio S26d2, sull'ultrasuonatore. Posizionare la provetta con il tessuto in un bagno di ghiaccio.
• Sonicare il campione con l'ultrasuonatore, ad esempio UP200St (ampiezza 80%) per 1 min. in modalità impulso (15 sec. accensione, 15 sec. pausa). Tenere il campione nel bagno di ghiaccio.
• Gli omogenati vengono poi centrifugati per ottenere pool specifici (citosolico, nucleare, mitocondriale o lisosomiale) al fine di arricchire le proteine da analizzare. Centrifugando il campione per 5 minuti a 5000×g, si recupera il surnatante.

Controllo affidabile della temperatura durante la sonicazione

La temperatura è un fattore cruciale che influenza il processo ed è particolarmente importante per il trattamento di campioni biologici, ad esempio per prevenire la degradazione termica delle proteine. Come tutte le tecniche di preparazione meccanica dei campioni, la sonicazione genera calore. Tuttavia, la temperatura dei campioni può essere ben controllata utilizzando i dispositivi Hielscher Ultrasonics. Vi presentiamo diverse opzioni per monitorare e controllare la temperatura dei vostri campioni durante la preparazione preanalitica con un ultrasuonatore a sonda o con il VialTweeter.

1. Monitoraggio della temperatura del campione: Tutti i processori digitali a ultrasuoni Hielscher sono dotati di un software intelligente e di un sensore di temperatura collegabile. Collegare il sensore di temperatura al dispositivo a ultrasuoni (ad esempio, UP200Ht, UP200St, VialTweeterUIP400MTP) e inserire la punta del sensore di temperatura in una delle provette di campione. Tramite il display digitale a sfioramento colorato, è possibile impostare nel menu del processore a ultrasuoni un intervallo di temperatura specifico per la sonicazione del campione. L'ultrasuonatore si arresta automaticamente quando viene raggiunta la temperatura massima e si ferma finché la temperatura del campione non scende al valore inferiore del ∆ di temperatura impostato. A quel punto la sonicazione riprende automaticamente. Questa funzione intelligente previene la degradazione indotta dal calore.
2. Per quanto riguarda l'unità multi-campione a ultrasuoni VialTweeter, il blocco di titanio, che contiene le provette di campione, può essere pre-raffreddato. Mettere il blocco VialTweeter (solo il sonotrodo senza trasduttore!) in frigorifero o nel congelatore per pre-raffreddare il blocco di titanio aiuta a posticipare l'aumento di temperatura nel campione. Se possibile, anche il campione stesso può essere pre-raffreddato.
3. Utilizzare un bagno di ghiaccio o ghiaccio secco per raffreddare durante la sonicazione. Durante la sonicazione, collocare la provetta o le provette in un bagno di ghiaccio. Per il VialTweeter, utilizzare un vassoio poco profondo riempito di ghiaccio secco e posizionare il VialTweeter sul ghiaccio secco in modo da dissipare rapidamente il calore.

I clienti di tutto il mondo utilizzano le sonde-ultrasoniche Hielscher e le unità di sonicazione multi-campione VialTweeter e UIP400MTP per il loro lavoro quotidiano di preparazione dei campioni nei laboratori biologici, biochimici, medici e clinici. Grazie al software intelligente e al controllo della temperatura dei processori Hielscher, la temperatura viene controllata in modo affidabile e si evita la degradazione del campione indotta dal calore. La preparazione dei campioni a ultrasuoni con le soluzioni a ultrasuoni Hielscher fornisce risultati altamente affidabili e riproducibili!