Tecnologia ad ultrasuoni Hielscher

Preparazione del campione a ultrasuoni per i test ELISA

Saggi come l'ELISA sono ampiamente utilizzati per la diagnostica in vitro, il rilevamento di proteine correlate alla malattia e il controllo di qualità (ad esempio, il monitoraggio degli allergeni alimentari). La preparazione del campione ad ultrasuoni è una tecnica rapida, affidabile e riproducibile per lisare le cellule e isolare le proteine intracellulari, il DNA, l'RNA e gli organuli. Hielscher Ultrasonics offre varie soluzioni ad ultrasuoni per la comoda preparazione di campioni singoli, fiale multiple, nonché per piastre per microtitolazione e piastre a 96 pozzetti.

ELISA – Test di immunosorbimento enzimatico

ELISA è l'acronimo di enzyme-linked immunosorbent test ed è una tecnica di analisi biochimica ampiamente utilizzata nella categoria dei saggi leganti leganti. Nell'ELISA, un campione liquido viene aggiunto su una fase solida stazionaria con speciali proprietà leganti. Normalmente, la fase solida stazionaria viene applicata come rivestimento su una piastra di pozzo o su una piastra ELISA. Poi, vari reagenti liquidi vengono aggiunti in sequenza, incubati e lavati, in modo che infine un cambiamento ottico (ad esempio, lo sviluppo del colore da parte del prodotto di una reazione enzimatica) si verifica nel liquido finale nel pozzetto. Il cambiamento ottico permette di misurare la quantità dell'analita con un cosiddetto quantitativo “lettura". Per la lettura quantitativa si utilizza uno spettrofotometro, un fluorimetro o un luminometro per rilevare e misurare l'intensità della luce trasmessa. La sensibilità di rilevazione è influenzata dall'amplificazione del segnale durante le reazioni analitiche. Poiché le reazioni enzimatiche sono ben studiate e i processi di amplificazione affidabili, gli enzimi sono utilizzati per creare il segnale. Gli enzimi sono collegati ai reagenti di rilevazione in proporzioni fisse per consentire un'accurata quantificazione, il che spiega anche il nome del saggio di immunosorbimento "legato agli enzimi".
Poiché i saggi ELISA vengono eseguiti in piastre per microtitolazione / piastre a 96 pozzetti, è nota come tecnica di saggio su piastra ed è utilizzata ad esempio nella diagnostica clinica in vitro, nella ricerca, nello sviluppo di farmaci, ecc. per rilevare e quantificare anticorpi, peptidi, proteine e ormoni.
La tecnica ELISA è spesso utilizzata come strumento diagnostico in medicina, biotecnologia, patologia vegetale ed è anche un'importante misura di controllo della qualità in diversi settori industriali.

Configurazione completa del VialTweeter: Sonotrodo VialTweeter al processore ad ultrasuoni UP200St

L'unità di preparazione del campione a ultrasuoni VialTweeter è utilizzato per la lisi cellulare e l'estrazione delle proteine prima dei saggi ELISA

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Preparazione del campione a ultrasuoni prima dell'ELISA

Prima che il saggio ELISA possa essere eseguito, i campioni richiedono fasi di preparazione quali la lisi cellulare e l'estrazione di proteine intracellulari, DNA, RNA, ecc. Il vantaggio della lisi cellulare ad ultrasuoni e dell'isolamento delle proteine è la sua alta efficienza, affidabilità e riproducibilità. Tutti questi fattori sono importanti per ottenere risultati diagnostici e di ricerca di alta qualità

Vantaggi della lisi ad ultrasuoni prima dell'ELISA

  • Trattamento omogeneo del campione
  • Lisi completa
  • Estrazione completa delle proteine (ad esempio anticorpi, DNA)
  • Adattamento ottimale al tipo di cella
  • Per qualsiasi dimensione di campione
  • riproducibile
  • A temperatura controllata
  • Protocollo automatico dei dati su scheda SD

Protocollo per la Lisi a Ultrasuoni Pre-ELISA

Insonificatore a sonda UP200St per lisi

  • Per le culture cellulari: Prima della lisi delle cellule ad ultrasuoni, centrifugare le cellule per 5 minuti a 270 x g in una microcentrifuga. Rimuovere il surnatante per aspirazione e risospendere le cellule in 30 - 100 μL di tampone RIPA. Quindi, incubare il pellet cella su ghiaccio per 30 min.
  • Ora, il campione cellulare è pronto per la lisi ad ultrasuoni:
    Utilizzare un ultrasuonatore a sonda (ad es. UP200Ht con sonda S26d2) o un dispositivo multi-campione ad ultrasuoni (ad es. VialTweeter per la sonicazione simultanea di un massimo di 10 fiale o UIP400MPT per piastre microtiter / piastre a 96 pozzetti) a seconda della quantità di campioni da preparare.
    Per la sonicazione di tipo sonda di un singolo campione, posizionare le cellule in provette per microcentrifuga da 1,5 mL.
  • Preimpostare la durata degli ultrasuoni, l'energia totale in ingresso, la modalità di ciclo e/o i limiti di temperatura nel menu digitale dell'ecografo. Ciò garantisce una sonicazione e una ripetibilità altamente affidabile.
  • Inserire il sonotrodo e accendere il dispositivo ad ultrasuoni. Muovere delicatamente la micro punta della sonda ad ultrasuoni attraverso il campione per sonicare il campione in modo uniforme.
    Per la maggior parte delle cellule, la lisi ad ultrasuoni sarà completata dopo 2 -4 cicli di 10 secondi di sonicazione.
  • Dopo l'ecografia, rimuovere il sonotrodo dal campione. I campioni devono essere incubati su ghiaccio per 5 min. Quindi, centrifugare a 10.000 x g per 20 minuti per ottenere il pellet dei detriti. Trasferire i supernatanti in una nuova provetta per microcentrifuga. Etichettare gli analiti e conservare a -20°C.
  • Il sonotrodo ad ultrasuoni può essere pulito strofinandolo correttamente con alcol o sonicato in un becher pieno di alcol, ad es. 70% di etanolo. Tutte le sonde ad ultrasuoni in titanio sono autoclavabili.

Per gli omogeneizzati dei tessuti:

  • Sciacquare il tessuto con PBS ghiacciato (0,01M, pH = 7,4) per rimuovere il sangue in eccesso di emolisi accuratamente.
  • Pesare il tessuto (rene, cuore, polmone, milza, ecc.) e macerare in piccoli pezzi, che vengono omogeneizzati in PBS. Il volume di PBS richiesto è correlato al peso del tessuto. Come regola generale, 1g di tessuto richiede circa 9mL di PBS. Si raccomanda di aggiungere al PBS un inibitore della proteasi. (In alternativa, si può usare il tampone di lisi ipotonica RIPA o il tampone di lisi contenente il cocktail di proteasi e di inibitore della fosfatasi).
  • A seconda delle dimensioni del tessuto, un breve trattamento a vortice (ca. 1-2 min. in 15 sec. di impulsi) può essere utile per pretrattare il tessuto.
  • Montare un micropuntale, ad esempio S26d2, sul vostro ecografo. Posizionare il tubo campione con il tessuto in un bagno di ghiaccio.
  • Sonicare il campione con il vostro ecografo, ad esempio UP200St (80% di ampiezza) per 1 min. in modalità ad impulsi (15sec acceso, 15sec in pausa). Tenere il campione nel bagno di ghiaccio.
  • Gli omogeneizzati vengono poi centrifugati per ottenere specifici pool (citosolico, nucleare, mitocondriale o lisosomiale) al fine di arricchire la proteina per l'analisi. Centrifugando il campione per 5 minuti a 5000×g, il supernatante viene recuperato.
Il sonotrodo MTP-24-8-96 ha otto sonde ad ultrasuoni per la sonicazione dei pozzetti delle piastre microtiter.

Il sonotrodo MTP-24-8-96 ha otto sonde ad ultrasuoni per la sonicazione dei pozzetti delle piastre microtiter.

Controllo affidabile della temperatura durante la sonicazione

La temperatura è un fattore cruciale che influenza il processo e che è particolarmente importante per il trattamento di campioni biologici, ad esempio per prevenire la degradazione termica delle proteine. Come tutte le tecniche di preparazione meccanica del campione, la sonicazione crea calore. Tuttavia, la temperatura dei campioni può essere ben controllata quando si utilizzano i dispositivi Hielscher Ultrasonics. Vi presentiamo varie opzioni per monitorare e controllare la temperatura dei vostri campioni mentre li preparate con l'ultrasuonatore a sonda o il VialTweeter pre-analitico.

  1. Monitoraggio della temperatura del campione: Tutti i processori digitali ad ultrasuoni Hielscher sono dotati di un software intelligente e di un sensore di temperatura collegabile. Inserire il sensore di temperatura nel dispositivo ad ultrasuoni (ad es, UP200Ht, UP200St, VialTweeterUIP400MTP) e inserire la punta del sensore di temperatura in una delle provette campione. Tramite il display digitale a colori touch-display, è possibile impostare nel menu del processore ad ultrasuoni un intervallo di temperatura specifico per la sonicazione del campione. L'ultrasonografo si arresta automaticamente al raggiungimento della temperatura massima e si mette in pausa fino a quando la temperatura del campione non scende al valore inferiore della temperatura impostata ∆. Poi la sonicazione ricomincia automaticamente. Questa funzione intelligente previene la degradazione indotta dal calore.
  2. Per quanto riguarda l'unità multi-campione ad ultrasuoni VialTweeter, il blocco di titanio, che contiene i tubi campione, può essere pre-raffreddato. Mettere il blocco VialTweeter (solo il sonotrodo senza trasduttore!) nel frigorifero o nel congelatore per pre-raffreddare il blocco di titanio aiuta a posticipare l'aumento di temperatura nel campione. Se possibile, anche il campione stesso può essere pre-raffreddato.
  3. Utilizzare un bagno di ghiaccio o ghiaccio secco per raffreddare durante la sonicazione. Posizionare la provetta o le provette del campione durante l'ecografia in un bagno di ghiaccio. Per il VialTweeter, utilizzare una vaschetta poco profonda riempita di ghiaccio secco e posizionare il VialTweeter sul ghiaccio secco in modo che il calore possa dissiparsi rapidamente.

I clienti di tutto il mondo utilizzano gli ultrasuoni a sonda Hielscher e le unità di sonicazione multi-campione VialTweeter e UIP400MTP per il loro lavoro quotidiano di preparazione dei campioni nei laboratori biologici, biochimici, medici e clinici. Il software intelligente e il controllo della temperatura dei processori Hielscher, la temperatura è controllata in modo affidabile e si evita la degradazione del campione indotta dal calore. La preparazione del campione ad ultrasuoni con le soluzioni ad ultrasuoni Hielscher fornisce risultati altamente affidabili e riproducibili!

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Ultrasonic high-shear homogenizers are used in lab, bench-top, pilot and industrial processing.

Hielscher Ultrasonics produce omogeneizzatori ad ultrasuoni ad alte prestazioni per applicazioni di miscelazione, dispersione, emulsificazione ed estrazione in laboratorio, pilota e su scala industriale.

Letteratura / Referenze



Particolarità / Cose da sapere

Tipi di ELISA

Esistono diversi tipi di ELISA, che si distinguono per il loro principio di funzionamento. Sono noti come ELISA diretti, ELISA indiretti, ELISA a sandwich, ELISA competitivi e ELISA inversi. Di seguito vi presentiamo una panoramica dei vari tipi di ELISA e delle loro principali caratteristiche e differenze.
L'ELISA può essere eseguito in un formato qualitativo o quantitativo. I risultati qualitativi forniscono un semplice risultato positivo o negativo, mentre nell'ELISA quantitativo la densità ottica (OD) del campione viene confrontata con una curva standard, che è tipicamente una diluizione seriale di una soluzione a concentrazione nota della molecola target.

ELISA diretto

L'ELISA diretto è la forma di dosaggio più semplice di Elisa, in cui viene utilizzato solo un anticorpo primario marcato con un enzima e non sono richiesti anticorpi secondari. L'anticorpo primario marcato con l'enzima si lega direttamente al bersaglio, cioè all'antigene. La soluzione di antigene tamponato viene aggiunta ad ogni pozzetto di una piastra microtiter (di solito piastre a 96 pozzetti, piastre ELISA), dove aderisce alla superficie plastica attraverso le interazioni di carica. Quando l'enzima legato all'anticorpo primario reagisce con il suo substrato, produce un segnale visibile che può essere misurato tramite spettrofotometro, fluorimetro o luminometro.

ELISA indiretta

Per il test ELISA indiretto sono necessari sia un anticorpo primario che un anticorpo secondario. Tuttavia, contrariamente all'ELISA diretto, non l'anticorpo primario, ma l'anticorpo secondario è etichettato con un enzima. L'antigene è immobilizzato alla piastra del pozzetto e legato dall'anticorpo primario. Successivamente, l'anticorpo secondario marcato con l'enzima si lega all'anticorpo primario. Infine, l'enzima legato all'anticorpo secondario reagisce con il suo substrato per produrre un segnale visibile che può essere rilevato.

Sandwich ELISA

Mentre nei test ELISA diretti e indiretti, l'antigene viene immobilizzato e rivestito sulla superficie della piastra del pozzetto, nell'ELISA a sandwich l'anticorpo viene immobilizzato sulla superficie plastica della piastra ELISA. Gli anticorpi immobilizzati nell'ELISA a sandwich sono noti come anticorpi di cattura. Oltre agli anticorpi di cattura, nell'ELISA a sandwich sono necessari anche i cosiddetti anticorpi di rilevazione. Gli anticorpi di rilevazione comprendono un anticorpo di rilevazione primario non marcato e un anticorpo di rilevazione secondario marcato con un enzima.
Passo dopo passo, l'antigene di interesse si lega all'anticorpo di cattura immobilizzato alla piastra. Poi, l'anticorpo di rilevazione primario si lega all'antigene. Successivamente, l'anticorpo di rilevazione secondario si lega all'anticorpo di rilevazione primario. Nella fase finale della reazione, l'enzima reagisce con il suo substrato per produrre un segnale visibile che può essere rilevato otticamente.

ELISA competitivo

L'ELISA competitivo, noto anche come ELISA di inibizione, è il tipo di ELISA più complesso perché prevede l'uso di un antigene inibitore. Ognuno dei tre formati, ELISA diretto, indiretto e sandwich, può essere adattato al formato ELISA competitivo. Nell'ELISA competitivo, l'antigene inibitore e l'antigene di interesse competono per il legame con l'anticorpo primario.
Per l'ELISA competitivo, l'anticorpo senza etichetta viene incubato in presenza del suo antigene, cioè del campione. Questi complessi anticorpo/antigene legati vengono poi aggiunti ad un pozzetto rivestito di antigene.
La piastra viene lavata, in modo che gli anticorpi non legati vengano rimossi. L'ELISA competitivo ha il suo nome per il fatto che più antigene è presente nel campione, più complessi antigene-anticorpo si formano. Ciò significa che ci sono meno anticorpi non legati disponibili per legarsi all'antigene nel pozzetto e gli antigeni devono competere per un anticorpo disponibile. Viene aggiunto un anticorpo secondario, che corrisponde all'anticorpo primario. Questo secondo anticorpo è collegato all'enzima. Quando il substrato viene aggiunto, gli enzimi rimanenti producono un segnale cromogenico o fluorescente.
A questo punto la reazione viene fermata per evitare l'eventuale saturazione del segnale.
Alcuni kit ELISA della concorrenza includono un antigene legato all'enzima invece di un anticorpo legato all'enzima. L'antigene etichettato compete per i siti di legame dell'anticorpo primario con l'antigene campione (non etichettato). Meno antigene è presente nel campione, più l'antigene etichettato viene trattenuto nel pozzetto e più forte è il segnale.

ELISA inverso

L'ELISA inverso non utilizza piastre di pozzo, ma lascia gli antigeni in sospensione nel liquido di prova. Il test ELISA inverso misura la quantità di anticorpo legato tramite l'antigene. È stato sviluppato specificamente per rilevare e indagare la proteina dell'involucro del virus del Nilo occidentale e come è in grado di trovare anticorpi specifici del virus.

Marcatore enzimatico usato per ELISA

L'elenco seguente fornisce i marcatori enzimatici più comuni utilizzati nei saggi ELISA, che consentono di misurare i risultati del saggio al termine del test.

  • OPD (o-fenilendiammina diidrocloruro) si trasforma in ambra per rilevare HRP (perossidasi di rafano), che è spesso usato come proteina coniugata.
  • TMB (3,3′,5,5′-tetrametilbenzidina) diventa blu quando rileva l'HRP e diventa giallo dopo l'aggiunta di acido solforico o fosforico.
  • ABTS (2,2′-Azinobis [acido 3-etilbenzotiazolina-6-solfonico]-sale diammonico] diventa verde quando rileva l'HRP.
  • Il PNPP (p-Nitrofenil fosfato di nitrofenile, sale disodico) diventa giallo quando rileva la fosfatasi alcalina.