Preparazione dei campioni mediante ultrasuoni per saggi ELISA

I saggi come l’ELISA sono ampiamente utilizzati per la diagnostica in vitro, il rilevamento di proteine associate a malattie e il controllo qualità (ad es. il monitoraggio degli allergeni alimentari). La preparazione dei campioni mediante ultrasuoni è una tecnica rapida, affidabile e riproducibile per lisare le cellule e isolare proteine intracellulari, DNA, RNA e organelli. Hielscher Ultrasonics offre diverse soluzioni a ultrasuoni per preparare agevolmente campioni singoli, più flaconcini, nonché piastre per microtitolazione e piastre a 96 pozzetti.

ELISA – Saggio immunoenzimatico

ELISA è l’acronimo di enzyme-linked immunosorbent assay, ossia saggio immunoenzimatico, ed è una tecnica di analisi biochimica ampiamente utilizzata appartenente alla categoria dei saggi di legame del ligando. Nell’ELISA, un campione liquido viene aggiunto a una fase solida stazionaria con specifiche proprietà di legame. Normalmente, la fase solida stazionaria viene applicata come rivestimento a una piastra a pozzetti o a una piastra ELISA. Successivamente, diversi reagenti liquidi vengono aggiunti in sequenza, incubati e sottoposti a lavaggio, affinché nel liquido finale nel pozzetto si verifichi una variazione ottica (ad es. lo sviluppo di colore dovuto al prodotto di una reazione enzimatica). La variazione ottica consente di misurare la quantità dell’analita mediante una cosiddetta «lettura» quantitativa. Per la lettura quantitativa si utilizza uno spettrofotometro, un fluorimetro o un luminometro per rilevare e misurare l’intensità della luce trasmessa. La sensibilità del rilevamento è influenzata dall’amplificazione del segnale durante le reazioni analitiche. Poiché le reazioni enzimatiche sono processi di amplificazione ben studiati e affidabili, gli enzimi vengono utilizzati per generare il segnale. Gli enzimi sono legati ai reagenti di rilevamento in proporzioni fisse per consentire una quantificazione accurata, il che spiega anche la denominazione di saggio immunoenzimatico «con enzima legato».
Poiché i saggi ELISA vengono eseguiti in piastre per microtitolazione / piastre a 96 pozzetti, l’ELISA è nota come tecnica di saggio su piastra e viene utilizzata, ad esempio, nella diagnostica clinica in vitro, nella ricerca, nello sviluppo di farmaci ecc. per rilevare e quantificare anticorpi, peptidi, proteine e ormoni.
La tecnica ELISA viene frequentemente utilizzata come strumento diagnostico in medicina, nelle biotecnologie e in fitopatologia, ed è anche un’importante misura di controllo qualità in numerosi settori industriali.

Preparazione dei campioni mediante ultrasuoni prima dell’ELISA

Prima di poter eseguire il saggio ELISA, i campioni richiedono fasi di preparazione quali la lisi cellulare e l’estrazione di proteine intracellulari, DNA, RNA ecc. Il vantaggio della lisi cellulare e dell’isolamento delle proteine mediante ultrasuoni risiede nella loro elevata efficienza, affidabilità e riproducibilità. Tutti questi fattori sono importanti per ottenere risultati diagnostici e di ricerca di alta qualità

Protocollo per la lisi cellulare mediante ultrasuoni prima dell’ELISA

• Per le colture cellulari: Prima della lisi cellulare mediante ultrasuoni, centrifugare le cellule per 5 min a 270 x g in una microcentrifuga. Rimuovere il surnatante mediante aspirazione e risospendere le cellule in 30 – 100 μL di tampone RIPA. Quindi, incubare il pellet cellulare su ghiaccio per 30 min.
• Ora il campione cellulare è pronto per la lisi mediante ultrasuoni:
  Utilizzare un sonicatore a sonda (ad es. UP200Ht con sonda S26d2) oppure un dispositivo a ultrasuoni per più campioni (ad es. VialTweeter per la sonicazione simultanea di fino a 10 flaconcini o UIP400MPT per piastre per microtitolazione / piastre a 96 pozzetti), a seconda del numero di campioni da preparare.
  Per la sonicazione a sonda di un singolo campione, collocare le cellule in provette da microcentrifuga da 1,5 mL.
• Preimpostare la durata del trattamento a ultrasuoni, l’apporto energetico totale, la modalità a cicli e/o i limiti di temperatura nel menu digitale del sonicatore. Ciò garantisce una sonicazione altamente affidabile e ripetibile.
• Inserire il sonotrodo e accendere il dispositivo a ultrasuoni. Muovere delicatamente la micropunta della sonda a ultrasuoni all’interno del campione per sonicarlo uniformemente.
  Per la maggior parte delle cellule, la lisi mediante ultrasuoni sarà completata dopo 2 – 4 cicli di sonicazione da 10 sec.
• Dopo la sonicazione, rimuovere il sonotrodo dal campione. I campioni devono essere incubati su ghiaccio per 5 min. Quindi, centrifugare a 10.000 x g per 20 min per sedimentare i detriti. Trasferire i surnatanti in una nuova provetta da microcentrifuga. Etichettare gli analiti e conservarli a -20°C.
• Il sonotrodo a ultrasuoni può essere pulito strofinandolo accuratamente con alcol oppure mediante sonicazione in un becher riempito di alcol, ad es. etanolo al 70%. Tutte le sonde a ultrasuoni in titanio sono autoclavabili.

• Sciacquare il tessuto con PBS ghiacciato (0,01M, pH=7,4) per rimuovere accuratamente il sangue emolizzato in eccesso.
• Pesare il tessuto (rene, cuore, polmone, milza ecc.) e macerarlo in piccoli pezzi, che vengono omogeneizzati in PBS. Il volume di PBS necessario dipende dal peso del tessuto. Come regola generale, 1g di tessuto richiede circa 9mL di PBS. Si consiglia di aggiungere al PBS un inibitore delle proteasi. (In alternativa, è possibile utilizzare RIPA o un tampone di lisi ipotonico contenente un cocktail di inibitori delle proteasi e delle fosfatasi.)
• A seconda delle dimensioni del tessuto, un breve trattamento con vortex (circa 1–2 min. con impulsi di 15 sec.) può essere utile per pretrattare il tessuto.
• Montare una micropunta, ad es. S26d2, sul sonicatore. Collocare la provetta contenente il tessuto in un bagno di ghiaccio.
• Sonicare il campione con il sonicatore, ad es. UP200St (ampiezza dell’80%), per 1 min. in modalità pulsata (15sec di funzionamento, 15sec di pausa). Mantenere il campione nel bagno di ghiaccio.
• Gli omogenati vengono quindi centrifugati per ottenere frazioni specifiche (citosoliche, nucleari, mitocondriali o lisosomiali), allo scopo di arricchire la proteina per l’analisi. Centrifugando il campione per 5 minuti a 5000×g, si recupera il surnatante.

Controllo affidabile della temperatura durante la sonicazione

La temperatura è un fattore cruciale che influenza il processo ed è particolarmente importante per il trattamento dei campioni biologici, ad es. per prevenire la degradazione termica delle proteine. Come tutte le tecniche meccaniche di preparazione dei campioni, la sonicazione genera calore. Tuttavia, utilizzando i dispositivi Hielscher Ultrasonics, è possibile controllare efficacemente la temperatura dei campioni. Vi presentiamo diverse opzioni per monitorare e controllare la temperatura dei campioni durante la preparazione preanalitica con un sonicatore a sonda o con VialTweeter.

1. Monitoraggio della temperatura del campione: tutti i processori digitali a ultrasuoni Hielscher sono dotati di un software intelligente e di un sensore di temperatura collegabile. Collegare il sensore di temperatura al dispositivo a ultrasuoni (ad es., UP200Ht, UP200St, VialTweeter, sonicatore per piastre multipozzetto UIP400MTP) e inserire la punta del sensore di temperatura in una delle provette contenenti i campioni. Tramite il display digitale touch a colori, è possibile impostare nel menu del processore a ultrasuoni un intervallo di temperatura specifico per la sonicazione dei campioni. Il sonicatore si arresta automaticamente quando viene raggiunta la temperatura massima e rimane in pausa finché la temperatura del campione non scende al valore inferiore dell’intervallo di temperatura ∆ impostato. A quel punto, la sonicazione riprende automaticamente. Questa funzione intelligente previene la degradazione indotta dal calore.
2. Per quanto riguarda l’unità a ultrasuoni per più campioni VialTweeter, il blocco in titanio che alloggia le provette dei campioni può essere preraffreddato. Collocare il blocco VialTweeter (solo il sonotrodo senza trasduttore!) in frigorifero o nel congelatore per preraffreddare il blocco in titanio aiuta a ritardare l’aumento della temperatura nel campione. Se possibile, anche il campione stesso può essere preraffreddato.
3. Utilizzare un bagno di ghiaccio o ghiaccio secco per raffreddare durante la sonicazione. Collocare la provetta o le provette dei campioni in un bagno di ghiaccio durante la sonicazione. Per VialTweeter, utilizzare un vassoio poco profondo riempito di ghiaccio secco e collocare VialTweeter sul ghiaccio secco, affinché il calore possa dissiparsi rapidamente.

Clienti di tutto il mondo utilizzano i sonicatori a sonda Hielscher e le unità di sonicazione per più campioni VialTweeter e UIP400MTP per il lavoro quotidiano di preparazione dei campioni nei laboratori biologici, biochimici, medici e clinici. Grazie al software intelligente e al controllo della temperatura dei processori Hielscher, la temperatura viene controllata in modo affidabile e si evita la degradazione dei campioni indotta dal calore. La preparazione dei campioni mediante ultrasuoni con le soluzioni Hielscher offre risultati altamente affidabili e riproducibili!
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