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Frammentazione del DNA a ultrasuoni per il sequenziamento Next Gen

Il sequenziamento di nuova generazione (NGS) richiede il taglio e la frammentazione affidabile del DNA genomico per sequenziare i filamenti di DNA genomico e creare librerie di genomi. La frammentazione controllata del DNA in frammenti di DNA è una fase essenziale della preparazione del campione, necessaria prima del sequenziamento del DNA. L'ultrasonicazione si è dimostrata una tecnica efficiente e affidabile per la frammentazione del DNA di una certa lunghezza. I protocolli di frammentazione del DNA a ultrasuoni consentono di ottenere risultati di frammentazione riproducibili. Gli ultrasuonatori Hielscher sono in grado di produrre un'ampia gamma di distribuzioni dimensionali dei frammenti di DNA genomico, controllabili con precisione attraverso i parametri operativi. Poiché i sistemi di taglio del DNA a ultrasuoni Hielscher sono disponibili per fiale singole e multiple e per micropiastre, la preparazione dei campioni diventa altamente efficiente.

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Sonicatore per piastre UIP400MTP per la preparazione di campioni ad alta produttività: L'UIP400MTP sonicchia uniformemente i campioni in piastre a più pozzetti, piastre per microtitolazione e piastre a 96 pozzetti, disgregando le cellule, estraendo le proteine, frammentando il DNA, l'RNA e le fibrille di alfa-sinucleina.

Il sonicatore a piastra UIP400MTP per la preparazione di campioni ad alta produttività sonica uniformemente i campioni in piastre multipozzetto, piastre per microtitolazione e piastre a 96 pozzetti

Vantaggi della frammentazione del DNA a ultrasuoni

  • risultati ripetibili? riproducibili
  • regolabile con precisione per ottenere una determinata lunghezza del frammento
  • Elaborazione rapida
  • risultati coerenti di frammentazione del DNA
  • dispositivi per qualsiasi volume di campione (ad esempio, più fiale o micropiastre)
  • elevata produttività
  • controllo preciso della temperatura
  • funzionamento semplice e intuitivo

Sequenziamento Next-Gen: Frammentazione del DNA a ultrasuoni per la preparazione delle librerie

Per eseguire un sequenziamento di nuova generazione, è necessario eseguire le tre fasi fondamentali di (1) preparazione della libreria, (2) sequenziamento e (3) analisi dei dati. Durante la preparazione della libreria, il DNA viene frammentato, quindi le estremità dei frammenti vengono riparate (lucidate) aggiungendo una singola base adenina e i frammenti target vengono convertiti in DNA a doppio filamento. Infine, vengono attaccati i cosiddetti adattatori mediante legatura, PCR o tagmentazione, in modo che il prodotto finale della libreria di DNA possa essere quantificato per il sequenziamento.
Frammentazione del DNA mediante sonicazione: Soprattutto con le tecnologie di sequenziamento a lettura breve come Illumina, che non sono in grado di leggere facilmente frammenti di DNA più lunghi, gli stand di DNA devono essere frammentati a una certa dimensione, che può essere ottenuta in modo affidabile mediante ultrasuoni.
Gli ultrasuoni possono essere utilizzati in modo affidabile per la frammentazione di DNA, RNA e cromatina.

Sequenziamento Next Gen – preparazione della biblioteca

La frammentazione ultrasonica del DNA è comunemente impiegata nella preparazione di librerie di sequenziamento del DNA per le piattaforme di sequenziamento di nuova generazione (NGS). Questa tecnica viene utilizzata per rompere le molecole di DNA in frammenti più piccoli di dimensioni desiderate, che facilitano le fasi successive della preparazione delle librerie. La frammentazione del DNA a ultrasuoni è tipicamente richiesta durante la fase di preparazione delle librerie nei flussi di lavoro NGS per frammentare il DNA genomico in pezzi più piccoli adatti all'elaborazione e al sequenziamento a valle. Svolge un ruolo cruciale nel garantire il successo dell'esperimento di sequenziamento, generando frammenti di DNA delle dimensioni appropriate per la specifica piattaforma di sequenziamento utilizzata.

La frammentazione del DNA a ultrasuoni è spesso utilizzata come fase di preparazione del campione nel sequenziamento di nuova generazione (NGS).

Analisi elettroforetiche del DNA genomico di E. coli EDL933 sottoposto a ultrasuoni da 0 a 15 minuti. L indica la DNA Ladder. (Basselet et al. 2008)

Sequenziamento di nuova generazione – Fasi del processo:

  • Frammentazione ultrasonica del DNA: Prima della costruzione della libreria, il DNA genomico viene frammentato in pezzi più piccoli e maneggevoli. La frammentazione a ultrasuoni prevede l'uso di onde sonore ad alta frequenza per tagliare le molecole di DNA in frammenti della dimensione desiderata. Questa fase è fondamentale perché contribuisce a garantire che le letture di sequenziamento generate in seguito siano della lunghezza appropriata per la piattaforma di sequenziamento utilizzata. L'intervallo di dimensioni dei frammenti può essere regolato in base ai requisiti specifici dell'esperimento di sequenziamento.
  • Amplificazione clonale mediante PCR: Dopo la frammentazione a ultrasuoni, i frammenti di DNA vengono sottoposti a riparazione delle estremità, legatura dell'adattatore e amplificazione PCR per generare le librerie finali di sequenziamento del DNA. Queste fasi preparano le molecole di DNA frammentate per il processo di sequenziamento aggiungendo sequenze di adattatori necessarie per il legame con la piattaforma di sequenziamento e fornendo siti di priming per l'amplificazione PCR.
  • Sequenziamento del DNA mediante sintesi: Una volta preparate le librerie di sequenziamento, inizia il processo di sequenziamento del DNA per sintesi (SBS). Durante la SBS, la sequenza del DNA è determinata dall'aggiunta sequenziale di nucleotidi al filamento complementare. Questa fase comporta reazioni cicliche di incorporazione, imaging e scissione dei nucleotidi, consentendo di determinare la sequenza del DNA in base ai segnali fluorescenti emessi dai nucleotidi incorporati.
  • Sequenziamento massicciamente parallelo: Nella fase finale, i modelli di DNA amplificati e segregati spazialmente vengono sequenziati simultaneamente in modo massicciamente parallelo. Questo approccio di sequenziamento ad alta velocità consente di generare milioni o miliardi di letture di sequenziamento in una singola corsa di sequenziamento, permettendo una determinazione efficiente e rapida delle sequenze di DNA.

Come funziona la frammentazione del DNA a ultrasuoni?

La sonicazione, nota anche come trattamento acustico del campione, è un metodo ampiamente utilizzato per frammentare il DNA. Per il taglio del DNA a ultrasuoni, i campioni vengono esposti a onde ultrasoniche in condizioni controllate. Il principio di funzionamento della frammentazione ultrasonica del DNA si basa sulle vibrazioni e sulla cavitazione generate dalle onde ultrasonore. Le forze di taglio che derivano dalla cavitazione ultrasonica (acustica) rompono le molecole di DNA ad alto peso molecolare. Le impostazioni della sonicazione, come l'intensità (ampiezza, durata), la modalità di pulsazione e la temperatura, consentono di ottenere una frammentazione precisa del DNA fino a raggiungere una determinata lunghezza desiderata di frammenti di DNA. Mentre il DNA viene spesso ridotto a 100-600 bp utilizzando gli ultrasuoni, è possibile ottenere frammenti di DNA più lunghi, fino a 1300 bp, applicando condizioni ultrasoniche più blande.

Gli omogeneizzatori a ultrasuoni sono affidabili per il taglio del DNA

Taglio ultrasonico del DNA durante la ChIP – Immunoprecipitazione della cromatinaAdattato da Jkwchui sotto CC-BY-SA.03

 

Questo tutorial spiega qual è il tipo di sonicatore più adatto per le attività di preparazione dei campioni, come la lisi, la disgregazione delle cellule, l'isolamento delle proteine, la frammentazione del DNA e dell'RNA nei laboratori, nelle analisi e nella ricerca. Scegliete il tipo di sonicatore ideale per la vostra applicazione, il volume del campione, il numero di campioni e la produttività. Hielscher Ultrasonics ha l'omogeneizzatore a ultrasuoni ideale per voi!

Come trovare il sonicatore perfetto per la disgregazione cellulare e l'estrazione di proteine in ambito scientifico e analitico

Miniatura del video

 

Controllo della temperatura per prevenire la degradazione del DNA

La forma molecolare a doppio filamento del DNA è altamente sensibile alle temperature elevate, per cui il controllo esatto della temperatura durante le fasi di preparazione del campione è un fattore cruciale per ottenere risultati di analisi affidabili.
Sia che si utilizzino gli ultrasuoni a sonda Hielscher, il VialTweeter o il UIP400MTP – Il monitoraggio e il controllo continui della temperatura sono garantiti da un sensore di temperatura collegabile e dal software del dispositivo intelligente. Per mantenere la temperatura entro un certo intervallo, è possibile impostare un limite di temperatura superiore e inferiore. Di conseguenza, l'ultrasuonatore si ferma non appena viene superato questo limite di temperatura e continua automaticamente a sonicare quando la temperatura si abbassa di un ∆T impostato.
Il sofisticato software degli ultrasuonatori Hielscher garantisce il mantenimento affidabile delle condizioni ideali di trattamento dei campioni.

Frammentazione massiva del DNA dei campioni con l'ultrasuonatore per piastre a pozzetti multipli UIP400MTP

Unità di preparazione di campioni multipli a ultrasuoni UIP400MTP per la sonicazione di piastre multipozzettoIl numero di campioni nelle scienze biologiche è aumentato in modo significativo nell'ultimo decennio. Ciò significa che un numero molto elevato di campioni (ad esempio, 384, 1536 o 3456 pozzetti per micropiastra) deve essere processato durante la preparazione e l'analisi dei campioni in condizioni sempre uguali, al fine di ottenere risultati comparabili e validi. Con l'UIP400MTP, Hielscher Ultrasonics segue la tendenza dell'elaborazione di massa dei campioni. L'UIP400MTP è un ultrasuonatore per la preparazione dei campioni utilizzando micropiastre. L'UIP400MTP può trattare piastre con 6, 12, 24, 48, 96, 384, 1536 o 3456 pozzetti. A seconda del tipo di micropiastra, ogni pozzetto può contenere volumi di campione compresi tra decine di nanolitri e diversi millilitri. Ampiamente utilizzata nella ricerca sulle scienze biologiche, la UIP400MTP è molto comunemente impiegata per la preparazione dei campioni prima di test come ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) o PCR, prima dell'analisi delle proteine, nonché per la preparazione della cromatina prima di CHiP e CHiP-seq, l'identificazione delle modificazioni istoniche e altri trattamenti analitici (ad esempio, elettroforesi su gel, spettrometria di massa).
Per saperne di più sul trattamento ad alta produttività delle piastre PCR!

L'omogeneizzatore a ultrasuoni UIP400MTP è in grado di sonicare piastre multipozzetto e micropiastre per la lisi cellulare, la frammentazione del DNA, la dispersione o l'omogeneizzazione.

UIP400MTP per la sonicazione multipozzetto

Miniatura del video

Il VialTweeter per la preparazione dei campioni fino a 10 vials

Configurazione completa del VialTweeter: Sonotrodo VialTweeter con processore a ultrasuoni UP200StIl VialTweeter è un ultrasuonatore da laboratorio molto diffuso che consente di sonicare in modo efficace e confortevole fino a 10 fiale contemporaneamente. Poiché le fiale e le provette (ad esempio, fiale Eppendorf, fiale criogeniche, provette da centrifuga) vengono sonicate indirettamente, si evita qualsiasi contaminazione incrociata. Poiché ogni campione riceve la stessa intensità di ultrasuoni, tutti i risultati della sonicazione sono omogenei e riproducibili. Il VialTweeter offre tutte le funzioni intelligenti come i nostri altri dispositivi digitali (ad esempio, menu intelligente, impostazioni programmabili, controllo della temperatura, controllo remoto, ecc.

Sonde a più dita per piastre per micropozzetti

4 teste di sonda o 4 sonotrodi per la sonicazione simultanea di 4 campioni alla stessa intensità con gli ultrasuoni Hielscher da 200 watt modelli UP200ST e UP200HTDisponibili per gli omogeneizzatori con sonda a ultrasuoni UP200Ht e UP200St, le sonde a più dita con 4 o 8 dita sono una comoda opzione per sonicare più campioni contemporaneamente alle stesse condizioni. Ad esempio, il sonotrodo MTP-24-8-96 è una sonda a otto dita, ideale per l'integrazione in sistemi automatizzati o per la preparazione manuale efficiente dei pozzetti di piastre a più pozzetti. Il sonotrodo a più dita è ideale per i laboratori automatizzati, dove vengono trattati soprattutto becher e provette con un sonotrodo a ultrasuoni standard. Le sonde multi-dita e quelle standard possono essere rapidamente scambiate in pochi minuti, trasformando l'ultrasuonatore a sonda singola in un disgregatore a ultrasuoni multi-sonda.

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Ultrasuonatori Hielscher per la frammentazione del DNA

Hielscher Ultrasonics offre diverse piattaforme a ultrasuoni per la frammentazione di DNA, RNA e cromatina. Queste piattaforme includono sonde a ultrasuoni (sonotrodi), soluzioni di sonicazione indiretta per la preparazione simultanea di più provette o piastre a più pozzetti (ad esempio, piastre a 96 pozzetti, piastre per microtitolazione), sonoreattori e corna a ultrasuoni. Tutte le piattaforme per il taglio del DNA sono alimentate da processori a ultrasuoni ad alte prestazioni e sintonizzati in frequenza, che sono controllabili con precisione e forniscono risultati riproducibili.

Processori a ultrasuoni per qualsiasi numero e dimensione di campioni

Con gli ultrasuoni multi-campione Hielscher VialTweeter (per un massimo di 10 provette) e UIP400MTP (per micropiastre/piastre multipozzetto) diventa facilmente possibile ridurre il tempo di elaborazione del campione grazie a ultrasuoni intensi e controllabili con precisione, ottenendo al contempo la distribuzione dimensionale e la resa dei frammenti di DNA desiderati. La frammentazione ultrasonica del DNA rende la preparazione dei campioni efficiente, affidabile e scalabile. I protocolli possono essere scalati linearmente da uno a numerosi campioni applicando ultrasuoni costantemente controllati.
Gli ultrasuoni a sonda da una a cinque dita sono ideali per la preparazione di campioni più piccoli. Gli ultrasuoni da laboratorio Hielscher sono disponibili in varie dimensioni, in modo da potervi consigliare il dispositivo ideale per la vostra applicazione e le vostre esigenze.

controllo preciso del processo

Gli ultrasuonatori Hielscher possono essere controllati a distanza tramite browser. I parametri di sonicazione possono essere monitorati e regolati con precisione in base ai requisiti del processo.Le impostazioni di sonicazione controllabili con precisione sono fondamentali poiché una sonificazione esaustiva può distruggere DNA, RNA e cromatina, ma un taglio ultrasonico inadeguato provoca frammenti di DNA e cromatina troppo lunghi. Gli ultrasuoni digitali Hielscher possono essere facilmente impostati su parametri di sonicazione precisi. Le impostazioni specifiche di sonicazione possono anche essere salvate come impostazioni programmate per una rapida ripetizione della stessa procedura.
Tutte le sonicazioni vengono automaticamente protocollate e memorizzate come file CSV su una scheda SD integrata. Ciò consente di documentare con precisione le prove eseguite e di rivedere facilmente i cicli di sonicazione.
Grazie al controllo remoto via browser, tutti gli ultrasuoni digitali possono essere gestiti e monitorati tramite qualsiasi browser standard. Non è necessaria l'installazione di software aggiuntivi, poiché una connessione LAN consente una configurazione plug-n-play molto semplice.

Massima facilità d'uso nella preparazione dei campioni a ultrasuoni

Tutti gli ultrasuoni Hielscher sono progettati per fornire ultrasuoni ad alte prestazioni, ma allo stesso tempo sono sempre molto facili da usare e da gestire. Tutte le impostazioni sono ben strutturate in un menu chiaro, facilmente accessibile tramite il display touch colorato o il telecomando del browser. Il software intelligente con impostazioni programmabili e registrazione automatica dei dati garantisce impostazioni di sonicazione ottimali per risultati affidabili e riproducibili. L'interfaccia del menu, pulita e facile da usare, trasforma gli ultrasonori Hielscher in dispositivi facili da usare ed efficienti.
La tabella seguente fornisce un'indicazione della capacità di trattamento approssimativa dei nostri ultrasuonatori da laboratorio, ideali per attività di preparazione dei campioni come la frammentazione di DNA e RNA, la lisi cellulare e l'estrazione di proteine:

Dispositivo Potenza [W] Tipo Volume [mL]
UIP400MTP 400 per micropiastre 6 – 3456 pozzi
VialTweeter 200 per un massimo di 10 fiale e possibilità di fissaggio a morsetto 0.5 – 1.5
UP50H 50 tipo di sonda 0.01 – 250
UP100H 100 tipo di sonda 0.01 – 500
UP200Ht 200 tipo di sonda 0.1 – 1000
UP200St 200 tipo di sonda 0.1 – 1000
UP400St 400 tipo di sonda 5.0 – 2000
Cuphorn 200 CupHorn, sonoreattore 10 – 200
GDmini2 200 cella a flusso senza contaminazione

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Il VialTweeter è un Ultraonicator multi-campione che consente una preparazione affidabile dei campioni in condizioni di temperatura controllata con precisione.

L'unità di preparazione multi-campione a ultrasuoni VialTweeter consente di sonicare contemporaneamente fino a 10 fiale. Con il dispositivo a morsetto VialPress, è possibile premere fino a 4 provette aggiuntive sulla parte anteriore per una sonicazione intensa.


Il sonotrodo MTP-24-8-96 è dotato di otto sonde a ultrasuoni per la sonicazione dei pozzetti delle piastre per microtitolazione.

Il sonotrodo MTP-24-8-96 è dotato di otto sonde a ultrasuoni per la sonicazione dei pozzetti delle piastre per microtitolazione.



Letteratura? Riferimenti

Particolarità? Cose da sapere

Che cos'è il sequenziamento di nuova generazione?

Il sequenziamento di nuova generazione, anche Next Gen Sequencing (NGS), sequenziamento ad alto rendimento o sequenziamento di seconda generazione, si riferisce all'approccio del sequenziamento parallelo massivo, in cui quantità molto grandi (massicce) di DNA di milioni di frammenti vengono sequenziate simultaneamente in parallelo per ogni corsa.
Per effettuare un sequenziamento di nuova generazione, le tre fasi fondamentali di

  1. preparazione della biblioteca,
  2. sequenziamento e
  3. analisi dei dati

sono necessari.
Durante la preparazione delle librerie, i filamenti di DNA devono essere frammentati in frammenti di DNA di una certa lunghezza. La sonicazione è una delle tecniche preferite per frammentare il DNA.
Durante il processo di sequenziamento del DNA, l'ordine dei nucleotidi nel DNA – nota come sequenza dell'acido nucleico. La sequenza degli acidi nucleici è composta da quattro basi nucleotidiche: adenina, citosina, guanina e timina. – che codice per le informazioni.
Il sequenziamento di nuova generazione sta guidando la ricerca nel campo delle scienze della vita e della medicina personalizzata, poiché il sequenziamento del DNA e dell'RNA è molto utilizzato nella ricerca genomica, nella ricerca sul cancro, nella ricerca di malattie rare e complesse, nella ricerca microbica, nell'agrigenomica e in molti altri campi di ricerca.

Sequenziamento di nuova generazione vs sequenziamento Sanger

Mentre con il sequenziamento di nuova generazione (NGS) è possibile sequenziare un numero massiccio di campioni genomici, il sequenziamento Sanger (noto anche come metodo di terminazione della catena o sequenziamento di prima generazione) è in grado di sequenziare solo un numero ridotto di campioni. Il sequenziamento Sanger sequenzia solo un singolo frammento di DNA alla volta e può essere realizzato in un solo giorno. Grazie alla sua precisione, il sequenziamento Sanger è considerato la tecnologia gold-standard, utilizzata per verificare i risultati ottenuti con il sequenziamento di nuova generazione.
Il sequenziamento Sanger raggiunge lunghezze di lettura di circa 800 bp (in genere 500-600 bp con DNA non arricchito). Le lunghezze di lettura più elevate del sequenziamento Sanger presentano vantaggi significativi rispetto ad altri metodi di sequenziamento, soprattutto per quanto riguarda il sequenziamento di regioni ripetitive del genoma. La sfida dei dati di sequenza a lettura breve è particolarmente importante nel sequenziamento di nuovi genomi (de novo) e nel sequenziamento di segmenti genomici altamente riarrangiati, tipicamente quelli osservati nei genomi dei tumori o nelle regioni dei cromosomi che presentano variazioni strutturali. [Morozova e Marra, 2008]

IL DNA – Acido desossiribonucleico – Forme e funzioni

Ogni forma di DNA ha caratteristiche e applicazioni uniche, che contribuiscono a un ampio spettro di campi di ricerca, tra cui l'oncologia, la genetica, la scienza forense e la biologia evolutiva. I sonicatori Hielscher sono una soluzione altamente efficiente e affidabile per isolare e frammentare il DNA e l'RNA a scopo di analisi. Nell'elenco che segue, vi illustriamo le forme specifiche di DNA e le classifichiamo in base al loro contesto biologico e alle loro funzioni:

  • DNA genomico (gDNA)
    DNA genomico (gDNA): L'insieme completo del DNA di un organismo, comprese le regioni codificanti (geni) e non codificanti.
  • DNA extracellulare
    DNA tumorale circolante (ctDNA): Frammenti di DNA rilasciati nel sangue dalle cellule tumorali.
    DNA libero da cellule (cfDNA): Frammenti di DNA che circolano liberamente nel sangue, provenienti da vari tessuti.
  • DNA circolare extracromosomico (eccDNA): Molecole di DNA circolari che si trovano all'esterno dei cromosomi nelle cellule eucariotiche.
    DNA virale: DNA proveniente da virus, integrato nel genoma dell'ospite o come DNA episomale.
  • DNA mitocondriale
    DNA mitocondriale (mtDNA): DNA situato nei mitocondri, ereditato per via materna e coinvolto nella produzione di energia.
  • DNA plasmidico
    DNA plasmidico: Piccole molecole di DNA circolari che si replicano indipendentemente dal DNA cromosomico, comunemente presenti nei batteri e utilizzate nell'ingegneria genetica.
  • DNA nucleare
    DNA nucleare (nDNA): DNA contenuto nel nucleo delle cellule eucariotiche, che costituisce la maggior parte del materiale genetico di un organismo.
  • DNA di una singola cellula
    DNA a cellula singola (scDNA): DNA estratto da una singola cellula, utilizzato per analisi genomiche dettagliate a livello di singola cellula.
  • DNA ricombinante
    DNA ricombinante (rDNA): Molecole di DNA formate con metodi di ricombinazione genetica in laboratorio per riunire materiale genetico proveniente da più fonti.
  • Moduli specializzati
    DNA ambientale (eDNA): DNA raccolto da campioni ambientali (suolo, acqua) senza isolare gli organismi di origine
    DNA antico (aDNA): DNA estratto da antichi esemplari, che fornisce approfondimenti sulla biologia evolutiva e sulle antiche popolazioni.
  • DNA cromosomico
    DNA cromosomico: DNA che costituisce i cromosomi all'interno del nucleo cellulare, comprendendo sia le regioni codificanti che quelle non codificanti.
  • Forme virali e sintetiche
    DNA virale: DNA derivato da virus, che può essere integrato nel genoma dell'ospite o esistere come entità indipendente.
    DNA sintetico: Sequenze di DNA sintetizzate artificialmente e create attraverso processi chimici, spesso utilizzate nella ricerca e nella biotecnologia.

Ultrasuoni ad alte prestazioni! La gamma di prodotti Hielscher copre l'intero spettro, dai compatti ultrasuoni da laboratorio alle unità da banco, fino ai sistemi ultrasonici industriali.

Hielscher Ultrasonics produce omogeneizzatori a ultrasuoni ad alte prestazioni da laboratorio a dimensioni industriali.

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