Frammentazione del DNA a ultrasuoni per il sequenziamento Next Gen

Il sequenziamento di nuova generazione (NGS) richiede il taglio e la frammentazione affidabile del DNA genomico per sequenziare i filamenti di DNA genomico e creare librerie di genomi. La frammentazione controllata del DNA in frammenti di DNA è una fase essenziale della preparazione del campione, necessaria prima del sequenziamento del DNA. L'ultrasonicazione si è dimostrata una tecnica efficiente e affidabile per la frammentazione del DNA di una certa lunghezza. I protocolli di frammentazione del DNA a ultrasuoni consentono di ottenere risultati di frammentazione riproducibili. Gli ultrasuonatori Hielscher sono in grado di produrre un'ampia gamma di distribuzioni dimensionali dei frammenti di DNA genomico, controllabili con precisione attraverso i parametri operativi. Poiché i sistemi di taglio del DNA a ultrasuoni Hielscher sono disponibili per fiale singole e multiple e per micropiastre, la preparazione dei campioni diventa altamente efficiente.

Sequenziamento Next-Gen: Frammentazione del DNA a ultrasuoni per la preparazione delle librerie

Per eseguire un sequenziamento di nuova generazione, è necessario eseguire le tre fasi fondamentali di (1) preparazione della libreria, (2) sequenziamento e (3) analisi dei dati. Durante la preparazione della libreria, il DNA viene frammentato, quindi le estremità dei frammenti vengono riparate (lucidate) aggiungendo una singola base adenina e i frammenti target vengono convertiti in DNA a doppio filamento. Infine, vengono attaccati i cosiddetti adattatori mediante legatura, PCR o tagmentazione, in modo che il prodotto finale della libreria di DNA possa essere quantificato per il sequenziamento.
Frammentazione del DNA mediante sonicazione: Soprattutto con le tecnologie di sequenziamento a lettura breve come Illumina, che non sono in grado di leggere facilmente frammenti di DNA più lunghi, gli stand di DNA devono essere frammentati a una certa dimensione, che può essere ottenuta in modo affidabile mediante ultrasuoni.
Gli ultrasuoni possono essere utilizzati in modo affidabile per la frammentazione di DNA, RNA e cromatina.

Sequenziamento Next Gen – preparazione della biblioteca

La frammentazione ultrasonica del DNA è comunemente impiegata nella preparazione di librerie di sequenziamento del DNA per le piattaforme di sequenziamento di nuova generazione (NGS). Questa tecnica viene utilizzata per rompere le molecole di DNA in frammenti più piccoli di dimensioni desiderate, che facilitano le fasi successive della preparazione delle librerie. La frammentazione del DNA a ultrasuoni è tipicamente richiesta durante la fase di preparazione delle librerie nei flussi di lavoro NGS per frammentare il DNA genomico in pezzi più piccoli adatti all'elaborazione e al sequenziamento a valle. Svolge un ruolo cruciale nel garantire il successo dell'esperimento di sequenziamento, generando frammenti di DNA delle dimensioni appropriate per la specifica piattaforma di sequenziamento utilizzata.

Sequenziamento di nuova generazione – Fasi del processo:

• Frammentazione ultrasonica del DNA: Prima della costruzione della libreria, il DNA genomico viene frammentato in pezzi più piccoli e maneggevoli. La frammentazione a ultrasuoni prevede l'uso di onde sonore ad alta frequenza per tagliare le molecole di DNA in frammenti della dimensione desiderata. Questa fase è fondamentale perché contribuisce a garantire che le letture di sequenziamento generate in seguito siano della lunghezza appropriata per la piattaforma di sequenziamento utilizzata. L'intervallo di dimensioni dei frammenti può essere regolato in base ai requisiti specifici dell'esperimento di sequenziamento.
• Amplificazione clonale mediante PCR: Dopo la frammentazione a ultrasuoni, i frammenti di DNA vengono sottoposti a riparazione delle estremità, legatura dell'adattatore e amplificazione PCR per generare le librerie finali di sequenziamento del DNA. Queste fasi preparano le molecole di DNA frammentate per il processo di sequenziamento aggiungendo sequenze di adattatori necessarie per il legame con la piattaforma di sequenziamento e fornendo siti di priming per l'amplificazione PCR.
• Sequenziamento del DNA mediante sintesi: Una volta preparate le librerie di sequenziamento, inizia il processo di sequenziamento del DNA per sintesi (SBS). Durante la SBS, la sequenza del DNA è determinata dall'aggiunta sequenziale di nucleotidi al filamento complementare. Questa fase comporta reazioni cicliche di incorporazione, imaging e scissione dei nucleotidi, consentendo di determinare la sequenza del DNA in base ai segnali fluorescenti emessi dai nucleotidi incorporati.
• Sequenziamento massicciamente parallelo: Nella fase finale, i modelli di DNA amplificati e segregati spazialmente vengono sequenziati simultaneamente in modo massicciamente parallelo. Questo approccio di sequenziamento ad alta velocità consente di generare milioni o miliardi di letture di sequenziamento in una singola corsa di sequenziamento, permettendo una determinazione efficiente e rapida delle sequenze di DNA.

Come funziona la frammentazione del DNA a ultrasuoni?

La sonicazione, nota anche come trattamento acustico del campione, è un metodo ampiamente utilizzato per frammentare il DNA. Per il taglio del DNA a ultrasuoni, i campioni vengono esposti a onde ultrasoniche in condizioni controllate. Il principio di funzionamento della frammentazione ultrasonica del DNA si basa sulle vibrazioni e sulla cavitazione generate dalle onde ultrasonore. Le forze di taglio che derivano dalla cavitazione ultrasonica (acustica) rompono le molecole di DNA ad alto peso molecolare. Le impostazioni della sonicazione, come l'intensità (ampiezza, durata), la modalità di pulsazione e la temperatura, consentono di ottenere una frammentazione precisa del DNA fino a raggiungere una determinata lunghezza desiderata di frammenti di DNA. Mentre il DNA viene spesso ridotto a 100-600 bp utilizzando gli ultrasuoni, è possibile ottenere frammenti di DNA più lunghi, fino a 1300 bp, applicando condizioni ultrasoniche più blande.

Controllo della temperatura per prevenire la degradazione del DNA

La forma molecolare a doppio filamento del DNA è altamente sensibile alle temperature elevate, per cui il controllo esatto della temperatura durante le fasi di preparazione del campione è un fattore cruciale per ottenere risultati di analisi affidabili.
Sia che si utilizzino gli ultrasuoni a sonda Hielscher, il VialTweeter o il UIP400MTP – Il monitoraggio e il controllo continui della temperatura sono garantiti da un sensore di temperatura collegabile e dal software del dispositivo intelligente. Per mantenere la temperatura entro un certo intervallo, è possibile impostare un limite di temperatura superiore e inferiore. Di conseguenza, l'ultrasuonatore si ferma non appena viene superato questo limite di temperatura e continua automaticamente a sonicare quando la temperatura si abbassa di un ∆T impostato.
Il sofisticato software degli ultrasuonatori Hielscher garantisce il mantenimento affidabile delle condizioni ideali di trattamento dei campioni.

Frammentazione massiva del DNA dei campioni con l'ultrasuonatore per piastre a pozzetti multipli UIP400MTP

Il numero di campioni nelle scienze biologiche è aumentato in modo significativo nell'ultimo decennio. Ciò significa che un numero molto elevato di campioni (ad esempio, 384, 1536 o 3456 pozzetti per micropiastra) deve essere processato durante la preparazione e l'analisi dei campioni in condizioni sempre uguali, al fine di ottenere risultati comparabili e validi. Con l'UIP400MTP, Hielscher Ultrasonics segue la tendenza dell'elaborazione di massa dei campioni. L'UIP400MTP è un ultrasuonatore per la preparazione dei campioni utilizzando micropiastre. L'UIP400MTP può trattare piastre con 6, 12, 24, 48, 96, 384, 1536 o 3456 pozzetti. A seconda del tipo di micropiastra, ogni pozzetto può contenere volumi di campione compresi tra decine di nanolitri e diversi millilitri. Ampiamente utilizzata nella ricerca sulle scienze biologiche, la UIP400MTP è molto comunemente impiegata per la preparazione dei campioni prima di test come ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) o PCR, prima dell'analisi delle proteine, nonché per la preparazione della cromatina prima di CHiP e CHiP-seq, l'identificazione delle modificazioni istoniche e altri trattamenti analitici (ad esempio, elettroforesi su gel, spettrometria di massa).
Per saperne di più sul trattamento ad alta produttività delle piastre PCR!

Il VialTweeter per la preparazione dei campioni fino a 10 vials

Il VialTweeter è un ultrasuonatore da laboratorio molto diffuso che consente di sonicare in modo efficace e confortevole fino a 10 fiale contemporaneamente. Poiché le fiale e le provette (ad esempio, fiale Eppendorf, fiale criogeniche, provette da centrifuga) vengono sonicate indirettamente, si evita qualsiasi contaminazione incrociata. Poiché ogni campione riceve la stessa intensità di ultrasuoni, tutti i risultati della sonicazione sono omogenei e riproducibili. Il VialTweeter offre tutte le funzioni intelligenti come i nostri altri dispositivi digitali (ad esempio, menu intelligente, impostazioni programmabili, controllo della temperatura, controllo remoto, ecc.

Sonde a più dita per piastre per micropozzetti

Disponibili per gli omogeneizzatori con sonda a ultrasuoni UP200Ht e UP200St, le sonde a più dita con 4 o 8 dita sono una comoda opzione per sonicare più campioni contemporaneamente alle stesse condizioni. Ad esempio, il sonotrodo MTP-24-8-96 è una sonda a otto dita, ideale per l'integrazione in sistemi automatizzati o per la preparazione manuale efficiente dei pozzetti di piastre a più pozzetti. Il sonotrodo a più dita è ideale per i laboratori automatizzati, dove vengono trattati soprattutto becher e provette con un sonotrodo a ultrasuoni standard. Le sonde multi-dita e quelle standard possono essere rapidamente scambiate in pochi minuti, trasformando l'ultrasuonatore a sonda singola in un disgregatore a ultrasuoni multi-sonda.

Ultrasuonatori Hielscher per la frammentazione del DNA

Hielscher Ultrasonics offre diverse piattaforme a ultrasuoni per la frammentazione di DNA, RNA e cromatina. Queste piattaforme includono sonde a ultrasuoni (sonotrodi), soluzioni di sonicazione indiretta per la preparazione simultanea di più provette o piastre a più pozzetti (ad esempio, piastre a 96 pozzetti, piastre per microtitolazione), sonoreattori e corna a ultrasuoni. Tutte le piattaforme per il taglio del DNA sono alimentate da processori a ultrasuoni ad alte prestazioni e sintonizzati in frequenza, che sono controllabili con precisione e forniscono risultati riproducibili.

Processori a ultrasuoni per qualsiasi numero e dimensione di campioni

Con gli ultrasuoni multi-campione Hielscher VialTweeter (per un massimo di 10 provette) e UIP400MTP (per micropiastre/piastre multipozzetto) diventa facilmente possibile ridurre il tempo di elaborazione del campione grazie a ultrasuoni intensi e controllabili con precisione, ottenendo al contempo la distribuzione dimensionale e la resa dei frammenti di DNA desiderati. La frammentazione ultrasonica del DNA rende la preparazione dei campioni efficiente, affidabile e scalabile. I protocolli possono essere scalati linearmente da uno a numerosi campioni applicando ultrasuoni costantemente controllati.
Gli ultrasuoni a sonda da una a cinque dita sono ideali per la preparazione di campioni più piccoli. Gli ultrasuoni da laboratorio Hielscher sono disponibili in varie dimensioni, in modo da potervi consigliare il dispositivo ideale per la vostra applicazione e le vostre esigenze.

controllo preciso del processo

Le impostazioni di sonicazione controllabili con precisione sono fondamentali poiché una sonificazione esaustiva può distruggere DNA, RNA e cromatina, ma un taglio ultrasonico inadeguato provoca frammenti di DNA e cromatina troppo lunghi. Gli ultrasuoni digitali Hielscher possono essere facilmente impostati su parametri di sonicazione precisi. Le impostazioni specifiche di sonicazione possono anche essere salvate come impostazioni programmate per una rapida ripetizione della stessa procedura.
Tutte le sonicazioni vengono automaticamente protocollate e memorizzate come file CSV su una scheda SD integrata. Ciò consente di documentare con precisione le prove eseguite e di rivedere facilmente i cicli di sonicazione.
Grazie al controllo remoto via browser, tutti gli ultrasuoni digitali possono essere gestiti e monitorati tramite qualsiasi browser standard. Non è necessaria l'installazione di software aggiuntivi, poiché una connessione LAN consente una configurazione plug-n-play molto semplice.

Massima facilità d'uso nella preparazione dei campioni a ultrasuoni

Tutti gli ultrasuoni Hielscher sono progettati per fornire ultrasuoni ad alte prestazioni, ma allo stesso tempo sono sempre molto facili da usare e da gestire. Tutte le impostazioni sono ben strutturate in un menu chiaro, facilmente accessibile tramite il display touch colorato o il telecomando del browser. Il software intelligente con impostazioni programmabili e registrazione automatica dei dati garantisce impostazioni di sonicazione ottimali per risultati affidabili e riproducibili. L'interfaccia del menu, pulita e facile da usare, trasforma gli ultrasonori Hielscher in dispositivi facili da usare ed efficienti.
La tabella seguente fornisce un'indicazione della capacità di trattamento approssimativa dei nostri ultrasuonatori da laboratorio, ideali per attività di preparazione dei campioni come la frammentazione di DNA e RNA, la lisi cellulare e l'estrazione di proteine: