Frammentazione ultrasonica del DNA per il sequenziamento di prossima generazione

Il Next Generation Sequencing (NGS) richiede la tranciatura e la frammentazione affidabile del DNA genomico per sequenziare i filamenti di DNA genomico e creare librerie di genomi. La frammentazione controllata del DNA in frammenti di DNA è una fase essenziale di preparazione del campione richiesta prima che il DNA venga sequenziato. L'ultrasuonazione si è dimostrata una tecnica efficiente e affidabile per la frammentazione del DNA di una certa lunghezza. I protocolli di frammentazione del DNA ad ultrasuoni raggiungono risultati di frammentazione riproducibili. Gli ultrasuoni Hielscher sono in grado di produrre un'ampia gamma di distribuzioni delle dimensioni dei frammenti di DNA genomico, controllabili con precisione attraverso i parametri operativi. Poiché i sistemi di taglio del DNA a ultrasuoni della Hielscher sono disponibili per fiale singole e multiple e per micropiastre, la preparazione dei campioni diventa altamente efficiente.

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Sonicatore per piastre UIP400MTP per la preparazione di campioni ad alta produttività: L'UIP400MTP sonicchia uniformemente i campioni in piastre a più pozzetti, piastre per microtitolazione e piastre a 96 pozzetti, disgregando le cellule, estraendo le proteine, frammentando il DNA, l'RNA e le fibrille di alfa-sinucleina.

Il sonicatore a piastra UIP400MTP per la preparazione di campioni ad alta produttività sonica uniformemente i campioni in piastre multipozzetto, piastre per microtitolazione e piastre a 96 pozzetti

Vantaggi della frammentazione ultrasonica del DNA

  • risultati ripetibili / riproducibili
  • regolabile con precisione per ottenere una certa lunghezza del frammento
  • elaborazione rapida
  • risultati coerenti di frammentazione del DNA
  • dispositivi per qualsiasi volume di campione (per esempio, fiale multiple o micropiastre)
  • alto rendimento
  • controllo preciso della temperatura
  • funzionamento semplice e facile da usare

Sequenziamento Next-Gen: Frammentazione ultrasonica del DNA per la preparazione della libreria

Per eseguire un sequenziamento di prossima generazione, devono essere eseguite le tre fasi fondamentali di (1) preparazione della libreria, (2) sequenziamento e (3) analisi dei dati. Durante la preparazione della libreria, il DNA viene frammentato, poi le estremità dei frammenti vengono riparate (lucidate) aggiungendo una singola base di adenina e i frammenti target vengono convertiti in DNA a doppio filamento. Infine i cosiddetti adattatori sono attaccati tramite legatura, PCR o tagmentazione in modo che il prodotto finale della libreria di DNA possa essere quantificato per il sequenziamento.
Frammentazione del DNA tramite sonicazione: Specialmente quando le tecnologie di sequenziamento a lettura breve come Illumina, che non possono leggere facilmente frammenti di DNA più lunghi, i supporti di DNA devono essere frammentati ad una certa dimensione che può essere ottenuta in modo affidabile tramite ultrasuoni.
Gli ultrasuoni possono essere utilizzati in modo affidabile per la frammentazione di DNA, RNA e cromatina.

Sequenziamento Next Gen – Preparazione della biblioteca

La frammentazione ultrasonica del DNA è comunemente impiegata nella preparazione di librerie di sequenziamento del DNA per le piattaforme di sequenziamento di nuova generazione (NGS). Questa tecnica viene utilizzata per rompere le molecole di DNA in frammenti più piccoli di dimensioni desiderate, che facilitano le fasi successive della preparazione delle librerie. La frammentazione del DNA a ultrasuoni è tipicamente richiesta durante la fase di preparazione delle librerie nei flussi di lavoro NGS per frammentare il DNA genomico in pezzi più piccoli adatti all'elaborazione e al sequenziamento a valle. Svolge un ruolo cruciale nel garantire il successo dell'esperimento di sequenziamento, generando frammenti di DNA delle dimensioni appropriate per la specifica piattaforma di sequenziamento utilizzata.

La frammentazione ultrasonica del DNA è frequentemente utilizzata come fase di preparazione del campione nel Next Generation Sequencing (NGS)

Analisi elettroforetiche del DNA genomico di E. coli EDL933 sottoposto ad un'ecografia di 0-15 minuti. L indica la scala del DNA. (Basselet et al. 2008)

Sequenziamento di nuova generazione – Fasi del processo:

  • Frammentazione ultrasonica del DNA: Prima della costruzione della libreria, il DNA genomico viene frammentato in pezzi più piccoli e maneggevoli. La frammentazione a ultrasuoni prevede l'uso di onde sonore ad alta frequenza per tagliare le molecole di DNA in frammenti della dimensione desiderata. Questa fase è fondamentale perché contribuisce a garantire che le letture di sequenziamento generate in seguito siano della lunghezza appropriata per la piattaforma di sequenziamento utilizzata. L'intervallo di dimensioni dei frammenti può essere regolato in base ai requisiti specifici dell'esperimento di sequenziamento.
  • Amplificazione clonale mediante PCR: Dopo la frammentazione a ultrasuoni, i frammenti di DNA vengono sottoposti a riparazione delle estremità, legatura dell'adattatore e amplificazione PCR per generare le librerie finali di sequenziamento del DNA. Queste fasi preparano le molecole di DNA frammentate per il processo di sequenziamento aggiungendo sequenze di adattatori necessarie per il legame con la piattaforma di sequenziamento e fornendo siti di priming per l'amplificazione PCR.
  • Sequenziamento del DNA mediante sintesi: Una volta preparate le librerie di sequenziamento, inizia il processo di sequenziamento del DNA per sintesi (SBS). Durante la SBS, la sequenza del DNA è determinata dall'aggiunta sequenziale di nucleotidi al filamento complementare. Questa fase comporta reazioni cicliche di incorporazione, imaging e scissione dei nucleotidi, consentendo di determinare la sequenza del DNA in base ai segnali fluorescenti emessi dai nucleotidi incorporati.
  • Sequenziamento massicciamente parallelo: Nella fase finale, i modelli di DNA amplificati e segregati spazialmente vengono sequenziati simultaneamente in modo massicciamente parallelo. Questo approccio di sequenziamento ad alta velocità consente di generare milioni o miliardi di letture di sequenziamento in una singola corsa di sequenziamento, permettendo una determinazione efficiente e rapida delle sequenze di DNA.

Come funziona la frammentazione ultrasonica del DNA?

La sonicazione, conosciuta anche come trattamento acustico del campione, è un metodo ampiamente utilizzato per frammentare il DNA. Per il taglio ultrasonico del DNA, i campioni sono esposti alle onde ultrasoniche in condizioni controllate. Il principio di funzionamento della frammentazione ultrasonica del DNA si basa sulle vibrazioni e sulla cavitazione generate dalle onde ultrasoniche. Le forze di taglio che risultano dalla cavitazione ultrasonica (acustica) rompono le molecole di DNA ad alto peso molecolare. L'impostazione della sonicazione come l'intensità (ampiezza, durata), la modalità di pulsazione e la temperatura permettono una frammentazione precisa del DNA ad una certa lunghezza desiderata di frammenti di DNA. Mentre il DNA viene spesso ridotto a 100-600 bp usando gli ultrasuoni, frammenti di DNA più lunghi, fino a 1300 bp, possono essere ottenuti quando vengono applicate condizioni ultrasoniche più blande.

Gli omogeneizzatori a ultrasuoni sono affidabili per il taglio del DNA

Taglio ultrasonico del DNA durante il ChIP – Immunoprecipitazione cromatina
Adattato da Jkwchui sotto CC-BY-SA.03

 

Questo tutorial spiega qual è il tipo di sonicatore migliore per le attività di preparazione dei campioni, come la lisi, la disgregazione delle cellule, l'isolamento delle proteine, la frammentazione del DNA e dell'RNA nei laboratori, nelle analisi e nella ricerca. Scegliete il tipo di sonicatore ideale per la vostra applicazione, il volume del campione, il numero di campioni e la produttività. Hielscher Ultrasonics ha l'omogeneizzatore a ultrasuoni ideale per voi!

Come trovare il sonicatore perfetto per la disgregazione cellulare e l'estrazione di proteine in ambito scientifico e analitico

Miniatura del video

 

Controllo della temperatura per prevenire la degradazione del DNA

La forma molecolare a doppio filamento del DNA è altamente sensibile alle temperature elevate, per cui l'esatto controllo della temperatura durante le fasi di preparazione del campione è un fattore cruciale per risultati di analisi affidabili.
Sia che utilizziate gli ultrasuoni a sonda della Hielscher, il VialTweeter o il UIP400MTP – Il monitoraggio e il controllo continuo della temperatura sono garantiti da un sensore di temperatura collegabile e dal software del dispositivo intelligente. Per mantenere la temperatura entro un certo intervallo, è possibile impostare un limite di temperatura superiore e inferiore. Di conseguenza, l'ultrasuonatore si fermerà non appena questo limite di temperatura viene superato e automaticamente continuerà a sonicare quando la temperatura si è abbassata di un ∆T impostato.
Il sofisticato software degli ultrasuoni Hielscher assicura il mantenimento affidabile delle condizioni ideali di trattamento del campione.

Frammentazione del DNA del campione di massa con l'ultrasuoni UIP400MTP Multi-Well Plate

Unità di preparazione multi-campione a ultrasuoni UIP400MTP per la sonicazione di piastre a più pozzettiIl numero di campioni nelle scienze biologiche è aumentato significativamente nell'ultimo decennio. Ciò significa che un numero molto elevato di campioni (ad esempio, 384, 1536 o 3456 pozzetti per micropiastra) deve essere elaborato durante la preparazione e l'analisi dei campioni in condizioni sempre uguali, al fine di ottenere risultati comparabili e validi. Con l'UIP400MTP, Hielscher Ultrasonics segue la tendenza all'elaborazione di massa dei campioni. L'UIP400MTP è un ultrasuonatore per la preparazione dei campioni mediante micropiastre. L'UIP400MTP può elaborare piastre con 6, 12, 24, 48, 96, 384, 1536 o 3456 pozzetti. A seconda del tipo di micropiastra, ogni pozzetto può contenere tipicamente volumi di campione da decine di nanolitri a diversi millilitri. Ampiamente utilizzata nella ricerca nelle scienze della vita, la UIP400MTP è molto comunemente usata per la preparazione dei campioni prima di saggi come ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) o PCR, prima dell'analisi delle proteine, così come per la preparazione della cromatina prima di CHiP e CHiP-seq, l'identificazione delle modifiche degli istoni, e altri trattamenti analitici (ad esempio, elettroforesi su gel, spettrometria di massa).

L'omogeneizzatore a ultrasuoni UIP400MTP è in grado di sonicare piastre multipozzetto e micropiastre per la lisi cellulare, la frammentazione del DNA, la dispersione o l'omogeneizzazione.

UIP400MTP per la sonicazione multipozzetto

Miniatura del video

Il VialTweeter per la separazione dei campioni fino a 10 fiale

Configurazione completa del VialTweeter: Sonotrodo VialTweeter al processore ad ultrasuoni UP200StIl VialTweeter è un ultrasuonatore da laboratorio molto usato VialTweeter che permette la sonicazione efficace e comoda di fino a 10 fiale contemporaneamente. Poiché le fiale e le provette (ad esempio, fiale Eppendorf, cryo fiale, provette da centrifuga) vengono sonicate indirettamente, si evita qualsiasi contaminazione incrociata. Poiché ad ogni campione viene erogata la stessa intensità di ultrasuoni, tutti i risultati della sonicazione sono omogenei e riproducibili. Il VialTweeter offre tutte le funzioni intelligenti come i nostri altri dispositivi digitali (ad esempio, menu intelligente, impostazioni programmabili, controllo della temperatura, controllo remoto, ecc.

Sonde a più dita per piastre di micropozzetti

4 teste o 4 sonotrodi per la sonicazione simultanea di 4 campioni alla stessa intensità con l'ultrasuonatore Hielscher da 200 watts modelli UP200ST e UP200HTDisponibili per gli omogeneizzatori a ultrasuoni UP200Ht e UP200St, le sonde multi-finger con 4 o 8 dita sono una comoda opzione per sonicare più campioni contemporaneamente nelle stesse condizioni. Per esempio, il sonotrodo MTP-24-8-96 è una sonda a otto dita, ideale per l'integrazione in sistemi automatizzati o per l'efficiente preparazione manuale del campione nei pozzetti delle piastre multipozzetto. Il sonotrodo a più dita è ideale per i laboratori automatizzati, dove vengono processati soprattutto becher e provette con un sonotrodo a ultrasuoni standard. Le sonde multi-dito e quelle standard possono essere scambiate rapidamente in pochi minuti trasformando il sonotrodo monosonda in un distruttore a ultrasuoni multi-sonda.

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Ultrasuoni Hielscher per la frammentazione del DNA

Hielscher Ultrasonics offre diverse piattaforme basate sugli ultrasuoni per la frammentazione di DNA, RNA e cromatina. Queste diverse piattaforme includono sonde a ultrasuoni (sonotrodi), soluzioni di sonicazione indiretta per la preparazione simultanea di campioni in più provette o piastre a più pozzetti (ad esempio, piastre a 96 pozzetti, piastre per microtitolazione), sonoreattori e coppelle a ultrasuoni. Tutte le piattaforme per il taglio del DNA sono alimentate da processori a ultrasuoni ad alte prestazioni con regolazione di frequenza, che sono controllabili con precisione e forniscono risultati riproducibili.

Processori a ultrasuoni per qualsiasi numero e dimensione di campioni

Con gli ultrasuoni multicampione della Hielscher VialTweeter (per un massimo di 10 provette) e UIP400MTP (per micropiastre/piastre multiwell) diventa facilmente possibile ridurre il tempo di elaborazione del campione grazie a un'ultrasuonazione intensa e precisamente controllabile, ottenendo al contempo la distribuzione delle dimensioni e la resa del frammento di DNA desiderate. La frammentazione ultrasonica del DNA rende la preparazione del campione efficiente, affidabile e scalabile. I protocolli possono essere scalati linearmente da uno a numerosi campioni applicando ultrasuoni costantemente controllati.
Gli ultrasuonatori a sonda da una a cinque dita sono ideali per la preparazione di un numero minore di campioni. Gli ultrasuonatori da laboratorio della Hielscher sono disponibili in varie dimensioni, in modo da potervi consigliare il dispositivo ideale per la vostra applicazione e le vostre esigenze.

Controllo di processo preciso

Gli ultrasuonatori Hielscher possono essere controllati a distanza tramite un controllo via browser. I parametri di sonicazione possono essere monitorati e regolati con precisione in base ai requisiti del processo.Le impostazioni di sonicazione precisamente controllabili sono cruciali poiché una sonicazione esaustiva può distruggere il DNA, l'RNA e la cromatina, ma un taglio ultrasonico inadeguato produce frammenti di DNA e cromatina troppo lunghi. Gli ultrasuonatori digitali della Hielscher possono essere facilmente impostati su precisi parametri di sonicazione. Le impostazioni di sonicazione specifiche possono anche essere salvate come impostazioni programmate per una rapida ripetizione della stessa procedura.
Tutte le sonicazioni sono automaticamente protocollate e memorizzate come file CSV su una scheda SD integrata. Questo permette una documentazione accurata delle prove eseguite e rende possibile rivedere facilmente i cicli di sonicazione.
Tramite il controllo remoto via browser, tutti gli ultrasuoni digitali possono essere azionati e monitorati tramite qualsiasi browser standard. Non è richiesta l'installazione di un software aggiuntivo, poiché una connessione LAN permette una configurazione plug-n-play molto semplice.

Massima facilità d'uso nella preparazione di campioni ad ultrasuoni

Tutti gli ultrasuoni Hielscher sono progettati per fornire ultrasuoni ad alte prestazioni, ma allo stesso tempo sono sempre molto facili da usare e da gestire. Tutte le impostazioni sono ben strutturate in un menu chiaro, a cui si può accedere facilmente tramite un touch-display colorato o un telecomando con browser. Il software intelligente con impostazioni programmabili e registrazione automatica dei dati assicura impostazioni di sonicazione ottimali per risultati affidabili e riproducibili. L'interfaccia del menu pulita e facile da usare trasforma gli ultrasuonatori Hielscher in dispositivi efficienti e facili da usare.
La tabella qui sotto vi dà un'indicazione della capacità di elaborazione approssimativa dei nostri ultrasuoni da laboratorio, che sono ideali per compiti di preparazione dei campioni come la frammentazione del DNA e dell'RNA, la lisi cellulare e l'estrazione delle proteine:

DispositivoPotenza [W]TipoVolume [mL]
UIP400MTP400per micropiastre6 – 3456 pozzi
VialTweeter200per un massimo di 10 fiale più possibilità di pinza0.5 – 1.5
UP50H50Tipo di sonda0.01 – 250
UP100H100Tipo di sonda0.01 – 500
UP200Ht200Tipo di sonda0.1 – 1000
UP200St200Tipo di sonda0.1 – 1000
UP400St400Tipo di sonda5.0 – 2000
Cuphorn200CupHorn, sonoreactor10 – 200
GDmini2 200cella a flusso libero da contaminazioni

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Il VialTweeter è un Ultraonicator multi-campione che permette una preparazione affidabile del campione in condizioni di temperatura precisamente controllate.

L'unità di preparazione multi-campione a ultrasuoni VialTweeter consente la sonicazione simultanea di un massimo di 10 fiale. Con il dispositivo a pinza VialPress è possibile premere fino a 4 tubi aggiuntivi nella parte anteriore per un'intensa sonicazione.


Il sonotrodo MTP-24-8-96 ha otto sonde ad ultrasuoni per la sonicazione dei pozzetti delle piastre microtiter.

Il sonotrodo MTP-24-8-96 ha otto sonde ad ultrasuoni per la sonicazione dei pozzetti delle piastre microtiter.



Letteratura / Referenze

Particolarità / Cose da sapere

Cos'è il sequenziamento di prossima generazione?

Next-generation Sequencing, anche Next Gen Sequencing (NGS), high-throughput sequencing o sequenziamento di seconda generazione, si riferisce all'approccio del sequenziamento parallelo massivo, in cui quantità molto grandi (massicce) di DNA di milioni di frammenti sono sequenziate simultaneamente in parallelo per corsa.
Per effettuare un sequenziamento di nuova generazione, le tre fasi fondamentali di

  1. preparazione della biblioteca,
  2. sequenziamento e
  3. analisi dei dati

sono necessari.
Durante la preparazione delle librerie, i filamenti di DNA devono essere frammentati in frammenti di DNA di una certa lunghezza. La sonicazione è una delle tecniche preferite per frammentare il DNA.
Durante il processo di sequenziamento del DNA, l'ordine dei nucleotidi nel DNA – noto come sequenza dell'acido nucleico - è determinato. La sequenza dell'acido nucleico è composta da quattro basi nucleotidiche - adenina, citosina, guanina, timina – quale codice per informazioni.
Il sequenziamento di prossima generazione sta guidando la ricerca nelle scienze della vita e nella medicina personalizzata, dato che il sequenziamento del DNA e dell'RNA sono molto usati nella ricerca genomica, nella ricerca sul cancro, nella ricerca di malattie rare e complesse, nella ricerca microbica, nell'agrigenomica e in molti altri campi di ricerca.

Sequenziamento di nuova generazione vs. sequenziamento Sanger

Mentre con il Next Generation Sequencing (NGS) è possibile sequenziare un numero enorme di campioni genomici, il Sanger Sequencing (noto anche come metodo di terminazione a catena o First Generation Sequencing) ha solo la capacità di sequenziare un piccolo numero di campioni. Il sequenziamento Sanger sequenzia solo un singolo frammento di DNA alla volta e può essere realizzato in un solo giorno. Grazie alla sua accuratezza, il sequenziamento Sanger è anche considerato la tecnologia gold-standard, che viene utilizzata per verificare i risultati ottenuti dal sequenziamento di prossima generazione.
Il sequenziamento Sanger raggiunge lunghezze di lettura di circa 800 bp (tipicamente 500-600 bp con DNA non arricchito). Le lunghezze di lettura più lunghe nel sequenziamento Sanger mostrano vantaggi significativi rispetto ad altri metodi di sequenziamento soprattutto in termini di sequenziamento di regioni ripetitive del genoma. Una sfida di dati di sequenza a lettura breve è particolarmente un problema nel sequenziamento di nuovi genomi (de novo) e nel sequenziamento di segmenti di genoma altamente riarrangiati, tipicamente quelli visti di genomi di cancro o in regioni di cromosomi che mostrano variazioni strutturali. [cp. Morozova e Marra, 2008]

DNA – Acido desossiribonucleico – Forme e funzioni

Ogni forma di DNA ha caratteristiche e applicazioni uniche, che contribuiscono a un ampio spettro di campi di ricerca, tra cui l'oncologia, la genetica, la scienza forense e la biologia evolutiva. I sonicatori Hielscher sono una soluzione altamente efficiente e affidabile per isolare e frammentare il DNA e l'RNA a scopo di analisi. Nell'elenco che segue, vi illustriamo le forme specifiche di DNA e le classifichiamo in base al loro contesto biologico e alle loro funzioni:

  • DNA genomico (gDNA)
    DNA genomico (gDNA): L'insieme completo del DNA di un organismo, comprese le regioni codificanti (geni) e non codificanti.
  • DNA extracellulare
    DNA tumorale circolante (ctDNA): Frammenti di DNA rilasciati nel sangue dalle cellule tumorali.
    DNA libero da cellule (cfDNA): Frammenti di DNA che circolano liberamente nel sangue, provenienti da vari tessuti.
  • DNA circolare extracromosomico (eccDNA): Molecole di DNA circolari che si trovano all'esterno dei cromosomi nelle cellule eucariotiche.
    DNA virale: DNA proveniente da virus, integrato nel genoma dell'ospite o come DNA episomale.
  • DNA mitocondriale
    DNA mitocondriale (mtDNA): DNA situato nei mitocondri, ereditato per via materna e coinvolto nella produzione di energia.
  • DNA plasmidico
    DNA plasmidico: Piccole molecole di DNA circolari che si replicano indipendentemente dal DNA cromosomico, comunemente presenti nei batteri e utilizzate nell'ingegneria genetica.
  • DNA nucleare
    DNA nucleare (nDNA): DNA contenuto nel nucleo delle cellule eucariotiche, che costituisce la maggior parte del materiale genetico di un organismo.
  • DNA di una singola cellula
    DNA a cellula singola (scDNA): DNA estratto da una singola cellula, utilizzato per analisi genomiche dettagliate a livello di singola cellula.
  • DNA ricombinante
    DNA ricombinante (rDNA): Molecole di DNA formate con metodi di ricombinazione genetica in laboratorio per riunire materiale genetico proveniente da più fonti.
  • Moduli specializzati
    DNA ambientale (eDNA): DNA raccolto da campioni ambientali (suolo, acqua) senza isolare gli organismi di origine
    DNA antico (aDNA): DNA estratto da antichi esemplari, che fornisce approfondimenti sulla biologia evolutiva e sulle antiche popolazioni.
  • DNA cromosomico
    DNA cromosomico: DNA che costituisce i cromosomi all'interno del nucleo cellulare, comprendendo sia le regioni codificanti che quelle non codificanti.
  • Forme virali e sintetiche
    DNA virale: DNA derivato da virus, che può essere integrato nel genoma dell'ospite o esistere come entità indipendente.
    DNA sintetico: Sequenze di DNA sintetizzate artificialmente e create attraverso processi chimici, spesso utilizzate nella ricerca e nella biotecnologia.

Ultrasuoni ad alte prestazioni! La gamma di prodotti Hielscher copre l'intero spettro, dagli ultrasuoni da laboratorio compatti alle unità da banco fino ai sistemi a ultrasuoni industriali completi.

Hielscher Ultrasonics produce omogeneizzatori a ultrasuoni ad alte prestazioni da laboratorio a dimensione industriale.


Saremo lieti di discutere il vostro processo.

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