Frammentazione del DNA mediante ultrasuoni per il sequenziamento di nuova generazione

Il sequenziamento di nuova generazione (NGS) richiede il taglio e la frammentazione affidabili del DNA genomico per sequenziare i filamenti di DNA genomico e creare librerie genomiche. La frammentazione controllata del DNA in frammenti è una fase essenziale della preparazione dei campioni, necessaria prima del sequenziamento del DNA. La sonicazione si è dimostrata una tecnica efficiente e affidabile per frammentare il DNA in frammenti di una determinata lunghezza. I protocolli di frammentazione del DNA mediante ultrasuoni consentono di ottenere risultati di frammentazione riproducibili. I sonicatori Hielscher sono in grado di produrre un’ampia gamma di distribuzioni dimensionali dei frammenti di DNA genomico, controllabili con precisione tramite i parametri operativi. Poiché i sistemi Hielscher per il taglio del DNA mediante ultrasuoni sono disponibili per fiale singole e multiple, nonché per micropiastre, la preparazione dei campioni diventa altamente efficiente.

Sequenziamento di nuova generazione: frammentazione del DNA mediante ultrasuoni per la preparazione delle librerie

Per eseguire un sequenziamento di nuova generazione, occorre effettuare le tre fasi fondamentali: (1) preparazione delle librerie, (2) sequenziamento e (3) analisi dei dati. Durante la preparazione delle librerie, il DNA viene frammentato, quindi le estremità dei frammenti vengono riparate (rifinite) aggiungendo una singola base di adenina e i frammenti di interesse vengono convertiti in DNA a doppio filamento. Infine, i cosiddetti adattatori vengono aggiunti mediante ligazione, PCR o tagmentazione, in modo che il prodotto finale di DNA della libreria possa essere quantificato per il sequenziamento.
Frammentazione del DNA mediante sonicazione: Soprattutto quando si utilizzano tecnologie di sequenziamento a letture corte come Illumina, che non possono leggere agevolmente frammenti di DNA più lunghi, i filamenti di DNA devono essere frammentati fino a una determinata dimensione, ottenibile in modo affidabile mediante sonicazione.
La sonicazione può essere utilizzata in modo affidabile per frammentare DNA, RNA e cromatina.

Sequenziamento di nuova generazione – Preparazione delle librerie

La frammentazione del DNA mediante ultrasuoni è comunemente impiegata nella preparazione delle librerie di sequenziamento del DNA per le piattaforme di sequenziamento di nuova generazione (NGS). Questa tecnica viene utilizzata per spezzare le molecole di DNA in frammenti più piccoli, compresi nell’intervallo dimensionale desiderato, facilitando le fasi successive della preparazione delle librerie. La frammentazione del DNA mediante ultrasuoni è generalmente richiesta durante la fase di preparazione delle librerie nei flussi di lavoro NGS per frammentare il DNA genomico in porzioni più piccole, adatte al trattamento e al sequenziamento successivi. Svolge un ruolo cruciale nel garantire il successo dell’esperimento di sequenziamento, generando frammenti di DNA compresi nell’intervallo dimensionale appropriato per la specifica piattaforma di sequenziamento utilizzata.

Sequenziamento di nuova generazione – Fasi del processo:

• Frammentazione del DNA mediante ultrasuoni: Prima della costruzione delle librerie, il DNA genomico viene frammentato in porzioni più piccole e più facili da gestire. La frammentazione mediante ultrasuoni utilizza onde sonore ad alta frequenza per tagliare le molecole di DNA in frammenti compresi nell’intervallo dimensionale desiderato. Questa fase è cruciale perché contribuisce a garantire che le letture di sequenziamento generate successivamente abbiano una lunghezza appropriata per la piattaforma di sequenziamento utilizzata. L’intervallo dimensionale dei frammenti può essere regolato in base ai requisiti specifici dell’esperimento di sequenziamento.
• Amplificazione clonale mediante PCR: Dopo la frammentazione mediante ultrasuoni, i frammenti di DNA vengono sottoposti a riparazione delle estremità, ligazione degli adattatori e amplificazione mediante PCR per generare le librerie finali di sequenziamento del DNA. Queste fasi preparano le molecole di DNA frammentate al processo di sequenziamento, aggiungendo le sequenze degli adattatori necessarie per il legame alla piattaforma di sequenziamento e fornendo i siti di innesco per l’amplificazione mediante PCR.
• Sequenziamento del DNA mediante sintesi: Una volta preparate le librerie di sequenziamento, inizia il processo di sequenziamento del DNA mediante sintesi (SBS). Durante l’SBS, la sequenza del DNA viene determinata mediante l’aggiunta sequenziale di nucleotidi al filamento complementare. Questa fase comprende reazioni cicliche di incorporazione dei nucleotidi, acquisizione delle immagini e scissione, consentendo di determinare la sequenza del DNA in base ai segnali fluorescenti emessi dai nucleotidi incorporati.
• Sequenziamento massivamente parallelo: Nella fase finale, gli stampi di DNA amplificati e separati spazialmente vengono sequenziati simultaneamente in modo massivamente parallelo. Questo approccio di sequenziamento ad alta capacità consente di generare da milioni a miliardi di letture di sequenziamento in una singola esecuzione, permettendo di determinare le sequenze di DNA in modo efficiente e rapido.

Come funziona la frammentazione del DNA mediante ultrasuoni?

La sonicazione, nota anche come trattamento acustico dei campioni, è un metodo ampiamente utilizzato per frammentare il DNA. Per il taglio del DNA mediante ultrasuoni, i campioni vengono esposti a onde ultrasoniche in condizioni controllate. Il principio di funzionamento della frammentazione del DNA mediante ultrasuoni si basa sulle vibrazioni e sulla cavitazione generate dalle onde ultrasoniche. Le forze di taglio risultanti dalla cavitazione ultrasonica (acustica) spezzano le molecole di DNA ad alto peso molecolare. Le impostazioni di sonicazione, quali intensità (ampiezza, durata), modalità di pulsazione e temperatura, consentono di frammentare con precisione il DNA in frammenti della lunghezza desiderata. Sebbene il DNA venga spesso ridotto a 100–600 bp mediante sonicazione, applicando condizioni ultrasoniche più blande si possono ottenere frammenti di DNA più lunghi, fino a 1300 bp.

Controllo della temperatura per prevenire la degradazione del DNA

La struttura molecolare a doppio filamento del DNA è altamente sensibile alle temperature elevate, pertanto un controllo preciso della temperatura durante le fasi di preparazione dei campioni è un fattore cruciale per ottenere risultati analitici affidabili.
Sia che si utilizzino i sonicatori a sonda Hielscher, il VialTweeter o l’UIP400MTP, il monitoraggio e il controllo continui della temperatura sono garantiti da un sensore di temperatura collegabile e dal software intelligente del dispositivo. Per mantenere la temperatura entro un determinato intervallo, è possibile impostare un limite di temperatura superiore e uno inferiore. Di conseguenza, il sonicatore si arresta temporaneamente non appena questo limite di temperatura viene superato e riprende automaticamente la sonicazione quando la temperatura è diminuita di un ∆T impostato.
Il sofisticato software dei sonicatori Hielscher garantisce il mantenimento affidabile delle condizioni ideali di trattamento dei campioni.

Frammentazione del DNA in un elevato numero di campioni con il sonicatore per piastre multipozzetto UIP400MTP

Il numero di campioni nelle scienze della vita è aumentato significativamente nell’ultimo decennio. Ciò significa che numeri molto elevati di campioni (ad es., 384, 1536 o 3456 pozzetti per micropiastra) devono essere trattati durante la preparazione e l’analisi in condizioni costantemente uguali, per ottenere risultati confrontabili e validi. Con l’UIP400MTP, Hielscher Ultrasonics segue la tendenza al trattamento di un elevato numero di campioni. L’UIP400MTP è un sonicatore per la preparazione dei campioni mediante micropiastre. L’UIP400MTP può trattare piastre con 6, 12, 24, 48, 96, 384, 1536 o 3456 pozzetti. A seconda del tipo di micropiastra, ciascun pozzetto può generalmente contenere volumi di campione da decine di nanolitri a diversi millilitri. Ampiamente impiegato nella ricerca nelle scienze della vita, l’UIP400MTP viene utilizzato molto frequentemente per la preparazione dei campioni prima di saggi quali ELISA (saggio immunoassorbente legato a un enzima) o PCR, prima delle analisi delle proteine, nonché per la preparazione della cromatina prima di CHiP e CHiP-seq, per l’identificazione delle modificazioni degli istoni e per altri trattamenti analitici (ad es., elettroforesi su gel, spettrometria di massa).
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Il VialTweeter per la preparazione dei campioni in un massimo di 10 fiale

Il VialTweeter è un sonicatore da laboratorio VialTweeter ampiamente utilizzato che consente la sonicazione efficace e pratica di un massimo di 10 fiale simultaneamente. Poiché le fiale e le provette (ad es., fiale Eppendorf, fiale criogeniche, provette da centrifuga) vengono sottoposte a sonicazione indiretta, si evita qualsiasi contaminazione incrociata. Poiché a ogni campione viene applicata la stessa intensità ultrasonica, tutti i risultati di sonicazione sono omogenei e riproducibili. Il VialTweeter offre tutte le funzionalità intelligenti dei nostri altri dispositivi digitali (ad es., menu intelligente, impostazioni programmabili, controllo della temperatura, controllo remoto ecc.), garantendo così la massima comodità d’uso.

Sonde a più dita per piastre a micropozzetti

Disponibili per gli omogeneizzatori a ultrasuoni a sonda UP200Ht e UP200St, le sonde a più dita con 4 o 8 dita sono un’opzione pratica per sottoporre a sonicazione più campioni contemporaneamente nelle stesse condizioni. Ad esempio, il sonotrodo MTP-24-8-96 è una sonda a otto dita, ideale per l’integrazione in sistemi automatizzati o per la preparazione manuale efficiente dei campioni nei pozzetti delle piastre multipozzetto. Il sonotrodo a più dita è ideale per l’automazione nei laboratori, dove vengono trattati principalmente becher e provette utilizzando un sonotrodo standard a ultrasuoni. Le sonde a più dita e quelle standard possono essere intercambiate rapidamente in pochi minuti, trasformando il sonicatore a sonda singola in un disgregatore a ultrasuoni a più sonde.

Sonicatori Hielscher per la frammentazione del DNA

Hielscher Ultrasonics offre varie piattaforme basate sugli ultrasuoni per la frammentazione di DNA, RNA e cromatina. Queste diverse piattaforme comprendono sonde a ultrasuoni (sonotrodi), soluzioni di sonicazione indiretta per la preparazione simultanea di campioni in più provette o piastre multipozzetto (ad es., piastre a 96 pozzetti, piastre per microtitolazione), sonoreattori e sonotrodi a tazza. Tutte le piattaforme per il taglio del DNA sono azionate da processori a ultrasuoni ad alte prestazioni con frequenza accordata, controllabili con precisione e in grado di fornire risultati riproducibili.

Processori a ultrasuoni per qualsiasi numero e dimensione dei campioni

Con i sonicatori Hielscher per più campioni VialTweeter (per un massimo di 10 provette) e UIP400MTP (per micropiastre / piastre multipozzetto), è possibile ridurre facilmente il tempo di trattamento dei campioni grazie a una sonicazione intensa e controllabile con precisione, ottenendo al contempo la distribuzione dimensionale e la resa desiderate dei frammenti di DNA. La frammentazione del DNA mediante ultrasuoni rende la preparazione dei campioni efficiente, affidabile e scalabile. I protocolli possono essere scalati linearmente da uno a numerosi campioni applicando ultrasuoni costantemente controllati.
I sonicatori a sonda con da uno a cinque dita sono ideali per la preparazione di un numero ridotto di campioni. I sonicatori da laboratorio Hielscher sono disponibili in varie dimensioni, così da poter consigliare il dispositivo ideale per la tua applicazione e le tue esigenze.

Controllo preciso del processo

Impostazioni di sonicazione controllabili con precisione sono cruciali, poiché una sonicazione eccessiva può distruggere DNA, RNA e cromatina, mentre un taglio mediante ultrasuoni inadeguato produce frammenti di DNA e cromatina troppo lunghi. I sonicatori digitali Hielscher possono essere facilmente configurati con parametri di sonicazione precisi. Le impostazioni specifiche di sonicazione possono inoltre essere salvate come impostazioni programmate per ripetere rapidamente la stessa procedura.
Tutte le sonicazioni vengono automaticamente registrate e salvate come file CSV su una scheda SD integrata. Ciò consente una documentazione accurata delle prove eseguite e permette di riesaminare facilmente le sessioni di sonicazione.
Tramite il controllo remoto via browser, tutti i sonicatori digitali possono essere azionati e monitorati da qualsiasi browser standard. Non è necessaria l’installazione di software aggiuntivo, poiché una connessione LAN consente una configurazione plug-and-play molto semplice.


Massima facilità d’uso nella preparazione dei campioni mediante ultrasuoni

Tutti i sonicatori Hielscher sono progettati per erogare ultrasuoni ad alte prestazioni, mantenendo al contempo un’elevata facilità d’uso e di funzionamento. Tutte le impostazioni sono ben organizzate in un menu chiaro, facilmente accessibile tramite il display touch a colori o il controllo remoto via browser. Il software intelligente, con impostazioni programmabili e registrazione automatica dei dati, garantisce impostazioni di sonicazione ottimali per risultati affidabili e riproducibili. L’interfaccia del menu, chiara e facile da usare, rende i sonicatori Hielscher dispositivi intuitivi ed efficienti.
La tabella seguente fornisce un’indicazione della capacità di trattamento approssimativa dei nostri sonicatori da laboratorio, ideali per attività di preparazione dei campioni quali la frammentazione di DNA e RNA, la lisi cellulare e l’estrazione delle proteine: