Frammentazione ultrasonica del DNA per il sequenziamento di prossima generazione
Il Next Generation Sequencing (NGS) richiede la tranciatura e la frammentazione affidabile del DNA genomico per sequenziare i filamenti di DNA genomico e creare librerie di genomi. La frammentazione controllata del DNA in frammenti di DNA è una fase essenziale di preparazione del campione richiesta prima che il DNA venga sequenziato. L'ultrasuonazione si è dimostrata una tecnica efficiente e affidabile per la frammentazione del DNA di una certa lunghezza. I protocolli di frammentazione del DNA ad ultrasuoni raggiungono risultati di frammentazione riproducibili. Gli ultrasuoni Hielscher sono in grado di produrre un'ampia gamma di distribuzioni delle dimensioni dei frammenti di DNA genomico, controllabili con precisione attraverso i parametri operativi. Poiché i sistemi di taglio del DNA a ultrasuoni della Hielscher sono disponibili per fiale singole e multiple e per micropiastre, la preparazione dei campioni diventa altamente efficiente.
Analisi elettroforetiche del DNA genomico di E. coli EDL933 sottoposto ad un'ecografia di 0-15 minuti. L indica la scala del DNA. (Basselet et al. 2008)
- risultati ripetibili / riproducibili
- regolabile con precisione per ottenere una certa lunghezza del frammento
- elaborazione rapida
- risultati coerenti di frammentazione del DNA
- dispositivi per qualsiasi volume di campione (per esempio, fiale multiple o micropiastre)
- alto rendimento
- controllo preciso della temperatura
- funzionamento semplice e facile da usare
Sequenziamento Next-Gen: Frammentazione ultrasonica del DNA per la preparazione della libreria
Per eseguire un sequenziamento di prossima generazione, devono essere eseguite le tre fasi fondamentali di (1) preparazione della libreria, (2) sequenziamento e (3) analisi dei dati. Durante la preparazione della libreria, il DNA viene frammentato, poi le estremità dei frammenti vengono riparate (lucidate) aggiungendo una singola base di adenina e i frammenti target vengono convertiti in DNA a doppio filamento. Infine i cosiddetti adattatori sono attaccati tramite legatura, PCR o tagmentazione in modo che il prodotto finale della libreria di DNA possa essere quantificato per il sequenziamento.
Frammentazione del DNA tramite sonicazione: Specialmente quando le tecnologie di sequenziamento a lettura breve come Illumina, che non possono leggere facilmente frammenti di DNA più lunghi, i supporti di DNA devono essere frammentati ad una certa dimensione che può essere ottenuta in modo affidabile tramite ultrasuoni.
Gli ultrasuoni possono essere utilizzati in modo affidabile per la frammentazione di DNA, RNA e cromatina.
Come funziona la frammentazione ultrasonica del DNA?
La sonicazione, conosciuta anche come trattamento acustico del campione, è un metodo ampiamente utilizzato per frammentare il DNA. Per il taglio ultrasonico del DNA, i campioni sono esposti alle onde ultrasoniche in condizioni controllate. Il principio di funzionamento della frammentazione ultrasonica del DNA si basa sulle vibrazioni e sulla cavitazione generate dalle onde ultrasoniche. Le forze di taglio che risultano dalla cavitazione ultrasonica (acustica) rompono le molecole di DNA ad alto peso molecolare. L'impostazione della sonicazione come l'intensità (ampiezza, durata), la modalità di pulsazione e la temperatura permettono una frammentazione precisa del DNA ad una certa lunghezza desiderata di frammenti di DNA. Mentre il DNA viene spesso ridotto a 100-600 bp usando gli ultrasuoni, frammenti di DNA più lunghi, fino a 1300 bp, possono essere ottenuti quando vengono applicate condizioni ultrasoniche più blande.
Taglio ultrasonico del DNA durante il ChIP – Immunoprecipitazione cromatina
Adattato da Jkwchui sotto CC-BY-SA.03
Controllo della temperatura per prevenire la degradazione del DNA
La forma molecolare a doppio filamento del DNA è altamente sensibile alle temperature elevate, per cui l'esatto controllo della temperatura durante le fasi di preparazione del campione è un fattore cruciale per risultati di analisi affidabili.
Sia che utilizziate gli ultrasuoni a sonda della Hielscher, il VialTweeter o il UIP400MTP – Il monitoraggio e il controllo continuo della temperatura sono garantiti da un sensore di temperatura collegabile e dal software del dispositivo intelligente. Per mantenere la temperatura entro un certo intervallo, è possibile impostare un limite di temperatura superiore e inferiore. Di conseguenza, l'ultrasuonatore si fermerà non appena questo limite di temperatura viene superato e automaticamente continuerà a sonicare quando la temperatura si è abbassata di un ∆T impostato.
Il sofisticato software degli ultrasuoni Hielscher assicura il mantenimento affidabile delle condizioni ideali di trattamento del campione.
Frammentazione del DNA del campione di massa con l'ultrasuoni UIP400MTP Multi-Well Plate
Il numero di campioni nelle scienze biologiche è aumentato significativamente nell'ultimo decennio. Ciò significa che un numero molto elevato di campioni (ad esempio, 384, 1536 o 3456 pozzetti per micropiastra) deve essere elaborato durante la preparazione e l'analisi dei campioni in condizioni sempre uguali, al fine di ottenere risultati comparabili e validi. Con l'UIP400MTP, Hielscher Ultrasonics segue la tendenza all'elaborazione di massa dei campioni. L'UIP400MTP è un ultrasuonatore per la preparazione dei campioni mediante micropiastre. L'UIP400MTP può elaborare piastre con 6, 12, 24, 48, 96, 384, 1536 o 3456 pozzetti. A seconda del tipo di micropiastra, ogni pozzetto può contenere tipicamente volumi di campione da decine di nanolitri a diversi millilitri. Ampiamente utilizzata nella ricerca nelle scienze della vita, la UIP400MTP è molto comunemente usata per la preparazione dei campioni prima di saggi come ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) o PCR, prima dell'analisi delle proteine, così come per la preparazione della cromatina prima di CHiP e CHiP-seq, l'identificazione delle modifiche degli istoni, e altri trattamenti analitici (ad esempio, elettroforesi su gel, spettrometria di massa).
Il VialTweeter per la separazione dei campioni fino a 10 fiale
Il VialTweeter è un ultrasuonatore da laboratorio molto usato VialTweeter che permette la sonicazione efficace e comoda di fino a 10 fiale contemporaneamente. Poiché le fiale e le provette (ad esempio, fiale Eppendorf, cryo fiale, provette da centrifuga) vengono sonicate indirettamente, si evita qualsiasi contaminazione incrociata. Poiché ad ogni campione viene erogata la stessa intensità di ultrasuoni, tutti i risultati della sonicazione sono omogenei e riproducibili. Il VialTweeter offre tutte le funzioni intelligenti come i nostri altri dispositivi digitali (ad esempio, menu intelligente, impostazioni programmabili, controllo della temperatura, controllo remoto, ecc.
Sonde a più dita per piastre di micropozzetti
Disponibili per gli omogeneizzatori a ultrasuoni UP200Ht e UP200St, le sonde multi-finger con 4 o 8 dita sono una comoda opzione per sonicare più campioni contemporaneamente nelle stesse condizioni. Per esempio, il sonotrodo MTP-24-8-96 è una sonda a otto dita, ideale per l'integrazione in sistemi automatizzati o per l'efficiente preparazione manuale del campione nei pozzetti delle piastre multipozzetto. Il sonotrodo a più dita è ideale per i laboratori automatizzati, dove vengono processati soprattutto becher e provette con un sonotrodo a ultrasuoni standard. Le sonde multi-dito e quelle standard possono essere scambiate rapidamente in pochi minuti trasformando il sonotrodo monosonda in un distruttore a ultrasuoni multi-sonda.
Ultrasuoni Hielscher per la frammentazione del DNA
Hielscher Ultrasonics offre diverse piattaforme basate sugli ultrasuoni per la frammentazione di DNA, RNA e cromatina. Queste diverse piattaforme includono sonde a ultrasuoni (sonotrodi), soluzioni di sonicazione indiretta per la preparazione simultanea di campioni in più provette o piastre a più pozzetti (ad esempio, piastre a 96 pozzetti, piastre per microtitolazione), sonoreattori e coppelle a ultrasuoni. Tutte le piattaforme per il taglio del DNA sono alimentate da processori a ultrasuoni ad alte prestazioni con regolazione di frequenza, che sono controllabili con precisione e forniscono risultati riproducibili.
Processori a ultrasuoni per qualsiasi numero e dimensione di campioni
Con gli ultrasuoni multicampione della Hielscher VialTweeter (per un massimo di 10 provette) e UIP400MTP (per micropiastre/piastre multiwell) diventa facilmente possibile ridurre il tempo di elaborazione del campione grazie a un'ultrasuonazione intensa e precisamente controllabile, ottenendo al contempo la distribuzione delle dimensioni e la resa del frammento di DNA desiderate. La frammentazione ultrasonica del DNA rende la preparazione del campione efficiente, affidabile e scalabile. I protocolli possono essere scalati linearmente da uno a numerosi campioni applicando ultrasuoni costantemente controllati.
Gli ultrasuonatori a sonda da una a cinque dita sono ideali per la preparazione di un numero minore di campioni. Gli ultrasuonatori da laboratorio della Hielscher sono disponibili in varie dimensioni, in modo da potervi consigliare il dispositivo ideale per la vostra applicazione e le vostre esigenze.
Controllo di processo preciso
Le impostazioni di sonicazione precisamente controllabili sono cruciali poiché una sonicazione esaustiva può distruggere il DNA, l'RNA e la cromatina, ma un taglio ultrasonico inadeguato produce frammenti di DNA e cromatina troppo lunghi. Gli ultrasuonatori digitali della Hielscher possono essere facilmente impostati su precisi parametri di sonicazione. Le impostazioni di sonicazione specifiche possono anche essere salvate come impostazioni programmate per una rapida ripetizione della stessa procedura.
Tutte le sonicazioni sono automaticamente protocollate e memorizzate come file CSV su una scheda SD integrata. Questo permette una documentazione accurata delle prove eseguite e rende possibile rivedere facilmente i cicli di sonicazione.
Tramite il controllo remoto via browser, tutti gli ultrasuoni digitali possono essere azionati e monitorati tramite qualsiasi browser standard. Non è richiesta l'installazione di un software aggiuntivo, poiché una connessione LAN permette una configurazione plug-n-play molto semplice.
Massima facilità d'uso nella preparazione di campioni ad ultrasuoni
Tutti gli ultrasuoni Hielscher sono progettati per fornire ultrasuoni ad alte prestazioni, ma allo stesso tempo sono sempre molto facili da usare e da gestire. Tutte le impostazioni sono ben strutturate in un menu chiaro, a cui si può accedere facilmente tramite un touch-display colorato o un telecomando con browser. Il software intelligente con impostazioni programmabili e registrazione automatica dei dati assicura impostazioni di sonicazione ottimali per risultati affidabili e riproducibili. L'interfaccia del menu pulita e facile da usare trasforma gli ultrasuonatori Hielscher in dispositivi efficienti e facili da usare.
La tabella qui sotto vi dà un'indicazione della capacità di elaborazione approssimativa dei nostri ultrasuoni da laboratorio, che sono ideali per compiti di preparazione dei campioni come la frammentazione del DNA e dell'RNA, la lisi cellulare e l'estrazione delle proteine:
| Dispositivo | Potenza [W] | Tipo | Volume [mL] |
|---|---|---|---|
| UIP400MTP | 400 | per micropiastre | 6 – 3456 pozzi | VialTweeter | 200 | per un massimo di 10 fiale più possibilità di pinza | 0.5 – 1.5 |
| UP50H | 50 | Tipo di sonda | 0.01 – 250 |
| UP100H | 100 | Tipo di sonda | 0.01 – 500 |
| UP200Ht | 200 | Tipo di sonda | 0.1 – 1000 |
| UP200St | 200 | Tipo di sonda | 0.1 – 1000 |
| UP400St | 400 | Tipo di sonda | 5.0 – 2000 |
| Cuphorn | 200 | CupHorn, sonoreactor | 10 – 200 |
| GDmini2 | 200 | cella a flusso libero da contaminazioni |
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L'unità di preparazione multi-campione a ultrasuoni VialTweeter consente la sonicazione simultanea di un massimo di 10 fiale. Con il dispositivo a pinza VialPress è possibile premere fino a 4 tubi aggiuntivi nella parte anteriore per un'intensa sonicazione.
Il sonotrodo MTP-24-8-96 ha otto sonde ad ultrasuoni per la sonicazione dei pozzetti delle piastre microtiter.
Letteratura / Referenze
- Poptsova, M., Il’icheva, I., Nechipurenko, D. et al. (2014): Non-random DNA fragmentation in next-generation sequencing. Scientific Reports 4, 4532; 2014.
- Basselet P., Wegrzyn G., Enfors S.-O., Gabig-Ciminska M. (2008): Sample processing for DNA chip array-based analysis of enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC). Microbial Cell Factories 7:29. 2008.
- Doublier S., Riganti Ch., Voena C., Costamagna C., Aldieri E., Pescarmona G., Ghigo D., Bosia A. (008): RhoA Silencing Reverts the Resistance to Doxorubicin in Human Colon Cancer Cells. Molecular Cancer Research 6(10), 2008.
- Fredlund E., Gidlund A., Olsen M., Börjesson T., Spliid N.H.H., Simonsson M. (2008): Method evaluation of Fusarium DNA extraction from mycelia and wheat for down-stream real-time PCR quantification and correlation to mycotoxin levels. Journal of Microbiological Methods 2008.
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- Ristola M., Arpiainen S., Saleem M. A., Mathieson P. W., Welsh G. I., Lehtonen S., Holthöfer H. (2009): Regulation of Neph3 gene in podocytes – key roles of transcription factors NF-κB and Sp1. BMC Molecular Biology 10:83, 2009.
- Rodriguez J., Vives L., Jorda M., Morales C., Munoz M., Vendrell E., Peinado M. A. (2008): Genome-wide tracking of unmethylated DNA Alu repeats in normal and cancer cells. Nucleic Acids Research Vol. 36, No. 3, 2008. 770-784.
- Weiske J. Huber O. (2006): The Histidine Triad Protein Hint1 Triggers Apoptosis Independent of Its Enzymatic Activity. The Journal of Biological chemistry. Vol. 281, No. 37, 2006. 27356–27366.
Particolarità / Cose da sapere
Cos'è il sequenziamento di prossima generazione?
Next-generation Sequencing, anche Next Gen Sequencing (NGS), high-throughput sequencing o sequenziamento di seconda generazione, si riferisce all'approccio del sequenziamento parallelo massivo, in cui quantità molto grandi (massicce) di DNA di milioni di frammenti sono sequenziate simultaneamente in parallelo per corsa.
Per eseguire un sequenziamento di prossima generazione, devono essere eseguite le tre fasi fondamentali di (1) preparazione della libreria, (2) sequenziamento e (3) analisi dei dati. Durante la preparazione della libreria, i filamenti di DNA devono essere frammentati in frammenti di DNA di una certa lunghezza. La sonicazione è una delle tecniche preferite per frammentare il DNA.
Durante il processo di sequenziamento del DNA, l'ordine dei nucleotidi nel DNA – noto come sequenza dell'acido nucleico - è determinato. La sequenza dell'acido nucleico è composta da quattro basi nucleotidiche - adenina, citosina, guanina, timina – quale codice per informazioni.
Il sequenziamento di prossima generazione sta guidando la ricerca nelle scienze della vita e nella medicina personalizzata, dato che il sequenziamento del DNA e dell'RNA sono molto usati nella ricerca genomica, nella ricerca sul cancro, nella ricerca di malattie rare e complesse, nella ricerca microbica, nell'agrigenomica e in molti altri campi di ricerca.
Sequenziamento di nuova generazione vs. sequenziamento Sanger
Mentre con il Next Generation Sequencing (NGS) è possibile sequenziare un numero enorme di campioni genomici, il Sanger Sequencing (noto anche come metodo di terminazione a catena o First Generation Sequencing) ha solo la capacità di sequenziare un piccolo numero di campioni. Il sequenziamento Sanger sequenzia solo un singolo frammento di DNA alla volta e può essere realizzato in un solo giorno. Grazie alla sua accuratezza, il sequenziamento Sanger è anche considerato la tecnologia gold-standard, che viene utilizzata per verificare i risultati ottenuti dal sequenziamento di prossima generazione.
Il sequenziamento Sanger raggiunge lunghezze di lettura di circa 800 bp (tipicamente 500-600 bp con DNA non arricchito). Le lunghezze di lettura più lunghe nel sequenziamento Sanger mostrano vantaggi significativi rispetto ad altri metodi di sequenziamento soprattutto in termini di sequenziamento di regioni ripetitive del genoma. Una sfida di dati di sequenza a lettura breve è particolarmente un problema nel sequenziamento di nuovi genomi (de novo) e nel sequenziamento di segmenti di genoma altamente riarrangiati, tipicamente quelli visti di genomi di cancro o in regioni di cromosomi che mostrano variazioni strutturali. [cp. Morozova e Marra, 2008]
Hielscher Ultrasonics produce omogeneizzatori a ultrasuoni ad alte prestazioni da laboratorio a dimensione industriale.