Frammentazione dell'alfa-sinucleina con il sonicatore VialTweeter
Le fibrille e i nastri di α-sinucleina vengono frammentati nella ricerca scientifica per generare frammenti di fibrille più piccoli o addirittura singole molecole proteiche, che possono essere analizzate più facilmente con varie tecniche sperimentali. Il sonicatore VialTweeter è uno degli ultrasuoni più utilizzati per una frammentazione efficiente e affidabile dell'alfa-sinucleina.
L'α-sinucleina nella ricerca
Le fibrille di alfa-sinucleina sono aggregati proteici fortemente associati a disturbi neurodegenerativi come la malattia di Parkinson e alcune forme di demenza, tra cui la demenza a corpi di Lewy. La ricerca sulle fibrille di alfa-sinucleina mira a comprendere il loro ruolo nella progressione della malattia e a sviluppare potenziali interventi terapeutici. Scomponendo le fibrille di alfa-sinucleina in frammenti più piccoli, i ricercatori possono studiarne le caratteristiche strutturali specifiche. Per esempio, frammentare le fibrille di alfa-sinucleina consente ai ricercatori di studiare le loro interazioni con altre molecole, come proteine, lipidi o piccole molecole. Producendo frammenti più piccoli, i siti di legame e l'affinità per questi partner interagenti possono essere sondati in modo più efficace. Le fribrille e i nastri di α-Syn più piccoli possono anche mostrare effetti tossici e biochimici alterati. Pertanto, una tecnica di frammentazione affidabile ed efficiente, che produca risultati riproducibili con un trattamento rapido e semplice dei campioni, è fondamentale.
Frammentazione alfa-sinergica a ultrasuoni: Il sonicatore VialTweeter è l'affermato sistema di preparazione dei campioni a ultrasuoni che sonicchia fino a 10 fiale contemporaneamente esattamente alle stesse condizioni. Le impostazioni programmabili consentono di ripetere in modo semplice e rapido gli stessi esperimenti, ottenendo risultati altamente affidabili e riproducibili nella frammentazione delle fibrille di alfa-sinucleina.
Sonicatore VialTweeter per la frammentazione ultrasonica simultanea di più campioni di alfa-sinucleina.
Preparazione del campione di α-sinucleina con un sonicatore
Un approccio allo studio delle fibrille di alfa-sinucleina prevede la loro estrazione e frammentazione mediante tecniche come la sonicazione. La sonicazione è un processo che utilizza onde ultrasoniche ad alta intensità e bassa frequenza per disgregare e rompere gli aggregati proteici, portando al rilascio di fibrille più piccole o di singole molecole proteiche. Il sonicatore VialTweeter è un dispositivo comunemente utilizzato a questo scopo negli studi di ricerca sulla α-sinucleina.
Numerosi studi di ricerca descrivono precisi protocolli di preparazione del campione per la sonicazione delle fibrille di alfa-sinucleina, che utilizzano il VialTweeter di Hielscher per una frammentazione efficiente e affidabile delle fibrille di α-sinucleina. Frammentando le fibrille con gli ultrasuoni, i ricercatori possono analizzare i prodotti risultanti ed esaminarne la struttura, la tossicità e le interazioni con altre molecole. Questa ricerca fornisce importanti indicazioni sui meccanismi alla base della neurodegenerazione e potenzialmente identifica nuovi bersagli terapeutici. I protocolli di sonicazione dell'α-sinucleina ben consolidati che utilizzano il sonicatore VialTweeter consentono di ottenere risultati affidabili e riproducibili.
Immagini superiori: fibrille di alfa-sinucleina non frammentate.
Immagini inferiori: Fibrille di alfa-sinucleina frammentate ad ultrasuoni con il sonicatore VialTweeter
(studio e immagini: ©Dieriks et al., 2022)
Frammentazione ultrasonica delle fibrille di α-sinucleina – Protocolli
Poiché numerosi ricercatori utilizzano il sonicatore VialTweeter come tecnica di frammentazione preferita per produrre frammenti uniformi di fibrille di α-sinucleina, sono prontamente disponibili protocolli consolidati. Di seguito sono riportati alcuni protocolli di frammentazione esemplari.
Preparazione del seme ClearTau: Le fibrille di ClearTau sono state diluite a 10 μM in dH2O e sonicate al 70% di ampiezza per 50 s con un ciclo di 1 s ON 1 s OFF in provetta utilizzando il sonicatore UP200St con VialTweeter. I semi sono stati caratterizzati mediante microscopia elettronica.
Misura della fluorescenza di ThS: Le fibrille di ClearTau sono state diluite a 2,5 μM in dH2O e sonicate al 70% di ampiezza per 50 s con un ciclo di 1 s ON 1 s OFF in provetta utilizzando UP200St con VialTweeter. 2,5 μM di monomero Tau 4R2N completo sono stati utilizzati come controllo. Alla reazione di 100 μl sono stati aggiunti 100 μl di ThS (10 μM), ottenendo concentrazioni finali di proteine di 1,25 μM. La fluorescenza di ThS in un singolo punto è stata misurata utilizzando piastre a 96 pozzetti con fondo trasparente, allestite con il lettore di micropiastre FLUOstar Omega con eccitazione a 445 nm ed emissione a 485 nm.
(cfr. Limorenko et al., 2023)
Lunghezza uniforme dell'α-sinucleina mediante sonicazione: L'eterogeneità della lunghezza delle fibrille e dei nastri di α-syn è stata ridotta mediante sonicazione per 20 minuti in ghiaccio in provette Eppendorf da 2 ml in un VialTweeter impostato al 75% di ampiezza, con impulsi di 0,5 secondi.
(cfr. Bousset et al., 2013)
È stato effettuato il controllo di qualità dell'a-Syn ricombinante monomerico umano WT o S129A e dei polimorfi fibrillari da essi generati, nonché di a-Syn 1-110. Successivamente, i polimorfi fibrillari sono stati frammentati mediante sonicazione per 20 minuti in provette Eppendorf da 2 ml nell'ultrasuonatore VialTweeter per generare particelle fibrillari con una dimensione media di 42-52 nm adatte all'endocitosi.
(cfr. Shrivastava et al., 2020)
Caratterizzazione di cinque polimorfi fibrillari di α-Syn. (A) Sono mostrate le micrografie elettroniche a trasmissione delle fibrille, dei nastri, delle fibrille-91, delle fibrille-65 e delle fibrille-110 dei polimorfi fibrillari di α-Syn colorati negativamente prima (corsia superiore) e dopo la frammentazione con il VialTweeter (corsia inferiore). (B) È mostrata la distribuzione della lunghezza dei polimorfi fibrillari frammentati. È indicato il numero (n) di assemblaggi fibrillari da cui sono stati ricavati gli istogrammi.
(studio e immagini: Shrivastava et al., 2020)
Le fibrille di α-Syn sono state frammentate mediante sonicazione per 20 minuti in provette Eppendorf da 2 ml in un VialTweeter per generare particelle fibrillari con una dimensione media di 42-52 nm come valutato dall'analisi TEM.
(cfr. Negrini et al., 2022)
Le fibrille risospese91 (in PBS) sono state frammentate prima dell'aggiunta alle colture cellulari mediante sonicazione per 20 minuti in provette Eppendorf da 2 mL utilizzando il sonicatore Vial Tweeter, aliquotate, congelate in azoto liquido e conservate fino all'uso a -80 ̊C.
(cfr. Vajhøj et al., 2021)
Sonicator UIP400MTP per la frammentazione delle fibrille di alfa-sinucleina in piastre a pozzetti multipli.
VialTweeter e Sonicatori da laboratorio per la frammentazione di α-Syn
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La tabella seguente fornisce un'indicazione della capacità di trattamento approssimativa dei nostri ultrasuoni da laboratorio:
| Dispositivi raccomandati | Volume di batch | Portata |
|---|---|---|
| UIP400MTP | piastre multipozzetto / microtitolazione | n.a. |
| Coccodrillo a ultrasuoni | CupHorn per fiale o becher | n.a. |
| GDmini2 | Reattore a microflusso a ultrasuoni | n.a. |
| VialTweeter | 0,5-1,5 mL | n.a. |
| UP100H | 1 - 500mL | 10 - 200mL/min |
| UP200Ht, UP400St | 10 - 2000mL | 20 - 400mL/min |
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Il VialTweeter è comunemente utilizzato per frammentare la fibrilla di alfa-sinucleina come fase di preparazione del campione pre-analitico.
Letteratura / Riferimenti
- Emil Dandanell Agerschou, Marie P. Schützmann, Nikolas Reppert, Michael M. Wördehoff, Hamed Shaykhalishahi, Alexander K. Buell, Wolfgang Hoyer (2021): β-Turn exchanges in the α-synuclein segment 44-TKEG-47 reveal high sequence fidelity requirements of amyloid fibril elongation. Biophysical Chemistry, Volume 269, 2021.
- Bousset, L., Pieri, L., Ruiz-Arlandis, G. et al. (2013): Structural and functional characterization of two alpha-synuclein strains. Nature Communications 4, 2575 (2013).
- Vajhøj, Charlott; Schmid, Benjamin; Alik, Ania; Melki, Ronald; Fog, Karina; Holst, Bjørn; Stummann, Tina (2021): Establishment of a human induced pluripotent stem cell neuronal model for identification of modulators of A53T α-synuclein levels and aggregation. PLOS ONE 16, 2021.
- Dieriks B.V.; Highet B.; Alik A.; Bellande T.; Stevenson T.J.; Low V.; Park T.I.; Correia J.; Schweder P.; Faull R.L.M.; Melki R.; Curtis M.A.; Dragunow M. (2022): Human pericytes degrade diverse α-synuclein aggregates. PLoS One, Nov 18;17(11), 2022.
- Amulya Nidhi Shrivastava, Luc Bousset, Marianne Renner, Virginie Redeker, Jimmy Savistchenko, Antoine Triller, Ronald Melki (2020): Differential Membrane Binding and Seeding of Distinct α-Synuclein Fibrillar Polymorphs. Biophysical Journal, Volume 118, Issue 6, 2020. 1301-1320.
- Negrini M, Tomasello G, Davidsson M, Fenyi A, Adant C, Hauser S, Espa E, Gubinelli F, Manfredsson FP, Melki R, Heuer A. (2022): Sequential or Simultaneous Injection of Preformed Fibrils and AAV Overexpression of Alpha-Synuclein Are Equipotent in Producing Relevant Pathology and Behavioral Deficits. Journal of Parkinsons Disease 12(4), 2022. 1133-1153.
- Limorenko G, Tatli M, Kolla R, Nazarov S, Weil MT, Schöndorf DC, Geist D, Reinhardt P, Ehrnhoefer DE, Stahlberg H, Gasparini L, Lashuel HA (2023): Fully co-factor-free ClearTau platform produces seeding-competent Tau fibrils for reconstructing pathological Tau aggregates. Nature Communications 4;14(1), July 2023.
Domande frequenti
L'alfa-sinucleina è un amiloide?
Sì, l'alfa-sinucleina può formare fibrille di tipo amiloide. È un componente chiave dei corpi di Lewy, il segno distintivo patologico della malattia di Parkinson e di altre sinucleinopatie. La sua aggregazione segue un processo di polimerizzazione dipendente dalla nucleazione, simile a quello delle amiloidi classiche.
Qual è la differenza tra amiloide-beta e alfa-sinucleina?
L'amiloide-beta (Aβ) e l'alfa-sinucleina (α-syn) sono proteine distinte che formano aggregati patologici nelle malattie neurodegenerative. L'Aβ, derivata dalla proteina precursore dell'amiloide (APP), è principalmente associata alla malattia di Alzheimer e forma placche extracellulari. L'α-syn, invece, è una proteina neuronale presinaptica che si aggrega a livello intracellulare nel morbo di Parkinson e nei disturbi correlati. Sebbene entrambe presentino strutture amiloidi ricche di fogli β, differiscono per le sequenze, le vie di aggregazione e la patologia specifica della malattia.
Che tipo di proteina è l'amiloide?
L'amiloide è una proteina fibrillare mal ripiegata che adotta una struttura a foglietti incrociati e si aggrega in fibrille insolubili. Queste proteine derivano tipicamente da precursori normalmente solubili che subiscono cambiamenti conformazionali che portano all'autoassemblaggio e alla deposizione. Gli amiloidi sono associati a varie malattie neurodegenerative e sistemiche, in cui la loro aggregazione contribuisce alla tossicità cellulare e al danno tissutale. Scoprite come il sonicatore per piastre da 96 pozzetti UIP400MTP aiuta a formare rapidamente fibrille amiloidi standardizzate per scopi di ricerca!
Quali malattie sono causate dalle amiloidi?
Gli amiloidi sono implicati in numerose malattie, definite collettivamente amiloidosi. Queste includono:
- Malattie neurodegenerative: Malattia di Alzheimer (Aβ), malattia di Parkinson (α-syn), malattia di Huntington (huntingtina mutante) e malattie da prioni (PrPSc). (Per saperne di più sulla PMCA assistita da sonicazione per il rilevamento dei prioni ad alta produttività!)
- Amiloidosi sistemiche: Amiloidosi a catena leggera (AL), amiloidosi da transtiretina (ATTR) e amiloidosi secondaria (AA).
- Amiloidosi localizzate: Il polipeptide amiloide dell'isolotto (IAPP) nel diabete di tipo 2.
Ogni malattia associata all'amiloide è caratterizzata da misfolding, aggregazione e deposito di proteine, con conseguente disfunzione e tossicità cellulare.
Hielscher Ultrasonics produce omogeneizzatori a ultrasuoni ad alte prestazioni da laboratorio a dimensioni industriali.