Frammentazione dell’alfa-sinucleina con il sonicatore VialTweeter

Nella ricerca scientifica, le fibrille e i nastri di α-sinucleina vengono frammentati per generare frammenti fibrillari più piccoli o persino singole molecole proteiche, che possono essere analizzati più facilmente mediante varie tecniche sperimentali. Il sonicatore VialTweeter è uno dei sonicatori più comunemente utilizzati per una frammentazione efficiente e affidabile dell’alfa-sinucleina.

L’α-sinucleina nella ricerca

Le fibrille di alfa-sinucleina sono aggregati proteici fortemente associati a malattie neurodegenerative come la malattia di Parkinson e alcune forme di demenza, tra cui la demenza a corpi di Lewy. La ricerca sulle fibrille di alfa-sinucleina mira a comprenderne il ruolo nella progressione della malattia e a sviluppare potenziali interventi terapeutici. Scomponendo le fibrille di alfa-sinucleina in frammenti più piccoli, i ricercatori possono studiarne le caratteristiche strutturali specifiche. Ad esempio, la frammentazione delle fibrille di alfa-sinucleina consente ai ricercatori di studiarne le interazioni con altre molecole, come proteine, lipidi o piccole molecole. Producendo frammenti più piccoli, è possibile esaminare più efficacemente i siti di legame e l’affinità per queste molecole interagenti. Le fibrille e i nastri di α-Syn più piccoli possono inoltre presentare una tossicità ed effetti biochimici alterati. È quindi fondamentale disporre di una tecnica di frammentazione affidabile ed efficiente, che produca risultati riproducibili mediante un trattamento dei campioni rapido e semplice.
Frammentazione di Alpha-Syn mediante ultrasuoni: Il sonicatore VialTweeter è il consolidato sistema di preparazione dei campioni a ultrasuoni che sottopone a sonicazione fino a 10 fiale contemporaneamente, esattamente nelle stesse condizioni. Le impostazioni programmabili consentono di ripetere gli stessi esperimenti in modo semplice e rapido, ottenendo risultati altamente affidabili e riproducibili nella frammentazione delle fibrille di alfa-sinucleina.

Preparazione dei campioni di α-sinucleina con un sonicatore

Un approccio allo studio delle fibrille di alfa-sinucleina prevede la loro estrazione e frammentazione mediante tecniche come la sonicazione. La sonicazione è un processo che utilizza onde ultrasoniche ad alta intensità e bassa frequenza per disgregare e scomporre gli aggregati proteici, liberando fibrille più piccole o singole molecole proteiche. Il sonicatore VialTweeter è un dispositivo comunemente utilizzato a questo scopo negli studi di ricerca sull’α-sinucleina.

Numerosi studi di ricerca descrivono protocolli precisi di preparazione dei campioni mediante sonicazione delle fibrille di alfa-sinucleina, che utilizzano Hielscher VialTweeter per una frammentazione efficiente e affidabile delle fibrille di α-sinucleina. Frammentando le fibrille mediante ultrasuoni, i ricercatori possono analizzare i prodotti risultanti ed esaminarne la struttura, la tossicità e le interazioni con altre molecole. Questa ricerca fornisce importanti informazioni sui meccanismi alla base della neurodegenerazione e può identificare nuovi bersagli terapeutici. I protocolli consolidati di sonicazione dell’α-sinucleina con il sonicatore VialTweeter consentono di ottenere risultati affidabili e riproducibili.

Immagini superiori: fibrille di alfa-sinucleina non frammentate
Immagini inferiori: fibrille di alfa-sinucleina frammentate mediante ultrasuoni con il sonicatore VialTweeter
(studio e immagini: ©Dieriks et al., 2022)

Frammentazione a ultrasuoni delle fibrille di α-sinucleina – Protocolli

Poiché numerosi ricercatori utilizzano il sonicatore VialTweeter come tecnica di frammentazione preferita per produrre frammenti uniformi di fibrille di α-sinucleina, sono facilmente disponibili protocolli consolidati. Di seguito sono riportati alcuni esempi di protocolli di frammentazione.
 

 
Preparazione dei semi di nucleazione ClearTau: Le fibrille ClearTau sono state diluite a 10 μM in dH2O e sottoposte a sonicazione al 70 % di ampiezza per 50 s, con un ciclo di 1 s ON e 1 s OFF, all’interno della provetta utilizzando il sonicatore UP200St con VialTweeter. I semi di nucleazione sono stati caratterizzati mediante microscopia elettronica.
Misurazione della fluorescenza ThS: Le fibrille ClearTau sono state diluite a 2,5 μM in dH2O e sottoposte a sonicazione al 70 % di ampiezza per 50 s, con un ciclo di 1 s ON e 1 s OFF, all’interno della provetta utilizzando UP200St con VialTweeter. Come controllo è stato utilizzato il monomero Tau 4R2N a lunghezza intera a 2,5 μM. Alla reazione da 100 μl sono stati aggiunti 100 μl di ThS (10 μM), ottenendo concentrazioni proteiche finali di 1,25 μM. La fluorescenza ThS è stata misurata in un singolo punto temporale utilizzando piastre a 96 pozzetti con fondo trasparente inserite nel lettore di micropiastre FLUOstar Omega, con eccitazione a 445 nm e registrazione dell’emissione a 485 nm.
(cfr. Limorenko et al., 2023)
 
Lunghezza uniforme dell’α-sinucleina mediante sonicazione: L’eterogeneità della lunghezza delle fibrille e dei nastri di α-syn è stata ridotta mediante sonicazione per 20 min su ghiaccio, in provette Eppendorf da 2-ml, in un VialTweeter impostato al 75% di ampiezza, con impulsi di 0,5 s.
(cfr. Bousset et al., 2013)
 
È stato eseguito il controllo di qualità dell’a-Syn umana ricombinante monomerica WT o S129A e dei polimorfi fibrillari da essa generati, nonché dell’a-Syn 1–110. Successivamente, i polimorfi fibrillari sono stati frammentati mediante sonicazione per 20 min in provette Eppendorf da 2-mL nel sonicatore VialTweeter, per generare particelle fibrillari con dimensioni medie di 42–52 nm, adatte all’endocitosi.
(cfr. Shrivastava et al., 2020)
 

Caratterizzazione di cinque polimorfi fibrillari di α-Syn. (A) Sono mostrate micrografie elettroniche a trasmissione dei polimorfi fibrillari di α-Syn fibrille, nastri, fibrille-91, fibrille-65 e fibrille-110, sottoposti a colorazione negativa, prima (fila superiore) e dopo la frammentazione con VialTweeter (fila inferiore). (B) È mostrata la distribuzione delle lunghezze dei polimorfi fibrillari frammentati. È indicato il numero (n) di assemblaggi fibrillari da cui sono stati ricavati gli istogrammi.
(studio e immagini: Shrivastava et al., 2020)

 
Le fibrille di α-Syn sono state frammentate mediante sonicazione per 20 min in provette Eppendorf da 2 ml in un VialTweeter, per generare particelle fibrillari con dimensioni medie di 42–52 nm, valutate mediante analisi TEM.
(cfr. Negrini et al., 2022)
 
Le fibrille91 risospese (in PBS) sono state frammentate prima dell’aggiunta alle colture cellulari mediante sonicazione per 20 min in provette Eppendorf da 2 mL utilizzando il sonicatore Vial Tweeter, suddivise in aliquote, congelate rapidamente in azoto liquido e conservate fino all’uso a -80 ̊C.
(cfr. Vajhøj et al., 2021)
 

VialTweeter e sonicatori da laboratorio per la frammentazione di α-Syn

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