PMCA per la rilevazione ad alta produttività di prioni con il sonicatore UIP400MTP

Il sonicatore per piastre multipozzetto UIP400MTP offre una soluzione potente per la preparazione di campioni ad alta produttività nell'amplificazione ciclica del misfolding proteico (PMCA). Grazie alla distribuzione uniforme dell'energia su più pozzetti e al mantenimento di precisi parametri di sonicazione, questo sistema consente l'elaborazione simultanea di numerosi campioni con un'eccezionale riproducibilità. Queste capacità sono fondamentali per ottimizzare la PMCA per rilevare i prioni a basse concentrazioni in campioni biologici difficili, come la saliva, dove gli inibitori del saggio possono oscurare i risultati.

Le malattie da prioni, come la malattia da deperimento cronico (CWD) nei cervidi e la malattia di Creutzfeldt-Jakob (CJD) nell'uomo, sono disturbi neurodegenerativi causati da proteine prioniche mal ripiegate (PrP^Sc). Queste malattie spesso comportano bassi livelli di prioni infettivi nei fluidi corporei, come saliva, sangue e urina, complicando la diagnosi e la ricerca. La trasmissione orizzontale della CWD attraverso i prioni dispersi nelle matrici ambientali ha implicazioni particolarmente significative per la gestione della fauna selvatica e la salute ecologica. Allo stesso modo, in malattie come la malattia di Creutzfeldt-Jakob, l'amplificazione affidabile di proteine prioniche mal ripiegate da campioni umani è fondamentale per il progresso della diagnostica e la comprensione della progressione della malattia.

L'applicazione di un protocollo PMCA modificato consente di aggirare i comuni inibitori del saggio (ad esempio, le mucine nella saliva) e di ottenere un'elevata sensibilità nell'individuazione di prioni che altrimenti non sarebbero rilevabili o sarebbero ambigui utilizzando tecniche come la conversione indotta dal quaking in tempo reale (RT-QuIC). Questi progressi migliorano la rilevazione dei prioni per varie malattie, rendendo il PMCA uno strumento indispensabile per la ricerca e la diagnostica sui prioni. Il sonicatore per piastre a pozzetti multipli UIP400MTP facilita la sonicazione PMCA ad alta produttività di numerosi campioni in micropiastre (ad esempio piastre a 6, 24 o 96 pozzetti) o fiale in un rack per provette.

Protocollo per l'amplificazione ciclica del disadattamento delle proteine (PMCA) ad alto rendimento

Il seguente protocollo consente di elaborare in modo efficiente un numero elevato di campioni esattamente nelle stesse condizioni per ottenere risultati di ricerca affidabili.

preparazione del campione

Materiale di partenza:
Preparare i campioni mediante:

• Risospendere i pellet di estrazione del sarkosyl nel substrato PMCA.
• Pilotare direttamente omogenati cerebrali o campioni di sangue con semi di prioni.

Substrato:

• Utilizzare un omogenato cerebrale al 10% (wt/vol) preparato da topi transgenici che sovraesprimono la PrP^C (ad esempio, topi Tg).
• Omogeneizzare il tessuto cerebrale in:
  – 1× PBS.
  – 150 mM NaCl.
  – 1% Triton X-100.
• Conservare il substrato a -80ºC fino al momento dell'uso.

Impostazione del campione in micropiastra o in provetta:
Tubi:

• Aggiungere 90 μL di substrato di omogenato cerebrale e seminare con 10 μL di campione (ad esempio, sangue, omogenato cerebrale o pellet di sarkosyl).
• Posizionare 3 microsfere di teflon (diametro 1,59 mm o 2,38 mm) in ciascuna provetta da 0,2 mL.
• Montare le provette in un rack compatibile con il sonicatore UIP400MTP.

Micropiastra a 6 pozzetti:

• Aggiungere 5 mL di substrato di omogenato cerebrale e seminare con 500 μL di campione per pozzetto.
• Aggiungere 3 microsfere di Teflon in ogni pozzetto.

Procedura PMCA

Collocazione:
Posizionare il rack di provette o la micropiastra a 6 pozzetti nel sonicatore UIP400MTP secondo le istruzioni del produttore.

Programma ciclistico:
Eseguire 144 cicli PMCA come segue:

• Incubazione: 29 minuti e 30 secondi a 37°C.
• Sonicazione: 30 secondi al 60% di ampiezza.
• Monitoraggio della temperatura: Usare il sensore di temperatura collegabile per monitorare la temperatura del campione e programmare l'UIP400MTP a una temperatura massima di 48-50°C.

Turni successivi:
Dopo aver completato il primo ciclo di 144 cicli, trasferire un'aliquota del materiale amplificato:

• Diluire 10 volte in un substrato fresco di omogenato di cervello di topo transgenico.
• Eseguire 96 cicli PMCA per i cicli successivi, mantenendo gli stessi parametri di sonicazione.
• Continuare per il numero di giri desiderato (in genere fino a 5).

Rilevamento della PrP^Sc

1. Digestione con proteinasi K:
   – Trattare i campioni con Proteinasi K (50 μg/mL) a 37°C per 1 ora.
   – Terminare la digestione aggiungendo il tampone SDS e facendo bollire per 10 minuti.
2. Analisi del Western Blot:
   – Analizzare i campioni digeriti utilizzando:
   – 6H4 o anticorpi anti-PrP PRC1.
   – Eseguire SDS-PAGE e trasferire su membrane PVDF per la rilevazione.

 

 

Elaborazione di più campioni per risultati più robusti

Il sonicatore per piastre multipozzetto UIP400MTP migliora significativamente l'efficienza e la scalabilità dell'amplificazione ciclica del misfolding proteico (PMCA), affrontando la natura tradizionalmente lunga della procedura. Consentendo l'elaborazione simultanea di un massimo di 96 campioni in una piastra da 96 pozzetti, il sistema semplifica i flussi di lavoro PMCA mantenendo condizioni di sonicazione precise e uniformi in tutti i pozzetti. Questa capacità di alta produttività riduce al minimo la manipolazione manuale, riduce le fasi che richiedono molto lavoro e garantisce la riproducibilità, rendendolo uno strumento indispensabile per la ricerca sui prioni. Che si tratti di studi sulla malattia da deperimento cronico o sulla malattia di Creutzfeldt-Jakob, l'UIP400MTP facilita gli studi su larga scala con maggiore efficienza, consentendo ai ricercatori di soddisfare le esigenze delle moderne applicazioni diagnostiche e scientifiche.

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Letteratura / Riferimenti

• FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
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