PMCA per il rilevamento dei prioni con elevata capacità di trattamento dei campioni mediante il sonicatore UIP400MTP

Il sonicatore per piastre multipozzetto UIP400MTP offre una soluzione potente per la preparazione dei campioni con elevata capacità di trattamento nell’amplificazione ciclica del ripiegamento proteico anomalo (PMCA). Distribuendo uniformemente l’energia tra più pozzetti e mantenendo precisi parametri di sonicazione, questo sistema consente di trattare simultaneamente numerosi campioni con una riproducibilità eccezionale. Queste capacità sono fondamentali per ottimizzare la PMCA e rilevare prioni a basse concentrazioni in campioni biologici complessi, come la saliva, nei quali gli inibitori del saggio possono mascherare i risultati.

Le malattie da prioni, come la malattia del deperimento cronico (CWD) nei cervidi e la malattia di Creutzfeldt-Jakob (CJD) nell’uomo, sono patologie neurodegenerative causate da proteine prioniche con ripiegamento anomalo (PrP^Sc). Queste malattie comportano spesso bassi livelli di prioni infettivi nei fluidi corporei, come saliva, sangue e urina, complicando la diagnosi e la ricerca. La trasmissione orizzontale della CWD attraverso prioni rilasciati nelle matrici ambientali ha implicazioni particolarmente significative per la gestione della fauna selvatica e la salute degli ecosistemi. Analogamente, in malattie come quella di Creutzfeldt-Jakob, l’amplificazione affidabile delle proteine prioniche con ripiegamento anomalo a partire da campioni umani è cruciale per far progredire la diagnostica e comprendere la progressione della malattia.

L’applicazione di un protocollo PMCA modificato consente di aggirare i comuni inibitori del saggio (ad es., le mucine nella saliva) e di ottenere un’elevata sensibilità nel rilevamento dei prioni che, con tecniche come la conversione indotta da agitazione in tempo reale (RT-QuIC), risulterebbero altrimenti non rilevabili o darebbero risultati ambigui. Questi progressi migliorano il rilevamento dei prioni in diverse malattie, rendendo la PMCA uno strumento indispensabile per la ricerca e la diagnostica dei prioni. Il sonicatore per piastre multipozzetto UIP400MTP facilita la PMCA con elevata capacità di trattamento dei campioni, sonicando numerosi campioni in micropiastre (ad es. piastre da 6, 24 o 96 pozzetti) o in fiale collocate in un portaprovette.

Protocollo per l’amplificazione ciclica del ripiegamento proteico anomalo (PMCA) con elevata capacità di trattamento dei campioni

Il seguente protocollo consente di trattare in modo efficiente un elevato numero di campioni nelle medesime condizioni, per ottenere risultati di ricerca solidi.

Preparazione dei campioni

Materiale di partenza:
Preparare i campioni mediante:

• Risospensione dei pellet ottenuti dall’estrazione con sarkosyl nel substrato PMCA.
• Aggiunta diretta di semi prionici agli omogenati cerebrali o ai campioni di sangue.

Substrato:

• Utilizzare un omogenato cerebrale al 10% (peso/volume) preparato da topi transgenici che sovraesprimono PrP^C (ad es., topi Tg).
• Omogeneizzare il tessuto cerebrale in:
  – PBS 1×.
  – NaCl 150 mM.
  – Triton X-100 all’1%.
• Conservare il substrato a -80ºC fino all’utilizzo.

Allestimento dei campioni in micropiastra o in provette:
Provette:

• Aggiungere 90 μL di substrato di omogenato cerebrale e inoculare con 10 μL di campione (ad es., sangue, omogenato cerebrale o pellet di sarkosyl).
• Inserire 3 sfere di Teflon (diametro di 1,59 mm o 2,38 mm) in ciascuna provetta da 0,2 mL.
• Collocare le provette in un portaprovette compatibile con il sonicatore UIP400MTP.

Micropiastra da 6 pozzetti:

• Aggiungere 5 mL di substrato di omogenato cerebrale e inoculare con 500 μL di campione per pozzetto.
• Aggiungere 3 sfere di Teflon a ciascun pozzetto.

Procedura PMCA

Posizionamento:
Collocare il portaprovette o la micropiastra da 6 pozzetti nel sonicatore UIP400MTP secondo le istruzioni del produttore.

Programma dei cicli:
Eseguire 144 cicli PMCA come segue:

• Incubazione: 29 minuti e 30 secondi a 37°C.
• Sonicazione: 30 secondi con un’ampiezza del 60%.
• Monitorare la temperatura: utilizzare il sensore di temperatura collegabile per monitorare la temperatura dei campioni e programmare l’UIP400MTP per una temperatura massima di 48–50°C.

Serie successive:
Dopo aver completato la prima serie di 144 cicli, trasferire un’aliquota del materiale amplificato:

• Diluire di 10 volte in substrato fresco di omogenato cerebrale di topo transgenico.
• Eseguire 96 cicli PMCA per le serie successive, mantenendo gli stessi parametri di sonicazione.
• Proseguire per il numero desiderato di serie (in genere fino a 5).

Rilevamento di PrP^Sc

1. Digestione con proteinasi K:
   – Trattare i campioni con proteinasi K (50 μg/mL) a 37°C per 1 ora.
   – Terminare la digestione aggiungendo tampone per campioni contenente SDS e facendo bollire per 10 minuti.
2. Analisi mediante Western blot:
   – Analizzare i campioni digeriti utilizzando:
   – Anticorpi anti-PrP 6H4 o PRC1.
   – Eseguire la SDS-PAGE e il trasferimento su membrane in PVDF per il rilevamento.

 

Hielscher UIP400MTP è il sonicatore più versatile per le vostre piastre multipozzetto, piastre PCR o provette per campioni. Con una potenza di sonicazione continua di 400 watt, è progettato per applicazioni quali lisi cellulare, emulsificazione, estrazione delle proteine, frammentazione di DNA / RNA, deagglomerazione, estrazione da campioni FFPE, distacco di cellule e biofilm o emulsificazione. L’UIP400MTP non è un bagno a ultrasuoni. È un sonotrodo a coppa ad alta intensità per la sonicazione focalizzata. Questo potente sonicatore senza contatto garantisce una sonicazione uniforme in tutti i pozzetti della vostra piastra standard. Offre un controllo preciso dell’ampiezza, della potenza e del funzionamento a impulsi. Un timer integrato e una sonda di temperatura garantiscono risultati costanti. Il sonicatore per piastre UIP400MTP raffredda i campioni mediante un bagno d’acqua (refrigeratore esterno opzionale).

 

Trattare più campioni per ottenere risultati più solidi

Il sonicatore per piastre multipozzetto UIP400MTP migliora significativamente l’efficienza e la scalabilità dell’amplificazione ciclica del ripiegamento proteico anomalo (PMCA), affrontando il problema dei tempi tradizionalmente lunghi della procedura. Consentendo il trattamento simultaneo di un massimo di 96 campioni in una piastra da 96 pozzetti, il sistema semplifica i flussi di lavoro PMCA mantenendo condizioni di sonicazione precise e uniformi in tutti i pozzetti. Questa elevata capacità di trattamento dei campioni riduce al minimo la manipolazione manuale, riduce le fasi che richiedono molto lavoro e garantisce la riproducibilità, rendendolo uno strumento indispensabile per la ricerca sui prioni. Sia nello studio della malattia del deperimento cronico sia in quello della malattia di Creutzfeldt-Jakob, l’UIP400MTP facilita studi su larga scala con maggiore efficienza, consentendo ai ricercatori di soddisfare le esigenze delle moderne applicazioni diagnostiche e scientifiche.

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Letteratura / Riferimenti

• FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
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