Formazione di fibrille amiloidi mediante il sonicatore per micropiastre UIP400MTP

Le fibrille amiloidi, proprio come i cristalli, si formano attraverso un processo di nucleazione e successiva crescita. Tuttavia, a causa dell’elevata barriera di energia libera della nucleazione, la formazione spontanea di fibrille amiloidi avviene solo dopo una fase di latenza prolungata. La sonicazione si è affermata come uno strumento potente per indurre la nucleazione amiloide, accelerando così significativamente la formazione delle fibrille. In combinazione con un lettore di micropiastre che utilizza la fluorescenza della tioflavina T (ThT), la sonicazione consente di rilevare fibrille amiloidi simultaneamente in più campioni con un’elevata capacità di trattamento dei campioni.

Formazione di fibrille amiloidi indotta da ultrasuoni con il sonicatore per micropiastre UIP400MTP

Con il sonicatore per piastre multipozzetto UIP400MTP è possibile sintetizzare rapidamente grandi quantità di fibrille amiloidi di qualità uniforme per scopi di ricerca. Questo approccio efficiente consente di studiare l’amiloidogenicità delle proteine. La tecnica facilita una fibrillazione amiloide rapida e riproducibile, come dimostrato con la β2-microglobulina (β2-m), una proteina amiloidogenica associata all’amiloidosi correlata alla dialisi.

Approccio sperimentale semplice: fibrillazione amiloide indotta da ultrasuoni

Per indurre la formazione delle fibrille, una micropiastra a 96 pozzetti è stata collocata al centro del sonicatore per piastre multipozzetto UIP400MTP, che garantisce un’esposizione uniforme agli ultrasuoni in tutti i pozzetti. Le condizioni sperimentali erano le seguenti:

1. Ogni pozzetto conteneva 0,2 ml di soluzione di β2-microglobulina (0,3 mg/ml, pH 2,5) addizionata con 5 μM di ThT.
2. La piastra è stata sottoposta a cicli di sonicazione, ad esempio 1 minuto di sonicazione seguito da 9 minuti di pausa.
3. Dopo la sonicazione, la fluorescenza della ThT è stata misurata utilizzando un lettore di micropiastre.

(cfr. So et al., 2011)

Confronto con l’agitazione convenzionale

Rispetto ai metodi di agitazione tradizionali, la sonicazione ha ridotto drasticamente la fase di latenza della formazione delle fibrille. In condizioni convenzionali di agitazione delle micropiastre, solo 1 pozzetto su 10 ha mostrato un aumento della fluorescenza della ThT dopo 20 ore. Al contrario, utilizzando una sonicazione ciclica (15 minuti di sonicazione seguiti da 5 minuti di riposo), è stato rilevato un aumento significativo della fluorescenza della ThT immediatamente dopo il primo trattamento di sonicazione.

Rapida accelerazione della cinetica di fibrillazione

I risultati ottenuti da So et al. (2011) hanno dimostrato che la formazione spontanea di fibrille di β2-microglobulina a pH 2,5 può essere accelerata, passando da diverse ore a soli 10–15 minuti con la sonicazione.
Le immagini di microscopia a forza atomica (AFM) hanno confermato che le fibrille generate mediante 10 minuti di sonicazione ogni 15 minuti erano morfologicamente indistinguibili da quelle formate utilizzando 1 minuto di sonicazione ogni 10 minuti. Ciò evidenzia la riproducibilità e la robustezza della fibrillazione amiloide indotta da ultrasuoni.

Immagini AFM di fibrille amiloidi prodotte mediante sonicazione di 1 min ogni 10 min (i), sonicazione di 10 min ogni 15 min (ii) e reazione di inseminazione senza sonicazione (iii). La barra di scala bianca rappresenta 1 μm.
Studio e immagini: ©So et al., 2011

Fibrillazione in condizioni di pH neutro

Anche in condizioni di pH neutro, la formazione delle fibrille è stata ottenuta dopo un tempo di latenza di 1,5 ore, dimostrando che la sonicazione abbassa significativamente la barriera energetica alla nucleazione e alla crescita. Questo sostiene ulteriormente l’ipotesi che la fibrillazione amiloide sia principalmente una reazione fisica, in larga misura limitata dalla barriera energetica della nucleazione, che la sonicazione riduce efficacemente.

Impatto sulla ricerca sulle malattie correlate all’amiloide

La formazione semplice e affidabile di fibrille amiloidi mediante il sonicatore per micropiastre UIP400MTP ha implicazioni significative per la ricerca sulla malattia di Alzheimer (AD) e su altre patologie correlate all’amiloide, come la malattia di Parkinson, il diabete di tipo II e le amiloidosi sistemiche. Nell’AD, l’aggregazione dell’amiloide-β (Aβ) è un tratto patologico distintivo fondamentale, ma lo studio della sua cinetica di fibrillazione rimane difficile a causa delle lunghe fasi di latenza e della variabilità dei metodi convenzionali. La formazione di fibrille indotta dalla sonicazione accelera la nucleazione, garantendo un’elevata riproducibilità e una variabilità ridotta, aspetti cruciali per lo screening di potenziali inibitori e la comprensione dei meccanismi amiloidogenici. Inoltre, l’elevata capacità di trattamento dei campioni dell’UIP400MTP consente indagini su larga scala sul ripiegamento errato e sull’aggregazione delle proteine, facilitando la scoperta di agenti terapeutici in grado di modulare la formazione delle fibrille e potenzialmente attenuare la progressione neurodegenerativa.

Questo studio dimostra che la sonicazione mediante il sonicatore per piastre multipozzetto UIP400MTP è un metodo altamente efficiente per accelerare la formazione di fibrille amiloidi. I principali vantaggi di questo approccio includono:

• Drastica riduzione del tempo di latenza della fibrillazione.
• Esposizione uniforme agli ultrasuoni in tutti i pozzetti, che consente una formazione riproducibile delle fibrille.
• Capacità di screening ad alta produttività, che lo rende adatto a ricerche sull’amiloidogenicità delle proteine su scala genomica.

Integrando la sonicazione con il rilevamento della fluorescenza della ThT, questo metodo fornisce una piattaforma rapida, scalabile e affidabile per lo studio della fibrillazione amiloide. Grazie alla sua efficienza e al suo potenziale di elevata capacità di trattamento dei campioni, questo approccio può facilitare la sintesi semplice di fibrille amiloidi per la ricerca biofisica e farmaceutica, offrendo uno strumento promettente per gli studi correlati all’amiloide e lo screening di farmaci.