Flussi di lavoro proteomici con digestione delle proteine ad alta produttività

La proteomica è un campo essenziale per la comprensione dei processi e dei sistemi biologici e la digestione delle proteine costituisce una fase critica dei suoi flussi di lavoro. Tradizionalmente, la digestione delle proteine viene effettuata in soluzione utilizzando enzimi proteolitici come la tripsina, che idrolizza specificamente i legami peptidici in corrispondenza dei residui di lisina e arginina. Questo processo genera peptidi ben adatti alla ionizzazione e alla frammentazione in applicazioni di spettrometria di massa (MS). Tuttavia, i metodi di digestione convenzionali richiedono 12-24 ore per essere completati, creando notevoli colli di bottiglia nei flussi di lavoro proteomici.
L'ultrasuonoterapia offre una potente alternativa, riducendo drasticamente i tempi di digestione da ore a pochi minuti. Se combinata con sonicatori avanzati multi-campione come Hielscher CupHorn, VialTweeter e il sonicatore per piastre a 96 pozzetti UIP400MTP, l'ultrasonicazione consente di accelerare la proteomica ad alto rendimento. Queste tecnologie semplificano i flussi di lavoro, riducendo i tempi di preparazione dei campioni e aumentando l'efficienza senza compromettere la riproducibilità o la qualità dei dati.

Il ruolo degli ultrasuoni nella digestione delle proteine

L'ultrasuonoterapia impiega onde ultrasonore focalizzate per creare microbolle localizzate in cavitazione che collassano generando intense forze di taglio. Questo fenomeno aumenta il trasferimento di massa, favorisce la miscelazione degli enzimi con i substrati e dispiega le strutture proteiche, esponendo i siti di scissione agli enzimi proteolitici come la tripsina.
Il risultato? Una riduzione significativa del tempo di digestione senza compromettere l'efficienza o la riproducibilità.

Digestione proteolitica potenziata dagli ultrasuoni: Metodologia e risultati

Protocollo di digestione accelerata

La digestione assistita da ultrasuoni combina enzimi proteolitici ed energia ultrasonica per accelerare i flussi di lavoro. Ad esempio, utilizzando l'Hielscher UP200St-CupHorn (200 W, 26 kHz), il flusso di lavoro della digestione procede come segue:

1. Riduzione: I campioni di proteine (0,5 mg/mL, 20 µL) vengono trattati con DTT (2 µL, 110 mM) in tampone bicarbonato di ammonio (12,5 mM). La sonicazione viene applicata al 50% di ampiezza per 5 minuti.
2. Alchilazione: Dopo l'aggiunta di IAA (2 µL, 400 mM), la sonicazione viene ripetuta nelle stesse condizioni.
3. Digestione: I campioni vengono diluiti e incubati con nanoparticelle di tripsina immobilizzate. Un ciclo finale di sonicazione (5 minuti) completa la digestione. I peptidi vengono separati, essiccati e conservati per l'analisi MS.

Questo metodo a ultrasuoni riduce il tempo totale di preparazione da 12 ore a meno di 30 minuti. Nonostante il processo accelerato, la resa e la qualità dei peptidi rimangono in linea con i metodi tradizionali overnight.

Efficienza della digestione delle proteine a ultrasuoni

In studi comparativi che utilizzano i proteomi di E. coli:

• Identificazione della proteina: I campioni digeriti a ultrasuoni hanno identificato 777 proteine in 5 minuti, rispetto alle 817 di 12 ore. Le identificazioni di proteine condivise hanno superato il 70%.
• Riproducibilità: Le analisi replicate hanno mostrato valori di correlazione superiori al 98% per ciascun metodo, dimostrando l'affidabilità.
• Selettività: Alcune proteine sono state digerite in modo preferenziale da ciascun metodo, con la digestione a ultrasuoni che ha favorito 65 proteine e la digestione notturna 54 proteine. Queste differenze sfumate sottolineano il potenziale unico dell'ultrasuoni per applicazioni specifiche.

Risultati della quantificazione proteica senza etichetta di sette proteine spiked in un E. coli
campione. Le seguenti proteine sono state aggiunte a due livelli diversi, come indicato nella colonna
denominato "Theo Ratio". Il Theo Ratio è il rapporto teorico tra i due livelli utilizzato in questo
esperimento. Sieroalbumina bovina (ALBU), β-lattoglobulina (LACB), α-S1 caseina (CASA1),
α-S2 caseina (CASA2), citocromo c (CYC), ovalbumina (OVAL) e anidrasi carbonica 2
(CAH2). I rapporti sono stati calcolati utilizzando le intensità delle proteine LFQ ottenute da MaxQuant.
analysis. The student’s t test was applied to compare the values obtained with each method (p>0.01, n=3, t-theoretical=4.6).
Studio e grafica: © Martins et al., 2019)

Tripsina immobilizzata in nanoparticelle

L'integrazione di nanoparticelle di tripsina immobilizzate (ad esempio, T-FMNPs) con gli ultrasuoni migliora ulteriormente i flussi di lavoro della proteomica. Queste nanoparticelle offrono un'elevata area superficiale per le interazioni enzima-substrato, aumentando l'efficienza. Applicato a proteomi complessi, come quello di E. coli, il metodo combinato consente di ottenere:

• Velocità: Digestione completa in 5 minuti.
• Precisione: Comparable protein quantification to traditional methods (p > 0.01, n=3).
• Scalabilità: L'adattamento a piattaforme multipozzetto come la UIP400MTP consente un'elaborazione ad alta produttività.

Cliccate qui per il protocollo dettagliato con istruzioni passo-passo!
(cfr. Martins et al., 2019)

Digestione proteolitica ad alta velocità e ad alto rendimento con i sonicatori Hielscher

I migliori modelli di sonicatori per la proteomica

Hielscher Ultrasonics offre diversi modelli di sonicatori per la preparazione simultanea di più campioni, facilitando i flussi di lavoro ad alta produttività. Sia che si lavori con fiale, provette, piastre a più pozzetti (ad es. piastre a 6, 24, 96 pozzetti) o piastre di Petri – vi offriamo i sonicatori ideali per i vostri esperimenti.

UIP400MTP Sonicatore per piastre a pozzetti multipli

Per ottenere la massima produttività, l'UIP400MTP è in grado di processare a ultrasuoni piastre a 96 pozzetti. Compatibile con qualsiasi micropiastra standard, l'UIP400MTP non richiede costosi materiali monouso proprietari e offre la libertà di scegliere la piastra multipozzetto più adatta alla propria ricerca. Fornendo energia uniforme su tutta la piastra, consente di ridurre, alchilare e digerire rapidamente fino a 200 proteomi complessi in appena un'ora. Questo livello di automazione ed efficienza è fondamentale per la proteomica ad alto rendimento e per le applicazioni cliniche. Per saperne di più sul sonicatore per piastre multipozzetto!

VialTweeter

Il VialTweeter è stato progettato per i laboratori che richiedono la sonicazione simultanea di un massimo di 10 fiale o provette. Il suo approccio non invasivo elimina i rischi di contaminazione incrociata e garantisce una digestione riproducibile delle proteine. Questo dispositivo è ideale per i ricercatori che lavorano con volumi di campioni limitati o con tipi di campioni diversi.
Per saperne di più sul sonicatore multi-tubo VialTweeter!

Hielscher UP200St-Cuffia

Il sonicatore CupHorn è un potente dispositivo progettato per il trattamento simultaneo di più campioni in contenitori sigillati. Assicura una distribuzione uniforme dell'energia ultrasonica e un controllo preciso della temperatura. La capacità di processare fino a cinque campioni contemporaneamente, unita alla compatibilità con flussi di lavoro ridotti, alchilati e digeriti, rende CupHorn uno strumento affidabile per la proteomica basata sulla MS.
Per saperne di più sul SonoReactor di CupHorn!

Protocollo passo-passo per la digestione proteolitica assistita da ultrasuoni utilizzando la tripsina immobilizzata con nanoparticelle

Questo protocollo di Martins et al. (2019) è ottimizzato per la digestione rapida delle proteine utilizzando energia ultrasonica e tripsina immobilizzata con nanoparticelle (T-FMNPs). Le fasi descritte garantiscono una riduzione, un'alchilazione e una proteolisi efficienti, adatte alle applicazioni di spettrometria di massa (MS).
Fasi del protocollo

1. Riduzione dei legami disolfuro
   • Aggiungere 2 µL di soluzione di DTT (110 mM) a 20 µL di campione proteico (0,5 mg/mL) in tampone AmBic.
   • Posizionare la provetta di campione nel sonoreattore UP200St-CupHorn.
   • Sonicare il campione per 2,5 minuti al 50% di ampiezza (200 W, 26 kHz).
   • Fare una breve pausa per consentire il raffreddamento, quindi sonicare per altri 2,5 minuti alle stesse condizioni.
2. Alchilazione dei residui di cisteina ridotti
   • Aggiungere 2 µL di soluzione di IAA (400 mM) al campione di proteine ridotte.
   • Sonicare per 2,5 minuti al 50% di ampiezza per facilitare l'alchilazione.
   • Fare una pausa per il raffreddamento, quindi sonicare per altri 2,5 minuti.

   Nota: ridurre al minimo l'esposizione del campione alchilato alla luce per evitare la degradazione dell'IAA.

3. Diluizione del campione
   • Diluire il campione proteico alchilato a un volume finale di 100 µL utilizzando un tampone AmBic 25 mM contenente il 4% di acetonitrile (v/v).
   • Miscelare accuratamente con un leggero pipettaggio.
4. Digestione proteolitica con tripsina immobilizzata in nanoparticelle
   • Aggiungere 20 µL di soluzione T-FMNP (3 mg/mL) al campione proteico diluito.
   • Sonicare la miscela nel sonoreattore per 2,5 minuti al 50% di ampiezza.
   • Fare una pausa per il raffreddamento, quindi sonicare per altri 2,5 minuti alle stesse condizioni.
5. Separazione delle nanoparticelle di tripsina
   • Utilizzare un magnete per separare le T-FMNP dal surnatante contenente i peptidi digeriti.
   • Trasferire il surnatante in una nuova provetta da microcentrifuga.
6. Preparazione dei peptidi per l'analisi MS
   • Asciugare il surnatante contenente i peptidi in una centrifuga a vuoto.
   • Conservare i peptidi essiccati a -20°C fino alla successiva analisi mediante spettrometria di massa.