Flussi di lavoro proteomici con digestione proteica ad alta capacità di trattamento

La proteomica è un campo essenziale per comprendere i processi e i sistemi biologici, e la digestione proteica costituisce una fase cruciale dei suoi flussi di lavoro. Tradizionalmente, la digestione proteica viene eseguita in soluzione utilizzando enzimi proteolitici come la tripsina, che idrolizza specificamente i legami peptidici in corrispondenza dei residui di lisina e arginina. Questo processo genera peptidi particolarmente adatti alla ionizzazione e alla frammentazione nelle applicazioni di spettrometria di massa (MS). Tuttavia, i metodi di digestione convenzionali richiedono 12–24 ore per completare il processo, creando notevoli colli di bottiglia nei flussi di lavoro proteomici.
La sonicazione offre una potente alternativa, riducendo drasticamente i tempi di digestione da ore a pochi minuti. Abbinata a sonicatori avanzati per più campioni, come Hielscher CupHorn, VialTweeter e il sonicatore per piastre a 96 pozzetti UIP400MTP, la sonicazione consente di accelerare le analisi proteomiche e di trattare un elevato numero di campioni. Queste tecnologie semplificano i flussi di lavoro, riducendo i tempi di preparazione dei campioni e aumentando l’efficienza senza compromettere la riproducibilità o la qualità dei dati.

Il ruolo dell’energia ultrasonica nella digestione proteica

La sonicazione impiega onde ultrasoniche focalizzate per creare cavitazione – microbolle localizzate che collassano generando intense forze di taglio. Questo fenomeno migliora il trasferimento di massa, favorisce la miscelazione degli enzimi con i substrati e provoca il dispiegamento delle strutture proteiche, esponendo i siti di scissione agli enzimi proteolitici come la tripsina.
Il risultato? Una riduzione significativa dei tempi di digestione senza compromettere l’efficienza o la riproducibilità.

Digestione proteolitica potenziata dagli ultrasuoni: metodologia e risultati

Protocollo di digestione accelerata

La digestione assistita da ultrasuoni combina enzimi proteolitici ed energia ultrasonica per accelerare i flussi di lavoro. Ad esempio, utilizzando Hielscher UP200St-CupHorn (200 W, 26 kHz), il flusso di lavoro per la digestione procede come segue:

1. Riduzione: i campioni proteici (0,5 mg/mL, 20 µL) vengono trattati con DTT (2 µL, 110 mM) in tampone bicarbonato di ammonio (12,5 mM). La sonicazione viene applicata al 50% di ampiezza per 5 minuti.
2. Alchilazione: dopo l’aggiunta di IAA (2 µL, 400 mM), la sonicazione viene ripetuta nelle stesse condizioni.
3. Digestione: i campioni vengono diluiti e incubati con nanoparticelle su cui è immobilizzata la tripsina. Un ciclo finale di sonicazione (5 minuti) completa la digestione. I peptidi vengono separati, essiccati e conservati per l’analisi MS.

Questo metodo a ultrasuoni riduce il tempo totale di preparazione da 12 ore a meno di 30 minuti. Nonostante l’accelerazione del processo, la resa e la qualità dei peptidi rimangono comparabili a quelle dei metodi tradizionali con incubazione notturna.

Efficienza della digestione proteica mediante ultrasuoni

Negli studi comparativi condotti utilizzando proteomi di E. coli:

• Identificazione delle proteine: Nei campioni digeriti mediante ultrasuoni sono state identificate 777 proteine in 5 minuti, rispetto a 817 in 12 ore. Le identificazioni proteiche comuni ai due metodi superavano il 70%.
• Riproducibilità: Le analisi replicate hanno mostrato valori di correlazione superiori al 98% all’interno di ciascun metodo, dimostrandone l’affidabilità.
• Selettività: Ciascun metodo ha digerito preferenzialmente determinate proteine: la digestione mediante ultrasuoni ha favorito 65 proteine, mentre quella con incubazione notturna ne ha favorite 54. Queste sottili differenze evidenziano il potenziale peculiare della sonicazione per applicazioni specifiche.

Risultati della quantificazione proteica senza marcatura di sette proteine aggiunte a un
campione di E. coli. Le seguenti proteine sono state aggiunte a due livelli diversi, come indicato nella colonna
denominata “Theo Ratio”. Theo Ratio è il rapporto teorico tra i due livelli utilizzati in questo
esperimento. Albumina sierica bovina (ALBU), β-lattoglobulina (LACB), caseina α-S1 (CASA1),
caseina α-S2 (CASA2), citocromo c (CYC), ovalbumina (OVAL) e anidrasi carbonica 2
(CAH2). I rapporti sono stati calcolati utilizzando le intensità proteiche LFQ ottenute dall’analisi
con MaxQuant. Il test t di Student è stato applicato per confrontare i valori ottenuti con ciascun metodo (p>0,01, n=3, t-teorico=4,6).
Studio e grafico: © Martins et al., 2019)

Tripsina immobilizzata su nanoparticelle

L’integrazione di nanoparticelle su cui è immobilizzata la tripsina (ad es. T-FMNPs) con la sonicazione migliora ulteriormente i flussi di lavoro proteomici. Queste nanoparticelle offrono un’elevata superficie per le interazioni enzima-substrato, aumentando l’efficienza. Applicato a proteomi complessi, come quello di E. coli, il metodo combinato consente di ottenere:

• Rapidità: Digestione completa entro 5 minuti.
• Accuratezza: Quantificazione proteica comparabile a quella dei metodi tradizionali (p > 0,01, n=3).
• Scalabilità: L’adattamento a piattaforme multipozzetto come UIP400MTP consente il trattamento di un elevato numero di campioni.

Fai clic qui per il protocollo dettagliato con istruzioni passo per passo!
(cfr. Martins et al., 2019)

Digestione proteolitica ad alta velocità e con elevata capacità di trattamento dei campioni mediante i sonicatori Hielscher

I migliori modelli di sonicatore per la proteomica

Hielscher Ultrasonics offre vari modelli di sonicatore per la preparazione simultanea di più campioni, agevolando i flussi di lavoro con elevata capacità di trattamento dei campioni. Che tu lavori con flaconcini, provette, piastre multipozzetto (ad es. piastre a 6, 24 o 96 pozzetti) o piastre di Petri – ti offriamo i sonicatori ideali per i tuoi esperimenti.

Sonicatore per piastre multipozzetto UIP400MTP

Per la massima capacità di trattamento dei campioni, UIP400MTP consente di trattare mediante ultrasuoni piastre a 96 pozzetti. Compatibile con qualsiasi micropiastra standard, UIP400MTP non richiede costosi materiali monouso proprietari e ti lascia la libertà di scegliere la piastra multipozzetto più adatta alla tua ricerca. Distribuendo uniformemente l’energia su tutta la piastra, consente la rapida riduzione, alchilazione e digestione di un massimo di 200 proteomi complessi in appena 1 ora. Questo livello di automazione ed efficienza è fondamentale per la proteomica ad alta capacità di trattamento dei campioni e per le applicazioni cliniche. Scopri di più sul sonicatore per piastre multipozzetto!

VialTweeter

VialTweeter è progettato per i laboratori che richiedono la sonicazione simultanea di un massimo di 10 flaconcini o provette. Il suo approccio non invasivo elimina i rischi di contaminazione crociata, garantendo al contempo una digestione proteica riproducibile. Questo dispositivo è ideale per i ricercatori che lavorano con volumi limitati di campione o con diverse tipologie di campioni.
Scopri di più sul sonicatore per più provette VialTweeter!

Hielscher UP200St-CupHorn

Il sonicatore CupHorn è un potente dispositivo progettato per il trattamento simultaneo di più campioni in contenitori sigillati. Garantisce una distribuzione uniforme dell’energia ultrasonica e un controllo preciso della temperatura. La capacità di trattare fino a cinque campioni contemporaneamente, unita alla compatibilità con flussi di lavoro che prevedono riduzione, alchilazione e digestione, rende CupHorn uno strumento affidabile per la proteomica basata sulla MS.
Scopri di più su CupHorn SonoReactor!

Protocollo passo per passo per la digestione proteolitica assistita da ultrasuoni utilizzando tripsina immobilizzata su nanoparticelle

Questo protocollo di Martins et al. (2019) è ottimizzato per la digestione proteica rapida utilizzando energia ultrasonica e tripsina immobilizzata su nanoparticelle (T-FMNPs). Le fasi descritte garantiscono una riduzione, un’alchilazione e una proteolisi efficienti, adatte alle applicazioni di spettrometria di massa (MS).
Fasi del protocollo

1. Riduzione dei legami disolfuro
   • Aggiungere 2 µL di soluzione di DTT (110 mM) al campione proteico di 20 µL (0,5 mg/mL) in tampone AmBic.
   • Posizionare la provetta del campione nel sonoreattore UP200St-CupHorn.
   • Sonicare il campione per 2,5 minuti al 50% di ampiezza (200 W, 26 kHz).
   • Interrompere brevemente per consentire il raffreddamento, quindi sonicare per altri 2,5 minuti nelle stesse condizioni.
2. Alchilazione dei residui di cisteina ridotti
   • Aggiungere 2 µL di soluzione di IAA (400 mM) al campione proteico ridotto.
   • Sonicare per 2,5 minuti al 50% di ampiezza per facilitare l’alchilazione.
   • Interrompere per consentire il raffreddamento, quindi sonicare per ulteriori 2,5 minuti.

   Nota: ridurre al minimo l’esposizione del campione alchilato alla luce per prevenire la degradazione dello IAA.

3. Diluizione del campione
   • Diluire il campione proteico alchilato fino a un volume finale di 100 µL utilizzando tampone AmBic 25 mM contenente il 4% di acetonitrile (v/v).
   • Miscelare accuratamente pipettando delicatamente.
4. Digestione proteolitica con tripsina immobilizzata su nanoparticelle
   • Aggiungere 20 µL di soluzione di T-FMNP (3 mg/mL) al campione proteico diluito.
   • Sonicare la miscela nel sonoreattore per 2,5 minuti al 50% di ampiezza.
   • Interrompere per consentire il raffreddamento, quindi sonicare per altri 2,5 minuti nelle stesse condizioni.
5. Separazione delle nanoparticelle con tripsina
   • Utilizzare un magnete per separare le T-FMNPs dal surnatante contenente i peptidi derivati dalla digestione.
   • Trasferire il surnatante in una nuova provetta per microcentrifuga.
6. Preparazione dei peptidi per l’analisi MS
   • Essiccare il surnatante contenente i peptidi in una centrifuga sotto vuoto.
   • Conservare i peptidi essiccati a -20°C fino alla successiva analisi mediante spettrometria di massa.