Preparazione del campione assistita da filtro a ultrasuoni (FASP): migliorare i flussi di lavoro della proteomica con la sonicazione avanzata

La preparazione del campione assistita da filtri a ultrasuoni (FASP) sta emergendo come un metodo altamente efficiente e riproducibile nella moderna proteomica. Integrando la sonicazione controllata nei flussi di lavoro FASP consolidati, i ricercatori possono migliorare significativamente l'estrazione delle proteine, l'efficienza della digestione e la qualità complessiva dei dati. Con l'aumento della domanda di preparazione dei campioni ad alta produttività e riproducibilità, i sonicatori mirati come il sonicatore per micropiastre UIP400MTP stanno acquisendo importanza scientifica e pratica.

Contesto scientifico: Perché la FASP è importante nella proteomica

La preparazione del campione con filtri (FASP) è diventata un gold standard nella proteomica bottom-up grazie alla sua capacità di rimuovere detergenti, sali e altri contaminanti, consentendo al contempo un'efficiente digestione enzimatica. Tuttavia, i protocolli FASP classici spesso incontrano limitazioni legate alla lisi incompleta, alla digestione incoerente e alla variabilità del campione. – soprattutto quando si tratta di cellule o tessuti biologici complessi o resilienti.
È qui che l'energia ultrasonica focalizzata (sonicazione) offre un vantaggio decisivo. Introducendo forze meccaniche di taglio e cavitazione, la sonicazione migliora diverse fasi critiche del flusso di lavoro FASP senza compromettere l'integrità delle proteine.

Gli effetti positivi della sonicazione nella FASP a ultrasuoni

La sonicazione introduce la cavitazione acustica controllata – formazione e collasso di bolle microscopiche – che genera forze di taglio localizzate e microflussi.
La sonicazione migliora sia la fase di alchilazione che quella di digestione nella FASP a ultrasuoni, migliorando il trasferimento di massa e accelerando la cinetica di reazione. L'applicazione di energia ultrasonica genera una cavitazione che porta a microflussi localizzati e forze di taglio transitorie che promuovono una rapida miscelazione e un'efficiente penetrazione dei reagenti nella matrice proteica o nell'ambiente del filtro. Durante l'alchilazione, ciò determina una modifica più uniforme e più rapida dei residui di cisteina da parte della iodoacetamide. Nella fase di digestione, la sonicazione aumenta l'accessibilità dei siti di clivaggio proteolitico e migliora le interazioni enzima-substrato, accelerando così l'attività della tripsina e migliorando l'efficienza della digestione. In generale, il trattamento a ultrasuoni riduce i tempi di lavorazione, mantenendo o migliorando la completezza e la riproducibilità della reazione.

Nella preparazione dei campioni di proteomica, la FASP ad ultrasuoni si traduce in:

• Disgregazione cellulare ed estrazione proteica più efficienti, anche in tessuti difficili o campioni microbici
• Maggiore solubilizzazione delle proteine
• Migliore accessibilità agli enzimi durante la digestione
• Riduzione dei tempi di lavorazione e aumento della riproducibilità

A differenza dei metodi di lisi meccanici o chimici convenzionali, il trattamento a ultrasuoni è altamente controllabile e scalabile, il che lo rende particolarmente adatto a flussi di lavoro proteomici standardizzati.

Vantaggi del FASP a ultrasuoni rispetto agli approcci convenzionali

L'integrazione della sonicazione nei protocolli FASP offre vantaggi misurabili che hanno un impatto diretto sui risultati della spettrometria di massa a valle.
La FASP a ultrasuoni consente un recupero più completo delle proteine, in particolare da campioni difficili come tessuti fibrosi o biofilm. La distribuzione uniforme dell'energia garantisce un trattamento uniforme tra le repliche, riducendo la variabilità. – un requisito essenziale per la proteomica quantitativa.
Inoltre, la sonicazione accelera la cinetica di digestione migliorando l'interazione enzima-substrato. Ciò si traduce spesso in tempi di digestione più brevi e in una maggiore resa peptidica, pur mantenendo la copertura della sequenza.
Dal punto di vista del flusso di lavoro, i sistemi a ultrasuoni riducono l'intervento manuale ed eliminano la necessità di trattamenti chimici aggressivi, preservando l'integrità del campione e semplificando la standardizzazione del protocollo.

Diagramma di Venn che mostra l'aumento del numero di proteine identificate dalla FASP ultrasonica rispetto alla FASP notturna.
Immagine e studio: ©Carvalho et al., 2020

Protocollo: FASP a ultrasuoni ad alta produttività con UIP400MTP

Per i laboratori che trattano grandi gruppi di campioni, il sonicatore per micropiastre UIP400MTP consente la sonicazione simultanea di piastre standard a più pozzetti (ad esempio, piastre a 96 pozzetti), aumentando significativamente la produttività e la riproducibilità.
In questo formato, i campioni (in genere 50-200 µL per pozzetto) vengono preparati direttamente in micropiastre compatibili con l'ultrafiltrazione o il trattamento a valle. I tamponi di lisi sono simili a quelli utilizzati nei protocolli FASP standard.

Il sistema UIP400MTP applica un'energia ultrasonica uniforme su tutti i pozzetti. La sonicazione viene generalmente eseguita al 60-80% di ampiezza per 2-4 minuti, a seconda del tipo di campione. Monitorare la temperatura utilizzando il sensore di temperatura collegabile. Utilizzando la sonicazione pulsata e, opzionalmente, un refrigeratore da laboratorio.

Protocollo esemplare:

1. Per la fase di alchilazione, i campioni sono stati sonicati con il sonicatore per micropiastre (UIP400MTP) al 40% di ampiezza per 7 cicli (30 s ON, 15 s OFF; tempo totale di sonicazione: 5 min 45 s).
2. Dopo la sonicazione, la soluzione di iodoacetamide (IAA) viene rimossa mediante centrifugazione. Prima della digestione con tripsina, i campioni devono essere lavati per rimuovere l'urea residua, un forte agente caotropico che inibisce l'attività enzimatica. Pertanto, i campioni vengono lavati due volte con 200 μL di bicarbonato di ammonio 25 mM (AmBic).
3. Successivamente, vengono aggiunti 100 μL di soluzione di tripsina (rapporto enzima/proteina 1:30) preparata in bicarbonato di ammonio 12,5 mM. La digestione delle proteine viene quindi eseguita con l'UIP400MTP alle stesse condizioni di sonicazione (40% di ampiezza, 7 cicli, 30 s ON / 15 s OFF; tempo totale: 5 min 45 s).
4. Dopo la sonicazione, i campioni vengono trasferiti su piastre filtranti o processati con sistemi FASP a piastra. Le fasi di riduzione e alchilazione vengono eseguite in piastra, mantenendo un flusso di lavoro semplificato.
5. La digestione con tripsina avviene in condizioni controllate (ad esempio, 37°C, 4-16 ore), con l'opzione di una breve stimolazione a ultrasuoni per accelerare l'attività enzimatica e migliorare la resa dei peptidi.
6. I peptidi vengono recuperati per centrifugazione e sono pronti per l'analisi LC-MS/MS.

Il vantaggio principale di questo sistema risiede nella sua capacità di fornire condizioni di trattamento identiche in tutti i pozzetti, riducendo al minimo gli effetti dei lotti e consentendo solidi confronti quantitativi negli studi di proteomica su larga scala.

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