Estrazione proteica assistita da sonicazione da tessuto tumorale – Protocollo

Questo protocollo descrive un metodo di estrazione proteica assistita da sonicazione per il tessuto tumorale che migliora il flusso di lavoro standard CPTAC di lisi con urea aggiungendo una fase controllata di sonicazione con sonda durante la disgregazione del tessuto. Basata sulla strategia consolidata CPTAC di preparazione del proteoma e del fosfoproteoma per analisi approfondite, questa modifica migliora la disgregazione delle cellule e delle strutture subcellulari, riduce la viscosità del campione e favorisce il rilascio di proteine che sono generalmente più difficili da recuperare con la sola lisi con urea, in particolare le proteine legate alle membrane e quelle che legano il DNA o sono associate al nucleo. Nello studio di riferimento, il flusso di lavoro assistito da sonicazione ha aumentato il rilevamento sia delle proteine sia dei fosfopeptidi, mantenendo la compatibilità con la sequenza di operazioni successive di digestione secondo l’approccio CPTAC, marcatura TMT, frazionamento, arricchimento dei fosfopeptidi e analisi LC-MS/MS.

Estrazione proteica assistita da sonicazione da tessuto tumorale per analisi proteomiche e fosfoproteomiche approfondite

Il seguente protocollo è ottimizzato per l’estrazione delle proteine da tessuto tumorale criopolverizzato in tampone di lisi con urea 8 M: una fase aggiuntiva di sonicazione con sonda migliora il recupero di classi di proteine difficili da estrarre, in particolare quelle associate alle membrane e al DNA/al nucleo, prima della digestione e della successiva analisi LC-MS/MS. Nello studio di riferimento di Li et al. (2025), l’aggiunta della sonicazione ha aumentato il rilevamento delle proteine associate alle membrane e al nucleo e ha consentito una copertura approfondita di >12.000 proteine e >25.000 fosfopeptidi nell’ambito del loro flusso di lavoro.

Ambito di applicazione del protocollo

Utilizzare questa procedura per:

• tessuto tumorale congelato fresco e criopolverizzato
• pellet cellulari o altri campioni biologici per i quali l’estrazione con urea è già consolidata
• flussi di lavoro di proteomica globale e fosfoproteomica che utilizzano la digestione con tripsina e, facoltativamente, la marcatura TMT

Lo studio di Li et al. (2025) afferma che il flusso di lavoro è applicabile anche ad altri tipi di campioni, come linee cellulari, sangue e urina; tuttavia, può essere necessaria un’ottimizzazione in funzione del tipo di campione.

Flusso di lavoro ottimizzato per la preparazione dei campioni con una fase di sonicazione integrata. Il flusso di lavoro ottimizzato e il disegno sperimentale si basano sul protocollo CPTAC di preparazione dei campioni per l’analisi proteomica globale e fosfoproteomica.
Studio e schema: ©Li et al., 2025

Principio di funzionamento

Lo studio originale ha aggiunto la sonicazione al flusso di lavoro standard CPTAC di lisi con urea e ha riscontrato un miglioramento nel rilevamento delle proteine associate alle membrane e ai nuclei. Gli autori affermano che i parametri di sonicazione devono essere regolati con precisione in funzione della quantità/concentrazione del campione – scegliendo le dimensioni del sonotrodo, l’apporto energetico e la temporizzazione degli impulsi.

Ad esempio, per Hielscher UP200Ht e UP200St, ciò significa:

• utilizzare l’ampiezza e la modalità a impulsi come principali variabili di controllo
• mantenere i campioni freddi per tutta la durata del trattamento (ossia su ghiaccio)
• iniziare con impostazioni conservative
• ottimizzare in base alla limpidezza del campione, alla temperatura, alla resa proteica e alla qualità dei peptidi nelle fasi successive

 
Entrambi i modelli di sonicatore Hielscher da 200 watt, UP200Ht e UP200St, sono progettati per campioni di piccolo e medio volume, con impostazioni regolabili dell’ampiezza e degli impulsi; entrambi gli omogeneizzatori a ultrasuoni offrono un controllo digitale tramite touchscreen per la regolazione precisa dei parametri, la registrazione automatica dei dati, un sensore di temperatura collegabile, il controllo remoto e l’illuminazione del campione.
 

Reagenti per l’estrazione proteica assistita da sonicazione

Tampone di lisi con urea

Preparare fresco immediatamente prima dell’uso:

• Urea 8 M
• NaCl 75 mM
• Tris 50 mM, pH 8,0
• EDTA 1 mM
• Aprotinina 2 µg/mL
• Leupeptina 10 µg/mL
• PMSF 1 mM
• NaF 10 mM
• PUGNAc 20 µM
• Phosphatase Inhibitor Cocktail 2, 1:100 (v/v)
• Phosphatase Inhibitor Cocktail 3, 1:100 (v/v)

L’urea deve essere completamente disciolta prima di aggiungere gli additivi; gli inibitori devono essere aggiunti immediatamente prima dell’uso; il tampone deve essere mantenuto su ghiaccio; dopo l’aggiunta degli additivi, si raccomanda di agitare con un movimento circolare anziché utilizzare vigorosamente il vortex.
 

Reagenti aggiuntivi:

• Reagenti per il dosaggio delle proteine con il metodo BCA
• Tris-HCl 50 mM, pH 8,0
• DTT
• Iodoacetamide
• LysC
• Tripsina
• Acido formico
• Reagenti TMT, se si utilizza la proteomica quantitativa multiplex
• Reagenti IMAC, se si esegue l’arricchimento dei fosfopeptidi

Attrezzatura per l’estrazione proteica assistita da sonicazione

Attrezzatura necessaria

Scelta della sonda consigliata

Per campioni di circa 200–1000 µL, utilizzare un sonotrodo di piccolo diametro adatto al trattamento diretto ad alta intensità di piccoli volumi. Hielscher offre sonotrodi di diversi diametri e i diametri più piccoli delle punte forniscono una maggiore intensità sulla punta.

Nota pratica: utilizzare la sonda più piccola che garantisca una miscelazione efficiente senza formazione eccessiva di schiuma né contatto con le pareti del recipiente.

Se si lavora con più campioni contemporaneamente, si può prendere in considerazione il sonicatore per più provette VialTweeter o il sonicatore per micropiastre UIP400MTP!

Istruzioni passo passo: procedura di estrazione proteica assistita da sonicazione

A. Preraffreddamento e preparazione

1. Raffreddare la centrifuga a 4°C.
2. Preparare il tampone di lisi con urea fresco e mantenerlo su ghiaccio.
3. Montare UP200Ht o UP200St su un supporto all’interno di una cabina di insonorizzazione.
4. Preparare un bagno di ghiaccio sufficientemente grande da mantenere le provette dei campioni verticali e stabili.

La preparazione del tampone fresco e la manipolazione a freddo sono fondamentali.

B. Estrazione iniziale con urea

1. Mantenere il tessuto criopolverizzato su ghiaccio.
2. Aggiungere 200 µL di tampone di lisi con urea raffreddato per 50 mg di tessuto umido.
3. Agitare al vortex per 5–10 s ad alta velocità.
4. Incubare per 15 min a 4°C.
5. Ripetere ancora una volta la fase di agitazione al vortex seguita dall’incubazione.
6. Centrifugare a 20.000g per 10 min a 4°C.
7. Trasferire il lisato/surnatante in una provetta pulita a basso legame proteico.

C. Sonicazione con UP200Ht o UP200St

Condizioni iniziali per la sonicazione

• Ampiezza: iniziare al 20–30%
• Durata dell’impulso: 5 s di attivazione
• Raffreddamento: 2 min su ghiaccio tra gli impulsi
• Numero di cicli: 4 cicli
• Tempo totale di sonicazione attiva: 20 s
• Tempo totale del processo, incluso il raffreddamento: circa 8–10 min

Fasi della sonicazione

1. Trasferire il lisato in una provetta adatta alla sonicazione. Utilizzare una provetta stretta e a pareti sottili che consenta un buon scambio termico e un’immersione sicura della sonda.
2. Posizionare la provetta in un bagno di ghiaccio. L’articolo identifica il raffreddamento durante la sonicazione come fondamentale per prevenire i danni da calore.
3. Immergere la punta della sonda nel campione. Mantenere la punta sufficientemente immersa per una cavitazione stabile, senza farla entrare in contatto con le pareti o il fondo della provetta.
4. Eseguire un impulso di 5 s all’ampiezza iniziale.
5. Riportare immediatamente il campione interamente su ghiaccio per 2 min.
6. Ripetere fino al completamento di 4 cicli.
7. Esaminare il lisato dopo il ciclo.
8. Proseguire solo se necessario, utilizzando un impulso aggiuntivo di 5 s alla volta, sempre seguito da un raffreddamento completo.
9. Interrompere quando il lisato diventa più uniforme e meno filamentoso/viscoso.
   Il punto finale è un lisato più traslucido che forma gocce anziché un flusso viscoso continuo.
10. Centrifugare a circa 16.000g per 15 min a 4°C.
11. Trasferire il surnatante chiarificato in una nuova provetta e misurare la concentrazione proteica.

Confronto della proteomica globale e della fosfoproteomica tra campioni sottoposti e non sottoposti a sonicazione.
a. Numero di proteine identificate (proteomica globale) in tutti i tessuti tumorali PDX con o senza sonicazione. b. Numero di fosfopeptidi identificati (arricchimento IMAC) in tutti i tessuti tumorali PDX con o senza sonicazione. Sono state conteggiate solo le proteine e i fosfopeptidi con un rapporto di abbondanza maggiore o uguale al 25° percentile. Il rapporto di abbondanza è stato calcolato tra gli stessi tipi di campioni.
Studio e grafici: ©Li et al., 2025

Digestione e analisi successive

Dopo la sonicazione e la chiarificazione, procedere come descritto nel flusso di lavoro originale secondo l’approccio CPTAC:

1. Diluire il lisato 1:3 (v/v) con Tris-HCl 50 mM a pH 8,0 per ridurre l’urea a <2 M.
2. Aggiungere LysC in ragione di 1 mAU per 50 µg di proteine e incubare per 2 h a 25°C.
3. Aggiungere tripsina con un rapporto enzima:substrato di 1:49 (w/w) e digerire per tutta la notte a 25°C.
4. Arrestare la reazione con acido formico fino a una concentrazione finale dell’1%.
5. Proseguire con la desalinizzazione, la marcatura TMT, il frazionamento, l’arricchimento dei fosfopeptidi e l’analisi LC-MS/MS secondo necessità.

Espressione differenziale dei fosfopeptidi rilevata mediante MS con marcatura TMT.
a. Il sottotipo basale, con evidenziazione di alcuni fosfopeptidi umani (inizio e fine della sequenza proteica) la cui espressione è aumentata nei campioni sottoposti a sonicazione rispetto ai campioni non sottoposti a sonicazione. b. Il sottotipo luminale, con evidenziazione di alcuni fosfopeptidi umani (inizio e fine della sequenza proteica) la cui espressione è aumentata nei campioni sottoposti a sonicazione rispetto ai campioni non sottoposti a sonicazione. c. Vie KEGG arricchite sulla base delle proteine dei fosfopeptidi con espressione aumentata nei tumori del sottotipo basale sottoposti a sonicazione. d. Vie KEGG arricchite sulla base delle proteine dei fosfopeptidi con espressione aumentata nei tumori del sottotipo luminale sottoposti a sonicazione.
Studio e grafici: ©Li et al., 2025

Progettazione, produzione e consulenza – Qualità Made in Germany

I sonicatori Hielscher sono rinomati per i loro elevatissimi standard di qualità e progettazione. La robustezza e la facilità d’uso consentono un’integrazione agevole dei nostri sonicatori negli impianti industriali. I sonicatori Hielscher affrontano facilmente condizioni difficili e ambienti impegnativi.

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Bibliografia / Riferimenti

• Li Q.K.; Lih T.M.; Clark D.J.; Chen L.; Schnaubelt M.; Zhang H. (2025): Sonication-assisted protein extraction improves proteomic detection of membrane-bound and DNA-binding proteins from tumor tissues. Nature Protocols 2025 Aug;20(8):2083-2099.
• Stadlmann, J., Taubenschmid, J., Wenzel, D. et al. (2017): Comparative glycoproteomics of stem cells identifies new players in ricin toxicity. Nature 549, 2017. 538–542
• Jakob, S., Steinchen, W., Hanßmann, J. et al. (2024): The virulence regulator VirB from Shigella flexneri uses a CTP-dependent switch mechanism to activate gene expression. Nature Communications 15, 318 (2024).
• Jorge S., Capelo J.L., LaFramboise W., Dhir R., Lodeiro C., Santos H.M. (2019): Development of a Robust Ultrasonic-Based Sample Treatment To Unravel the Proteome of OCT-Embedded Solid Tumor Biopsies. Journal of Proteome Research 2019 Jul 5;18(7):2979-2986.
• Mertins P, Tang LC, Krug K, et al. (2018): Reproducible workflow for multiplexed deep-scale proteome and phosphoproteome analysis of tumor tissues by liquid chromatography-mass spectrometry. (Initial CPTAC protocol). Nature Protocols 7, 2018. 1632-1661.