Estrazione di proteine da tessuto tumorale assistita da sonicazione – protocollo

Questo protocollo descrive un metodo di estrazione proteica assistita da sonicazione per il tessuto tumorale che migliora il flusso di lavoro standard della lisi ureica CPTAC aggiungendo una fase di sonicazione controllata della sonda durante la disgregazione del tessuto. Basandosi sulla consolidata strategia di preparazione del proteoma e del fosfoproteoma su scala profonda CPTAC, questa modifica migliora la disgregazione delle cellule e della struttura subcellulare, riduce la viscosità del campione e aumenta il rilascio di proteine che in genere sono più difficili da recuperare con la sola lisi ureica, in particolare le proteine legate alla membrana e quelle legate al DNA o associate al nucleo. Nello studio sottostante, il flusso di lavoro assistito dalla sonicazione ha aumentato il rilevamento di proteine e fosfopeptidi, preservando la compatibilità con la digestione in stile CPTAC, l'etichettatura TMT, il frazionamento, l'arricchimento dei fosfopeptidi e la pipeline di analisi LC-MS/MS.

Estrazione di proteine da tessuto tumorale assistita da sonicazione per l'analisi proteomica e fosfoproteomica profonda

The following protocol is optimized for extraction of proteins from cryopulverized tumor tissue in 8 M urea lysis buffer: An added probe-type sonication step improves the recovery of difficult protein classes, especially membrane-associated and DNA-/nucleus-associated proteins, before digestion and downstream LC-MS/MS analysis. In the underlying study by Li et al. (2025), adding sonication increased detection of membrane and nucleus-associated proteins and supported deep-scale coverage of >12,000 proteins and >25,000 phosphopeptides under their workflow.

Area di applicazione del protocollo

Utilizzare questa procedura per:

• tessuto tumorale fresco congelato e criopolverizzato
• pellet di cellule o altri campioni biologici in cui l'estrazione a base di urea è già stata stabilita
• flussi di lavoro di proteomica globale e fosfoproteomica che utilizzano la digestione triptica e l'etichettatura TMT opzionale

Lo studio di Li et al. (2025) afferma che il flusso di lavoro è applicabile anche ad altri tipi di campioni, come linee cellulari, sangue e urine, ma potrebbe essere necessaria un'ottimizzazione in base al tipo di campione.

Flusso di lavoro ottimizzato per la preparazione dei campioni con implementazione della fase di sonicazione. Il flusso di lavoro ottimizzato e il disegno sperimentale si basano sul protocollo di preparazione dei campioni CPTAC per l'analisi proteomica e fosfoproteomica globale.
Studio e schema: ©Li et al., 2025

Principio di funzionamento

Lo studio originale ha aggiunto la sonicazione al flusso di lavoro standard di lisi dell'urea CPTAC e ha rilevato un miglioramento nella rilevazione delle proteine associate alle membrane e ai nuclei. Gli autori affermano che i parametri di sonicazione devono essere regolati con precisione in base alle dimensioni/concentrazione del campione. – scegliendo le dimensioni del sonotrodo, l'energia immessa e la tempistica degli impulsi.

Ad esempio, per gli Hielscher UP200Ht e UP200St, ciò significa:

• utilizzare l'ampiezza e la modalità di impulso come variabili di controllo principali
• mantenere i campioni al freddo (ad esempio, nel ghiaccio)
• iniziare con impostazioni conservative
• ottimizzare rispetto alla limpidezza del campione, alla temperatura, alla resa proteica e alla qualità dei peptidi a valle

 
Entrambi i sonicatori Hielscher da 200 watt UP200Ht e UP200St sono progettati per volumi di campione piccoli e medi, con impostazioni di ampiezza e impulso regolabili; entrambi gli omogeneizzatori a ultrasuoni sono dotati di controllo digitale touchscreen per la regolazione precisa dei parametri, registrazione automatica dei dati, sensore di temperatura collegabile, controllo remoto, illuminazione del campione.
 

Reagenti per l'estrazione di proteine assistita da sonicazione

Tampone di lisi con urea

Preparare il prodotto fresco immediatamente prima dell'uso:

• 8 M urea
• 75 mM NaCl
• 50 mM Tris, pH 8,0
• 1 mM EDTA
• 2 µg/mL di aprotinina
• 10 µg/mL leupeptina
• 1 mM PMSF
• 10 mM NaF
• 20 µM PUGNAc
• Cocktail di inibitori della fosfatasi 2, 1:100 (v/v)
• Cocktail di inibitori della fosfatasi 3, 1:100 (v/v)

L'urea deve essere completamente disciolta prima di aggiungere gli additivi; gli inibitori devono essere aggiunti immediatamente prima dell'uso; il tampone deve essere conservato in ghiaccio; dopo l'aggiunta degli additivi si raccomanda di agitare piuttosto che agitare vigorosamente.
 

Reagenti aggiuntivi:

• Reagenti per il dosaggio delle proteine BCA
• 50 mM Tris-HCl, pH 8,0
• DTT
• Iodoacetamide
• LysC
• tripsina
• Acido formico
• Reagenti TMT, se si utilizza la proteomica quantitativa multiplexed
• reagenti IMAC, se si esegue l'arricchimento dei fosfopeptidi

Apparecchiatura per l'estrazione di proteine assistita da sonicazione

Richiesto

Selezione della sonda consigliata

Per campioni di circa 200-1000 µL, utilizzare un sonotrodo di piccolo diametro adatto all'elaborazione diretta ad alta intensità di piccoli volumi. Hielscher offre diversi diametri di sonotrodi e i diametri più piccoli delle punte garantiscono un'intensità maggiore sulla punta.

Nota pratica: utilizzare la sonda più piccola per ottenere una miscelazione efficace senza eccessiva formazione di schiuma o contatto con le pareti del recipiente.

Se si lavora con più campioni contemporaneamente, è possibile considerare il Sonicator multi-tubo VialTweeter o il Sonicatore per micropiastre UIP400MTP!

Istruzioni passo-passo: Procedura di estrazione delle proteine assistita da sonicazione

A. Preraffreddamento e preparazione

1. Raffreddare la centrifuga a 4°C.
2. Preparare un tampone di lisi di urea fresco e tenerlo in ghiaccio.
3. Installare l'UP200Ht o l'UP200St su un supporto all'interno di una cassa acustica.
4. Preparare un bagno di ghiaccio sufficientemente grande da tenere le provette di campione in posizione verticale e stabile.

La preparazione del tampone fresco e la manipolazione a freddo sono fondamentali.

B. Estrazione iniziale dell'urea

1. Conservare il tessuto criopolverizzato nel ghiaccio.
2. Aggiungere 200 µL di tampone di lisi ureico raffreddato per 50 mg di tessuto umido.
3. Vortex 5-10 s ad alta velocità.
4. Incubare 15 minuti a 4°C.
5. Ripetere ancora una volta la fase di vortex e di incubazione.
6. Centrifugare a 20.000g per 10 minuti a 4°C.
7. Trasferire il lisato/supernatante in una provetta pulita a basso legame.

C. Sonicazione con UP200Ht o UP200St

Condizioni di partenza per la sonicazione

• Ampiezza: iniziare con il 20-30%.
• Durata dell'impulso: 5 s ON
• Raffreddamento: 2 minuti con ghiaccio tra gli impulsi
• Numero di cicli: 4 cicli
• Tempo totale di sonicazione attiva: 20 s
• Tempo totale di lavorazione, compreso il raffreddamento: circa 8-10 min.

Fasi di sonicazione

1. Trasferire il lisato in una provetta adatta alla sonicazione. Utilizzare una provetta stretta e a parete sottile che consenta un buon scambio di calore e un'immersione sicura della sonda.
2. Mettere la provetta in un bagno di ghiaccio. Il documento indica che il raffreddamento durante la sonicazione è fondamentale per evitare danni da calore.
3. Immergere la punta della sonda nel campione. Mantenere la punta sufficientemente immersa per garantire una cavitazione stabile, ma non farla toccare la parete o il fondo della provetta.
4. Eseguire un impulso di 5 s all'ampiezza iniziale.
5. Riportare immediatamente il campione in ghiaccio per 2 minuti.
6. Ripetere fino a completare 4 cicli.
7. Ispezionare il lisato dopo il ciclo.
8. Continuare solo se necessario, utilizzando un ulteriore impulso di 5 s alla volta, sempre seguito da un raffreddamento completo.
9. Interrompere quando il lisato diventa più uniforme e meno filante/vischioso.
   Il risultato finale è un lisato più traslucido che forma gocce piuttosto che un flusso viscoso continuo.
10. Centrifugare a circa 16.000g per 15 minuti a 4°C.
11. Trasferire il surnatante chiarificato in una nuova provetta e misurare la concentrazione proteica.

Confronto della proteomica globale e della fosfoproteomica tra campioni sonicati e non sonicati.
a. Numero di proteine identificate (proteomica globale) in tutti i tessuti tumorali PDX con o senza sonicazione. b. Numero di fosfopeptidi identificati (arricchimento IMAC) in tutti i tessuti tumorali PDX con o senza sonicazione. Sono state contate solo le proteine e i fosfopeptidi con un rapporto di abbondanza maggiore o uguale al 25° percentile. Il rapporto di abbondanza è stato calcolato tra gli stessi tipi di campioni.
Studio e grafici: ©Li et al., 2025

Digestione e analisi a valle

Dopo la sonicazione e la chiarificazione, procedere come descritto nel flusso di lavoro originale in stile CPTAC:

1. Diluire il lisato 1:3 (v/v) con 50 mM Tris-HCl pH 8.0 per ridurre l'urea a <2 M.
2. Aggiungere LysC a 1 mAU per 50 µg di proteina e incubare 2 ore a 25°C.
3. Aggiungere tripsina a 1:49 enzima:substrato (p/p) e digerire per una notte a 25°C.
4. Raffreddare con acido formico all'1% finale.
5. Proseguire con il desalaggio, l'etichettatura TMT, il frazionamento, l'arricchimento dei fosfopeptidi e la LC-MS/MS come richiesto.

Espressione differenziale di fosfopeptidi da MS marcati con TMT.
a. Il sottotipo basale, evidenziando alcuni fosfopeptidi umani (inizio e fine della sequenza proteica) upregolati nei campioni sonicati rispetto ai campioni non sonicati. b. Il sottotipo luminale, evidenziando alcuni fosfopeptidi umani (inizio e fine della sequenza proteica) upregolati nei campioni sonicati rispetto ai campioni non sonicati. c. Percorsi KEGG arricchiti in base alle proteine dei fosfopeptidi upregolati nel sottotipo basale di tumori sonicati. d. Percorsi KEGG arricchiti in base alle proteine dei fosfopeptidi upregolati nel sottotipo luminale di tumori sonicati.
Studio e grafici: ©Li et al., 2025

Progettazione, produzione e consulenza – Qualità Made in Germany

Gli ultrasuoni Hielscher sono noti per i loro elevati standard di qualità e design. La robustezza e la facilità d'uso consentono un'agevole integrazione dei nostri ultrasuoni negli impianti industriali. Gli ultrasuonatori Hielscher sono in grado di gestire facilmente condizioni difficili e ambienti impegnativi.

Hielscher Ultrasonics è un'azienda certificata ISO e pone particolare enfasi sugli ultrasuonatori ad alte prestazioni, caratterizzati da tecnologia all'avanguardia e facilità d'uso. Naturalmente, gli ultrasuoni Hielscher sono conformi alla normativa CE e soddisfano i requisiti UL, CSA e RoH.

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