Estrazione ultrasonica di proteine da tessuti e colture cellulari
- L'estrazione delle proteine è una fase essenziale della preparazione del campione nella proteomica.
- Le proteine possono essere estratte da tessuti vegetali e animali, lieviti e microrganismi.
- La sonicazione è un metodo di estrazione delle proteine affidabile ed efficiente, che fornisce elevate rese proteiche in un breve tempo di estrazione.
Estrazione di proteine da tessuti e cellule
L'estrazione di proteine da tessuti e cellule coltivate è una fase essenziale di preparazione del campione che viene eseguita durante molte tecniche biochimiche e analitiche come ELISA, PAGE, Blotting occidentaleo purificazione delle proteine. Ultrasuoni rottura, lisi ed estrazione delle cellule è una tecnica precisamente controllabile per garantire un'elevata resa di proteine.
Estrazione di proteine dal tessuto animale
Per la preparazione di tessuti integrali (ad es. reni, cuore, cuore, polmoni, muscoli, ecc.), il tessuto dovrebbe essere sezionato in pezzi molto piccoli con strumenti puliti, preferibilmente su ghiaccio, e il più rapidamente possibile per prevenire la degradazione da parte delle proteasi (ad es. tampone di lisi come RIPA o tampone di lisi ipotonico contenente proteasi e cocktail inibitore della fosfatasi). Dopo la dissezione, il campione viene immerso in azoto liquido per essere congelato a scatto. Il campione può essere conservato a -80°C per un uso successivo o conservato su ghiaccio per un'immediata omogeneizzazione. Immediatamente prima dell'estrazione ad ultrasuoni, il tampone di lisi a freddo (con inibitori della proteasi DTT, lepeptina e aprotinina) viene aggiunto rapidamente nella provetta del campione (per ~ 10 mg di tessuto circa ~ 600 μL di tampone sono raccomandati). Si raccomandano circa 20-60 mg di tessuto per provetta.
L'omogeneizzazione, la lisi e l'estrazione ad ultrasuoni viene eseguita con un omogeneizzatore ad ultrasuoni come il UP200Ht o UP200Stdotato di un micropunta sonotrodo. La durata dell'ecografia è di 60-90 sec. con una modalità a ciclo ultrasonoro di 15 sec. sonicazione e 10 sec. di tempo di riposo. Il campione dovrebbe essere tenuto sempre in ghiaccio.
Dopo l'omogeneizzazione/estrazione ad ultrasuoni, il lisato viene centrifugato a 27.000 g per circa 20 min. Successivamente viene raccolto il supernatente, in modo che la concentrazione proteica possa essere determinata da un dosaggio proteico come il Pierce protein assay BCA.
Estrazione di proteine ad ultrasuoni da cellule con UP200St
Estrazione di proteine dal siero del sangue
Per una miscela omogenea del siero e del tampone fosfato, il campione viene vortexato prima della lisi cellulare ad ultrasuoni. Per la lisi ad ultrasuoni, il campione viene sonicato con un omogeneizzatore di laboratorio ad ultrasuoni come il UP100H per 8 cicli al 20% di ampiezza, per cicli di 5 secondi ogni 5 secondi di accensione e 15 secondi di spegnimento. La sonocazione viene effettuata mediante sonicazione in cicli e ponendo il campione su ghiaccio in modo da evitare il surriscaldamento e la degradazione termica del campione. Poiché il siero contiene una grande quantità di proteine ad alto peso molecolare (come albumina, α1-antitripsina, transferrina, aptoglobulina, immunoglobulina G e immunoglobulina A), che interferiscono con la separazione delle proteine a basso peso molecolare durante l'IEF, si raccomanda di depletare dal siero utilizzando una colonna di esaurimento.
Estrazione di proteine dal tessuto vegetale
I tessuti vegetali freschi e molli, come il muschio, ecc. possono essere facilmente interrotti semplicemente mettendo il campione tritato nel tampone di lisi per la sonicazione. I tessuti vegetali legnose e resistenti, come i semi, gli aghi di abete, ecc. devono essere macinati a secco. Alcuni materiali vegetali duri e legnosi devono essere congelati e macinati in azoto liquido prima di essere estratti mediante sonicazione. Per le sospensioni di colture di cellule vegetali, è sufficiente un trattamento ultrasonico tra 30 e 150 secondi in un tampone di lisi. Materiali più duri come i semi di zucca richiedono una sonicazione più intensa come descritto di seguito.
Protocollo per l'estrazione ad ultrasuoni dell'albumina dai semi di zucca
Per l'estrazione ultrasonica delle proteine dell'albumina da semi di zucca macinati finemente in polvere, 10 g di semi di zucca sgrassati in polvere e 100 ml di acqua deionizzata come solvente vengono aggiunti in un bicchiere di vetro da 250 ml. L'estrazione delle proteine consiste in due fasi: In primo luogo, il campione viene sonicato con un ultrasuoni a sonda. UP400St (400W, 24kHz) con sonotrodo montato S24d7. Il bicchiere di vetro viene posto in un bagno d'acqua fredda durante l'omogeneizzazione ad ultrasuoni. L'impostazione dell'ultrasonorizzatore UP400St con il sensore di temperatura ad innesto garantisce che la temperatura del campione sia sempre inferiore a 30°C. Grazie al controllo preciso della temperatura durante la sonicazione, si evita la denaturazione dell'albumina. In secondo luogo, l'estrazione è stata effettuata con un miscelatore a 200 giri/minuto e a 30°C. Successivamente il becher viene trasferito in uno scuotitore termostatico. La globulina viene rimossa tramite dialisi con acqua distillata. Dopo la rimozione della globulina, l'estratto proteico può essere campionato per la determinazione del profilo dell'albumina e successivamente viene regolato a pI=3.0 usando 0.1 M HCl per la coagulazione dell'albumina. La fase solida viene separata mediante centrifugazione a 5000g, 20°C e ridissolvendola in acqua deionizzata. La coagulazione dell'albumina viene eseguita due volte per aumentare il rapporto proteico nel concentrato di albumina.
L'estrazione ultrasonica di proteine alcaline alcaline per la preparazione di concentrato proteico dalla crusca di riso mostra che il trattamento ad ultrasuoni si traduce in una maggiore resa proteica in un tempo di estrazione significativamente più breve. – rispetto ai metodi di estrazione convenzionali.
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Protocollo di preparazione del campione per l'enzima funzionale iNOS
Per ottenere un enzima iNOS perfettamente funzionante (ad es. per lo screening farmacologico), si raccomanda il seguente protocollo: La sospensione cellulare deve essere posto su ghiaccio e sonicare con un UP100H a 10µm di ampiezza in modalità ciclo di 5 sec. sonicazione e 25 sec. di riposo su ghiaccio. La procedura deve essere ripetuta circa 3 volte. Il tempo di riposo tra un ciclo di sonicazione e l'altro riduce l'aumento della temperatura e quindi il rischio di denaturazione.
Solubilizzazione ultrasonica delle proteine
La sonicazione può accelerare il processo di solubilizzazione delle proteine, che di solito richiede diverse ore. Per non surriscaldare il campione e prevenire la degradazione proteica e le modifiche nelle soluzioni contenenti urea, le esplosioni ad ultrasuoni non dovrebbero durare più di pochi secondi.
Istruzioni generali
Controllo della temperatura: Per garantire un'elevata resa proteica senza denaturazione termica, la temperatura durante l'estrazione deve essere controllata. Omogeneizzatori ad ultrasuoni all'avanguardia di Hielscher – chiamato anche disintegratore o sonificatore ad ultrasuoni – sono controllabili con precisione. Sono dotati di un sensore di temperatura collegabile. Nelle opzioni di impostazione dell'omogeneizzatore ad ultrasuoni è possibile impostare una temperatura massima. Quando questa temperatura massima viene raggiunta, l'ultrasuoni si arresta automaticamente fino a quando il campione non si è raffreddato.
Tampone: La scelta di un tampone adeguato e del giusto volume di tampone varia da tessuto a tessuto e deve essere determinata mediante prove ed errori.
Isolamento / purificazione: I lisati proteici possono contenere un eccesso di biomolecole come DNA o carboidrati, che possono essere rimossi mediante precipitazione proteica (acido desossicolato-tricloroacetico) o scambio di tamponi.
Chittapalo e Noomhorm (2009) hanno riferito che la produzione proteica è aumentata utilizzando la sonicazione e che il processo di lisi e omogeneizzazione ultrasonica dei tessuti può migliorare significativamente i processi di estrazione esistenti. – consentire nuove opportunità di estrazione commerciale.
Omogeneizzatore ad ultrasuoni per tessuti UP200St per un'efficiente estrazione delle proteine
Controllo del browser per il funzionamento preciso e il monitoraggio del processo di sonicazione
Apparecchiature ad ultrasuoni per l'estrazione delle proteine
Hielscher Ultrasonics offre una vasta gamma di omogeneizzatori ad ultrasuoni per la disintegrazione di cellule, tessuti, batteri, microrganismi, lieviti e spore.
Gli ultrasuoni da laboratorio Hielscher sono potenti e facili da usare. Costruiti per un funzionamento 24/7, sono progettati come dispositivi da laboratorio e da banco robusti ed efficienti. Per tutti i dispositivi, l'uscita di energia e l'ampiezza possono essere controllate con precisione. La vasta gamma di Accessori apre ulteriori opzioni di impostazione. I dispositivi digitali come VialTweeter, UP200Ht, UP200Ste UP400St hanno un controllo integrato della temperatura e una scheda SD integrata per la registrazione automatica dei dati.
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A seconda dell'applicazione, del materiale e del volume del campione, vi raccomandiamo la configurazione più adatta per la preparazione del campione. Contattaci oggi stesso!
Letteratura/riferimenti
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Estrazione alcalina ultrasonica assistita di proteine da crusca di riso sgrassata e proprietà dei concentrati proteici. Int J Food Sci Technol 44: 1843-1849.
- Simões, André E.S.:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D'Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Recupero efficiente delle proteine da campioni provenienti da fonti multiple dopo l'estrazione dell'RNA del trizolo o del trizolo LS RNA e la conservazione a lungo termine. BMC Genomics 2013, 14:181.
Particolarità / Cose da sapere
Proteomica
La proteomica è il campo di ricerca che studia le proteine e il proteoma. Le proteine svolgono una vasta gamma di funzioni vitali all'interno degli organismi. Il proteoma è l'intero insieme di proteine espresse da un genoma, cellula, tessuto o organismo in un determinato momento. Il proteoma varia con il tempo e le esigenze distinte, o stress, che una cellula o un organismo subisce. Più specificamente, è l'insieme di proteine espresse in un dato tipo di cellula o organismo, in un dato momento, in condizioni definite. Il termine è una miscela di proteine e genoma. La proteomica è lo studio del proteoma.
Proteine
Le proteine sono grandi biomolecole, le cosiddette macromolecole. – che sono composti da una o più lunghe catene di residui di amminoacidi. Le proteine sono presenti in tutti gli organismi di origine vegetale e animale e sono fondamentali per la maggior parte delle funzioni biologiche. Poiché le proteine contengono molte informazioni biologiche, vengono estratte per scopi analitici, ad esempio per la ricerca proteomica. Le funzioni più importanti svolte dalle proteine comprendono la catalisi delle reazioni metaboliche, la replicazione del DNA, la risposta agli stimoli e il trasporto di molecole da un luogo all'altro. Le proteine si differenziano l'una dall'altra principalmente per la sequenza di aminoacidi, che è dettata dalla sequenza nucleotidica dei loro geni, e che di solito si traduce in una specifica struttura tridimensionale che ne determina l'attività. Le proteine sono – oltre ai peptidi – uno dei componenti chiave del cibo. Pertanto, la proteomica è un potente strumento nella scienza dell'alimentazione per ottimizzare i processi, la sicurezza alimentare e la valutazione nutrizionale.
Gel Elettroforesi
L'elettroforesi su gel è il metodo principale per la separazione e l'analisi di macromolecole come DNA, RNA e proteine così come i loro frammenti, in base alla loro dimensione e carica. Viene utilizzato in chimica clinica per separare le proteine per carica e/o dimensione (IEF agarosio, essenzialmente indipendente dalle dimensioni) e in biochimica, biologia molecolare e proteomica per separare una popolazione mista di frammenti di DNA e RNA per lunghezza, per stimare la dimensione dei frammenti di DNA e RNA o per separare le proteine per carica.
Colture cellulari
La coltura cellulare è il processo di crescita controllata mediante il quale le cellule sono coltivate in condizioni controllate. Le condizioni di coltura cellulare variano a seconda del tipo di cellula. In generale, l'ambiente di una coltura cellulare è costituito da un recipiente adatto (ad es. capsula Petri) con substrato o mezzo che fornisce i nutrienti essenziali (aminoacidi, carboidrati, vitamine, minerali), fattori di crescita, ormoni e gas (CO2, O2), e regola l'ambiente fisico-chimico (tampone pH, pressione osmotica, temperatura). La maggior parte delle cellule ha bisogno di un substrato superficiale o artificiale, mentre altre colture cellulari possono essere coltivate in mezzo di coltura (coltura in sospensione, sospensione cellulare).
Le colture di massa di linee cellulari animali sono utilizzate nella produzione industriale di vaccini virali e altri prodotti di derivazione biotecnologica. Le cellule staminali umane sono coltivate per espandere il numero di cellule e differenziare le cellule in vari tipi di cellule somatiche a scopo di trapianto.
Campioni di tessuto
Il termine tessuto descrive un intermedio cellulare, in cui il materiale cellulare è a livello organizzativo tra le cellule e un organo completo. Nel tessuto, cellule simili, della stessa origine che insieme svolgono una funzione specifica, vengono assemblate. Dal raggruppamento funzionale di tessuti multipli, si formano le strutture complesse degli organi.
Il tessuto viene campionato per ricerche in biologia, istologia/istopatologia, parassitologia, biochimica, immunoistochimica e per coltivare ed estrarre il DNA. Si può distinguere tra tessuto animale (suddivisione: tessuto mammifero) e tessuto vegetale. I tessuti animali sono raggruppati nei quattro tipi base di tessuto connettivo, muscolare, nervoso ed epiteliale. Il tessuto vegetale è suddiviso nei seguenti tre sistemi tissutali: l'epidermide, il tessuto macinato e il tessuto vascolare.
I campioni di tessuto possono essere preparati a partire da parti animali o vegetali, come ossa, muscoli, foglie, ecc.
Fluidi per il corpo
Sangue, siero, plasma, plasma, liquido cerebrospinale, saliva e liquido sinoviale sono fluidi corporei che offrono una grande fonte di informazioni diagnosticamente rilevanti. Pertanto, è importante una sofisticata preparazione di campioni di fluidi corporei per l'analisi. La prima difficoltà è associata all'ampia gamma dinamica dei componenti presenti nei fluidi corporei.
Determinazione della concentrazione proteica
Bradford test, Lowry test e test dell'acido bicinconinico (BCA) sono saggi comuni per determinare la concentrazione di proteine. L'albumina sierica bovina (BSA) è uno degli standard proteici più frequentemente utilizzati.
Tampone di lisi
Il tampone di lisi deve essere scelto in funzione del materiale cellulare o del tessuto (coltura di tessuti, piante, batteri, funghi, ecc.), e se le cellule si trovano in una struttura e il tipo di struttura. Una vasta gamma di tamponi di lisi per l'estrazione di proteine, membrane e organelli sono formulati con uno o più detergenti. Il detersivo viene solitamente selezionato tramite test di prova ed errori oppure – se disponibile – secondo un protocollo esistente di estrazione delle proteine. Il detergente deve essere compatibile con la fonte di tessuto e le proteine. In generale, il detergente più delicato che lavora per uno specifico tessuto/proteine, viene scelto per mantenere la massima funzionalità dell'estratto. Inoltre, in caso di estrazione di membrane e organelli, un detergente delicato mantiene intatta la membrana. I detergenti comunemente usati nei tamponi di lisi sono per lo più non ionici o zitterionici, ad esempio CHAPS, desossicolato, Triton™ X-100, NP40 e Tween 20.
Per esempio, tessuti come cervello, fegato, fegato, intestino, reni, milza, ecc. possono essere semplicemente tamponati con RIPA. – tuttavia gli inibitori della proteasi e la DTT (ad esempio per l'elettroforesi su gel) dovrebbero essere inclusi.
Tampone di lisi per il tessuto muscolare scheletrico (ghiaccio freddo): 20 mM Tris (pH 7,8), 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 % Triton X-100, 10 % (p/v) glicerolo, 1 mM EDTA, 1 mM ditiotreitolo integrato con proteasi e cocktail inibitore della fosfatasi.
Tabella dei tamponi comuni e della loro gamma di pH. In generale, questi tamponi sono normalmente utilizzati a concentrazioni di 20-50 mM.
| Tampone | Intervallo di pH |
|---|---|
| Acido citrico – NaOh | 2.2 – 6.5 |
| Citrato di sodio – Acido citrico | 3.0 – 6.2 |
| Acetato di sodio – acido acetico | 3.6 – 5.6 |
| Sale di sodio dell'acido coccodilico – HCl | 5.0 – 7.4 |
| MES – NaOh | 5.6 – 6.8 |
| Diidrogeno fosfato di sodio – fosfato disodico di idrogeno fosfato disodico | 5.8 – 8.0 |
| Imidazolo – HCl | 6.2 – 7.8 |
| MOPS – KOH | 6.6 – 7.8 |
| Cloridrato di trietanolammina – NaOh | 6.8 – 8.8 |
| Tris – HCl | 7.0 – 9.0 |
| EUROPA..... – NaOh | 7.2 – 8.2 |
| Tricorno – NaOh | 7.6 – 8.6 |
| Tetraborato di sodio – acido borico | 7.6 – 9.2 |
| Bicicletta – NaOh | 7.7 – 8.9 |
| Glycine – NaOh | 8.6 – 10.6 |
La maggior parte dei tamponi mostra una dipendenza dal pH con la temperatura. Questo è particolarmente vero per i tamponi Tris. Il pKa passa da 8,06 a 25°C a 8,85 a 0°C.
(pH e pKa di un tampone: il pH misura la concentrazione di ioni idrogeno in una soluzione acquosa. pKa (= costante di dissociazione acida) è una misura correlata, ma più specifica, in quanto aiuta a prevedere come una molecola agirà ad un determinato valore di pH.)
TRIzolo
Il trizolo è una soluzione chimica utilizzata per estrarre RNA/DNA/proteine durante l'estrazione guanidinio tiocianato-fenolo cloroformio. L'uso dell'estrazione di TRIzol con l'ausilio di ultrasuoni consente di ottenere elevati rendimenti di DNA, RNA e proteine dallo stesso campione ed eccelle quindi in altri metodi di estrazione.