Estrazione di proteine a ultrasuoni da tessuti e colture cellulari
- L'estrazione delle proteine è una fase di preparazione del campione essenziale nella proteomica.
- Le proteine possono essere estratte da tessuti vegetali e animali, lieviti e microrganismi.
- La sonicazione è un metodo di estrazione delle proteine affidabile ed efficiente che consente di ottenere rese proteiche elevate in tempi brevi.
Estrazione di proteine da tessuti e cellule
L'estrazione di proteine da tessuti e cellule in coltura è una fase essenziale di preparazione del campione che viene eseguita durante molte tecniche biochimiche e analitiche come ELISA, PAGE, Western blotting, spettrometria di massa o purificazione delle proteine. La disgregazione, la lisi e l'estrazione cellulare a ultrasuoni è una tecnica non termica, controllabile con precisione, che garantisce un'elevata resa di proteine.
Estrazione delle proteine dalle cellule con il Sonda a ultrasuoni UP200St
- Rapido
- Rendimenti elevati
- altamente efficiente
- Controllo preciso dei parametri
- risultati riproducibili
- Scalabilità lineare
Istruzioni generali per la lisi a ultrasuoni e l'estrazione delle proteine
- Controllo della temperatura: Per garantire un'elevata resa proteica senza denaturazione termica, la temperatura durante l'estrazione deve essere controllata. I modernissimi omogeneizzatori a ultrasuoni Hielscher – chiamato anche disintegratore a ultrasuoni o ultrasonificatore – sono controllabili con precisione. Sono dotati di un sensore di temperatura collegabile. Nelle opzioni di impostazione dell'omogeneizzatore a ultrasuoni è possibile impostare una temperatura massima. Quando viene raggiunta questa temperatura massima, l'omogeneizzatore a ultrasuoni si arresta automaticamente finché il campione non si è raffreddato.
- Buffer: La scelta di un tampone adatto e del giusto volume di tampone varia da tessuto a tessuto e deve essere determinata mediante prove ed errori.
- Isolamento / purificazione: I lisati proteici possono contenere un eccesso di biomolecole come DNA o carboidrati, che possono essere rimossi mediante precipitazione proteica (acido desossicolato-tricloroacetico) o scambio di tamponi.
Chittapalo e Noomhorm (2009) hanno riportato nel loro studio che la resa proteica è aumentata utilizzando la sonicazione e che il processo di omogeneizzazione e lisi dei tessuti a ultrasuoni può migliorare significativamente i processi di estrazione esistenti. – consentendo nuove opportunità di estrazione commerciale.
Coccodrillo a ultrasuoni per la preparazione simultanea ed estremamente efficace di più campioni nelle stesse condizioni per l'isolamento delle proteine e la frammentazione del DNA.
Estrazione di proteine da tessuti animali
Per la preparazione di tessuti di dimensioni intere (ad es. reni, cuore, polmoni, muscoli ecc.), il tessuto deve essere sezionato in pezzi molto piccoli con strumenti puliti, preferibilmente in ghiaccio e il più rapidamente possibile per evitare la degradazione da parte delle proteasi (ad es. tampone di lisi come RIPA o tampone di lisi ipotonico contenente cocktail di inibitori di proteasi e fosfatasi). Dopo la dissezione, il campione viene immerso in azoto liquido per il congelamento istantaneo. Il campione può essere conservato a -80°C per un uso successivo o mantenuto in ghiaccio per l'omogeneizzazione immediata. Immediatamente prima dell'estrazione a ultrasuoni, il tampone di lisi freddo (con inibitori delle proteasi DTT, leupeptina e aprotinina) viene aggiunto rapidamente nella provetta del campione (per ~10 mg di tessuto si raccomandano circa ~600 μL di tampone). Si consigliano circa 20-60 mg di tessuto per provetta.
L'omogeneizzazione, la lisi e l'estrazione a ultrasuoni vengono eseguite con un omogeneizzatore a ultrasuoni come UP100H o UP200Ht, dotato di un sonotrodo a micropunte. La durata della sonicazione è di 60-90 sec. con una modalità di ciclo ultrasonico di 15 sec. di sonicazione e 10 sec. di riposo. Il campione deve essere sempre conservato nel ghiaccio.
Dopo l'omogeneizzazione/estrazione a ultrasuoni, il lisato viene centrifugato a 27.000 g per circa 20 minuti. Successivamente si raccoglie il surnatante, in modo da poter determinare la concentrazione proteica con un saggio proteico come il Pierce protein assay BCA.
Estrazione di proteine dal siero di sangue
Per ottenere una miscela omogenea di siero e tampone fosfato, il campione viene sottoposto a vortex prima della lisi cellulare a ultrasuoni. Per la lisi a ultrasuoni, il campione viene sonicato con un omogeneizzatore da laboratorio a ultrasuoni come l'UP100H per 8 cicli al 20% di ampiezza, per cicli di 5 secondi di accensione e 15 secondi di spegnimento. L'estrazione delle proteine viene effettuata sonicando a cicli (modalità pulsazione) e ponendo il campione in ghiaccio in modo da evitare il surriscaldamento e la degradazione termica del campione. Poiché il siero contiene una grande quantità di proteine ad alto peso molecolare (come l'albumina, l'α1-antitripsina, la transferrina, l'aptoglobulina, l'immunoglobulina G e l'immunoglobulina A), che interferiscono con la separazione delle proteine a basso peso molecolare durante la IEF, si raccomanda di eliminarle dal siero utilizzando una colonna di deplezione.
Estrazione di proteine da tessuti vegetali
I tessuti vegetali freschi e morbidi, ad esempio il muschio, ecc. possono essere facilmente disgregati semplicemente mettendo il materiale del campione tritato nel tampone di lisi per la sonicazione. I tessuti vegetali duri e lignificati, come semi, aghi di abete ecc. devono essere macinati a secco. Alcuni materiali vegetali duri e legnosi devono essere congelati e macinati in azoto liquido prima di essere estratti per sonicazione. Per le sospensioni di colture cellulari vegetali, un trattamento a ultrasuoni tra 30 e 150 secondi in un tampone di lisi è per lo più sufficiente. I materiali più duri, come i semi di zucca, richiedono una sonicazione più intensa, come descritto di seguito.
Protocollo per l'estrazione a ultrasuoni dell'albumina dai semi di zucca
Per l'estrazione proteica a ultrasuoni dell'albumina dalla polvere di semi di zucca macinati finemente, 10 g di polvere di semi di zucca sgrassati e 100 mL di acqua deionizzata come solvente vengono aggiunti in un becher di vetro da 250 mL. L'estrazione delle proteine avviene in due fasi: In primo luogo, il campione viene sonicato con un ultrasuonatore a sonda UP400St (400W, 24kHz) dotato di sonotrodo S24d7. Durante l'omogeneizzazione a ultrasuoni, il becher di vetro viene posto in un bagno di acqua fredda. Il sensore di temperatura collegabile e le impostazioni di controllo della temperatura dell'ultrasonorizzatore UP400St assicurano che la temperatura del campione sia sempre mantenuta al di sotto dei 30°C. Il controllo preciso della temperatura durante la sonicazione evita la denaturazione dell'albumina. In secondo luogo, l'estrazione è stata eseguita con un miscelatore alla velocità di 200 rpm e a 30°C. Successivamente, il becher è stato trasferito in un agitatore termostatico. La globulina viene rimossa tramite dialisi con acqua distillata. Dopo la rimozione della globulina, l'estratto proteico può essere campionato per la determinazione del profilo dell'albumina e viene successivamente regolato a pI=3,0 utilizzando HCl 0,1 M per la coagulazione dell'albumina. La fase solida viene separata mediante centrifugazione a 5000g, 20°C e ridisciogliata in acqua deionizzata. La coagulazione dell'albumina viene eseguita due volte per aumentare il rapporto proteico nel concentrato di albumina.
L'estrazione alcalina di proteine con ultrasuoni per la preparazione di un concentrato di proteine dalla crusca di riso dimostra che il trattamento con ultrasuoni consente di ottenere una maggiore resa proteica in un tempo di estrazione significativamente più breve. – rispetto ai metodi di estrazione convenzionali.
Protocollo di preparazione del campione per l'enzima iNOS funzionale
Per ottenere un enzima iNOS completamente funzionale (ad esempio per lo screening di farmaci), si raccomanda il seguente protocollo: La sospensione cellulare deve essere posta in ghiaccio e sonicata con un UP100H a 10µm di ampiezza con una modalità di ciclo di 5 sec. di sonicazione e 25 sec. di riposo in ghiaccio. La procedura deve essere ripetuta circa 3 volte. Il tempo di riposo tra i cicli di sonicazione riduce l'aumento di temperatura e quindi il rischio di denaturazione.
solubilizzazione delle proteine a ultrasuoni
La sonicazione può accelerare il processo di solubilizzazione delle proteine, che di solito richiede diverse ore. Per non surriscaldare il campione e prevenire la degradazione e le modifiche delle proteine nelle soluzioni contenenti urea, gli ultrasuoni non devono durare più di qualche secondo.
Ultrasuonatore UP200Ht con microtip S26d2 da 2 mm per la sonicazione di piccoli campioni.
Apparecchiature a ultrasuoni per l'estrazione delle proteine
Hielscher Ultrasonics offre un'ampia gamma di omogeneizzatori a ultrasuoni per la disintegrazione di cellule, tessuti, batteri, microrganismi, lieviti e spore.
Gli ultrasuoni da laboratorio Hielscher sono potenti e facili da usare. Costruiti per funzionare 24 ore su 24, 7 giorni su 7, sono progettati come dispositivi da laboratorio e da banco robusti ed efficienti. Per tutti i dispositivi è possibile controllare con precisione l'energia in uscita e l'ampiezza. L'ampia gamma di accessori offre ulteriori opzioni di configurazione. Gli ultrasuonatori digitali come VialTweeter, UP200Ht, UP200St e UP400St sono dotati di un controllo della temperatura integrato e di una scheda SD integrata per la registrazione automatica dei dati.
Per la sonicazione indiretta, senza contaminazione incrociata e simultanea di più campioni, offriamo il VialTweeter o il CupHorn a ultrasuoni.
La tabella che segue fornisce una panoramica dei nostri omogeneizzatori a ultrasuoni per la preparazione dei campioni, la disgregazione e l'estrazione delle cellule. Fate clic sul tipo di dispositivo per ottenere maggiori informazioni su ciascun omogeneizzatore a ultrasuoni. Il nostro personale tecnico, ben addestrato e di lunga esperienza, sarà lieto di aiutarvi a scegliere l'ultrasuonizzatore più adatto alla preparazione del vostro campione!
| Volume di batch | Portata | Dispositivi raccomandati |
|---|---|---|
| fino a 10 fiale o provette | n.a. | VialTweeter |
| piastre multiwell / microtiter | n.a. | UIP400MTP |
| tubi multipli / recipienti | n.a. | Cuphorn |
| 1 - 500mL | 10 - 200mL/min | UP100H |
| Da 10 a 1000 ml | Da 20 a 200 mL/min | UP200Ht, UP200St |
| 10 - 2000mL | 20 - 400mL/min | UP400St |
A seconda dell'applicazione, del materiale e del volume del campione, vi consiglieremo la configurazione più adatta per la preparazione del vostro campione. Contattateci oggi stesso!
Contattateci! / Chiedi a noi!
Gli ultrasuonatori digitali Hielscher sono dotati di un controllo remoto via browser e di una protocollatura automatica dei dati su una scheda SD integrata.
VialTweeter per la sonicazione indiretta.
Particolarità / Cose da sapere
proteomica
La proteomica è il campo di ricerca che studia le proteine e il proteoma. Le proteine svolgono una vasta gamma di funzioni vitali all'interno degli organismi. Il proteoma è l'insieme delle proteine espresse da un genoma, una cellula, un tessuto o un organismo in un determinato momento. Il proteoma varia con il tempo e con i diversi requisiti, o stress, a cui una cellula o un organismo sono sottoposti. Più specificamente, è l'insieme delle proteine espresse in un dato tipo di cellula o organismo, in un dato momento, in condizioni definite. Il termine è una combinazione di proteine e genoma. La proteomica è lo studio del proteoma.
proteina
Le proteine sono biomolecole di grandi dimensioni, le cosiddette macromolecole. – che sono composte da una o più lunghe catene di residui di amminoacidi. Le proteine sono presenti in tutti gli organismi di origine sia vegetale che animale e sono fondamentali per la maggior parte delle funzioni biologiche. Poiché le proteine contengono molte informazioni biologiche, vengono estratte a scopo analitico, ad esempio per la ricerca proteomica. Le funzioni più importanti svolte dalle proteine includono la catalisi delle reazioni metaboliche, la replicazione del DNA, la risposta agli stimoli e il trasporto di molecole da un luogo all'altro. Le proteine si differenziano l'una dall'altra principalmente per la loro sequenza di amminoacidi, dettata dalla sequenza nucleotidica dei loro geni, che di solito si traduce nel ripiegamento della proteina in una specifica struttura tridimensionale che ne determina l'attività. Le proteine sono – oltre ai peptidi – uno dei componenti chiave degli alimenti. Pertanto, la proteomica è uno strumento potente nella scienza alimentare per ottimizzare i processi, la sicurezza alimentare e la valutazione nutrizionale.
Cloud Point Extraction
Cloud Point Extraction è una procedura preanalitica per separare e preconcetrare gli analiti. In combinazione con gli ultrasuoni, l'estrazione del punto di nuvola può essere intensificata rendendo il processo più efficiente, più veloce e più rispettoso dell'ambiente. Con gli ultrasuoni, l'estrazione del punto di nuvola è un metodo significativamente più efficiente per la preparazione degli analiti. Per saperne di più sull'estrazione del punto di nuvola assistita dagli ultrasuoni!Elettroforesi su gel
L'elettroforesi su gel è il metodo principale per la separazione e l'analisi di macromolecole come DNA, RNA e proteine, nonché dei loro frammenti, in base alle loro dimensioni e alla loro carica. È utilizzata in chimica clinica per separare le proteine in base alla carica e/o alla dimensione (agarosio IEF, essenzialmente indipendente dalla dimensione) e in biochimica, biologia molecolare e proteomica per separare una popolazione mista di frammenti di DNA e RNA in base alla lunghezza, per stimare la dimensione dei frammenti di DNA e RNA o per separare le proteine in base alla carica.
colture cellulari
La coltura cellulare è il processo di crescita controllata mediante il quale le cellule vengono coltivate in condizioni controllate. Le condizioni di coltura cellulare variano a seconda del tipo di cellula. In generale, l'ambiente di una coltura cellulare consiste in un recipiente adatto (ad esempio, una piastra di Petri) con un substrato o un terreno di coltura che fornisce i nutrienti essenziali (aminoacidi, carboidrati, vitamine, minerali), fattori di crescita, ormoni e gas (CO2, O2) e regola l'ambiente fisico-chimico (tampone di pH, pressione osmotica, temperatura). La maggior parte delle cellule necessita di una superficie o di un substrato artificiale, mentre altre colture cellulari possono essere coltivate libere di galleggiare nel terreno di coltura (coltura in sospensione, sospensione cellulare).
Le colture di massa di linee cellulari animali sono utilizzate nella produzione industriale di vaccini virali e altri prodotti derivati dalle biotecnologie. Le cellule staminali umane vengono coltivate per espandere il numero di cellule e differenziarle in vari tipi di cellule somatiche a scopo di trapianto.
Campioni di tessuto
Il termine tessuto descrive un intermedio cellulare, in cui il materiale cellulare si trova a un livello organizzativo intermedio tra le cellule e un organo completo. Nel tessuto sono assemblate cellule simili, provenienti dalla stessa origine, che insieme svolgono una funzione specifica. Dal raggruppamento funzionale di più tessuti si formano le strutture complesse degli organi.
I tessuti vengono prelevati per ricerche di biologia, istologia/istopatologia, parassitologia, biochimica, immunoistochimica, nonché per coltivare ed estrarre il DNA. Si distingue tra tessuto animale (suddivisione: tessuto dei mammiferi) e tessuto vegetale. I tessuti animali sono raggruppati nei quattro tipi fondamentali di tessuto connettivo, muscolare, nervoso ed epiteliale. I tessuti vegetali sono suddivisi nei seguenti tre sistemi tissutali: l'epidermide, il tessuto del suolo e il tessuto vascolare.
I campioni di tessuto possono essere preparati da parti animali o vegetali, ad esempio ossa, muscoli, foglie, ecc.
Fluidi corporei
Sangue, siero, plasma, liquido cerebrospinale, saliva e liquido sinoviale sono fluidi corporei che offrono una grande fonte di informazioni rilevanti dal punto di vista diagnostico. Pertanto, è importante una preparazione sofisticata dei campioni di fluidi corporei da analizzare. La prima difficoltà è associata all'ampia gamma dinamica di componenti presenti nei fluidi corporei.
Determinazione della concentrazione di proteine
Il saggio di Bradford, il saggio di Lowry e il saggio dell'acido bicinchoninico (BCA) sono saggi comuni per determinare la concentrazione delle proteine. L'albumina di siero bovino (BSA) è uno degli standard proteici più frequentemente utilizzati.
tampone di lisi
Il tampone di lisi deve essere scelto in base al materiale cellulare o al tessuto (coltura di tessuto, pianta, batterio, fungo, ecc.), e se le cellule sono in una struttura e il tipo di struttura. Un'ampia gamma di tamponi di lisi per l'estrazione di proteine, membrane e organelli è formulata con uno o più detergenti. Il detergente viene di solito selezionato tramite test di prova ed errore o – se disponibile – secondo un protocollo di estrazione delle proteine esistente. Il detergente deve essere compatibile con la fonte tissutale e le proteine. In generale, si sceglie il detergente più delicato che funziona per uno specifico tessuto/proteina, al fine di mantenere la massima funzionalità dell'estratto. Inoltre, in caso di estrazione di membrane e organelli, un detergente delicato mantiene intatta la membrana. I detergenti comunemente usati nei tamponi di lisi sono per lo più non ionici o zwitterionici, ad esempio CHAPS, desossicolato, Triton™ X-100, NP40, e Tween 20.
Ad esempio, tessuti come cervello, fegato, intestino, rene, milza, ecc. possono essere semplicemente tamponati con RIPA – Tuttavia, devono essere inclusi gli inibitori delle proteasi e il DTT (ad esempio per l'elettroforesi su gel).
Tampone di lisi per tessuto muscolare scheletrico (freddo come il ghiaccio): 20 mM Tris (pH 7,8), 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1% Triton X-100, 10% (p/v) glicerolo, 1 mM EDTA, 1 mM ditiotreitolo integrato con cocktail di inibitori di proteasi e fosfatasi.
Tabella dei tamponi più comuni e del loro intervallo di pH. In generale, questi tamponi sono normalmente utilizzati a concentrazioni di 20-50 mM.
| tampone | Intervallo di pH |
|---|---|
| Acido citrico – NaOH | 2.2 – 6.5 |
| Sodio citrato – Acido citrico | 3.0 – 6.2 |
| Acetato di sodio – acido acetico | 3.6 – 5.6 |
| Acido cacodilico sale sodico – HCl | 5.0 – 7.4 |
| MES – NaOH | 5.6 – 6.8 |
| Sodio diidrogeno fosfato – idrogeno fosfato disodico | 5.8 – 8.0 |
| imidazolo – HCl | 6.2 – 7.8 |
| MOPS – KOH | 6.6 – 7.8 |
| Trietanolamina cloridrato – NaOH | 6.8 – 8.8 |
| Tris – HCl | 7.0 – 9.0 |
| HEPES – NaOH | 7.2 – 8.2 |
| Tricina – NaOH | 7.6 – 8.6 |
| Tetraborato di sodio – acido borico | 7.6 – 9.2 |
| Bicina – NaOH | 7.7 – 8.9 |
| glicina – NaOH | 8.6 – 10.6 |
La maggior parte dei tamponi mostra una dipendenza del pH dalla temperatura. Ciò è particolarmente vero per i tamponi Tris. Il pKa passa da 8,06 a 25°C a 8,85 a 0°C.
(pH e pKa di un tampone: il pH misura la concentrazione di ioni idrogeno in una soluzione acquosa. Il pKa (= costante di dissociazione acida) è una misura correlata, ma più specifica, in quanto aiuta a prevedere come si comporterà una molecola a un determinato valore di pH).
TRIzol
Il TRIzol è una soluzione chimica utilizzata per estrarre RNA/DNA/proteine durante l'estrazione con guanidinio tiocianato-fenolo-cloroformio. L'uso dell'estrazione TRIzol assistita da ultrasuoni consente di ottenere elevate rese di DNA, RNA e proteine dallo stesso campione, superando così altri metodi di estrazione.
Letteratura/riferimenti
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates. Int J Food Sci Technol 44: 1843–1849.
- Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D’Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Efficient recovery of proteins from multiple source samples after trizol or trizol LS RNA extraction and long-term storage. BMC Genomics 2013, 14:181.