Estrazione di proteine da tessuti e colture cellulari mediante ultrasuoni

• L’estrazione delle proteine è una fase essenziale della preparazione dei campioni in proteomica.
• Le proteine possono essere estratte da tessuti vegetali e animali, lieviti e microrganismi.
• La sonicazione è un metodo affidabile ed efficiente per l’estrazione delle proteine, che consente di ottenere rese proteiche elevate in tempi di estrazione brevi.

Estrazione di proteine da tessuti e cellule

L’estrazione delle proteine da tessuti e cellule in coltura è una fase essenziale della preparazione dei campioni, eseguita nell’ambito di numerose tecniche biochimiche e analitiche, quali ELISA, PAGE, Western blotting, spettrometria di massa o purificazione delle proteine. La disgregazione cellulare, la lisi e l’estrazione mediante ultrasuoni costituiscono una tecnica non termica, controllabile con precisione, che garantisce rese proteiche elevate.

Istruzioni generali per la lisi e l’estrazione delle proteine mediante ultrasuoni

• Controllo della temperatura: Per garantire una resa proteica elevata senza denaturazione termica, è necessario controllare la temperatura durante l’estrazione. Gli omogeneizzatori a ultrasuoni all’avanguardia di Hielscher – chiamati anche disintegratori a ultrasuoni o sonicatori – sono controllabili con precisione. Sono dotati di un sensore di temperatura collegabile. Nelle opzioni di configurazione dell’omogeneizzatore a ultrasuoni è possibile impostare una temperatura massima. Quando questa temperatura massima viene raggiunta, il sonicatore si arresta automaticamente finché il campione non si è raffreddato.
• Tampone: La scelta di un tampone idoneo e del volume appropriato varia da tessuto a tessuto e deve essere determinata mediante prove per tentativi.
• Isolamento / purificazione: I lisati proteici possono contenere un eccesso di biomolecole, come DNA o carboidrati, che possono essere rimosse mediante precipitazione delle proteine (desossicolato–acido tricloroacetico) o sostituzione del tampone.

Chittapalo e Noomhorm (2009) hanno riportato nel loro studio che la resa proteica aumentava utilizzando la sonicazione e che il processo di omogeneizzazione e lisi dei tessuti mediante ultrasuoni può migliorare significativamente i processi di estrazione esistenti – aprendo nuove possibilità di estrazione su scala commerciale.
 

Estrazione di proteine da tessuti animali

Per la preparazione di tessuti interi (ad es. rene, cuore, polmone, muscolo ecc.), il tessuto deve essere sezionato in pezzi molto piccoli con strumenti puliti, preferibilmente su ghiaccio, e il più rapidamente possibile per prevenire la degradazione da parte delle proteasi (ad es. tampone di lisi come RIPA o tampone di lisi ipotonico contenente un cocktail di inibitori delle proteasi e delle fosfatasi). Dopo il sezionamento, il campione viene immerso in azoto liquido per il congelamento rapido. Il campione può essere conservato a -80°C per un utilizzo successivo oppure mantenuto su ghiaccio per l’omogeneizzazione immediata. Immediatamente prima dell’estrazione mediante ultrasuoni, si aggiunge rapidamente nella provetta del campione un tampone di lisi freddo come il ghiaccio (con gli inibitori delle proteasi DTT, leupeptina e aprotinina); per ~10 mg di tessuto si raccomandano circa ~600 μL di tampone. Si raccomandano circa 20–60mg di tessuto per provetta.
L’omogeneizzazione, la lisi e l’estrazione mediante ultrasuoni vengono eseguite con un omogeneizzatore a ultrasuoni come UP100H o UP200Ht, dotato di un sonotrodo con micropunta. La durata della sonicazione è di 60–90 sec., in modalità ciclica con 15 sec. di sonicazione e 10 sec. di pausa. Il campione deve essere mantenuto nel ghiaccio per tutto il tempo.
Dopo l’omogeneizzazione / estrazione mediante ultrasuoni, il lisato viene centrifugato a 27.000g per circa 20 min. Successivamente si raccoglie il surnatante, in modo da poter determinare la concentrazione proteica mediante un saggio proteico, come il saggio BCA Pierce.

Estrazione di proteine dal siero ematico

Per ottenere una miscela omogenea di siero e tampone fosfato, il campione viene prima miscelato con un agitatore vortex, prima della lisi cellulare mediante ultrasuoni. Per la lisi mediante ultrasuoni, il campione viene sottoposto a sonicazione con un omogeneizzatore a ultrasuoni da laboratorio, come UP100H, per 8 cicli al 20% di ampiezza, ciascuno con 5 secondi di attività e 15 secondi di pausa. L’estrazione delle proteine viene eseguita mediante sonicazione a cicli (modalità pulsata), collocando il campione su ghiaccio per evitarne il surriscaldamento e la degradazione termica. Poiché il siero contiene una grande quantità di proteine ad alto peso molecolare (come albumina, α1-antitripsina, transferrina, aptoglobulina, immunoglobulina G e immunoglobulina A), che interferiscono con la separazione delle proteine a basso peso molecolare durante l’IEF, si raccomanda di rimuoverle dal siero utilizzando una colonna di deplezione.

Estrazione di proteine da tessuti vegetali

I tessuti vegetali freschi e morbidi, ad es. il muschio ecc., possono essere facilmente disgregati semplicemente collocando il materiale del campione sminuzzato nel tampone di lisi per la sonicazione. I tessuti vegetali resistenti e lignificati, come semi, aghi di abete ecc., devono essere macinati a secco. Alcuni materiali vegetali duri e legnosi devono essere congelati e macinati in azoto liquido prima dell’estrazione mediante sonicazione. Per le sospensioni di colture cellulari vegetali, un trattamento a ultrasuoni di durata compresa tra 30 e 150 secondi in un tampone di lisi è generalmente sufficiente. I materiali più resistenti, come i semi di zucca, richiedono una sonicazione più intensa, come descritto di seguito.
 

Protocollo per l’estrazione dell’albumina dai semi di zucca mediante ultrasuoni

Per l’estrazione dell’albumina mediante ultrasuoni dalla polvere di semi di zucca finemente macinati, si aggiungono 10 g di polvere di semi di zucca sgrassata e 100 mL di acqua deionizzata come solvente in un becher di vetro da 250mL. L’estrazione delle proteine consiste in due fasi: inizialmente, il campione viene sottoposto a sonicazione con un sonicatore a sonda UP400St (400W, 24kHz) dotato di sonotrodo S24d7. Il becher di vetro viene collocato in un bagno di acqua fredda durante l’omogeneizzazione mediante ultrasuoni. Il sensore di temperatura collegabile e le impostazioni di controllo della temperatura del sonicatore UP400St garantiscono che la temperatura del campione sia sempre mantenuta al di sotto di 30°C. Il controllo preciso della temperatura durante la sonicazione evita la denaturazione dell’albumina. Nella seconda fase, l’estrazione è stata eseguita con un miscelatore a una velocità di 200 rpm e a 30°C. Successivamente, il becher viene trasferito in un agitatore termostatato. La globulina viene rimossa mediante dialisi con acqua distillata. Dopo la rimozione della globulina, è possibile prelevare un campione dell’estratto proteico per determinare il profilo dell’albumina; successivamente, l’estratto viene portato a pI=3,0 utilizzando HCl 0,1 M per la coagulazione dell’albumina. La fase solida viene separata mediante centrifugazione a 5000g, 20°C e ridisciolta in acqua deionizzata. La coagulazione dell’albumina viene eseguita due volte per aumentare la proporzione di proteine nel concentrato di albumina.

L’estrazione alcalina delle proteine mediante ultrasuoni per la preparazione di concentrato proteico dalla crusca di riso mostra che il trattamento a ultrasuoni consente di ottenere una resa proteica più elevata in un tempo di estrazione significativamente più breve – rispetto ai metodi di estrazione convenzionali.

Protocollo di preparazione del campione per l’enzima iNOS funzionale

Per ottenere l’enzima iNOS pienamente funzionale (ad es. per lo screening di farmaci), si raccomanda il seguente protocollo: la sospensione cellulare deve essere collocata su ghiaccio e sottoposta a sonicazione con un UP100H a un’ampiezza di 10µm, in modalità ciclica con 5 sec. di sonicazione e 25 sec. di pausa su ghiaccio. La procedura deve essere ripetuta circa 3 volte. Il tempo di pausa tra i cicli di sonicazione limita l’aumento della temperatura e riduce quindi il rischio di denaturazione.

Solubilizzazione delle proteine mediante ultrasuoni

La sonicazione può accelerare il processo di solubilizzazione delle proteine, che solitamente richiede diverse ore. Per evitare il surriscaldamento del campione e prevenire la degradazione e le modificazioni delle proteine nelle soluzioni contenenti urea, gli impulsi ultrasonici non devono durare più di pochi secondi.

Apparecchiature a ultrasuoni per l’estrazione delle proteine

Hielscher Ultrasonics offre un’ampia gamma di omogeneizzatori a ultrasuoni per la disgregazione di cellule, tessuti, batteri, microrganismi, lieviti e spore.
I sonicatori da laboratorio Hielscher sono potenti e facili da utilizzare. Costruiti per il funzionamento 24/7, sono progettati come dispositivi da laboratorio e da banco robusti ed efficienti. Per tutti i dispositivi, l’energia erogata e l’ampiezza possono essere controllate con precisione. L’ampia gamma di accessori offre ulteriori opzioni di configurazione. I sonicatori digitali, come VialTweeter, UP200Ht, UP200St e UP400St, dispongono di un controllo della temperatura integrato e di una scheda SD incorporata per la registrazione automatica dei dati.
Per la sonicazione indiretta, simultanea e senza contaminazione incrociata di più campioni, offriamo VialTweeter o CupHorn a ultrasuoni.
La tabella seguente offre una panoramica dei nostri sonicatori per la preparazione dei campioni, la disgregazione cellulare e l’estrazione. Fate clic sul modello del dispositivo per ottenere maggiori informazioni su ciascun omogeneizzatore a ultrasuoni. Il nostro personale tecnico, altamente qualificato e con una lunga esperienza, sarà lieto di aiutarvi a scegliere il sonicatore più adatto alla preparazione dei vostri campioni!
 

In base alla vostra applicazione, al materiale e al volume del campione, vi consiglieremo la configurazione più adatta alla preparazione dei vostri campioni. Contattateci oggi stesso!