Estrazione ultrasonica di proteine da tessuti e colture cellulari

  • L'estrazione delle proteine è una fase essenziale della preparazione del campione nella proteomica.
  • Le proteine possono essere estratte da tessuti vegetali e animali, lieviti e microrganismi.
  • La sonicazione è un metodo di estrazione delle proteine affidabile ed efficiente, che fornisce elevate rese proteiche in un breve tempo di estrazione.

Estrazione di proteine da tessuti e cellule

L'estrazione di proteine da tessuti e cellule in coltura è una fase essenziale di preparazione del campione che viene eseguita durante molte tecniche biochimiche e analitiche come ELISA, PAGE, Western blotting, spettrometria di massa o purificazione delle proteine. La disgregazione, la lisi e l'estrazione cellulare a ultrasuoni è una tecnica non termica, controllabile con precisione, che garantisce un'elevata resa di proteine.

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Gli ultrasuonatori a sonda, come l'UP200St, sono omogeneizzatori di tessuti affidabili e ampiamente utilizzati per la preparazione dei campioni nella ricerca genetica e proteomica.

Estrazione di proteine da cellule con il Sonda a ultrasuoni UP200St

Vantaggi della lisi a ultrasuoni e dell'estrazione delle proteine
 

  • Rapido
  • rendimenti elevati
  • altamente efficiente
  • Controllo preciso dei parametri
  • risultati riproducibili
  • Scalabilità lineare

Istruzioni generali per la lisi a ultrasuoni e l'estrazione delle proteine

  • Controllo della temperatura: Per garantire un'elevata resa proteica senza denaturazione termica, la temperatura durante l'estrazione deve essere controllata. Omogeneizzatori ad ultrasuoni all'avanguardia di Hielscher – chiamato anche disintegratore a ultrasuoni o ultrasonificatore – sono controllabili con precisione. Sono dotati di un sensore di temperatura collegabile. Nelle opzioni di impostazione dell'omogeneizzatore ad ultrasuoni è possibile impostare una temperatura massima. Quando questa temperatura massima viene raggiunta, l'ultrasuoni si arresta automaticamente fino a quando il campione non si è raffreddato.
  • Tampone: La scelta di un tampone adeguato e del giusto volume di tampone varia da tessuto a tessuto e deve essere determinata mediante prove ed errori.
  • Isolamento / purificazione: I lisati proteici possono contenere un eccesso di biomolecole come DNA o carboidrati, che possono essere rimossi mediante precipitazione proteica (acido desossicolato-tricloroacetico) o scambio di tamponi.

Chittapalo e Noomhorm (2009) hanno riportato nel loro studio che la resa proteica è aumentata utilizzando la sonicazione e che il processo di omogeneizzazione e lisi dei tessuti a ultrasuoni può migliorare significativamente i processi di estrazione esistenti. – consentire nuove opportunità di estrazione commerciale.
 

CupHorn a ultrasuoni per la preparazione simultanea di più campioni nelle stesse condizioni per l'isolamento delle proteine e la frammentazione del DNA.

CupHorn ad ultrasuoni per la preparazione simultanea ed estremamente efficace di più campioni nelle stesse condizioni per l'isolamento delle proteine e la frammentazione del DNA.

Estrazione di proteine dal tessuto animale

L'Ultrasuonatore UP100H è un omogeneizzatore da laboratorio spesso utilizzato per la preparazione dei campioni delle piastre di coltura cellulare.Per la preparazione di tessuti integrali (ad es. reni, cuore, cuore, polmoni, muscoli, ecc.), il tessuto dovrebbe essere sezionato in pezzi molto piccoli con strumenti puliti, preferibilmente su ghiaccio, e il più rapidamente possibile per prevenire la degradazione da parte delle proteasi (ad es. tampone di lisi come RIPA o tampone di lisi ipotonico contenente proteasi e cocktail inibitore della fosfatasi). Dopo la dissezione, il campione viene immerso in azoto liquido per essere congelato a scatto. Il campione può essere conservato a -80°C per un uso successivo o conservato su ghiaccio per un'immediata omogeneizzazione. Immediatamente prima dell'estrazione ad ultrasuoni, il tampone di lisi a freddo (con inibitori della proteasi DTT, lepeptina e aprotinina) viene aggiunto rapidamente nella provetta del campione (per ~ 10 mg di tessuto circa ~ 600 μL di tampone sono raccomandati). Si raccomandano circa 20-60 mg di tessuto per provetta.
L'omogeneizzazione, la lisi e l'estrazione a ultrasuoni vengono eseguite con un omogeneizzatore a ultrasuoni come UP100H o UP200Ht, dotato di un sonotrodo a micropunte. La durata della sonicazione è di 60-90 sec. con una modalità di ciclo ultrasonico di 15 sec. di sonicazione e 10 sec. di riposo. Il campione deve essere tenuto sempre nel ghiaccio.
Dopo l'omogeneizzazione/estrazione ad ultrasuoni, il lisato viene centrifugato a 27.000 g per circa 20 min. Successivamente viene raccolto il supernatente, in modo che la concentrazione proteica possa essere determinata da un dosaggio proteico come il Pierce protein assay BCA.

Estrazione di proteine dal siero del sangue

Per ottenere una miscela omogenea di siero e tampone fosfato, il campione viene sottoposto a vortex prima della lisi cellulare a ultrasuoni. Per la lisi a ultrasuoni, il campione viene sonicato con un omogeneizzatore da laboratorio a ultrasuoni come l'UP100H per 8 cicli al 20% di ampiezza, per cicli di 5 secondi di accensione e 15 secondi di spegnimento. L'estrazione delle proteine viene effettuata sonicando a cicli (modalità pulsazione) e ponendo il campione in ghiaccio in modo da evitare il surriscaldamento e la degradazione termica del campione. Poiché il siero contiene una grande quantità di proteine ad alto peso molecolare (come l'albumina, l'α1-antitripsina, la transferrina, l'aptoglobulina, l'immunoglobulina G e l'immunoglobulina A), che interferiscono con la separazione delle proteine a basso peso molecolare durante la IEF, si raccomanda di eliminarle dal siero utilizzando una colonna di deplezione.

Estrazione di proteine dal tessuto vegetale

I tessuti vegetali freschi e molli, come il muschio, ecc. possono essere facilmente interrotti semplicemente mettendo il campione tritato nel tampone di lisi per la sonicazione. I tessuti vegetali legnose e resistenti, come i semi, gli aghi di abete, ecc. devono essere macinati a secco. Alcuni materiali vegetali duri e legnosi devono essere congelati e macinati in azoto liquido prima di essere estratti mediante sonicazione. Per le sospensioni di colture di cellule vegetali, è sufficiente un trattamento ultrasonico tra 30 e 150 secondi in un tampone di lisi. Materiali più duri come i semi di zucca richiedono una sonicazione più intensa come descritto di seguito.
 

Questo tutorial spiega qual è il tipo di sonicatore migliore per le attività di preparazione dei campioni, come la lisi, la disgregazione delle cellule, l'isolamento delle proteine, la frammentazione del DNA e dell'RNA nei laboratori, nelle analisi e nella ricerca. Scegliete il tipo di sonicatore ideale per la vostra applicazione, il volume del campione, il numero di campioni e la produttività. Hielscher Ultrasonics ha l'omogeneizzatore a ultrasuoni ideale per voi!

Come trovare il sonicatore perfetto per la disgregazione cellulare e l'estrazione di proteine in ambito scientifico e analitico

Miniatura del video

 

Protocollo per l'estrazione ad ultrasuoni dell'albumina dai semi di zucca

Omogeneizzatore ad ultrasuoni UP400St con S24d40 - per l'estrazione di proteine da tessuti vegetali e animali (Clicca per ingrandire!)Per l'estrazione proteica a ultrasuoni dell'albumina dalla polvere di semi di zucca macinati finemente, 10 g di polvere di semi di zucca sgrassati e 100 mL di acqua deionizzata come solvente vengono aggiunti in un becher di vetro da 250 mL. L'estrazione delle proteine avviene in due fasi: In primo luogo, il campione viene sonicato con un ultrasuonatore a sonda UP400St (400W, 24kHz) dotato di sonotrodo S24d7. Durante l'omogeneizzazione a ultrasuoni, il becher di vetro viene posto in un bagno di acqua fredda. Il sensore di temperatura collegabile e le impostazioni di controllo della temperatura dell'ultrasonorizzatore UP400St assicurano che la temperatura del campione sia sempre mantenuta al di sotto dei 30°C. Il controllo preciso della temperatura durante la sonicazione evita la denaturazione dell'albumina. In secondo luogo, l'estrazione è stata eseguita con un miscelatore alla velocità di 200 giri/minuto e a 30°C. Successivamente, il becher è stato trasferito in un agitatore termostatico. La globulina viene rimossa tramite dialisi con acqua distillata. Dopo la rimozione della globulina, l'estratto proteico può essere campionato per la determinazione del profilo dell'albumina e viene successivamente regolato a pI=3,0 utilizzando HCl 0,1 M per la coagulazione dell'albumina. La fase solida viene separata mediante centrifugazione a 5000g, 20°C e ridisciogliata in acqua deionizzata. La coagulazione dell'albumina viene eseguita due volte per aumentare il rapporto proteico nel concentrato di albumina.

L'estrazione ultrasonica di proteine alcaline alcaline per la preparazione di concentrato proteico dalla crusca di riso mostra che il trattamento ad ultrasuoni si traduce in una maggiore resa proteica in un tempo di estrazione significativamente più breve. – rispetto ai metodi di estrazione convenzionali.

Questo videoclip mostra l'omogeneizzatore a ultrasuoni UP100H di Hielscher, un apparecchio ad ultrasuoni ampiamente utilizzato per la preparazione dei campioni nei laboratori.

Omogeneizzatore a ultrasuoni UP100H

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Protocollo di preparazione del campione per l'enzima funzionale iNOS

Per ottenere un enzima iNOS completamente funzionale (ad esempio per lo screening di farmaci), si raccomanda il seguente protocollo: La sospensione cellulare deve essere posta in ghiaccio e sonicata con un UP100H a 10µm di ampiezza con una modalità di ciclo di 5 sec. di sonicazione e 25 sec. di riposo in ghiaccio. La procedura deve essere ripetuta circa 3 volte. Il tempo di riposo tra i cicli di sonicazione riduce l'aumento di temperatura e quindi il rischio di denaturazione.

Solubilizzazione ultrasonica delle proteine

La sonicazione può accelerare il processo di solubilizzazione delle proteine, che di solito richiede diverse ore. Per non surriscaldare il campione e prevenire la degradazione proteica e le modifiche nelle soluzioni contenenti urea, le esplosioni ad ultrasuoni non dovrebbero durare più di pochi secondi.

Il VialTweeter è un sistema ad ultrasuoni unico nel suo genere per la sonicazione simultanea di un massimo di 10 fiale nelle stesse identiche condizioni senza contaminazione crociata.

UP200St con VialTweeter per la sonicazione di flaconi chiusi

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Ultrasuoni UP200Ht con microtip S26d2 per la lisi a ultrasuoni di campioni biologici

Ultrasuonatore UP200Ht con microtip S26d2 da 2 mm per la sonicazione di piccoli campioni.

Apparecchiature ad ultrasuoni per l'estrazione delle proteine

Hielscher Ultrasonics offre una vasta gamma di omogeneizzatori ad ultrasuoni per la disintegrazione di cellule, tessuti, batteri, microrganismi, lieviti e spore.
Gli ultrasuoni da laboratorio Hielscher sono potenti e facili da usare. Costruiti per funzionare 24 ore su 24, 7 giorni su 7, sono progettati come dispositivi da laboratorio e da banco robusti ed efficienti. Per tutti i dispositivi è possibile controllare con precisione l'energia in uscita e l'ampiezza. L'ampia gamma di accessori offre ulteriori opzioni di configurazione. Gli ultrasuonatori digitali come VialTweeter, UP200Ht, UP200St e UP400St sono dotati di un controllo della temperatura integrato e di una scheda SD integrata per la registrazione automatica dei dati.
Per la sonicazione indiretta, senza contaminazione incrociata e simultanea di più campioni, offriamo il VialTweeter o il CupHorn a ultrasuoni.
La tabella che segue fornisce una panoramica dei nostri omogeneizzatori a ultrasuoni per la preparazione dei campioni, la disgregazione e l'estrazione delle cellule. Fate clic sul tipo di dispositivo per ottenere maggiori informazioni su ciascun omogeneizzatore a ultrasuoni. Il nostro personale tecnico, ben addestrato e di lunga esperienza, sarà lieto di aiutarvi a scegliere l'ultrasuonizzatore più adatto alla preparazione del vostro campione!
 

Volume di batch Portata Dispositivi raccomandati
fino a 10 fiale o provette n.a. VialTweeter
piastre multiwell / microtiter n.a. UIP400MTP
tubi multipli / recipienti n.a. Cuphorn
1 - 500mL 10 - 200mL/min UP100H
Da 10 a 1000 ml Da 20 a 200 mL/min UP200Ht, UP200St
10 - 2000mL 20 - 400mL/min UP400St

A seconda dell'applicazione, del materiale e del volume del campione, vi raccomandiamo la configurazione più adatta per la preparazione del campione. Contattaci oggi stesso!

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Utilizzate il modulo sottostante per richiedere ulteriori informazioni sugli omogeneizzatori a ultrasuoni, sulle applicazioni in biotecnologia e proteomica e sui prezzi. Saremo lieti di discutere con voi il vostro processo di disgregazione cellulare e di estrazione delle proteine e di offrirvi un omogeneizzatore a ultrasuoni che soddisfi le vostre esigenze!









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Il video mostra il sistema di preparazione del campione ad ultrasuoni UIP400MTP, che permette la preparazione affidabile del campione di qualsiasi piastra standard a più pozzetti utilizzando ultrasuoni ad alta intensità. Le applicazioni tipiche dell'UIP400MTP comprendono la lisi delle cellule, il taglio di DNA, RNA e cromatina e l'estrazione delle proteine.

Ultrasuonatore UIP400MTP per la sonicazione di piastre a più pozzetti

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Gli ultrasuonatori Hielscher possono essere controllati a distanza tramite un controllo via browser. I parametri di sonicazione possono essere monitorati e regolati con precisione in base ai requisiti del processo.

Gli ultrasuonatori digitali Hielscher sono dotati di un controllo remoto via browser e di una protocollatura automatica dei dati su una scheda SD integrata.

Dispositivo ad ultrasuoni VialTweeter per l'estrazione di proteine da campioni di tessuto (Clicca per ingrandire!)

VialTweeter per la sonicazione indiretta.



Particolarità / Cose da sapere

Proteomica

La proteomica è il campo di ricerca che studia le proteine e il proteoma. Le proteine svolgono una vasta gamma di funzioni vitali all'interno degli organismi. Il proteoma è l'intero insieme di proteine espresse da un genoma, cellula, tessuto o organismo in un determinato momento. Il proteoma varia con il tempo e le esigenze distinte, o stress, che una cellula o un organismo subisce. Più specificamente, è l'insieme di proteine espresse in un dato tipo di cellula o organismo, in un dato momento, in condizioni definite. Il termine è una miscela di proteine e genoma. La proteomica è lo studio del proteoma.

Proteine

Le proteine sono grandi biomolecole, le cosiddette macromolecole. – che sono composti da una o più lunghe catene di residui di amminoacidi. Le proteine sono presenti in tutti gli organismi di origine vegetale e animale e sono fondamentali per la maggior parte delle funzioni biologiche. Poiché le proteine contengono molte informazioni biologiche, vengono estratte per scopi analitici, ad esempio per la ricerca proteomica. Le funzioni più importanti svolte dalle proteine comprendono la catalisi delle reazioni metaboliche, la replicazione del DNA, la risposta agli stimoli e il trasporto di molecole da un luogo all'altro. Le proteine si differenziano l'una dall'altra principalmente per la sequenza di aminoacidi, che è dettata dalla sequenza nucleotidica dei loro geni, e che di solito si traduce in una specifica struttura tridimensionale che ne determina l'attività. Le proteine sono – oltre ai peptidi – uno dei componenti chiave del cibo. Pertanto, la proteomica è un potente strumento nella scienza dell'alimentazione per ottimizzare i processi, la sicurezza alimentare e la valutazione nutrizionale.

Cloud Point Extraction

Cloud Point Extraction è una procedura preanalitica per separare e preconcetrare gli analiti. In combinazione con gli ultrasuoni, l'estrazione del punto di nuvola può essere intensificata rendendo il processo più efficiente, più veloce e più rispettoso dell'ambiente. Con gli ultrasuoni, l'estrazione del punto di nuvola è un metodo significativamente più efficiente per la preparazione degli analiti. Per saperne di più sull'estrazione del punto di nuvola assistita dagli ultrasuoni!

Gel Elettroforesi

L'elettroforesi su gel è il metodo principale per la separazione e l'analisi di macromolecole come DNA, RNA e proteine così come i loro frammenti, in base alla loro dimensione e carica. Viene utilizzato in chimica clinica per separare le proteine per carica e/o dimensione (IEF agarosio, essenzialmente indipendente dalle dimensioni) e in biochimica, biologia molecolare e proteomica per separare una popolazione mista di frammenti di DNA e RNA per lunghezza, per stimare la dimensione dei frammenti di DNA e RNA o per separare le proteine per carica.

Colture cellulari

La coltura cellulare è il processo di crescita controllata mediante il quale le cellule sono coltivate in condizioni controllate. Le condizioni di coltura cellulare variano a seconda del tipo di cellula. In generale, l'ambiente di una coltura cellulare è costituito da un recipiente adatto (ad es. capsula Petri) con substrato o mezzo che fornisce i nutrienti essenziali (aminoacidi, carboidrati, vitamine, minerali), fattori di crescita, ormoni e gas (CO2, O2), e regola l'ambiente fisico-chimico (tampone pH, pressione osmotica, temperatura). La maggior parte delle cellule ha bisogno di un substrato superficiale o artificiale, mentre altre colture cellulari possono essere coltivate in mezzo di coltura (coltura in sospensione, sospensione cellulare).
Le colture di massa di linee cellulari animali sono utilizzate nella produzione industriale di vaccini virali e altri prodotti di derivazione biotecnologica. Le cellule staminali umane sono coltivate per espandere il numero di cellule e differenziare le cellule in vari tipi di cellule somatiche a scopo di trapianto.

Campioni di tessuto

Il termine tessuto descrive un intermedio cellulare, in cui il materiale cellulare è a livello organizzativo tra le cellule e un organo completo. Nel tessuto, cellule simili, della stessa origine che insieme svolgono una funzione specifica, vengono assemblate. Dal raggruppamento funzionale di tessuti multipli, si formano le strutture complesse degli organi.
Il tessuto viene campionato per ricerche in biologia, istologia/istopatologia, parassitologia, biochimica, immunoistochimica e per coltivare ed estrarre il DNA. Si può distinguere tra tessuto animale (suddivisione: tessuto mammifero) e tessuto vegetale. I tessuti animali sono raggruppati nei quattro tipi base di tessuto connettivo, muscolare, nervoso ed epiteliale. Il tessuto vegetale è suddiviso nei seguenti tre sistemi tissutali: l'epidermide, il tessuto macinato e il tessuto vascolare.
I campioni di tessuto possono essere preparati a partire da parti animali o vegetali, come ossa, muscoli, foglie, ecc.

Fluidi per il corpo

Sangue, siero, plasma, plasma, liquido cerebrospinale, saliva e liquido sinoviale sono fluidi corporei che offrono una grande fonte di informazioni diagnosticamente rilevanti. Pertanto, è importante una sofisticata preparazione di campioni di fluidi corporei per l'analisi. La prima difficoltà è associata all'ampia gamma dinamica dei componenti presenti nei fluidi corporei.

Determinazione della concentrazione proteica

Bradford test, Lowry test e test dell'acido bicinconinico (BCA) sono saggi comuni per determinare la concentrazione di proteine. L'albumina sierica bovina (BSA) è uno degli standard proteici più frequentemente utilizzati.

Tampone di lisi

Il tampone di lisi deve essere scelto in funzione del materiale cellulare o del tessuto (coltura di tessuti, piante, batteri, funghi, ecc.), e se le cellule si trovano in una struttura e il tipo di struttura. Una vasta gamma di tamponi di lisi per l'estrazione di proteine, membrane e organelli sono formulati con uno o più detergenti. Il detersivo viene solitamente selezionato tramite test di prova ed errori oppure – se disponibile – secondo un protocollo esistente di estrazione delle proteine. Il detergente deve essere compatibile con la fonte di tessuto e le proteine. In generale, il detergente più delicato che lavora per uno specifico tessuto/proteine, viene scelto per mantenere la massima funzionalità dell'estratto. Inoltre, in caso di estrazione di membrane e organelli, un detergente delicato mantiene intatta la membrana. I detergenti comunemente usati nei tamponi di lisi sono per lo più non ionici o zitterionici, ad esempio CHAPS, desossicolato, Triton™ X-100, NP40 e Tween 20.
Per esempio, tessuti come cervello, fegato, fegato, intestino, reni, milza, ecc. possono essere semplicemente tamponati con RIPA. – tuttavia gli inibitori della proteasi e la DTT (ad esempio per l'elettroforesi su gel) dovrebbero essere inclusi.
Tampone di lisi per il tessuto muscolare scheletrico (ghiaccio freddo): 20 mM Tris (pH 7,8), 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 % Triton X-100, 10 % (p/v) glicerolo, 1 mM EDTA, 1 mM ditiotreitolo integrato con proteasi e cocktail inibitore della fosfatasi.
Tabella dei tamponi comuni e della loro gamma di pH. In generale, questi tamponi sono normalmente utilizzati a concentrazioni di 20-50 mM.
 

Tampone Intervallo di pH
Acido citrico – NaOh 2.2 – 6.5
Citrato di sodio – Acido citrico 3.0 – 6.2
Acetato di sodio – acido acetico 3.6 – 5.6
Sale di sodio dell'acido coccodilico – HCl 5.0 – 7.4
MES – NaOh 5.6 – 6.8
Diidrogeno fosfato di sodio – fosfato disodico di idrogeno fosfato disodico 5.8 – 8.0
Imidazolo – HCl 6.2 – 7.8
MOPS – KOH 6.6 – 7.8
Cloridrato di trietanolammina – NaOh 6.8 – 8.8
Tris – HCl 7.0 – 9.0
EUROPA..... – NaOh 7.2 – 8.2
Tricorno – NaOh 7.6 – 8.6
Tetraborato di sodio – acido borico 7.6 – 9.2
Bicicletta – NaOh 7.7 – 8.9
Glycine – NaOh 8.6 – 10.6

La maggior parte dei tamponi mostra una dipendenza dal pH con la temperatura. Questo è particolarmente vero per i tamponi Tris. Il pKa passa da 8,06 a 25°C a 8,85 a 0°C.
(pH e pKa di un tampone: il pH misura la concentrazione di ioni idrogeno in una soluzione acquosa. pKa (= costante di dissociazione acida) è una misura correlata, ma più specifica, in quanto aiuta a prevedere come una molecola agirà ad un determinato valore di pH.)

TRIzolo

Il trizolo è una soluzione chimica utilizzata per estrarre RNA/DNA/proteine durante l'estrazione guanidinio tiocianato-fenolo cloroformio. L'uso dell'estrazione di TRIzol con l'ausilio di ultrasuoni consente di ottenere elevati rendimenti di DNA, RNA e proteine dallo stesso campione ed eccelle quindi in altri metodi di estrazione.

Letteratura/riferimenti

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