استخراج پروتئین از بافت تومور به کمک فراصوت‌دهی – پروتکل

این پروتکل روشی برای استخراج پروتئین از بافت تومور به کمک فراصوت‌دهی شرح می‌دهد که با افزودن یک مرحله فراصوت‌دهی کنترل‌شده با پروب در حین تخریب بافت، روند استاندارد لیز با اوره در CPTAC را ارتقا می‌دهد. این اصلاح با تکیه بر راهبرد تثبیت‌شده CPTAC برای آماده‌سازی پروتئوم و فسفوپروتئوم با پوشش عمیق، تخریب سلول‌ها و ساختارهای زیرسلولی را بهبود می‌بخشد، ویسکوزیته نمونه را کاهش می‌دهد و آزادسازی پروتئین‌هایی را افزایش می‌دهد که معمولاً بازیابی آن‌ها تنها با لیز اوره دشوارتر است؛ به‌ویژه پروتئین‌های متصل به غشا و پروتئین‌های متصل‌شونده به DNA یا مرتبط با هسته. در مطالعه مبنای این پروتکل، روند مبتنی بر فراصوت‌دهی شناسایی پروتئین‌ها و فسفوپپتیدها را افزایش داد و در عین حال، سازگاری با مراحل بعدی شامل هضم به سبک CPTAC، نشان‌گذاری TMT، جزءبندی، غنی‌سازی فسفوپپتیدها و تحلیل LC-MS/MS را حفظ کرد.

استخراج پروتئین از بافت تومور به کمک فراصوت‌دهی برای تحلیل عمیق پروتئومیک و فسفوپروتئومیک

پروتکل زیر برای استخراج پروتئین‌ها از بافت تومور پودرشده در شرایط برودتی، در بافر لیز اوره 8 M بهینه‌سازی شده است: افزودن یک مرحله فراصوت‌دهی با پروب، بازیابی رده‌های پروتئینی دشواراستخراج، به‌ویژه پروتئین‌های مرتبط با غشا و مرتبط با DNA یا هسته را پیش از هضم و تحلیل بعدی LC-MS/MS بهبود می‌بخشد. در مطالعه مبنا توسط Li et al. (2025)، افزودن فراصوت‌دهی شناسایی پروتئین‌های مرتبط با غشا و هسته را افزایش داد و در چارچوب روند کاری آن‌ها، پوشش عمیق >12٬000 پروتئین و >25٬000 فسفوپپتید را امکان‌پذیر کرد.

حوزه کاربرد پروتکل

از این روش برای موارد زیر استفاده کنید:

• بافت تومور تازه منجمدشده و پودرشده در شرایط برودتی
• رسوب‌های سلولی یا سایر نمونه‌های زیستی که استخراج مبتنی بر اوره برای آن‌ها از پیش تثبیت شده است
• روندهای پروتئومیکس و فسفوپروتئومیکس سراسری با استفاده از هضم تریپسینی و نشان‌گذاری اختیاری TMT

مطالعه Li et al. (2025) بیان می‌کند که این روند برای انواع دیگر نمونه، مانند رده‌های سلولی، خون و ادرار نیز کاربرد دارد؛ بااین‌حال، ممکن است بسته به نوع نمونه به بهینه‌سازی نیاز باشد.

روند بهینه‌شده آماده‌سازی نمونه با گنجاندن مرحله فراصوت‌دهی. روند بهینه‌شده و طراحی آزمایش بر پروتکل آماده‌سازی نمونه CPTAC برای تحلیل پروتئومیک و فسفوپروتئومیک سراسری مبتنی هستند.
مطالعه و طرح‌واره: ©Li et al., 2025

اصل عملکرد

در مطالعه اصلی، فراصوت‌دهی به روند استاندارد لیز با اوره در CPTAC افزوده شد و بهبود شناسایی پروتئین‌های مرتبط با غشاها و هسته‌ها مشاهده شد. نویسندگان بیان می‌کنند که پارامترهای فراصوت‌دهی باید با توجه به اندازه یا غلظت نمونه، از طریق انتخاب اندازه سونوتْرود، انرژی ورودی و زمان‌بندی پالس‌ها، به‌دقت تنظیم شوند.

برای مثال، در مورد Hielscher UP200Ht و UP200St، این به معنای موارد زیر است:

• از دامنه و حالت پالسی به‌عنوان متغیرهای اصلی کنترل استفاده کنید
• نمونه‌ها را در تمام مدت سرد نگه دارید (یعنی روی یخ)
• با تنظیمات محافظه‌کارانه آغاز کنید
• تنظیمات را با توجه به شفافیت نمونه، دما، بازده پروتئین و کیفیت پپتیدها در مراحل بعدی بهینه کنید

 
هر دو مدل سونیکاتور 200 وات شرکت Hielscher، یعنی UP200Ht و UP200St، برای حجم‌های کوچک و متوسط نمونه طراحی شده‌اند و تنظیمات دامنه و پالس آن‌ها قابل تنظیم است؛ هر دو هموژنایزر فراصوتی دارای کنترل دیجیتال با صفحه‌نمایش لمسی برای تنظیم دقیق پارامترها، ثبت خودکار داده‌ها، حسگر دمای قابل اتصال، کنترل از راه دور و روشنایی نمونه هستند.
 

معرف‌های موردنیاز برای استخراج پروتئین به کمک فراصوت‌دهی

بافر لیز اوره

بلافاصله پیش از استفاده، به‌صورت تازه تهیه کنید:

• اوره 8 M
• 75 mM NaCl
• 50 mM Tris، با pH 8٫0
• 1 mM EDTA
• آپروتینین 2 µg/mL
• لوپپتین 10 µg/mL
• 1 mM PMSF
• 10 mM NaF
• 20 µM PUGNAc
• کوکتل مهارکننده فسفاتاز 2، با نسبت 1:100 (v/v)
• کوکتل مهارکننده فسفاتاز 3، با نسبت 1:100 (v/v)

اوره باید پیش از افزودن مواد افزودنی کاملاً حل شود؛ مهارکننده‌ها باید بلافاصله پیش از استفاده اضافه شوند؛ بافر باید روی یخ نگهداری شود؛ و پس از افزودن مواد افزودنی، چرخاندن ملایم ظرف به‌جای ورتکس شدید توصیه می‌شود.
 

معرف‌های اضافی:

• معرف‌های سنجش پروتئین BCA
• 50 mM Tris-HCl، با pH 8٫0
• DTT
• یدواستامید
• LysC
• تریپسین
• اسید فرمیک
• معرف‌های TMT، در صورت استفاده از پروتئومیکس کمی چندگانه
• معرف‌های IMAC، در صورت انجام غنی‌سازی فسفوپپتیدها

تجهیزات موردنیاز برای استخراج پروتئین به کمک فراصوت‌دهی

تجهیزات ضروری

توصیه برای انتخاب پروب

برای نمونه‌هایی با حجم حدود 200–1000 µL، از سونوتْرود با قطر کم و مناسب برای پردازش مستقیم حجم‌های کوچک با شدت بالا استفاده کنید. Hielscher سونوتْرودهایی با قطرهای مختلف ارائه می‌دهد و قطر کمتر نوک، شدت بیشتری در نوک ایجاد می‌کند.

نکته عملی: کوچک‌ترین پروبی را انتخاب کنید که بدون ایجاد کف بیش‌ازحد یا تماس با دیواره ظرف، اختلاط مؤثر ایجاد کند.

اگر هم‌زمان با چندین نمونه کار می‌کنید، می‌توانید این گزینه‌ها را در نظر بگیرید: سونیکاتور چندلوله‌ای VialTweeter یا سونیکاتور میکروپلیت UIP400MTP!

دستورالعمل گام‌به‌گام: روش استخراج پروتئین به کمک فراصوت‌دهی

A. پیش‌سردسازی و آماده‌سازی

1. سانتریفیوژ را تا 4°C سرد کنید.
2. بافر لیز اوره را به‌صورت تازه تهیه کنید و روی یخ نگه دارید.
3. UP200Ht یا UP200St را روی پایه، داخل محفظه عایق صدا نصب کنید.
4. حمام یخی با اندازه کافی آماده کنید تا لوله‌های نمونه را به‌صورت عمودی و پایدار نگه دارد.

تهیه بافر تازه و انجام کار در شرایط سرد، حیاتی است.

B. استخراج اولیه با اوره

1. بافت پودرشده در شرایط برودتی را روی یخ نگه دارید.
2. به‌ازای هر 50 mg بافت مرطوب، 200 µL بافر لیز اوره سردشده اضافه کنید.
3. به‌مدت 5–10 s با سرعت بالا ورتکس کنید.
4. به‌مدت 15 min در 4°C انکوبه کنید.
5. مرحله ورتکس به‌همراه انکوباسیون را یک بار دیگر تکرار کنید.
6. با نیروی 20٬000g به‌مدت 10 min در 4°C سانتریفیوژ کنید.
7. لیزات / مایع رویی را به یک لوله تمیز با جذب سطحی کم منتقل کنید.

C. فراصوت‌دهی با استفاده از UP200Ht یا UP200St

شرایط آغاز فراصوت‌دهی

• دامنه: با 20–30% آغاز کنید
• طول پالس: 5 s روشن
• خنک‌سازی: 2 min روی یخ بین پالس‌ها
• تعداد چرخه‌ها: 4 چرخه
• مجموع زمان فعال فراصوت‌دهی: 20 s
• کل زمان فرایند با احتساب خنک‌سازی: حدود 8–10 min

مراحل فراصوت‌دهی

1. لیزات را به لوله‌ای مناسب برای فراصوت‌دهی منتقل کنید. از لوله‌ای باریک با دیواره نازک استفاده کنید که تبادل حرارتی مناسب و فروبردن ایمن پروب را امکان‌پذیر کند.
2. لوله را در حمام یخ قرار دهید. مقاله، خنک‌سازی در حین فراصوت‌دهی را برای جلوگیری از آسیب حرارتی حیاتی می‌داند.
3. نوک پروب را در نمونه فرو ببرید. نوک را به‌اندازه کافی زیر سطح مایع نگه دارید تا کاویتاسیون پایدار برقرار شود، اما اجازه ندهید با دیواره یا کف لوله تماس پیدا کند.
4. یک پالس 5 s با دامنه آغازین اعمال کنید.
5. بلافاصله نمونه را به‌طور کامل به محیط یخ بازگردانید و به‌مدت 2 min نگه دارید.
6. این کار را تا تکمیل 4 چرخه تکرار کنید.
7. لیزات را پس از هر چرخه بررسی کنید.
8. فقط در صورت نیاز ادامه دهید؛ هر بار یک پالس اضافی 5 s اعمال کنید و همیشه پس از آن، نمونه را کاملاً خنک کنید.
9. هنگامی که لیزات یکنواخت‌تر شد و حالت کش‌دار / ویسکوز آن کاهش یافت، متوقف شوید.
   نقطه پایان، لیزاتی شفاف‌تر است که به‌جای جریان پیوسته و ویسکوز، به‌شکل قطره درمی‌آید.
10. با نیروی حدود 16٬000g به‌مدت 15 min در 4°C سانتریفیوژ کنید.
11. مایع رویی شفاف‌شده را به لوله‌ای جدید منتقل کنید و غلظت پروتئین را اندازه بگیرید.

مقایسه پروتئومیکس و فسفوپروتئومیکس سراسری بین نمونه‌های فراصوت‌دهی‌شده و فراصوت‌دهی‌نشده.
a. تعداد پروتئین‌های شناسایی‌شده (پروتئومیکس سراسری) در تمام بافت‌های تومور PDX با یا بدون فراصوت‌دهی. b. تعداد فسفوپپتیدهای شناسایی‌شده (غنی‌سازی IMAC) در تمام بافت‌های تومور PDX با یا بدون فراصوت‌دهی. فقط پروتئین‌ها و فسفوپپتیدهایی شمارش شدند که نسبت فراوانی آن‌ها بزرگ‌تر یا مساوی صدک 25 بود. نسبت فراوانی بین نمونه‌های هم‌نوع محاسبه شد.
مطالعه و نمودارها: ©Li et al., 2025

هضم و تحلیل در مراحل بعدی

پس از فراصوت‌دهی و شفاف‌سازی، مطابق روند اصلی به سبک CPTAC ادامه دهید:

1. لیزات را با 50 mM Tris-HCl با pH 8٫0 به نسبت 1:3 (v/v) رقیق کنید تا غلظت اوره به <2 M کاهش یابد.
2. به‌ازای هر 50 µg پروتئین، 1 mAU از LysC اضافه کنید و به‌مدت 2 h در 25°C انکوبه کنید.
3. تریپسین را با نسبت آنزیم به سوبسترا 1:49 (w/w) اضافه کنید و هضم را در طول شب در 25°C انجام دهید.
4. با افزودن اسید فرمیک تا غلظت نهایی 1%، واکنش را متوقف کنید.
5. در صورت نیاز، مراحل نمک‌زدایی، نشان‌گذاری TMT، جزءبندی، غنی‌سازی فسفوپپتیدها و LC-MS/MS را ادامه دهید.

بیان افتراقی فسفوپپتیدها بر اساس MS با نشان‌گذاری TMT.
a. زیرنوع بازال، با مشخص‌کردن برخی فسفوپپتیدهای انسانی (آغاز و پایان توالی پروتئین) که بیان آن‌ها در نمونه‌های فراصوت‌دهی‌شده نسبت به نمونه‌های فراصوت‌دهی‌نشده افزایش یافته است. b. زیرنوع لومینال، با مشخص‌کردن برخی فسفوپپتیدهای انسانی (آغاز و پایان protein_sequence) که بیان آن‌ها در نمونه‌های فراصوت‌دهی‌شده نسبت به نمونه‌های فراصوت‌دهی‌نشده افزایش یافته است. c. مسیرهای غنی‌شده KEGG بر اساس پروتئین‌های مربوط به فسفوپپتیدهای دارای افزایش بیان در زیرنوع بازال تومورهای فراصوت‌دهی‌شده. d. مسیرهای غنی‌شده KEGG بر اساس پروتئین‌های مربوط به فسفوپپتیدهای دارای افزایش بیان در زیرنوع لومینال تومورهای فراصوت‌دهی‌شده.
مطالعه و نمودارها: ©Li et al., 2025

طراحی، ساخت و مشاوره – کیفیت ساخت آلمان

سونیکاتورهای Hielscher به برخورداری از بالاترین استانداردهای کیفیت و طراحی شناخته می‌شوند. استحکام و کاربری آسان، ادغام بی‌دردسر سونیکاتورهای ما در تأسیسات صنعتی را امکان‌پذیر می‌کند. سونیکاتورهای Hielscher به‌راحتی از عهده شرایط سخت و محیط‌های کاری پرفشار برمی‌آیند.

Hielscher Ultrasonics شرکتی دارای گواهی ISO است و بر سونیکاتورهای پربازده با فناوری روز و کاربری آسان تأکید ویژه دارد. البته سونیکاتورهای Hielscher با الزامات CE مطابقت دارند و الزامات UL، CSA و RoHs را برآورده می‌کنند.

منابع علمی / مراجع

• Li Q.K.; Lih T.M.; Clark D.J.; Chen L.; Schnaubelt M.; Zhang H. (2025): Sonication-assisted protein extraction improves proteomic detection of membrane-bound and DNA-binding proteins from tumor tissues. Nature Protocols 2025 Aug;20(8):2083-2099.
• Stadlmann, J., Taubenschmid, J., Wenzel, D. et al. (2017): Comparative glycoproteomics of stem cells identifies new players in ricin toxicity. Nature 549, 2017. 538–542
• Jakob, S., Steinchen, W., Hanßmann, J. et al. (2024): The virulence regulator VirB from Shigella flexneri uses a CTP-dependent switch mechanism to activate gene expression. Nature Communications 15, 318 (2024).
• Jorge S., Capelo J.L., LaFramboise W., Dhir R., Lodeiro C., Santos H.M. (2019): Development of a Robust Ultrasonic-Based Sample Treatment To Unravel the Proteome of OCT-Embedded Solid Tumor Biopsies. Journal of Proteome Research 2019 Jul 5;18(7):2979-2986.
• Mertins P, Tang LC, Krug K, et al. (2018): Reproducible workflow for multiplexed deep-scale proteome and phosphoproteome analysis of tumor tissues by liquid chromatography-mass spectrometry. (Initial CPTAC protocol). Nature Protocols 7, 2018. 1632-1661.