استخراج پروتئین با کمک سونیک از بافت تومور – پروتکل
این پروتکل روشی برای استخراج پروتئین با کمک سونیک برای بافت تومور را توصیف می کند که روند استاندارد لیز اوره CPTAC را با افزودن مرحله پروب-سونیک کنترل شده در هنگام اختلال بافت پیش می برد. با تکیه بر استراتژی پیشرفته CPTAC پروتئوم و تهیه فسفوپروتئوم در مقیاس عمیق، این اصلاح اختلال ساختار سلولی و زیرسلولی را بهبود می بخشد، ویسکوزیته نمونه را کاهش می دهد و آزادسازی پروتئین هایی را که معمولا با لیز اوره به تنهایی دشوارتر قابل بازیابی هستند، به ویژه پروتئین های متصل به غشا و اتصال به DNA یا هسته را بهبود می بخشد. در مطالعه پایه، جریان کاری با کمک سونیک باعث افزایش شناسایی پروتئین ها و فسفوپپتیدها شد و در عین حال سازگاری با هضم به سبک پایین دستی CPTAC، برچسب گذاری TMT، تفکیک بندی، غنی سازی فسفوپپتیدها و تحلیل LC-MS/MS حفظ گردید.
استخراج پروتئین با کمک سونیک از بافت تومور برای آنالیز عمیق پروتئومیک و فسفوپروتئومیک
The following protocol is optimized for extraction of proteins from cryopulverized tumor tissue in 8 M urea lysis buffer: An added probe-type sonication step improves the recovery of difficult protein classes, especially membrane-associated and DNA-/nucleus-associated proteins, before digestion and downstream LC-MS/MS analysis. In the underlying study by Li et al. (2025), adding sonication increased detection of membrane and nucleus-associated proteins and supported deep-scale coverage of >12,000 proteins and >25,000 phosphopeptides under their workflow.
پروب اولتراسونیک UP200St برای استخراج پروتئین در پروتئومیکس
حوزه کاربرد پروتکل
از این روش برای موارد زیر استفاده کنید:
- بافت تومور تازه منجمد و کرایوپولوریزه شده
- گلوله های سلولی یا نمونه های زیستی دیگر که استخراج مبتنی بر اوره در آن ها قبلا برقرار شده است
- جریان های کاری جهانی پروتئومیکس و فسفوپروتئومیکس با استفاده از هضم تریپتیک و برچسب گذاری اختیاری TMT
مطالعه لی و همکاران (۲۰۲۵) بیان می کند که این روند برای انواع نمونه های دیگر مانند خطوط سلولی، خون و ادرار نیز قابل استفاده است، اما بهینه سازی ممکن است بر اساس نوع نمونه لازم باشد.
فرآیند بهینه سازی آماده سازی نمونه با گام صوتی پیاده سازی شده. جریان کاری بهینه و طراحی آزمایش ها بر اساس پروتکل آماده سازی نمونه CPTAC برای تحلیل پروتئومیک و فسفوپروتئومیک جهانی است.
مطالعه و طرح: ©لی و همکاران، ۲۰۲۵
اصل کار
مطالعه اولیه سونیک را به روند استاندارد لیز اوره CPTAC افزود و تشخیص بهتری در شناسایی پروتئین های مرتبط با غشاها و هسته ها یافت. نویسندگان بیان می کنند که پارامترهای سونیک باید از نظر اندازه نمونه و غلظت دقیق تنظیم شوند – با انتخاب اندازه سونوترود، ورودی انرژی و زمان بندی پالس.
نمونه بارز، برای Hielscher UP200Ht و UP200St، این یعنی:
- از دامنه و حالت پالس به عنوان متغیرهای اصلی کنترل استفاده کنید
- نمونه ها را در تمام مدت سرد نگه دارید (یعنی روی یخ).
- با محیط های محافظه کارانه شروع کنید
- بهینه سازی بر اساس وضوح نمونه، دما، بازده پروتئین و کیفیت پپتید پایین دستی
هر دو مدل سونیکاتور Hielscher 200 وات UP200Ht و UP200St برای حجم نمونه های کوچک و متوسط طراحی شده اند و دامنه و پالس قابل تنظیم دارند؛ هر دو هموژنایزر اولتراسونیک کنترل دیجیتال صفحه لمسی برای تنظیم دقیق پارامترها، ضبط خودکار داده، حسگر دمای قابل اتصال، کنترل از راه دور و نوردهی نمونه را فراهم می کنند.
معرف ها برای استخراج پروتئین با کمک سونیک
بافر لیز اوره
بلافاصله قبل از استفاده تازه آماده کنید:
- ۸ میلیون اوره
- ۷۵ میلی ملار NaCl
- 50 میلی مولار تریس، pH 8.0
- ۱ میلی مایل EDTA
- ۲ میکروگرم بر میلی لیتر آپروتینین
- ۱۰ میکروگرم بر میلی لیتر لوپپتین
- 1 میلی مولار PMSF
- ۱۰ میلی ملار NaF
- ۲۰ میکرومتر PUGNAc
- کوکتل مهارکننده فسفاتاز ۲، ۱:۱۰۰ (v/v)
- کوکتل مهارکننده فسفاتاز ۳، ۱:۱۰۰ (v/v)
اوره باید به طور کامل حل شود قبل از افزودن افزودنی ها؛ مهارکننده ها باید بلافاصله قبل از استفاده اضافه شوند؛ بافر باید روی یخ نگه داشته شود؛ و پس از افزودن افزودنی ها، چرخش به جای گرداب شدید توصیه می شود.
واکنش دهنده های اضافی:
- واکنش دهنده های آزمایش پروتئین BCA
- 50 میلی مولار تریس-HCl، pH 8.0
- DTT
- یدواستامید
- LysC
- تریپسین
- اسید فرمیک
- معرف های TMT، اگر از پروتئومیکس کمی چندگانه استفاده کنند
- معرف های IMAC، اگر غنی سازی فسفوپپتیدی انجام دهند
Ultrasonicator UP200Ht با میکروتیپ S26d2 برای آماده سازی نمونه
تجهیزات استخراج پروتئین با کمک سونیک
مورد نیاز
انتخاب پروب پیشنهادی
برای نمونه هایی حدود ۲۰۰ تا ۱۰۰۰ میکرولیتر، از سونوترود با قطر کوچک مناسب برای پردازش مستقیم با شدت بالا حجم های کوچک استفاده کنید. هیلشر چندین قطر سونوترود ارائه می دهد و قطرهای نوک کوچکتر شدت بیشتری در نوک ایجاد می کنند.
نکته عملی: از کوچک ترین پروب استفاده کنید که مخلوط کردن کارآمد را بدون کف یا تماس زیاد با دیواره ظرف فراهم کند.
اگر همزمان با چند نمونه کار می کنید، شاید بد نباشد ویال توییتر صوتی چندلوله ای یا میکروپلیت سونیکاتور UIP400MTP!
دستورالعمل گام به گام: فرآیند استخراج پروتئین با کمک سونیک
الف. پیش خنک سازی و آماده سازی
- سانتریفیوژ را تا 4 درجه سانتی گراد سرد کنید.
- بافر لیز اوره تازه آماده کنید و آن را روی یخ نگه دارید.
- UP200Ht یا UP200St را روی پایه ای داخل یک محفظه صوتی نصب کنید.
- یک حمام یخ به اندازه کافی بزرگ برای نگه داشتن لوله های نمونه به صورت عمودی و پایدار آماده کنید.
آماده سازی بافر تازه و مدیریت سرما بسیار حیاتی است.
ب. استخراج اولیه اوره
- بافت کرایوپولوریزه شده را روی یخ نگه دارید.
- ۲۰۰ میکرولیتر بافر لیز اوره سرد شده به ازای هر ۵۰ میلی گرم بافت مرطوب اضافه کنید.
- ورتکس ۵ تا ۱۰ ثانیه در سرعت بالا.
- انکوباسیون ۱۵ دقیقه در دمای ۴ درجه سانتی گراد.
- مرحله گرداب به علاوه انکوباسیون را یک بار دیگر تکرار کنید.
- سانتریفیوژ در دمای ۲۰,۰۰۰ گرم به مدت ۱۰ دقیقه در ۴ درجه سانتی گراد.
- لیزات یا سوپرناتانت را به یک لوله تمیز و کم اتصال منتقل کنید.
ج. سونیکاسیون با استفاده از UP200Ht یا UP200St
شرایط شروع برای سونیکیشن
- دامنه: از ۲۰–۳۰٪ شروع کنید
- طول پالس: ۵ ثانیه روشن
- خنک کنندگی: ۲ دقیقه روی یخ بین پالس ها
- تعداد چرخه ها: ۴ چرخه
- کل زمان سونیک فعال: ۲۰ ثانیه
- کل زمان فرآیند با احتساب خنک کنندگی: حدود ۸ تا ۱۰ دقیقه
مراحل صوتی
- لیزات را به لوله ای مناسب برای سونیک منتقل کنید. از یک لوله باریک و دیواره نازک استفاده کنید که تبادل حرارتی خوب و غوطه وری ایمن در پروب را ممکن می سازد.
- لوله را در وان یخ قرار دهید. مقاله سرمایش در طول سونیک را برای جلوگیری از آسیب حرارتی حیاتی شناسایی می کند.
- نوک پروب را در نمونه غوطه ور کنید. نوک لوله را به اندازه کافی غوطه ور نگه دارید تا کاویتاسیون پایدار داشته باشد، اما اجازه ندهید به دیواره یا کف لوله برخورد کند.
- یک پالس ۵ ثانیه ای در دامنه شروع اجرا کنید.
- بلافاصله نمونه را کاملا به مدت ۲ دقیقه به حالت یخ برگردانید.
- این روند را تا تکمیل ۴ چرخه تکرار کنید.
- لیزات را بعد از چرخه بررسی کنید.
- فقط در صورت نیاز ادامه دهید، با استفاده از یک پالس ۵ ثانیه اضافی در هر بار، همیشه با خنک سازی کامل.
- وقتی لیزات یکنواخت تر و کمتر رشته ای/چسبناک شد، متوقف کنید.
نقطه پایانی یک لیزات شفاف تر است که قطره تشکیل می دهد نه جریان پیوسته و ویسکوزی. - سانتریفیوژ حدود ۱۶۰۰۰ گرم به مدت ۱۵ دقیقه در دمای ۴ درجه سانتی گراد.
- مایع شفاف شده را به یک لوله تازه منتقل کنید و غلظت پروتئین را اندازه بگیرید.
مقایسه پروتئومیکس جهانی و فسفوپروتئومیکس بین نمونه های صوتی و غیرصوتی.
a. تعداد پروتئین های شناسایی شده (پروتئومیکس جهانی) در تمام بافت های تومور PDX با یا بدون سونیکاسیون. b. تعداد فسفوپپتیدهای شناسایی شده (غنی سازی IMAC) در تمام بافت های تومور PDX با یا بدون سونیکاسیون. تنها پروتئین ها و فسفوپتیدهایی با نسبت فراوانی بیشتر یا مساوی صدک ۲۵ شمارش شدند. نسبت فراوانی بین همان نوع نمونه ها محاسبه شد.
مطالعه و نمودارها: ©لی و همکاران، ۲۰۲۵
هضم و تحلیل پایین دستی
پس از سونیک و روشن سازی، طبق روند کاری اولیه به سبک CPTAC ادامه دهید:
- لیزات 1:3 (v/v) را با pH 8.0 50 میلی مولار Tris-HCl رقیق کنید تا اوره به <2 M.
- LysC را با مقدار ۱ mAU در هر ۵۰ میکروگرم پروتئین اضافه کنید و ۲ ساعت را در دمای ۲۵ درجه سانتی گراد انکوبه کنید.
- تریپسین را در ۱:۴۹ آنزیم:سوبسترا (با وزن و هفته) اضافه کنید و شب را در دمای ۲۵ درجه سانتی گراد هضم کنید.
- با اسید فرمیک تا ۱٪ نهایی سرد کنید.
- در صورت نیاز، به نمک زدایی، برچسب گذاری TMT، تفکیک سازی، غنی سازی فسفوپپتید و LC-MS/MS ادامه دهید.
بیان متفاوت فسفوپپتیدها از MS برچسب خورده TMT.
a. زیرگروه پایه که برخی فسفوپپتیدهای انسانی (آغاز و پایان توالی پروتئین) را در نمونه های صوتی نسبت به نمونه های غیرصوتی افزایش یافته نشان می دهد. b. زیرنوع لومینال که برخی فسفپپتیدهای انسانی (protein_sequence آغاز و پایان) را در نمونه های صوتی نسبت به نمونه های غیرصوتی افزایش یافته نشان می دهد. ج. مسیرهای KEGG غنی شده بر اساس پروتئین های فسفوپپتیدهای افزایش یافته در زیرگروه پایه ای سونیکیت شده تومورها. د. مسیرهای KEGG غنی شده بر اساس پروتئین های فسفوپپتیدهای افزایش یافته در زیرگروه لومینال سونیک شده تومورها.
مطالعه و نمودارها: ©لی و همکاران، ۲۰۲۵
طراحی، ساخت و مشاوره – کیفیت ساخت آلمان
مافوق صوت Hielscher به خوبی برای بالاترین کیفیت و استانداردهای طراحی خود را شناخته شده. استحکام و بهره برداری آسان اجازه می دهد تا ادغام صاف از ultrasonicators ما به امکانات صنعتی. شرایط خشن و محیط های خواستار به راحتی توسط مافوق صوت Hielscher رسیده.
Hielscher اولتراسونیک یک شرکت دارای گواهینامه ISO است و تاکید ویژه ای بر مافوق صوت با کارایی بالا با ویژگی های دولت از هنر فن آوری و کاربر پسند قرار داده است. البته، مافوق صوت Hielscher مطابق با CE و دیدار با الزامات UL، CSA و RoHs.
چند چاه صفحه ماسونیکاتور UIP400MTP برای استخراج پروتئین با بازده بالا از نمونه ها
ادبیات / منابع
- Li Q.K.; Lih T.M.; Clark D.J.; Chen L.; Schnaubelt M.; Zhang H. (2025): Sonication-assisted protein extraction improves proteomic detection of membrane-bound and DNA-binding proteins from tumor tissues. Nature Protocols 2025 Aug;20(8):2083-2099.
- Stadlmann, J., Taubenschmid, J., Wenzel, D. et al. (2017): Comparative glycoproteomics of stem cells identifies new players in ricin toxicity. Nature 549, 2017. 538–542
- Jakob, S., Steinchen, W., Hanßmann, J. et al. (2024): The virulence regulator VirB from Shigella flexneri uses a CTP-dependent switch mechanism to activate gene expression. Nature Communications 15, 318 (2024).
- Jorge S., Capelo J.L., LaFramboise W., Dhir R., Lodeiro C., Santos H.M. (2019): Development of a Robust Ultrasonic-Based Sample Treatment To Unravel the Proteome of OCT-Embedded Solid Tumor Biopsies. Journal of Proteome Research 2019 Jul 5;18(7):2979-2986.
- Mertins P, Tang LC, Krug K, et al. (2018): Reproducible workflow for multiplexed deep-scale proteome and phosphoproteome analysis of tumor tissues by liquid chromatography-mass spectrometry. (Initial CPTAC protocol). Nature Protocols 7, 2018. 1632-1661.
پرسش و پاسخهای متداول
تفاوت بین استخراج پروتئین از بافت گیاهی و بافت پستانداران چیست؟
استخراج پروتئین از بافت گیاهی معمولا دشوارتر از بافت پستانداران است زیرا سلول های گیاهی دارای دیواره سلولزی سخت و غنی از سلولز، پلی ساکاریدهای فراوان، ترکیبات فنولی، رنگدانه ها و آنزیم های درون زاد فعال هستند که می توانند در حل شدن پروتئین ها اختلال ایجاد کنند، عصاره ها را آلوده کنند یا تخریب پروتئین را تشدید کنند. در مقابل، بافت پستانداران فاقد دیواره سلولی است و معمولا از نظر شیمیایی راحت تر مختل می شود، اگرچه اغلب حاوی لیپیدهای بیشتر، ماتریکس خارج سلولی و پروتئازهایی است که می توانند استخراج را پیچیده کنند. در نتیجه، پروتکل های کارخانه معمولا نیازمند اختلال مکانیکی قوی تر، آسیاب دمای پایین و افزودنی هایی مانند PVPP، عوامل کاهنده یا پاک سازی مبتنی بر فنول هستند، در حالی که بافت پستانداران اغلب با بافرهای مبتنی بر شوینده مانند RIPA یا سیستم های لیز مبتنی بر اوره به طور موفقیت آمیزی مدیریت می شوند. هم بافت گیاهی و هم بافت پستانداران را می توان به طور مؤثر با سونیکاسیون تجزیه کرد!
چگونه استخراج پروتئین از بافت را با استفاده از بافر RIPA بهبود بخشیم؟
استخراج پروتئین از بافت با بافر RIPA می تواند با بهینه سازی اختلال و حفاظت نمونه بهبود یابد. مهم ترین اقدامات شامل سرد نگه داشتن بافت و بافر، استفاده از مهارکننده های تازه آماده شده پروتئاز و فسفاتاز ها، خرد کردن یا خرد کردن کامل بافت قبل از لیزیس، حفظ نسبت مناسب بافر به بافت و افزودن مرحله مختل مکانیکی مانند همگن سازی یا سونیک کوتاه پروب برای شکستن بافت متراکم و کاهش ویسکوزیته است. بازده استخراج همچنین زمانی بهبود می یابد که لیزات ها روی یخ با مخلوط کردن متناوب انکوبه شوند و سپس سانتریفیوژ یخچالی با سرعت بالا برای حذف زباله های نامحلول انجام شود. برای بافت های فیبری، غنی از لیپید یا ساختار بالا، تکرار استخراج یک بار یا افزایش زمان تماس با مواد شوینده می تواند بهبودی را بهبود بخشد، اما باید از سونیکاسیون بیش از حد یا استفاده طولانی مدت در دمای اتاق اجتناب کرد، زیرا ممکن است پروتئین ها را دناتوره یا پروتئولیز را افزایش دهند.
چه الزامات ایمنی باید هنگام استخراج پروتئین اولتراسونیک رعایت شود؟
پروب سونیک را در جعبه محافظ صدا یا با محافظت شنوایی مناسب انجام دهید. پروتکل منبع به طور خاص درباره نویز شنیداری مضر تولید شده در طول سونیک هشدار می دهد.
محافظ چشم، روپوش آزمایشگاهی و دستکش بپوشید.
پروب را از پوست دور نگه دارید و هرگز ظرف باز را بدون محافظت در برابر پاشیدن صدا ندهید.
PMSF و سایر مهارکننده ها را طبق قوانین ایمنی شیمیایی محلی مدیریت کنید.
نمونه ها را روی یخ نگه دارید تا آسیب پروتئینی ناشی از گرما کاهش یابد؛ این مقاله بارها کنترل دما را به عنوان یک عامل حیاتی شناسایی می کند.
سونیکاتور ویالتوییتر استخراج پروتئین در پروتئومیک را تسریع و بهبود می بخشد
Hielscher مافوق صوت تولید کننده هموژنایزرهای مافوق صوت با کارایی بالا از ازمایشگاه ها تا اندازه صنعتی.