استخراج پروتئین التراسونیک از بافت و سلول فرهنگ
- استخراج پروتئین یک نمونه مرحله آماده سازی ضروری در پروتئومیکس است.
- پروتئین ها را می توان از گیاهان و حیوانات بافت ها، مخمرها و میکروارگانیسم استخراج شده است.
- روش فراصوت، روش استخراج پروتئین کارآمد قابل اعتماد دادن بازده پروتئین بالا در مدت زمان استخراج کوتاه است.
استخراج پروتئین از بافت ها و سلول ها
استخراج پروتئین از بافت ها و سلول های کشت شده یک گام آماده سازی نمونه ضروری است که در طول بسیاری از تکنیک های بیوشیمیایی و تحلیلی مانند الیزا، پیج، بلات غربی، طیف سنجی جرمی، یا تصفیه پروتئین انجام می شود. اختلال سلول مافوق صوت، لیز و استخراج یک تکنیک دقیقا قابل کنترل، غیر حرارتی برای اطمینان از عملکرد بالا از پروتئین است.
استخراج پروتئین از سلول ها با کاوشگر مافوق صوت UP200St
- سریع
- بازده بالا
- بسیار کارآمد
- کنترل دقیق بر پارامترهای
- نتایج تجدید پذیر
- مقیاس پذیری خطی
دستورالعمل های عمومی برای لیز مافوق صوت و استخراج پروتئین
- کنترل دما: برای اطمینان از عملکرد پروتئین بالا و بدون دناتوراسیون حرارتی، درجه حرارت در طول استخراج باید کنترل شود. دولت از هنر اسیاب اولتراسونیک Hielscher است – همچنین به نام فروپاشی مافوق صوت و یا ultrasonifier – دقیقا قابل کنترل است. آنها با یک سنسور دما plugable آمده است. در گزینه های تنظیم از هموژنایزر اولتراسونیک، حداکثر درجه حرارت می تواند تنظیم شود. هنگامی که این دمای حداکثر رسیده است، ultrasonicator به طور خودکار متوقف تا نمونه پایین سرد می شود.
- بافر: به گون از یک بافر مناسب و حجم حق بافر از یک بافت به بافت متفاوت است و باید توسط آزمایش آزمون و خطا کشف کردن باشد.
- جداسازی / تصفیه: lysate به پروتئین می تواند شامل بیش از مولکولهای زیستی مانند DNA و یا کربوهیدرات ها، که ممکن است توسط پروتئین بارش (اسید تری کلرواستیک deoxycholate-) حذف یا بافر ارز.
Chittapalo و Noomhorm (2009) در مطالعه خود گزارش داد که عملکرد پروتئین با استفاده از فراصوت افزایش یافته است و همگن سازی بافت مافوق صوت و فرایند لیز می تواند فرایندهای استخراج موجود را به طور قابل توجهی افزایش – را قادر می سازد برای فرصت های استخراج تجاری جدید است.
استخراج پروتئین از بافت حیوانی
برای تهیه بافت کامل با اندازه (مانند کلیه، قلب، ریه، عضله و غیره)، بافت ها باید به قطعات کوچک و کوچک با ابزارهای تمیز، بر روی یخ ترجیح داده شوند و به همان اندازه که ممکن است برای جلوگیری از تخریب پروتئاز ها (به عنوان مثال بافر ليزي مانند RIPA يا بافر ليز هيپوتونيک حاوي کوکتل مهار کننده پروتئاز و فسفاتاز). پس از محاسبه، نمونه به صورت نیتروژن مایع برای یخ زدگی غوطه ور می شود. نمونه را می توان در دمای -80 درجه سانتیگراد برای استفاده بعدی نگهداری کرد یا برای همگن سازی سریع بر روی یخ نگهداری شود. بلافاصله قبل از استخراج اولتراسونیک، بافر لیز یخ سرد (با مهارکننده های پروتئاز DTT، leupeptin و aprotinin) به سرعت به لوله نمونه اضافه می شود (برای هر 10 میلی گرم بافت نزدیک به 600 میلی لیتر از بافر توصیه می شود). تقریبا 20-60 میلی گرم بافت در هر لوله نمونه ای توصیه می شود.
همگن سازی مافوق صوت، لیز و استخراج با هموژنیزر مافوق صوت مانند UP100H یا UP200Ht، مجهز به sonotrode نوک میکرو انجام می شود. مدت زمان فراصوت 60-90 ثانیه است. در حالت چرخه مافوق صوت از 15 ثانیه فراصوت و 10 ثانیه زمان استراحت. نمونه باید تمام مدت در یخ نگهداری شود.
پس از مافوق صوت همگن / استخراج، عصاره است که در 27،000g برای حدود سانتریفیوژ شد. 20 دقیقه. پس از آن supernatent جمع آوری شده است، به طوری که غلظت پروتئین می تواند توسط یک سنجش پروتئین مانند پیرس BCA سنجش پروتئین مشخص می شود.
استخراج پروتئین از سرم خون
برای مخلوطی همگن از سرم و بافر فسفات، نمونه ابتدا قبل از لیز سلول مافوق صوت گرداب می شود. برای لیز مافوق صوت, نمونه با هموژنیزر آزمایشگاه مافوق صوت مانند UP100H برای 8 چرخه در دامنه 20٪ فراصوت, برای چرخه از هر 5 ثانیه در و 15 ثانیه خاموش. Sonocation توسط sonicationg در چرخه ها و با قرار دادن نمونه بر روی یخ انجام می شود به طوری که از تخریب بیش از حد گرم کننده و حرارتی نمونه اجتناب شود. از آنجا که سرم حاوی مقدار زیادی پروتئین با وزن مولکولی بالا (مانند آلبومین، α1-antitrypsin، transferrin، haptoglobulin، ایمونوگلوبولین G و ایمونوگلوبولین A) است، که با جداسازی پروتئین های کم وزن مولکولی در طول IEF تداخل دارند، توصیه می شود که با استفاده از ستون تهی شدن، آن ها را از سرم تهی کنید.
استخراج پروتئین از بافت گیاهی
تازه، بافت گیاهی نرم، به عنوان مثال، خزه و غیره، می تواند به راحتی به سادگی با قرار دادن مواد نمونه خرد شده در بافر لیز کننده برای فراصوت مختل کرده است. دشوار، بافتهای گیاهی ligenous، مانند دانه، شاه درخت سوزن و غیره، باید خشک زمین باشد. برخی از سخت، مواد چوبی گیاهی باید منجمد و زمین در نیتروژن مایع قبل توسط فراصوت استخراج شده است. برای تعلیق کشت سلول گیاهی، یک درمان فراصوت بین 30 تا 150 ثانیه در یک بافر لیز کننده بیشتر کافی است. مواد سخت تر مانند دانه کدو تنبل نیاز به یک فراصوت شدید آن به شرح زیر است.
پروتکل برای استخراج اولتراسونیک آلبومین از دانه کدو تنبل
برای استخراج پروتئین مافوق صوت آلبومین از پودر دانه کدو تنبل زمین ریز، 10 گرم پودر دانه کدو تنبل defatted و 100 میلی ال آب deionised به عنوان حلال در یک دانه شیشه ای 250mL اضافه شده است. استخراج پروتئین در دو مرحله تشکیل شده است: اول، نمونه با فراصوت کاوشگر نوع مافوق صوت UP400St (400W، 24kHz) مجهز به sonotrode S24d7. منقار شیشه ای در حمام آب سرد در طول همگن سازی مافوق صوت قرار داده شده است. تنظیم UP400St مافوق صوت با سنسور دمای قابل اتصال تضمین کرد که دمای نمونه همیشه زیر 30 درجه سانتی گراد نگه داشته می شود. با کنترل دقیق دما در حین فراصوت از یک دناتوراسیون آلبومین اجتناب می شود. دوم اینکه استخراج با یک میکسر با سرعت 200 دور در دقیقه و در 30 درجه سانتی گراد انجام شد. پس از آن بیکر به یک شاکر ترموستاتیک منتقل می شود. گلوبولین از طریق دیالیز با آب های گسست برداشته می شود. پس از حذف گلوبولین، عصاره پروتئین را می توان برای تعیین پروفایل آلبومین نمونه برداری کرد و پس از آن با استفاده از HCl 0.1 M برای انعقاد آلبومین به pI=3.0 تنظیم می شود. فاز جامد با سانتریفیوژ در ۵۰ گرم، ۲۰ درجه سانتی گراد از هم جدا می شود و در آب دیونه شده دوباره حل می شود. انعقاد آلبومین دو بار برای افزایش نسبت پروتئین در کنسانتره آلبومین انجام می شود.
التراسونیک استخراج پروتئین قلیایی برای تهیه کنسانتره پروتئین از سبوس برنج نشان می دهد که نتایج درمان فراصوت در عملکرد پروتئین بالاتر در یک زمان استخراج قابل توجهی کوتاه تر – در مقایسه با روش متداول استخراج است.
پروتکل آماده سازی نمونه برای آنزیم های کاربردی iNOS به
برای به دست آوردن آنزیم iNOS کاملا کاربردی (به عنوان مانند غربالگری دارو)، پروتکل زیر توصیه می شود: تعلیق سلول باید بر روی یخ قرار داده شود و با UP100H در دامنه 10μm در حالت چرخه 5 ثانیه فراصوت و 25 ثانیه استراحت بر روی یخ فراصوت. این عمل باید تقریباً ۳ بار تکرار شود. زمان استراحت در بین چرخه های فراصوت افزایش دما را کاهش می دهد و بنابراین خطر دناتوراسیون را کاهش خواهد داد.
انحلال پروتئین التراسونیک
روش فراصوت ممکن است روند حل پروتئین، که معمولا چند ساعت نیاز به سرعت بخشیدن به. به منظور بیش از حد گرم نمونه و جلوگیری از تخریب پروتئین و تغییرات در محلول های حاوی اوره، انفجار مافوق صوت باید از چند ثانیه دوام نمی شود.
مافوق صوت UP200Ht with 2mm microtip S26d2 for the sonication of small samples.
تجهیزات آلتراسونیک برای استخراج پروتئین
Hielscher فرا صوت ارائه طیف گسترده ای از اسیاب مافوق صوت برای فروپاشی سلول ها، بافت ها، باکتری ها، میکروارگانیسم ها، مخمر، و اسپور.
Hielscher سونوگرافی آزمایشگاه قدرتمند و آسان به کار. ساخته شده برای عملیات 24/7, آنها به عنوان آزمایشگاه قوی و کارآمد و دستگاه های نیمکت بالا طراحی شده است. برای تمام دستگاه ها می توان خروجی انرژی و دامنه را به طور دقیق کنترل کرد. طیف گسترده ای از لوازم جانبی باز می شود گزینه های راه اندازی بیشتر. مافوق صوت دیجیتال مانند VialTweeter، UP200Ht، UP200St، و UP400St کنترل درجه حرارت یکپارچه و ساخته شده در کارت SD برای ضبط خودکار داده ها.
برای غیر مستقیم، بدون آلودگی متقابل و فراصوت همزمان از نمونه های متعدد، ما ارائه VialTweeter و یا CupHorn مافوق صوت.
جدول زیر به شما می دهد بررسی اجمالی بیش از سونوگرافی ما برای آماده سازی نمونه، اختلال در سلول و استخراج. با کلیک بر روی نوع دستگاه برای دریافت اطلاعات بیشتر در هر هموژنیزر مافوق صوت. ما به خوبی آموزش دیده و طولانی مدت تجربه کارکنان فنی خوشحال خواهد شد برای کمک به شما انتخاب مافوق صوت مناسب ترین برای آماده سازی نمونه شما!
| دسته ای دوره | نرخ جریان | دستگاه های توصیه شده |
|---|---|---|
| تا 10 ویال یا لوله | خب | VialTweeter(ویال گروهی) |
| صفحات مولتی ول / میکروتیتر | خب | UIP400MTP |
| لوله های متعدد / عروق | خب | Cuphorn |
| 1 تا 500ML | 10 تا پوست 200ml / دقیقه | UP100H |
| 10 تا 1000mL | 20 تا 200mL/min | UP200Ht، UP200St |
| 10 به 2000mL | 20 تا 400ML / دقیقه | UP400St |
بسته به نوع کاربرد، مواد، و حجم نمونه، ما به شما راه اندازی مناسب برای آمادگی نمونه خود را توصیه خواهد کرد. تماس با ما امروز!
تماس با ما! / از ما بپرسید!
Hielscher دیجیتال ultrasonicators ویژگی های مرورگر کنترل از راه دور و پروتکل خودکار داده ها بر روی SD یکپارچه کارت.
VialTweeter(ویال گروهی) برای فراصوت غیر مستقیم.
آمار ارزشمند دانستن
پروتئومیکس
پروتئومیکس حوزه پژوهشی که پروتئین و پروتئوم بررسی است. پروتئین ها را fullfil یک آرایه وسیعی از عملکردهای حیاتی در موجودات زنده است. پروتئوم کل مجموعه ای از پروتئین های یک ژنوم، سلول، بافت، و یا ارگانیسم بیان در یک زمان خاص است. پروتئوم با گذشت زمان و مشخص مورد نیاز، و یا تنش های متفاوت است، که یک سلول یا ارگانیسم تحت. بیشتر به طور خاص، آن را به مجموعه ای از پروتئین بیان شده در یک نوع داده سلول یا ارگانیسم است، در یک زمان معین، تحت شرایط تعریف شده است. اصطلاح ترکیبی از پروتئین ها و ژنوم است. پروتئومیکس مطالعه پروتئوم است.
پروتئين
پروتئین ها مولکول های زیستی بزرگ، به اصطلاح مولکولهای – که از یک یا چند زنجیره طولانی از بقایای اسید آمینه تشکیل شده است. پروتئین موجود در تمام ارگانیسم های گیاهی و حیوانی موجود است و برای اکثر توابع بیولوژیکی حیاتی هستند. از آنجاییکه پروتئین ها حاوی اطلاعات بیولوژیکی زیادی هستند، برای تحلیلی استخراج می شوند، به عنوان مثال برای تحقیقات پروتئومیک. مهم ترین عملکرد انجام شده توسط پروتئین ها عبارتند از کاتالیز واکنش های متابولیکی، تکثیر DNA، پاسخ به محرک ها و انتقال مولکول ها از یک مکان به مکان دیگر. پروتئینها به طور عمده در دنباله ای از آمینو اسید ها متفاوتند، که از طریق توالی نوکلئوتیدی ژن های آنها تعریف می شود و معمولا نتیجه گیری از پوشیدن پروتئین به یک ساختار سه بعدی خاص است که فعالیت آن را تعیین می کند. پروتئین ها هستند – علاوه بر پپتیدهای – یکی از مولفه های کلیدی از مواد غذایی است. بنابراین، پروتئومیکس یک ابزار قدرتمند در علوم و صنایع غذایی برای بهینه سازی فرآیندهای، ایمنی مواد غذایی و ارزیابی تغذیه ای است.
Cloud Point Extraction
Cloud Point Extraction یک رویه پیش تحلیلی برای جدا کردن و پیش پنهان کردن تحلیل ها است. در ترکیب با امواج فراصوت, استخراج ابر نقطه را می توان تشدید ساخت فرایند کارآمد تر, سریع تر, و محیط زیست دوست. با امواج فراصوت، استخراج ابر نقطه به طور قابل توجهی کارآمد تر روش آماده سازی تجزیه و تحلیل است. اطلاعات بیشتر در مورد استخراج نقطه ابر به کمک مافوق صوت!ژل الکتروفورز
ژل الکتروفورز به روش عمده برای جداسازی و تجزیه و تحلیل مولکولهای مانند DNA، RNA و پروتئین و همچنین قطعات خود را، بر اساس اندازه و اتهام خود را است. این است که در شیمی بالینی استفاده به پروتئین های مسئول و / یا اندازه جدا (IEF آگارز، در اصل اندازه مستقل) و در بیوشیمی، زیست شناسی مولکولی و پروتئومیکس برای جدا کردن یک جمعیت مختلط قطعات DNA و RNA طول، به منظور برآورد اندازه از DNA و قطعات RNA یا به پروتئین جدا شده توسط مسئول.
کشت های سلولی
کشت سلول روند رو به رشد کنترل شده توسط که سلول ها در شرایط کنترل شده کشت می شود. شرایط کشت سلولی برای هر نوع سلول متفاوت است. به طور کلی، محیط یک کشت سلولی متشکل از یک کشتی مناسب (به عنوان مثال ظرف پتری) با بستر و یا متوسط که تامین مواد مغذی ضروری (اسیدهای آمینه، کربوهیدرات ها، ویتامین ها، مواد معدنی)، فاکتورهای رشد، هورمون ها، و گازهای (COH2SاینH2S)، و تنظیم محیط فیزیوتراپی و مواد شیمیایی (بافر pH، فشار اسمزی، دما). اکثر سلول های نیاز به یک سطح و یا بستر مصنوعی، در حالی که فرهنگ های دیگر سلول را می توان رایگان کشت شناور در محیط کشت (کشت سوسپانسیون، سوسپانسیون سلولی).
فرهنگ توده ای از رده های سلولی حیوانی در تولید صنعتی واکسن های ویروسی و سایر محصولات زیستفناوریای مشتق شده استفاده می شود. سلول های بنیادی انسانی کشت به گسترش تعداد سلول و تمایز سلول ها به انواع مختلف سلول های سوماتیک برای اهداف پیوند هستند.
نمونه های بافتی
بافت مدت توصیف متوسط سلولی، که در آن مواد سلولی در سطح سازمانی بین سلول ها و اندام کامل است. در بافت، سلول های مشابه، از مبدا همان که با هم انجام یک تابع خاص، مونتاژ شده است. با دستهبندی کاربردی بافت های متعدد، به ساختارهای پیچیده اندام تشکیل شده است.
بافت برای تحقیق در زیست شناسی، بافت شناسی / هیستوپاتولوژی، انگل شناسی، بیوشیمی، ایمونوهیستوشیمی و همچنین به پرورش و استخراج DNA نمونه برداری شد. و بافت گیاهی: می توان آن را بین حیوانات (بافت پستانداران زیربخش) مشخص شده است. بافت های حیوانی را به چهار نوع اساسی از همبند، عضلانی، عصبی، و بافت پوششی گروه بندی می شوند. اپیدرم، بافت زمین، و بافت عروقی: بافت گیاه به سه سیستم زیر بافت تقسیم می شوند.
نمونه های بافت می توان از حیوان یا گیاه قطعات، به عنوان مثال، آماده استخوان، عضله، برگ، و غیره
مایعات بدن
خون، سرم، پلاسما، مایع مغزی نخاعی، بزاق و مایع سینوویال مایعات بدن، که ارائه یک منبع بزرگ از اطلاعات تشخیصی مربوطه می باشد. بنابراین، آماده سازی پیچیده از نمونه های مایع بدن برای تجزیه و تحلیل مهم است. مشکل اول این است که با طیف گسترده ای پویا از اجزای موجود در مایعات بدن همراه است.
تعیین غلظت پروتئین
روش برادفورد، سنجش لوری و اسید bicinchoninic (BCA) روش سنجش مشترک برای تعیین غلظت پروتئین هستند. آلبومین سرم گاوی (BSA) یکی از استاندارد پروتئین اغلب استفاده می شود.
لیز بافر
بافر لیز کننده باید مطابق به مواد سلول یا بافت (کشت بافت، کارخانه ها، باکتری ها، قارچ ها، و غیره) انتخاب شود، و اینکه آیا سلول ها در یک ساختار و نوع ساختار هستند. طیف گسترده ای از لیز بافر برای استخراج پروتئین، غشاء، و اندامکهای با یک یا چند مواد پاک کننده فرموله شده است. مواد شوینده معمولا از طریق تست های آزمون و خطا و یا انتخاب – در صورت موجود بودن – با توجه به یک پروتکل استخراج پروتئین موجود است. مواد شوینده باید سازگار با منبع بافت و پروتئین باشد. به طور کلی، خفیف ترین مواد شوینده که برای یک بافت / پروتئین خاص کار می کند، این است که به منظور حفظ قابلیت حداکثر از عصاره انتخاب شده است. علاوه بر این، در صورت استخراج غشاء و اندامکهای، مواد شوینده ملایم نگه می دارد غشاء دست نخورده. مواد شوینده معمولا استفاده می شود در بافر لیز عمدتا غیر یونی یا zwitterionic، به عنوان مثال، می شلوار بی خشتک گاوداران، deoxycholate، تریتون ™ X-100، NP40، و Tween 20.
به عنوان مثال، بافت مانند مغز، کبد، روده، کلیه، طحال و غیره می تواند به سادگی با RIPA بافر – با این حال مهار کننده های پروتئاز و DTT (به عنوان مثال برای الکتروفورز ژل) باید شامل شود.
بافر لیز کننده برای بافت عضله اسکلتی (سرد): 20 میلی متر تریس (با pH 7.8)، 137 میلی مولار، 2.7 میلی کلرور پتاسیم، 1 میلی متر MgCl2 با، 1٪ تریتون X-100، 10٪ (W / V) گلیسرول، 1 میلی متر EDTA ، 1 میلی متر با پروتئاز و مهار کننده فسفاتاز کوکتل تکمیل دیتیوتریتول
جدول بافر مشترک و محدوده pH است. به طور کلی، این بافر به طور معمول در غلظت 20-50 میلی متر استفاده می شود.
| حائل | محدوده pH |
|---|---|
| اسید سیتریک – سود | ۲/۲ – ۶/۵ |
| سیترات سدیم – اسید سیتریک | ۳/۰ – ۶/۲ |
| استات سدیم – استیک اسید | ۳/۶ – ۵/۶ |
| اسید Cacodylic نمک سدیم – هیدروکلراید | ۵/۰ – ۷/۴ |
| من – سود | ۵/۶ – ۶/۸ |
| سدیم دی هیدروژن فسفات – هیدروژن فسفات دی سدیم | ۵/۸ – هشت |
| ایمیدازول – هیدروکلراید | ۶/۲ – ۷/۸ |
| MOPS – کوه | ۶/۶ – ۷/۸ |
| تری اتانول آمین هیدروکلراید – سود | ۶/۸ – ۸/۸ |
| تریس – هیدروکلراید | ۷/۰ – ۹/۰ |
| HEPES – سود | ۷/۲ – ۸/۲ |
| ترشیین – سود | ۷/۶ – ۸/۶ |
| بوراکس – اسید بوریک | ۷/۶ – ۹/۲ |
| بیسین – سود | ۷/۷ – ۸/۹ |
| گلیسین – سود | ۸/۶ – ۱۰/۶ |
ترین بافر را نشان می دهد pH برابر وابستگی با درجه حرارت. این امر به ویژه برای بافر تریس درست است. از pKa تغییر از 8.06 در 25 درجه سانتی گراد به 8.85 در 0 ° C.
(pH و مقدار pKa از یک بافر ها: PH اندازه گیری غلظت یون هیدروژن در محلول آبی مقدار pKa (= ثابت تفکیک اسیدی) اندازه گیری مرتبط، اما مشخص تر است، که در آن کمک می کند تا به پیش بینی یک مولکول در یک خاص عمل می کنند. مقدار PH است.)
Trizol انجام
Trizol انجام یک محلول شیمیایی مورد استفاده برای استخراج RNA / DNA / پروتئین در طول استخراج guanidinium تیوسیانات-فنل-کلروفرم است. استفاده از التراسونیک کمک نتایج استخراج Trizol انجام در DNA بالا، RNA، و بازده پروتئین را از نمونه های مشابه و برتری روش استخراج در نتیجه دیگر.
ادبیات / منابع
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates. Int J Food Sci Technol 44: 1843–1849.
- Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D’Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Efficient recovery of proteins from multiple source samples after trizol or trizol LS RNA extraction and long-term storage. BMC Genomics 2013, 14:181.