فن آوری اولتراسوند Hielscher

استخراج پروتئین التراسونیک از بافت و سلول فرهنگ

  • استخراج پروتئین یک نمونه مرحله آماده سازی ضروری در پروتئومیکس است.
  • پروتئین ها را می توان از گیاهان و حیوانات بافت ها، مخمرها و میکروارگانیسم استخراج شده است.
  • روش فراصوت، روش استخراج پروتئین کارآمد قابل اعتماد دادن بازده پروتئین بالا در مدت زمان استخراج کوتاه است.

 

استخراج پروتئین از بافت ها و سلول ها

استخراج پروتئین از بافت ها و سلول های کشت یک نمونه مرحله آماده سازی ضروری است که در طول بسیاری از تکنیک های بیوشیمیایی و تحلیلی مانند ELISA، صفحه انجام می گیرد، وسترن بلات، طیف سنجی جرمی، یا تصفیه پروتئین است. التراسونیک اختلال همراه، لیز و استخراج یک تکنیک دقیقا کنترل برای اطمینان از بازده بالا از پروتئین است.

استخراج پروتئین از بافت حیوانی

برای تهیه بافت کامل با اندازه (مانند کلیه، قلب، ریه، عضله و غیره)، بافت ها باید به قطعات کوچک و کوچک با ابزارهای تمیز، بر روی یخ ترجیح داده شوند و به همان اندازه که ممکن است برای جلوگیری از تخریب پروتئاز ها (به عنوان مثال بافر ليزي مانند RIPA يا بافر ليز هيپوتونيک حاوي کوکتل مهار کننده پروتئاز و فسفاتاز). پس از محاسبه، نمونه به صورت نیتروژن مایع برای یخ زدگی غوطه ور می شود. نمونه را می توان در دمای -80 درجه سانتیگراد برای استفاده بعدی نگهداری کرد یا برای همگن سازی سریع بر روی یخ نگهداری شود. بلافاصله قبل از استخراج اولتراسونیک، بافر لیز یخ سرد (با مهارکننده های پروتئاز DTT، leupeptin و aprotinin) به سرعت به لوله نمونه اضافه می شود (برای هر 10 میلی گرم بافت نزدیک به 600 میلی لیتر از بافر توصیه می شود). تقریبا 20-60 میلی گرم بافت در هر لوله نمونه ای توصیه می شود.
همگن التراسونیک، لیز و استخراج با هموژنایزر اولتراسونیک مانند انجام UP200Ht یا UP200St، مجهز به sonotrode میکرو نوک. مدت زمان فراصوت 60-90 ثانیه است. در حالت چرخه مافوق صوت از 15 ثانیه. فراصوت و 10 ثانیه. زمان استراحت. نمونه باید در یخ نگهداری تمام وقت.
پس از مافوق صوت همگن / ​​استخراج، عصاره است که در 27،000g برای حدود سانتریفیوژ شد. 20 دقیقه. پس از آن supernatent جمع آوری شده است، به طوری که غلظت پروتئین می تواند توسط یک سنجش پروتئین مانند پیرس BCA سنجش پروتئین مشخص می شود.

فراصوت پروتئین روش مهم آماده سازی نمونه است

استخراج پروتئین التراسونیک از سلول با UP200St

درخواست اطلاعات




توجه داشته باشید ما سیاست حفظ حریم خصوصی.


استخراج پروتئین از سرم خون

برای مخلوط یکنواخت سرم و بافر فسفات، ابتدا قبل از لیز کردن سلول های اولتراسونیک نمونه، vortexed می شود. برای لیزینگ اولتراسونیک، نمونه با یک هموژنایزر آزمایشگاهی اولتراسونیک مانند دستگاه سانتریفوژ مورد استفاده قرار می گیرد UP100H برای 8 چرخه در 20٪ دامنه، برای چرخه از هر 5 ثانیه و 15 ثانیه است. Sonocation است که توسط sonicationg در چرخه و با قرار دادن نمونه بر روی یخ به طوری که یک از حرارت زیاد و تخریب حرارتی از نمونه اجتناب شده است انجام شده است. از آنجا که سرم حاوی مقدار زیادی پروتئین با وزن مولکولی بالا (مانند آلبومین، α1-antitrypsin نامیده، ترانسفرین، haptoglobulin، ایمونوگلوبولین G و ایمونوگلوبولین A)، که با جدایی از پروتئین با وزن مولکولی پایین در طول IEF دخالت، توصیه می شود به آنها تهی از سرم با استفاده از یک ستون تخلیه.

استخراج پروتئین از بافت گیاهی

تازه، بافت گیاهی نرم، به عنوان مثال، خزه و غیره، می تواند به راحتی به سادگی با قرار دادن مواد نمونه خرد شده در بافر لیز کننده برای فراصوت مختل کرده است. دشوار، بافتهای گیاهی ligenous، مانند دانه، شاه درخت سوزن و غیره، باید خشک زمین باشد. برخی از سخت، مواد چوبی گیاهی باید منجمد و زمین در نیتروژن مایع قبل توسط فراصوت استخراج شده است. برای تعلیق کشت سلول گیاهی، یک درمان فراصوت بین 30 تا 150 ثانیه در یک بافر لیز کننده بیشتر کافی است. مواد سخت تر مانند دانه کدو تنبل نیاز به یک فراصوت شدید آن به شرح زیر است.

پروتکل برای استخراج اولتراسونیک آلبومین از دانه کدو تنبل

هموژنایزر بافت التراسونیک UP400St با S24d40 - برای استخراج پروتئین از گیاهی و بافت حیوان (برای بزرگنمایی کلیک کنید!)برای استخراج پروتئین اولتراسونیک آلبومین از پودر دانه کدو تنبل خوب زمین، 10 گرم پودر دانه کدو تنبل بدون چربی و 100 میلی لیتر آب به عنوان حلال deionised در یک بشر شیشه ای 250ML اضافه شده است. استخراج پروتئین شامل دو مرحله است: اول، نمونه با یک پروب نوع ultrasonicator فراصوت داده UP400St (400W، 24kHz) با sonotrode نصب S24d7. بشر شیشه ای در یک حمام آب سرد در طول همگن مافوق صوت قرار داده است. هر چه تنظیم ultrasonicator UP400St با سنسور دمای قابل اتصال، تضمین می کند که دمای نمونه همیشه زیر 30 درجه سانتیگراد نگه داشته می شود. با کنترل دقیق دما در طول طوفان زاویه، دیناما آلبومین اجتناب شود. دوم، استخراج با یک همزن در سرعت 200 دور در دقیقه و در دمای 30 درجه سانتیگراد انجام شد. بعد از آن بجر به یک شیکر ترموستات منتقل می شود. گلوبولین از طریق دیالیز با آب مقطر حذف می شود. پس از حذف گلوبولین، عصاره پروتئین را می توان برای تعیین مشخصات آلبومین نمونه برداری کرد و سپس با استفاده از 0.1 M HCl برای انعقاد آلبومین به pI = 3.0 تنظیم می شود. فاز جامد با سانتریفوژ با 5000 گرم، 20 درجه سانتیگراد و سپس دوباره در آب دئونیزه شده جدا می شود. انعقاد آلبومین دو بار برای افزایش نسبت پروتئین به کنسانتره آلبومین انجام می شود.

التراسونیک استخراج پروتئین قلیایی برای تهیه کنسانتره پروتئین از سبوس برنج نشان می دهد که نتایج درمان فراصوت در عملکرد پروتئین بالاتر در یک زمان استخراج قابل توجهی کوتاه تر – در مقایسه با روش متداول استخراج است.

VialTweeter دستگاه آلتراسونیک برای استخراج پروتئین از نمونه های بافتی (برای بزرگنمایی کلیک کنید!)

VialTweeter(ویال گروهی) برای فراصوت غیر مستقیم.

مزایای

  • سریع
  • بازده بالا
  • بسیار کارآمد
  • کنترل دقیق بر پارامترهای
  • نتایج تجدید پذیر
  • مقیاس پذیری خطی

پروتکل آماده سازی نمونه برای آنزیم های کاربردی iNOS به

برای به دست آوردن کاملا کاربردی آنزیم iNOS به (به عنوان مثال برای غربالگری داروها)، پروتکل زیر توصیه می شود: تعلیق همراه باید بر روی یخ و sonicate با قرار UP100H در دامنه 10μm در حالت چرخه از 5 ثانیه. فراصوت و 25 ثانیه. استراحت بر روی یخ. روش باید حدود تکرار می شود. 3 بار. ساعت استراحت در بین چرخه فراصوت افزایش درجه حرارت کاهش می دهد و بنابراین خطر ابتلا به دناتوراسیون را کاهش دهد.

انحلال پروتئین التراسونیک

روش فراصوت ممکن است روند حل پروتئین، که معمولا چند ساعت نیاز به سرعت بخشیدن به. به منظور بیش از حد گرم نمونه و جلوگیری از تخریب پروتئین و تغییرات در محلول های حاوی اوره، انفجار مافوق صوت باید از چند ثانیه دوام نمی شود.

دستورالعمل های کلی

کنترل دما: برای اطمینان از عملکرد پروتئین بالا و بدون دناتوراسیون حرارتی، درجه حرارت در طول استخراج باید کنترل شود. دولت از هنر اسیاب اولتراسونیک Hielscher است – همچنین disintegrator مافوق صوت و یا sonificator نام – دقیقا قابل کنترل است. آنها با یک سنسور دما plugable آمده است. در گزینه های تنظیم از هموژنایزر اولتراسونیک، حداکثر درجه حرارت می تواند تنظیم شود. هنگامی که این دمای حداکثر رسیده است، ultrasonicator به طور خودکار متوقف تا نمونه پایین سرد می شود.
بافر: به گون از یک بافر مناسب و حجم حق بافر از یک بافت به بافت متفاوت است و باید توسط آزمایش آزمون و خطا کشف کردن باشد.
جداسازی / تصفیه: lysate به پروتئین می تواند شامل بیش از مولکولهای زیستی مانند DNA و یا کربوهیدرات ها، که ممکن است توسط پروتئین بارش (اسید تری کلرواستیک deoxycholate-) حذف یا بافر ارز.

Chittapalo و Noomhorm (2009) گزارش داد که عملکرد پروتئین افزایش یافته با استفاده از فراصوت و همگن بافت و لیز روند مافوق صوت می تواند فرآیندهای استخراج موجود قابل توجهی افزایش – را قادر می سازد برای فرصت های استخراج تجاری جدید است.

صدا حفاظت با محفظه صدا Hielscher را SPB-L و دستگاه اولتراسونیک UP200St. (برای بزرگنمایی کلیک کنید!)

التراسونیک هموژنایزر بافت UP200St برای استخراج پروتئین کارآمد

کنترل دقیق درمان فراصوت (برای بزرگنمایی کلیک کنید!)

کنترل مرورگر برای عملیات و نظارت دقیق بر روند فراصوت

تجهیزات آلتراسونیک برای استخراج پروتئین

Hielscher فرا صوت ارائه طیف گسترده ای از اسیاب مافوق صوت برای فروپاشی سلول ها، بافت ها، باکتری ها، میکروارگانیسم ها، مخمر، و اسپور.
ultrasonicators آزمایشگاه Hielscher قدرتمند و آسان به این عمل می باشد. ساخته شده برای 24/7 عملیات، آنها به عنوان دستگاه های آزمایشگاه و رومیزی همراه قوی و کارآمد طراحی شده است. برای همه دستگاه، خروجی انرژی و دامنه را می توان دقیقا کنترل می شود. طیف گسترده ای از و لوازم جانبی باز می شود گزینه های راه اندازی شده است. دستگاه های دیجیتال مانند VialTweeter(ویال گروهی)، UP200Ht، UP200St، و UP400St دارای یک کنترل دمای یکپارچه و ساخته شده در کارت SD برای ضبط خودکار داده ها.
برای غیر مستقیم، کراس رایگان آلودگی و فراصوت به طور همزمان از نمونه های متعدد، ما ارائه می دهیم VialTweeter(ویال گروهی) یا cuphorn التراسونیک.
بسته به نوع کاربرد، مواد، و حجم نمونه، ما به شما راه اندازی مناسب برای آمادگی نمونه خود را توصیه خواهد کرد. تماس با ما امروز!

تماس با ما! / از ما بپرسید!

لطفاجهت کسب اطلاعات بیشتراز فرم زیر استفاده کنید .









لطفا توجه داشته باشید ما سیاست حفظ حریم خصوصی.


ادبیات / منابع

  • Chittapalo T، Noomhorm A (2009): التراسونیک کمک استخراج قلیایی پروتئین از سبوس برنج defatted و خواص کنسانتره پروتئین است. بین المللی J غذایی علمی فن آوری 44: 1843-1849.
  • سیموئس، آندره E.S:؛ پریرا، دایان M. آمارال، جوآن. نونز، آنا M. گومز، صوفیه E. رابرتز، پیتر M. در حقیقت، آدریان C. D'Hooge، رودی؛ هدایت، کلیفورد J. تیبودیو، استفان C. Borralho، پیتر M. رودریگز، سیسیلیا M. ص (2013): بازیابی کارآمد پروتئین از نمونه منبع های متعدد پس از Trizol انجام یا Trizol انجام LS استخراج RNA و ذخیره سازی طولانی مدت. BMC ژنومیک، 2013، 14: 181.


آمار ارزشمند دانستن

پروتئومیکس

پروتئومیکس حوزه پژوهشی که پروتئین و پروتئوم بررسی است. پروتئین ها را fullfil یک آرایه وسیعی از عملکردهای حیاتی در موجودات زنده است. پروتئوم کل مجموعه ای از پروتئین های یک ژنوم، سلول، بافت، و یا ارگانیسم بیان در یک زمان خاص است. پروتئوم با گذشت زمان و مشخص مورد نیاز، و یا تنش های متفاوت است، که یک سلول یا ارگانیسم تحت. بیشتر به طور خاص، آن را به مجموعه ای از پروتئین بیان شده در یک نوع داده سلول یا ارگانیسم است، در یک زمان معین، تحت شرایط تعریف شده است. اصطلاح ترکیبی از پروتئین ها و ژنوم است. پروتئومیکس مطالعه پروتئوم است.

پروتئين

پروتئین ها مولکول های زیستی بزرگ، به اصطلاح مولکولهای – که از یک یا چند زنجیره طولانی از بقایای اسید آمینه تشکیل شده است. پروتئین موجود در تمام ارگانیسم های گیاهی و حیوانی موجود است و برای اکثر توابع بیولوژیکی حیاتی هستند. از آنجاییکه پروتئین ها حاوی اطلاعات بیولوژیکی زیادی هستند، برای تحلیلی استخراج می شوند، به عنوان مثال برای تحقیقات پروتئومیک. مهم ترین عملکرد انجام شده توسط پروتئین ها عبارتند از کاتالیز واکنش های متابولیکی، تکثیر DNA، پاسخ به محرک ها و انتقال مولکول ها از یک مکان به مکان دیگر. پروتئینها به طور عمده در دنباله ای از آمینو اسید ها متفاوتند، که از طریق توالی نوکلئوتیدی ژن های آنها تعریف می شود و معمولا نتیجه گیری از پوشیدن پروتئین به یک ساختار سه بعدی خاص است که فعالیت آن را تعیین می کند. پروتئین ها هستند – علاوه بر پپتیدهای – یکی از مولفه های کلیدی از مواد غذایی است. بنابراین، پروتئومیکس یک ابزار قدرتمند در علوم و صنایع غذایی برای بهینه سازی فرآیندهای، ایمنی مواد غذایی و ارزیابی تغذیه ای است.

ژل الکتروفورز

ژل الکتروفورز به روش عمده برای جداسازی و تجزیه و تحلیل مولکولهای مانند DNA، RNA و پروتئین و همچنین قطعات خود را، بر اساس اندازه و اتهام خود را است. این است که در شیمی بالینی استفاده به پروتئین های مسئول و / یا اندازه جدا (IEF آگارز، در اصل اندازه مستقل) و در بیوشیمی، زیست شناسی مولکولی و پروتئومیکس برای جدا کردن یک جمعیت مختلط قطعات DNA و RNA طول، به منظور برآورد اندازه از DNA و قطعات RNA یا به پروتئین جدا شده توسط مسئول.

کشت های سلولی

کشت سلول روند رو به رشد کنترل شده توسط که سلول ها در شرایط کنترل شده کشت می شود. شرایط کشت سلولی برای هر نوع سلول متفاوت است. به طور کلی، محیط یک کشت سلولی متشکل از یک کشتی مناسب (به عنوان مثال ظرف پتری) با بستر و یا متوسط ​​که تامین مواد مغذی ضروری (اسیدهای آمینه، کربوهیدرات ها، ویتامین ها، مواد معدنی)، فاکتورهای رشد، هورمون ها، و گازهای (COH2SاینH2S)، و تنظیم محیط فیزیوتراپی و مواد شیمیایی (بافر pH، فشار اسمزی، دما). اکثر سلول های نیاز به یک سطح و یا بستر مصنوعی، در حالی که فرهنگ های دیگر سلول را می توان رایگان کشت شناور در محیط کشت (کشت سوسپانسیون، سوسپانسیون سلولی).
فرهنگ توده ای از رده های سلولی حیوانی در تولید صنعتی واکسن های ویروسی و سایر محصولات زیستفناوریای مشتق شده استفاده می شود. سلول های بنیادی انسانی کشت به گسترش تعداد سلول و تمایز سلول ها به انواع مختلف سلول های سوماتیک برای اهداف پیوند هستند.

نمونه های بافتی

بافت مدت توصیف متوسط ​​سلولی، که در آن مواد سلولی در سطح سازمانی بین سلول ها و اندام کامل است. در بافت، سلول های مشابه، از مبدا همان که با هم انجام یک تابع خاص، مونتاژ شده است. با دستهبندی کاربردی بافت های متعدد، به ساختارهای پیچیده اندام تشکیل شده است.
بافت برای تحقیق در زیست شناسی، بافت شناسی / هیستوپاتولوژی، انگل شناسی، بیوشیمی، ایمونوهیستوشیمی و همچنین به پرورش و استخراج DNA نمونه برداری شد. و بافت گیاهی: می توان آن را بین حیوانات (بافت پستانداران زیربخش) مشخص شده است. بافت های حیوانی را به چهار نوع اساسی از همبند، عضلانی، عصبی، و بافت پوششی گروه بندی می شوند. اپیدرم، بافت زمین، و بافت عروقی: بافت گیاه به سه سیستم زیر بافت تقسیم می شوند.
نمونه های بافت می توان از حیوان یا گیاه قطعات، به عنوان مثال، آماده استخوان، عضله، برگ، و غیره

مایعات بدن

خون، سرم، پلاسما، مایع مغزی نخاعی، بزاق و مایع سینوویال مایعات بدن، که ارائه یک منبع بزرگ از اطلاعات تشخیصی مربوطه می باشد. بنابراین، آماده سازی پیچیده از نمونه های مایع بدن برای تجزیه و تحلیل مهم است. مشکل اول این است که با طیف گسترده ای پویا از اجزای موجود در مایعات بدن همراه است.

تعیین غلظت پروتئین

روش برادفورد، سنجش لوری و اسید bicinchoninic (BCA) روش سنجش مشترک برای تعیین غلظت پروتئین هستند. آلبومین سرم گاوی (BSA) یکی از استاندارد پروتئین اغلب استفاده می شود.

لیز بافر

بافر لیز کننده باید مطابق به مواد سلول یا بافت (کشت بافت، کارخانه ها، باکتری ها، قارچ ها، و غیره) انتخاب شود، و اینکه آیا سلول ها در یک ساختار و نوع ساختار هستند. طیف گسترده ای از لیز بافر برای استخراج پروتئین، غشاء، و اندامکهای با یک یا چند مواد پاک کننده فرموله شده است. مواد شوینده معمولا از طریق تست های آزمون و خطا و یا انتخاب – در صورت موجود بودن – با توجه به یک پروتکل استخراج پروتئین موجود است. مواد شوینده باید سازگار با منبع بافت و پروتئین باشد. به طور کلی، خفیف ترین مواد شوینده که برای یک بافت / پروتئین خاص کار می کند، این است که به منظور حفظ قابلیت حداکثر از عصاره انتخاب شده است. علاوه بر این، در صورت استخراج غشاء و اندامکهای، مواد شوینده ملایم نگه می دارد غشاء دست نخورده. مواد شوینده معمولا استفاده می شود در بافر لیز عمدتا غیر یونی یا zwitterionic، به عنوان مثال، می شلوار بی خشتک گاوداران، deoxycholate، تریتون ™ X-100، NP40، و Tween 20.
به عنوان مثال، بافت مانند مغز، کبد، روده، کلیه، طحال و غیره می تواند به سادگی با RIPA بافر – با این حال مهار کننده های پروتئاز و DTT (به عنوان مثال برای الکتروفورز ژل) باید شامل شود.
بافر لیز کننده برای بافت عضله اسکلتی (سرد): 20 میلی متر تریس (با pH 7.8)، 137 میلی مولار، 2.7 میلی کلرور پتاسیم، 1 میلی متر MgCl2 با، 1٪ تریتون X-100، 10٪ (W / V) گلیسرول، 1 میلی متر EDTA ، 1 میلی متر با پروتئاز و مهار کننده فسفاتاز کوکتل تکمیل دیتیوتریتول
جدول بافر مشترک و محدوده pH است. به طور کلی، این بافر به طور معمول در غلظت 20-50 میلی متر استفاده می شود.

حائل محدوده pH
اسید سیتریک – سود ۲/۲ – ۶/۵
سیترات سدیم – اسید سیتریک ۳/۰ – ۶/۲
استات سدیم – استیک اسید ۳/۶ – ۵/۶
اسید Cacodylic نمک سدیم – هیدروکلراید ۵/۰ – ۷/۴
من – سود ۵/۶ – ۶/۸
سدیم دی هیدروژن فسفات – هیدروژن فسفات دی سدیم ۵/۸ – هشت
ایمیدازول – هیدروکلراید ۶/۲ – ۷/۸
MOPS – کوه ۶/۶ – ۷/۸
تری اتانول آمین هیدروکلراید – سود ۶/۸ – ۸/۸
تریس – هیدروکلراید ۷/۰ – ۹/۰
HEPES – سود ۷/۲ – ۸/۲
ترشیین – سود ۷/۶ – ۸/۶
بوراکس – اسید بوریک ۷/۶ – ۹/۲
بیسین – سود ۷/۷ – ۸/۹
گلیسین – سود ۸/۶ – ۱۰/۶

ترین بافر را نشان می دهد pH برابر وابستگی با درجه حرارت. این امر به ویژه برای بافر تریس درست است. از pKa تغییر از 8.06 در 25 درجه سانتی گراد به 8.85 در 0 ° C.
(pH و مقدار pKa از یک بافر ها: PH اندازه گیری غلظت یون هیدروژن در محلول آبی مقدار pKa (= ثابت تفکیک اسیدی) اندازه گیری مرتبط، اما مشخص تر است، که در آن کمک می کند تا به پیش بینی یک مولکول در یک خاص عمل می کنند. مقدار PH است.)

Trizol انجام

Trizol انجام یک محلول شیمیایی مورد استفاده برای استخراج RNA / DNA / پروتئین در طول استخراج guanidinium تیوسیانات-فنل-کلروفرم است. استفاده از التراسونیک کمک نتایج استخراج Trizol انجام در DNA بالا، RNA، و بازده پروتئین را از نمونه های مشابه و برتری روش استخراج در نتیجه دیگر.