استخراج فراصوتی پروتئین از بافت و کشت‌های سلولی
- استخراج پروتئین یکی از مراحل ضروری آماده‌سازی نمونه در پروتئومیکس است.
- پروتئین‌ها را می‌توان از بافت‌های گیاهی و جانوری، مخمرها و میکروارگانیسم‌ها استخراج کرد.
- فراصوت‌دهی روشی قابل‌اعتماد و کارآمد برای استخراج پروتئین است که در زمانی کوتاه، بازده بالایی از پروتئین به دست می‌دهد.
استخراج پروتئین از بافت‌ها و سلول‌ها
استخراج پروتئین از بافت‌ها و سلول‌های کشت‌شده یکی از مراحل ضروری آماده‌سازی نمونه است که در بسیاری از روش‌های بیوشیمیایی و تحلیلی مانند ELISA، PAGE، وسترن بلاتینگ، طیف‌سنجی جرمی یا خالص‌سازی پروتئین انجام می‌شود. تخریب سلولی، لیز و استخراج فراصوتی، روشی غیرحرارتی با قابلیت کنترل دقیق است که بازده بالای پروتئین را تضمین می‌کند.
استخراج پروتئین از سلول‌ها با پروب فراصوتی UP200St
- سریع
- بازده بالا
- بسیار کارآمد
- کنترل دقیق پارامترها
- نتایج تکرارپذیر
- مقیاس‌پذیری خطی
دستورالعمل‌های عمومی لیز و استخراج فراصوتی پروتئین
- کنترل دما: برای اطمینان از بازده بالای پروتئین بدون دناتوراسیون حرارتی، دما باید در طول استخراج کنترل شود. هموژنایزرهای فراصوتی پیشرفتهٔ Hielscher – که با نام دستگاه متلاشی‌کنندهٔ فراصوتی یا فراصوت‌ساز نیز شناخته می‌شوند – قابلیت کنترل دقیق دارند. این دستگاه‌ها به حسگر دمای قابل‌اتصال مجهزند. در گزینه‌های تنظیم هموژنایزر فراصوتی می‌توان حداکثر دما را تعیین کرد. هنگامی که دما به این مقدار حداکثر برسد، دستگاه فراصوتی به‌طور خودکار متوقف می‌شود تا نمونه خنک شود.
- بافر: انتخاب بافر مناسب و حجم صحیح آن برای هر بافت متفاوت است و باید با آزمون‌وخطا تعیین شود.
- جداسازی / خالص‌سازی: لیزات‌های پروتئینی ممکن است حاوی مقادیر اضافی زیست‌مولکول‌هایی مانند DNA یا کربوهیدرات‌ها باشند که می‌توان آن‌ها را با رسوب‌دهی پروتئین (دئوکسی‌کولات–اسید تری‌کلرواستیک) یا تعویض بافر حذف کرد.
Chittapalo و Noomhorm (2009) در مطالعهٔ خود گزارش کردند که استفاده از فراصوت‌دهی بازده پروتئین را افزایش می‌دهد و فرایند هموژن‌سازی و لیز فراصوتی بافت می‌تواند فرایندهای موجود استخراج را به‌طور چشمگیری بهبود دهد – و فرصت‌های تازه‌ای برای استخراج تجاری فراهم کند.
CupHorn فراصوتی برای آماده‌سازی هم‌زمان و بسیار مؤثر چندین نمونه در شرایط یکسان به‌منظور جداسازی پروتئین و قطعه‌قطعه‌سازی DNA.
استخراج پروتئین از بافت جانوری
برای آماده‌سازی بافت کامل (مانند کلیه، قلب، ریه، عضله و غیره)، بافت باید با ابزار تمیز، ترجیحاً روی یخ و با بیشترین سرعت ممکن به قطعات بسیار کوچک برش داده شود تا از تخریب آن به‌وسیلهٔ پروتئازها جلوگیری شود (برای مثال، بافر لیز مانند RIPA یا بافر لیز هیپوتونیک حاوی مخلوط مهارکننده‌های پروتئاز و فسفاتاز). پس از برش، نمونه برای انجماد سریع در نیتروژن مایع غوطه‌ور می‌شود. نمونه را می‌توان برای استفادهٔ بعدی در -80°C نگهداری کرد یا برای هموژن‌سازی فوری روی یخ قرار داد. درست پیش از استخراج فراصوتی، بافر لیز سردِ یخی (حاوی مهارکننده‌های پروتئاز DTT، لوپپتین و آپروتینین) به‌سرعت به لولهٔ نمونه افزوده می‌شود (به‌ازای ~10 mg بافت، حدود ~600 μL بافر توصیه می‌شود). برای هر لولهٔ نمونه حدود 20–60mg بافت توصیه می‌شود.
هموژن‌سازی، لیز و استخراج فراصوتی با هموژنایزر فراصوتی مانند UP100H یا UP200Ht مجهز به سونوتْرود با نوک میکرو انجام می‌شود. مدت فراصوت‌دهی 60–90 sec. است و در حالت چرخه‌ای، هر چرخه شامل 15 sec. فراصوت‌دهی و 10 sec. استراحت است. نمونه باید در تمام مدت در یخ نگهداری شود.
پس از هموژن‌سازی / استخراج فراصوتی، لیزات با 27٬000g به‌مدت حدود 20 min. سانتریفیوژ می‌شود. سپس مایع رویی جمع‌آوری می‌شود تا غلظت پروتئین با آزمونی مانند آزمون پروتئین BCA شرکت Pierce تعیین شود.
استخراج پروتئین از سرم خون
برای ایجاد مخلوطی همگن از سرم و بافر فسفات، ابتدا نمونه پیش از لیز فراصوتی سلول‌ها با ورتکس مخلوط می‌شود. برای لیز فراصوتی، نمونه با یک هموژنایزر فراصوتی آزمایشگاهی مانند UP100H طی 8 چرخه با دامنهٔ 20% فراصوت‌دهی می‌شود؛ هر چرخه شامل 5 ثانیه روشن و 15 ثانیه خاموش است. استخراج پروتئین با فراصوت‌دهی چرخه‌ای (حالت پالسی) و قرار دادن نمونه روی یخ انجام می‌شود تا از گرم‌شدن بیش‌ازحد و تخریب حرارتی نمونه جلوگیری شود. ازآنجاکه سرم حاوی مقدار زیادی پروتئین با وزن مولکولی بالا (مانند آلبومین، α1-آنتی‌تریپسین، ترانسفرین، هاپتوگلوبولین، ایمونوگلوبولین G و ایمونوگلوبولین A) است که در جداسازی پروتئین‌های با وزن مولکولی پایین طی IEF تداخل ایجاد می‌کنند، توصیه می‌شود این پروتئین‌ها با استفاده از ستون حذف از سرم زدوده شوند.
استخراج پروتئین از بافت گیاهی
بافت گیاهی تازه و نرم، مانند خزه و غیره، را می‌توان به‌آسانی با قرار دادن مواد نمونهٔ خردشده در بافر لیز و فراصوت‌دهی تخریب کرد. بافت‌های گیاهی سخت و چوبی، مانند دانه‌ها، برگ‌های سوزنی نراد و غیره، باید به‌صورت خشک آسیاب شوند. برخی مواد گیاهی سخت و چوبی باید پیش از استخراج با فراصوت‌دهی، در نیتروژن مایع منجمد و آسیاب شوند. برای سوسپانسیون‌های کشت سلول گیاهی، معمولاً تیمار فراصوتی بین 30 و 150 ثانیه در بافر لیز کافی است. مواد سخت‌تر مانند تخم کدو به فراصوت‌دهی شدیدتری نیاز دارند که در ادامه شرح داده شده است.
پروتکل استخراج فراصوتی آلبومین از تخم کدو
برای استخراج فراصوتی آلبومین از پودر نرم‌آسیاب‌شدهٔ تخم کدو، 10 g پودر تخم کدوی چربی‌زدایی‌شده و 100 mL آب دی‌یونیزه به‌عنوان حلال به یک بشر شیشه‌ای 250mL افزوده می‌شود. استخراج پروتئین شامل دو مرحله است: ابتدا نمونه با یک دستگاه فراصوتی پروبی UP400St (400W, 24kHz) مجهز به سونوتْرود S24d7 فراصوت‌دهی می‌شود. بشر شیشه‌ای در طول هموژن‌سازی فراصوتی در حمام آب سرد قرار می‌گیرد. حسگر دمای قابل‌اتصال و تنظیمات کنترل دمای دستگاه فراصوتی UP400St تضمین می‌کنند که دمای نمونه همواره زیر 30°C بماند. کنترل دقیق دما در طول فراصوت‌دهی از دناتوراسیون آلبومین جلوگیری می‌کند. در مرحلهٔ دوم، استخراج با همزن با سرعت 200 rpm و در دمای 30°C انجام شد. سپس بشر به شیکر ترموستات‌دار منتقل می‌شود. گلوبولین با دیالیز در برابر آب مقطر حذف می‌شود. پس از حذف گلوبولین، می‌توان از عصارهٔ پروتئینی برای تعیین پروفایل آلبومین نمونه‌برداری کرد؛ سپس برای انعقاد آلبومین، عصاره با استفاده از 0٫1 M HCl روی pI=3٫0 تنظیم می‌شود. فاز جامد با سانتریفیوژ در 5000g و 20°C جدا و دوباره در آب دی‌یونیزه حل می‌شود. انعقاد آلبومین دو بار انجام می‌شود تا نسبت پروتئین در کنسانترهٔ آلبومین افزایش یابد.
استخراج قلیایی فراصوتی پروتئین برای تهیهٔ کنسانترهٔ پروتئین از سبوس برنج نشان می‌دهد که تیمار فراصوتی، در مقایسه با روش‌های متداول استخراج، بازده پروتئین بالاتری را در زمان استخراج به‌مراتب کوتاه‌تری فراهم می‌کند.
پروتکل آماده‌سازی نمونه برای آنزیم فعال iNOS
برای به دست آوردن آنزیم iNOS با فعالیت کامل (برای مثال، برای غربالگری دارویی)، پروتکل زیر توصیه می‌شود: سوسپانسیون سلولی باید روی یخ قرار گیرد و با UP100H در دامنهٔ 10µm و در حالت چرخه‌ای شامل 5 sec. فراصوت‌دهی و 25 sec. استراحت روی یخ، فراصوت‌دهی شود. این فرایند باید حدود 3 بار تکرار شود. زمان استراحت بین چرخه‌های فراصوت‌دهی، افزایش دما را کاهش می‌دهد و در نتیجه خطر دناتوراسیون را کم می‌کند.
حل‌سازی فراصوتی پروتئین
فراصوت‌دهی می‌تواند فرایند حل‌سازی پروتئین را که معمولاً چندین ساعت زمان می‌برد، تسریع کند. برای جلوگیری از گرم‌شدن بیش‌ازحد نمونه و پیشگیری از تخریب و تغییرات پروتئین در محلول‌های حاوی اوره، پالس‌های فراصوت نباید بیش از چند ثانیه طول بکشند.
دستگاه فراصوتی UP200Ht با نوک میکرو 2mm مدل S26d2 برای فراصوت‌دهی نمونه‌های کوچک.
تجهیزات فراصوتی برای استخراج پروتئین
Hielscher Ultrasonics طیف گسترده‌ای از هموژنایزرهای فراصوتی را برای متلاشی‌کردن سلول‌ها، بافت‌ها، باکتری‌ها، میکروارگانیسم‌ها، مخمرها و اسپورها عرضه می‌کند.
دستگاه‌های فراصوتی آزمایشگاهی Hielscher قدرتمندند و کار با آن‌ها آسان است. این دستگاه‌ها برای کارکرد 24/7 ساخته شده‌اند و به‌صورت تجهیزات آزمایشگاهی و رومیزی مقاوم و کارآمد طراحی شده‌اند. در همهٔ دستگاه‌ها، انرژی خروجی و دامنه را می‌توان به‌دقت کنترل کرد. طیف گستردهٔ لوازم جانبی، گزینه‌های بیشتری برای پیکربندی فراهم می‌کند. دستگاه‌های فراصوتی دیجیتال مانند VialTweeter، UP200Ht، UP200St و UP400St دارای کنترل دمای یکپارچه و کارت SD داخلی برای ثبت خودکار داده‌ها هستند.
برای فراصوت‌دهی غیرمستقیم و هم‌زمان چندین نمونه، بدون آلودگی متقاطع، VialTweeter یا CupHorn فراصوتی را عرضه می‌کنیم.
جدول زیر نمایی کلی از دستگاه‌های فراصوتی ما برای آماده‌سازی نمونه، تخریب سلولی و استخراج ارائه می‌دهد. برای کسب اطلاعات بیشتر دربارهٔ هر هموژنایزر فراصوتی، روی نوع دستگاه کلیک کنید. کارکنان فنی آموزش‌دیده و باسابقهٔ ما با کمال میل به شما در انتخاب مناسب‌ترین دستگاه فراصوتی برای آماده‌سازی نمونه‌هایتان کمک می‌کنند!
| حجم بچ | دبی | دستگاه‌های پیشنهادی |
|---|---|---|
| تا 10 ویال یا لوله | قابل‌اعمال نیست | VialTweeter |
| پلیت‌های چندچاهکی / میکروتیتر | قابل‌اعمال نیست | UIP400MTP |
| چندین لوله / ظرف | قابل‌اعمال نیست | CupHorn |
| 1 تا 500mL | 10 تا 200mL/min | UP100H |
| 10 تا 1000mL | 20 تا 200mL/min | UP200Ht, UP200St |
| 10 تا 2000mL | 20 تا 400mL/min | UP400St |
با توجه به کاربرد، ماده و حجم نمونهٔ شما، مناسب‌ترین پیکربندی را برای آماده‌سازی نمونه‌هایتان پیشنهاد می‌کنیم. همین امروز با ما تماس بگیرید!
با ما تماس بگیرید! / از ما بپرسید!
دستگاه‌های فراصوتی دیجیتال Hielscher دارای قابلیت کنترل از راه دور از طریق مرورگر و ثبت خودکار داده‌ها روی کارت SD یکپارچه هستند.
VialTweeter برای فراصوت‌دهی غیرمستقیم.
دانستنی‌های مفید
پروتئومیکس
پروتئومیکس حوزه‌ای پژوهشی است که پروتئین‌ها و پروتئوم را بررسی می‌کند. پروتئین‌ها طیف وسیعی از وظایف حیاتی را در جانداران انجام می‌دهند. پروتئوم مجموعهٔ کامل پروتئین‌هایی است که یک ژنوم، سلول، بافت یا جاندار در زمانی معین بیان می‌کند. پروتئوم با گذشت زمان و برحسب نیازهای متفاوت یا تنش‌هایی که سلول یا جاندار تجربه می‌کند، تغییر می‌یابد. به‌طور دقیق‌تر، پروتئوم مجموعهٔ پروتئین‌های بیان‌شده در یک نوع مشخص سلول یا جاندار، در زمانی معین و تحت شرایط تعریف‌شده است. این اصطلاح از ترکیب واژه‌های پروتئین و ژنوم ساخته شده است. پروتئومیکس مطالعهٔ پروتئوم است.
پروتئین
پروتئین‌ها زیست‌مولکول‌های بزرگی هستند که درشت‌مولکول نامیده می‌شوند – و از یک یا چند زنجیرهٔ بلند از باقی‌مانده‌های اسید آمینه تشکیل شده‌اند. پروتئین‌ها در همهٔ جانداران با منشأ گیاهی و جانوری وجود دارند و برای بیشتر عملکردهای زیستی حیاتی‌اند. ازآنجاکه پروتئین‌ها حاوی اطلاعات زیستی فراوانی هستند، برای اهداف تحلیلی، از جمله پژوهش‌های پروتئومیکس، استخراج می‌شوند. مهم‌ترین وظایف پروتئین‌ها شامل کاتالیز واکنش‌های متابولیکی، همانندسازی DNA، پاسخ به محرک‌ها و انتقال مولکول‌ها از مکانی به مکان دیگر است. تفاوت اصلی پروتئین‌ها با یکدیگر در توالی اسیدهای آمینهٔ آن‌هاست که توالی نوکلئوتیدی ژن‌هایشان آن را تعیین می‌کند و معمولاً موجب تاخوردگی پروتئین به یک ساختار سه‌بعدی مشخص می‌شود که فعالیت آن را تعیین می‌کند. پروتئین‌ها – در کنار پپتیدها – از اجزای اصلی مواد غذایی هستند. بنابراین، پروتئومیکس ابزاری قدرتمند در علوم غذایی برای بهینه‌سازی فرایندها، ایمنی مواد غذایی و ارزیابی تغذیه‌ای است.
Cloud Point Extraction
Cloud Point Extraction روشی پیش‌تحلیلی برای جداسازی و پیش‌تغلیظ آنالیت‌ها است. استخراج نقطهٔ ابری را می‌توان با فراصوت‌دهی تشدید کرد و فرایند را کارآمدتر، سریع‌تر و سازگارتر با محیط‌زیست ساخت. با فراصوت‌دهی، استخراج نقطهٔ ابری به روشی به‌مراتب کارآمدتر برای آماده‌سازی آنالیت تبدیل می‌شود. دربارهٔ استخراج نقطهٔ ابری به کمک فراصوت بیشتر بخوانید!
الکتروفورز ژل
الکتروفورز ژل روش اصلی جداسازی و تحلیل درشت‌مولکول‌هایی مانند DNA، RNA و پروتئین‌ها و نیز قطعات آن‌ها بر اساس اندازه و بارشان است. این روش در شیمی بالینی برای جداسازی پروتئین‌ها بر اساس بار و/یا اندازه (IEF آگاروز، اساساً مستقل از اندازه) و در بیوشیمی، زیست‌شناسی مولکولی و پروتئومیکس برای جداسازی مجموعه‌ای مخلوط از قطعات DNA و RNA بر اساس طول، برآورد اندازهٔ قطعات DNA و RNA یا جداسازی پروتئین‌ها بر اساس بار به کار می‌رود.
کشت‌های سلولی
کشت سلولی فرایند رشد کنترل‌شده‌ای است که طی آن سلول‌ها در شرایط کنترل‌شده پرورش می‌یابند. شرایط کشت برای هر نوع سلول متفاوت است. به‌طور کلی، محیط کشت سلولی شامل ظرفی مناسب (مانند پتری‌دیش) با بستر یا محیط کشتی است که مواد مغذی ضروری (اسیدهای آمینه، کربوهیدرات‌ها، ویتامین‌ها، مواد معدنی)، عوامل رشد، هورمون‌ها و گازها (CO2، O2) را تأمین می‌کند و محیط فیزیکوشیمیایی (بافر pH، فشار اسمزی، دما) را تنظیم می‌کند. بیشتر سلول‌ها به یک سطح یا بستر مصنوعی نیاز دارند، درحالی‌که برخی دیگر از کشت‌های سلولی را می‌توان به‌صورت شناور آزاد در محیط کشت پرورش داد (کشت سوسپانسیونی، سوسپانسیون سلولی).
کشت‌های انبوه رده‌های سلولی جانوری در تولید صنعتی واکسن‌های ویروسی و سایر محصولات حاصل از زیست‌فناوری به کار می‌روند. سلول‌های بنیادی انسانی برای افزایش تعداد سلول‌ها و تمایز آن‌ها به انواع مختلف سلول‌های پیکری به‌منظور پیوند کشت داده می‌شوند.
نمونه‌های بافت
اصطلاح بافت به یک سطح میانی سازمان‌یافتگی سلولی اشاره دارد که در آن مادهٔ سلولی از نظر سازمان‌یافتگی بین سلول‌ها و یک اندام کامل قرار می‌گیرد. در بافت، سلول‌های مشابه با منشأ یکسان که با هم عملکرد مشخصی را انجام می‌دهند، گرد هم می‌آیند. از کنار هم قرار گرفتن عملکردی چندین بافت، ساختارهای پیچیدهٔ اندام‌ها شکل می‌گیرد.
از بافت برای پژوهش در زیست‌شناسی، بافت‌شناسی/آسیب‌شناسی بافتی، انگل‌شناسی، بیوشیمی، ایمونوهیستوشیمی و نیز برای کشت و استخراج DNA نمونه‌برداری می‌شود. بافت‌ها را می‌توان به جانوری (زیرگروه: بافت پستانداران) و گیاهی تفکیک کرد. بافت‌های جانوری در چهار نوع اصلی بافت همبند، عضلانی، عصبی و پوششی گروه‌بندی می‌شوند. بافت گیاهی به سه سامانهٔ بافتی زیر تقسیم می‌شود: روپوست، بافت زمینه‌ای و بافت آوندی.
نمونه‌های بافت را می‌توان از بخش‌های جانوری یا گیاهی، مانند استخوان، عضله، برگ و غیره تهیه کرد.
مایعات بدن
خون، سرم، پلاسما، مایع مغزی‌نخاعی، بزاق و مایع سینوویال از مایعات بدن هستند که منبعی غنی از اطلاعات مرتبط با تشخیص فراهم می‌کنند. بنابراین، آماده‌سازی دقیق و پیشرفتهٔ نمونه‌های مایعات بدن برای تحلیل اهمیت دارد. نخستین دشواری به دامنهٔ دینامیکی گستردهٔ اجزای موجود در مایعات بدن مربوط است.
تعیین غلظت پروتئین
آزمون Bradford، آزمون Lowry و آزمون اسید بی‌سینکونینیک (BCA) از آزمون‌های رایج برای تعیین غلظت پروتئین‌ها هستند. آلبومین سرم گاوی (BSA) یکی از پرکاربردترین استانداردهای پروتئینی است.
بافر لیز
بافر لیز باید متناسب با مادهٔ سلولی یا بافت (کشت بافت، گیاه، باکتری، قارچ و غیره) و با توجه به اینکه سلول‌ها درون یک ساختار قرار دارند یا خیر و نوع آن ساختار انتخاب شود. طیف گسترده‌ای از بافرهای لیز برای استخراج پروتئین‌ها، غشاها و اندامک‌ها با یک یا چند شوینده فرموله می‌شوند. شوینده معمولاً با آزمون‌وخطا یا – در صورت وجود – بر اساس یک پروتکل موجود استخراج پروتئین انتخاب می‌شود. شوینده باید با منبع بافت و پروتئین‌ها سازگار باشد. به‌طور کلی، برای حفظ بیشترین فعالیت عصاره، ملایم‌ترین شوینده‌ای انتخاب می‌شود که برای بافت / پروتئین موردنظر مؤثر باشد. افزون بر این، هنگام استخراج غشاها و اندامک‌ها، شویندهٔ ملایم غشا را دست‌نخورده نگه می‌دارد. شوینده‌های رایج در بافرهای لیز عمدتاً غیریونی یا زویتریونی هستند؛ مانند CHAPS، دئوکسی‌کولات، Triton™ X-100، NP40 و Tween 20.
برای مثال، بافت‌هایی مانند مغز، کبد، روده، کلیه، طحال و غیره را می‌توان به‌آسانی با RIPA بافری کرد – بااین‌حال، مهارکننده‌های پروتئاز و DTT (برای مثال، برای الکتروفورز ژل) نیز باید افزوده شوند.
بافر لیز برای بافت عضلهٔ اسکلتی (سردِ یخی): 20 mM Tris (pH 7٫8)، 137 mM NaCl، 2٫7 mM KCl، 1 mM MgCl2، 1 % Triton X-100، 10 % (w/v) گلیسرول، 1 mM EDTA، 1 mM دی‌تیوتریتول، همراه با مخلوط مهارکننده‌های پروتئاز و فسفاتاز
جدول بافرهای رایج و محدودهٔ pH آن‌ها. به‌طور کلی، این بافرها معمولاً در غلظت‌های 20–50 mM استفاده می‌شوند.
| بافر | محدودهٔ pH |
|---|---|
| اسید سیتریک – NaOH | 2٫2 – 6٫5 |
| سیترات سدیم – اسید سیتریک | 3٫0 – 6٫2 |
| استات سدیم – اسید استیک | 3٫6 – 5٫6 |
| نمک سدیم اسید کاکودیلیک – HCl | 5٫0 – 7٫4 |
| MES – NaOH | 5٫6 – 6٫8 |
| دی‌هیدروژن فسفات سدیم – هیدروژن فسفات دی‌سدیم | 5٫8 – 8٫0 |
| ایمیدازول – HCl | 6٫2 – 7٫8 |
| MOPS – KOH | 6٫6 – 7٫8 |
| تری‌اتانول‌آمین هیدروکلراید – NaOH | 6٫8 – 8٫8 |
| Tris – HCl | 7٫0 – 9٫0 |
| HEPES – NaOH | 7٫2 – 8٫2 |
| تریسین – NaOH | 7٫6 – 8٫6 |
| تترابورات سدیم – اسید بوریک | 7٫6 – 9٫2 |
| بیسین – NaOH | 7٫7 – 8٫9 |
| گلیسین – NaOH | 8٫6 – 10٫6 |
pH بیشتر بافرها به دما وابسته است. این موضوع به‌ویژه دربارهٔ بافرهای Tris صدق می‌کند. pKa از 8٫06 در 25°C به 8٫85 در 0°C تغییر می‌کند.
(pH و pKa یک بافر: pH غلظت یون‌های هیدروژن را در یک محلول آبی اندازه می‌گیرد. pKa (= ثابت تفکیک اسید) معیاری مرتبط، اما اختصاصی‌تر است، زیرا به پیش‌بینی رفتار یک مولکول در مقدار معینی از pH کمک می‌کند.)
TRIzol
TRIzol محلولی شیمیایی است که برای استخراج RNA/DNA/پروتئین طی استخراج با گوانیدینیوم تیوسیانات–فنول–کلروفرم استفاده می‌شود. استفاده از استخراج TRIzol به کمک فراصوت، بازده بالای DNA، RNA و پروتئین را از یک نمونهٔ واحد فراهم می‌کند و از این نظر بر سایر روش‌های استخراج برتری دارد.
منابع / مراجع
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates. Int J Food Sci Technol 44: 1843–1849.
- Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D’Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Efficient recovery of proteins from multiple source samples after trizol or trizol LS RNA extraction and long-term storage. BMC Genomics 2013, 14:181.