فن آوری اولتراسوند Hielscher

التراسونیک لیز باکتری E. coli

  • باکتری E.coli باکتری معمول مورد استفاده در میکروبیولوژی و بیوتکنولوژی هستند.
  • اخلالگران سلول التراسونیک ارائه نتایج قابل اعتماد و تجدید پذیر برای لیز باکتری E. coli.
  • کاویتاسیون و برش نیروهای شدید هنوز به دقت کنترل در اختلال کامل و بازده استخراج بالا (به عنوان مثال پروتئین ها، DNA) منجر شود.

اختلال همراه با حفره

باکتری اشرشیاکلی قابل اعتماد با استفاده از اسیاب بافت اولتراسونیک لیز.التراسونیک پروب نوع اسیاب با حدود به کار گیرند. 20000 سیکل در ثانیه (در 20kHz) و باعث حفره در مایعات یا supsensions. کاویتاسیون صوتی مناطق میکروسکوپی از فشار و خلاء مانند و درجه حرارت بالا که سلول های از هم گسیخته. اگرچه درجه حرارت ممکن است چند هزار درجه سانتیگراد برسد، حجم حفره قدری کم است که آیا روند گرم نمی به طور قابل توجهی می باشد. سونوگرافی تولید کاویتاسیون صوتی و نیروهای برشی در سوراخ و یا شکستن غشای سلولی از E.coli – بسته به تنظیم دستگاه از هموژنایزر اولتراسونیک.

مزایای استفاده از التراسونیک لیز

  • کنترل دقیق لیز کننده (شدت، دامنه، درجه حرارت)
  • انطباق مطلوب به نمونه های خاص
  • کنترل دما
  • برای نمونه بسیار کوچک تا بسیار بزرگ (میکرولیتر به لیتر)
  • مکانیکی تصفیه خالص
  • خطی مقیاس بالا از آزمایشگاه تا تولید
دستگاه اولتراسونیک VialTweeter اجازه می دهد تا برای آماده سازی نمونه به طور همزمان تا 10 ویال تحت شرایط همین روند. (برای بزرگنمایی کلیک کنید!)

VialTweeter(ویال گروهی) جهت لیز مافوق صوت

درخواست اطلاعات




توجه داشته باشید ما سیاست حفظ حریم خصوصی.


در حالی که لیز شیمیایی و enzymtic می تواند مشکل ساز – از لیز شیمیایی می تواند ساختارهای پروتئینی را تغییر داده و معرفی مشکلات تصفیه و لیز آنزیمی نیاز به بار کمون طولانی است و قابل تولید مجدد نبوده – اختلال مافوق صوت یک سلول سریع روش اختلال پیچیده است.
لیز مافوق صوت تنها بر اساس نیروهای مکانیکی است. هیچ ماده شیمیایی اضافه نمی شود، فراصوت توسط نیروهای برشی دیواره سلولی را می شکند. لیز شیمیایی می تواند ساختار پروتئین را تغییر دهد و مشکلات تصفیه را معرفی کند. اختلال آنزیمی نیاز به زمان جوجه کشی طولانی دارد و قابل تکثیر نیست. اختلال سلول های مافوق صوت سلول های باکتری E.coli سریع، ساده، قابل اعتماد و قابل تکثیر است. به همین دلیل است که سونوگرافی Hielscher در آزمایشگاه های بیولوژیکی و بیوشیمیایی در سراسر جهان برای آماده سازی نمونه استفاده می شود, قبل از ananlytics, مورب در شرایط آزمایشگاهی و اندازه گیری چند برابر.

توصیه های عمومی

ultrasonicator UP400St با راکتور جریانروش فراصوت روش محبوب ترین برای lysing مقادیر بسیار کم، متوسط ​​و بزرگ از سوسپانسیون های سلولی است – از پیکو لیتر تا 100L / ساعت (با استفاده از یک سلول جریان مافوق صوت). سلول ها توسط برشی مایع و کاویتاسیون لیز. DNA نیز در طول فراصوت چیده، پس از آن لازم است به اضافه از DNase به سوسپانسیون سلولی.
کنترل دما:
با پیش خنک کننده نمونه و نگه داشتن نمونه در طول فراصوت روی یخ، نمونه تخریب حرارتی از نمونه می توان به راحتی جلوگیری کرد.
در حالت ایده آل ، نمونه ها باید یخ سرد در طول لیز نگه داشته شود ، اما برای بسیاری از نمونه های آن کافی است اگر درجه حرارت بالاتر از درجه حرارت فرهنگ و یا بافت منبع افزایش نمی یابد. بنابراین توصیه می شود ، برای حفظ تعلیق بر روی یخ و sonicate با چندین پالس فرا صوت کوتاه از 5-10 ثانیه و مکث 10-30 ثانیه. در طول مکث ، گرما می تواند به منظور دوباره ایجاد دمای پایین پراکنده. برای نمونه سلول های بزرگتر ، راکتورهای سلول جریان های مختلف با کت خنک کننده در دسترس هستند.

پروتکل برای آماده سازی از E. coli lysate به

تجزیه و تحلیل بیان و تخلیص پروتئین نوترکیب

کولی پلت E. با یک سیستم اولتراسونیک فراصوت داده شد UP100H (Hielscher). برای این منظور، رسوب سلول در بافر لیز کننده سرد (50 میلی متر تریس هیدروکلراید = pH به 7.5، 100 میلی مولار، 5 میلی متر DTT، 1 میلی متر PMSF) اتفاده بود و بر روی یخ به مدت 10 دقیقه سرد می شود. سپس، سوسپانسیون سلولی با 10 کوتاه از 10 ثانیه پس از فاصله زمانی 30 ثانیه خنک کننده فراصوت داده شد. در نهایت، بقایای سلولی توسط اولتراسانتریفیوژ در 4 درجه سانتی گراد به مدت 15 دقیقه در 14000 دور در دقیقه برداشته شد. برای تایید بیان RPR، مایع رویی را بر روی ژل پلی آکریل آمید 12٪ اجرا شد و با روش SDS-PAGE و وسترن بلات استفاده شد. خالص سازی RPR با استفاده از نیکل انجام شد2 +رزین -NTA (INVITROGEN، USA) با توجه به راهنمای کارخانه سازنده. در این مرحله، روش تصفیه بومی استفاده شده است. خلوص پروتئین خالص با استفاده از الکتروفورز بر روی ژل پلی آکریل آمید 12٪ و پس از آن Coomassie رنگ آمیزی آبی مورد بررسی قرار گرفت. غلظت پروتئین خالص شده میکرو BCA کیت سنجش پروتئین (پیرس، USA) اندازه گیری شد. (Azarnezhad و همکاران 2016).

التراسونیک UP100H مختل سلول (100W) برای لیز، اختلال سلول و قیچی DNA.

هموژنایزر التراسونیک UP100H (100 وات)

رشد سلول، اتصال عرضی و تهیه E. coli با عصاره سلول

برای SeqA و RNA پلیمراز تراشه تراشه های E. coli MG1655 یا MG1655 ΔseqA در 37 ° C به OD رشد کرده بود۶۰۰ از حدود 0.15 در 50 میلی لیتر LB (+ 0.2٪ گلوکز) قبل از 27 میلی لیتر فرمالدئید (37٪) در هر میلی لیتر محیط اضافه شد (غلظت نهایی 1٪). Crosslinking با تکان دادن آرام (100 دور در دقیقه) در دمای اتاق به مدت 20 دقیقه انجام شد و سپس با 10 میلی لیتر 2.5 میلی گرم گلیسین (غلظت نهایی 0.5 M) خنک شد. برای آزمایش های شوک حرارتی، E.coli MG1655 در محیط 65 میلی لیتر LB در دمای 30 درجه سانتی گراد به OD۶۰۰ از حدود 0.3 سپس 30 میلی لیتر از کشت به یک فلاسک پیش گرم در دمای 43 درجه سانتیگراد منتقل شد و باقیمانده در دمای 30 درجه سانتیگراد نگهداری شد. پیوند صاف و خشك كردن همانطور كه ​​در بالا شرح داده شد، به جز مواردي كه سلول ها در دماي 30 و 43 درجه سانتيگراد به مدت 5 دقيقه نگهداري شدند، قبل از تكان دادن بيشتر در دماي اتاق. سلولها توسط سانتریفوژ جمع آوری شدند و دو بار با TBS سرد (pH7.5) شسته شدند. پس از احیا مجدد در 1 میلی لیتر لیز بافر (10 میلی متری تریس (pH 8.0)، 20 درصد ساکارز، 50 میلی متیل NaCl، 10 میلی متیل EDTA، 10 میلی گرم در میلی لیتر لیزوزیم) و انکوباسیون در دمای 37 درجه سانتیگراد برای 30 دقیقه و سپس اضافه کردن 4 میلی لیتر IP بافر، سلول ها بر روی یخ با استفاده از 12 بار 30 ثانیه و 30 ثانیه شکسته در یک UP400St پردازنده مافوق صوت (فرا صوت Hielscher شرکت) با قدرت 100٪. پس از سانتریفیوژ مدت 10 دقیقه در 9000 گرم، 800 aliquotes میکرولیتر از محلول رویی در -20 درجه سانتی گراد نگهداری شدند. (Waldminghaus 2010)

تولید بیش از حد و خالص سازی آنزیم ها.

برای تولید بیش از حد decahistidine (His10) پروتئین -tagged، باکتری E. coli BL21 (DE3) با pET19b سازه تبدیل شده است. preculture یک شبه توسط سانتریفوژ برداشت شد، و 1٪ برای تلقیح فرهنگ بیان استفاده می شد. سلول های حمل pET19mgtB در 22 درجه سانتی گراد تا زمانی که چگالی نوری در 600 نانومتر رشد داده شدند (OD۶۰۰) از 0.7. فرهنگ به 17 ° C منتقل شد و ناشی از 100 میکرومولار IPTG صورت گرفت. پس از 16 ساعت، فرهنگ توسط سانتریفوژ در 7500 × g در 4 درجه سانتی گراد برداشت شد. سلول ها در 50 میلی متر-بافر فسفات نمکی (PBS) با 0.3 مولار NaCl در pH 7.4 با S2 sonotrode میکرو نوک در اتفاده و مختل شد توسط امواج فراصوت UP200St ultrasonicator (Hielscher، تلتو، آلمان) در یک چرخه از 0.5 و دامنه 75٪.
تولید بیش از حد decahistidine برچسب گذاشته شده توسط GTFC در 37 ° C در OD القا شد۶۰۰ 0.6 با 100 میکرومولار IPTG صورت گرفت. سلول های پس از آن به مدت 4 ساعت انکوبه شدند، برداشت، و لیز همانطور که در بالا برای MgtB بیان شده است.
عصاره سلول خام در 15،000 × g و 4 ° C سانتریفوژ شدند رسوب بقایای سلولی است. عصاره روشن در قطب خام 1 میلی لیتر HisTrap FF استفاده از یک سیستم ÄKTAprime به علاوه (GE بهداشت و درمان) قرار گرفته است. آنزیم با توجه به پروتکل تولید کننده برای شستشو شیب پروتئین او برچسب گذاشته شده توسط خالص سازی شدند. راه حل های پروتئین شسته دو بار در برابر 1000 حجم 50 میلی متر PBS، pH برابر 7.4 با 0.3 مولار NaCl در 4 ° C دیالیز شدند. تصفیه 12٪ SDS-PAGE استفاده شد. غلظت پروتئین با روش برادفورد با استفاده از از Roti-م (کارل راث شرکت، کارلسروهه، آلمان) تعیین شد. (Rabausch و همکاران 2013).

استخراج پروتئین از باکتری اشریشیا کلی
پروتئین طعمه مورد نظر (در این مورد، MTV1 از thaliana Arabidopsis دارد) به یک تگ GST ذوب شده و بیان شده در BL21 اشریشیا کلی (E. coli با) سلول.
1. نگاهی به یک پلت GST-MTV1 و GST (مربوط به 50 میلی لیتر کشت) و resuspend هر یک در 2.5 میلی لیتر یخ بافر استخراج سرد است.
2. استفاده از یک ultrasonicator UP100H (مجهز به MS3 microtip-sonotrode برای حجم کوچک (2-5mL)) برای اخلال در سلول های باکتری تا زمانی که لیز می شود، است که توسط کاهش کدورت و افزایش ویسکوزیته نشان داد. این کار باید بر روی یخ انجام شده، و توصیه می شود به sonicate در فواصل (به عنوان مثال sonicating 10 ثانیه پس از 10 ثانیه در یخ و غیره). مراقبت باید گرفته شود به sonicate با شدت خیلی بالا نیست. اگر کف و یا تشکیل یک رسوب سفید شناسایی شده است، به شدت نیاز به کاهش است.
3. انتقال از راه حل باکتری lysed به 1.5 میلی لیتر لوله میکروسنتریفیوژ و سانتریفیوژ در 4 درجه سانتی گراد، 16000 × g به مدت 20 دقیقه.

پروتئین ها، آلیسین اصلاح شده در E. coli

VialTweeter یک ultrasonicator راحت برای همگن نمونه کوچک باشدتعیین مطالب سولفیدریل توسط 5،5'-Dithiobis (اسید 2-nitrobenzoic) (بنزی) روش
فرهنگ یک شبه باکتری E. coli MG1655 برای تلقیح MOPS حداقل متوسط ​​(: 100 1) استفاده شد. فرهنگ هوازی رشد کرده بود تا زمانی که A600 از 0.4 رسیده بود. فرهنگ به سه فرهنگ 15 میلی لیتری برای درمان استرس تقسیم شد. فرهنگ درمان نشده به عنوان یک کنترل منفی خدمت کرده است. 0.79 میلی آلیسین (128 میکروگرم در میلی لیتر-1) و یا 1 میلی متر diamide به یکی از هر دو فرهنگ باقی مانده اضافه شده است. فرهنگ به مدت 15 دقیقه انکوبه شدند. 5 میلی لیتر از هر فرهنگ توسط سانتریفوژ (8525 × گرم، 4 درجه سانتی گراد، 10 دقیقه) برداشت شدند. سلول دو بار با 1 میلی لیتر PBS (137 میلی مولار، 2.7 میلی کلرور پتاسیم، 10 میلی سدیم شسته شدندH2Sصندوق پستی4، 2 میلی متر KHH2Sصندوق4، pH 7.4، قبل از استفاده به صورت بی هوازی ذخیره می شود) و سانتریفوژ (13000 × گرم، 4 درجه سانتی گراد، 10 دقیقه). سلول ها در بافر لیز (PBS با 6 میلی مولار Guanidinium HCl، pH 7.4) به مدت 4 ساعت در معرض سانتریفیوژ قرار گرفتند (VialTweeter(ویال گروهی) ultrasonicator، Hielscher GmbH، آلمان) (3 × 1 دقیقه). بقایای سلول توسط سانتریفوژ (13000 × گرم، 4 درجه سانتی گراد، 15 دقیقه) پلت شدند. مایع رویی با یک نوار مغناطیسی هم بزنید تا 3.5 میلی لیتر QS-ماکرو کووت (10 میلی متر) منتقل شد و مخلوط شده با 1 میلی لیتر از بافر لیز کننده. انقراض نمونه در 412 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر JASCO V-650 مجهز به درجه حرارت کنترل دارنده سلول PSC-718 (JASCO) در دمای اتاق قرار گرفت. 100μl از یک راه حل 3 میلی متر dithiobis (اسید 2-nitrobenzoic) اضافه شد. انقراض تحت نظر بود تا زمانی که اشباع رسیده است. محاسبه غلظت تیول با استفاده از ε ضریب خاموشی انجام شد۴۱۲ = 13700 M-1 سانتی متر-1 برای thio-2-nitrobenzoic اسید (TNB). غلظت تیول همراه محاسبه شده بر اساس حجم سلول های E.coli از 6.7 × 10 شد-15 لیتر و تراکم سلول از یک۶۰۰ = 0.5 (معادل 1 × 108 میلی لیتر سلول-1 فرهنگ) است. (مولر و همکاران 2016).

در تعیین ویوو گلوتاتیون

باکتری E.coli MG1655 در MOPS حداقل متوسط ​​در حجم کل بدن 200ml تا زمانی که یک رشد شد۶۰۰ از 0.5 به دست آمد. کشت برای درمان استرس به کشت 50 میلی لیتر تقسیم شد. بعد از 15 دقیقه انكوباسيون با 0.79 ميلي مولار آليسين، 1 ميلي مولار دي آميد يا دي متیل سولفوکسيد (کنترل) سلول ها در 4000 گرم در دماي 4 درجه سانتیگراد به مدت 10 دقيقه برداشت شدند. سلول ها دو بار با بافر KPE قبل از احیا مجدد پلت ها در 700 میلی لیتر بافر KPE شسته شدند. برای ضدعفونی کردن، 300 لیتر 10٪ (w / v) سولفاسالسیلیک اسید قبل از قطع سلول ها با استفاده از اولتراسونیک (3 × 1 دقیقه؛ VialTweeter(ویال گروهی) ultrasonicator). رویی پس از سانتریفوژ (30 دقیقه، 13،000g، 4 درجه سانتی گراد) جمع آوری شد. غلظت اسید Sulfosalicylic علاوه بر این از 3 جلد از بافر KPE به 1٪ کاهش یافته است. اندازه گیری از گلوتاتیون کل و GSSG که در بالا توضیح انجام شد. غلظت گلوتاتیون همراه محاسبه شده بر اساس حجم E. شد کولی سلول های 6.7×10-15 لیتر و تراکم سلول از یک۶۰۰ 00.5 (معادل 1×108 میلی لیتر سلول-1 فرهنگ). غلظت GSH توسط تفریق از 2 [GSSG] از گلوتاتیون کل محاسبه شد. (مولر و همکاران 2016).

مختل کننده آلتراسونیک برای تحلیل سلول و استخراج از مواد بیولوژیکی (برای بزرگنمایی کلیک کنید!)

پروب نوع ultrasonicator UP400St

بیان mAspAT بشر در E. coli

التراسونیک مختل سلول UP400St (400W) برای استخراج ماده داخل سلولی (به عنوان مثال پروتئین ها، اندامک، DNA، RNA و غیره)مستعمره تنها از E. coli BL21 (DE3) پناه دادن به وکتور بیانی در 30 میلی لیتر از لوریا برتانی-(LB) محیط کشت حاوی 100μg / میلی لیتر آمپی سیلین، و سپس در دمای Cº37 تا چگالی نوری کشت (OD۶۰۰) رسیده 0.6. سلول توسط سانتریفوژ در 4000 × g به مدت 10 دقیقه برداشت شد، و مجددا در محیط LB تازه 3L حاوی 100μg / میلی لیتر آمپی سیلین.
پس از آن، بیان پروتئین و 1 میلی متر ایزوپروپیل β-ᴅ-1-thiogalactopyranoside (IPTG) به مدت 20 ساعت در 16ºC القا شد. سلول توسط سانتریفوژ در 8000 × g برای 15 دقیقه برداشت و شسته شده با بافر A (20 میلی NaH2PO4، 0.5 مولار NaCl، pH برابر 7.4) شدند. 45g تقریب (وزن تر) سلول از 3 فرهنگ L به دست آمد. پس از سانتریفیوژ، گلوله های سلول را در 40 میلی لیتر (برای 1 L فرهنگ) سرد استخراج بافر اتفاده بود، و با امواج فراصوت لیز در دمای سرد با استفاده از یک UP400St ابزار (دکتر Hielscher GmbH، آلمان). لیز سلولی در 12،000 دور در دقیقه به مدت 15 دقیقه برای جدا محلول در آب (مایع رویی) و (پلت) فراکسیون رسوب سانتریفوژ شد. (جیانگ و همکاران 2015)

جدول زیر به شما می دهد که نشانه ای از ظرفیت پردازش تقریبی ultrasonicators ما:

دسته ای دوره نرخ جریان دستگاه های توصیه شده
00.5 به 1.5mL خب VialTweeter(ویال گروهی)
1 تا 500ML 10 تا پوست 200ml / دقیقه UP100H
10 به 2000mL 20 تا 400ML / دقیقه UP200Ht، UP400St
00.1 به 20L 00.2 به 4L / دقیقه UIP2000hdT
10 تا 100L 2 تا 10L / دقیقه UIP4000
خب 10 تا 100L / min و UIP16000
خب بزرگتر خوشه UIP16000

تماس با ما! / از ما بپرسید!

لطفاجهت کسب اطلاعات بیشتراز فرم زیر استفاده کنید .









لطفا توجه داشته باشید ما سیاست حفظ حریم خصوصی.


ادبیات / منابع



آمار ارزشمند دانستن

اشریشیا کلی

Escherichia coli (E.coli) یک باکتری گرم منفی، فاکتوریل بی هوازی، میله ای شکل و کولتیفیک از جنس Escherichia است که معمولا در روده های پایینی از ارگانیسم های گرم خون (Endotherms) یافت می شود. تعداد زیادی از گونه های E. coli (یا زیرمجموعه ها) با ویژگی های متنوع وجود دارد. بیشتر سوسیس E. coli برای انسان ها بی ضرر هستند، مثلا سوسپانسیون های B و K-12 که معمولا برای کاربرد های تحقیقاتی در آزمایشگاه ها استفاده می شود. با این حال، برخی از گونه ها مضر هستند و می توانند باعث بیماری جدی شوند.
باکتری E. coli نقش مهمی در مهندسی زیستی مدرن و میکروبیولوژی صنعتی بازی میکند، چون باکتری آسان به دستکاری است. برنامه های کاربردی آزمایشگاه مشترک که شامل اغلب استفاده از باکتری E. coli، به عنوان مثال، ایجاد اسید دئوکسی ریبونوکلئیک نوترکیب (DNA) و یا به عنوان یک ارگانیسم مدل عمل می کنند.
باکتری E. coli یک میزبان بسیار متنوع برای تولید پروتئین های هترولوگ است، و سیستم های بیان پروتئین چند برابر در دسترس برای تولید پروتئین های نوترکیب در باکتری E. coli هستند. با استفاده از پلاسمیدها که اجازه بیان سطح بالایی از پروتئین، ژن را می توان به باکتری ها، که قادر به تولید این پروتئین ها در مقادیر بالا در فرآیندهای تخمیر صنعتی معرفی شده است.
باکتری E.coli به عنوان یک کارخانه سلول برای تولید انسولین استفاده می شود. برنامه های کاربردی بیشتر شامل استفاده از اصلاح سلول های E.coli برای توسعه و تولید واکسن و آنزیم بی حرکت، به تولید سوخت های زیستی، و همچنین برای اصلاح زیستی.
فشار K-12 یک فرم جهش یافته از E. coli که بیش از حد بیان آنزیم آلکالین فسفاتاز (ALP). این جهش به دلیل نقص در ژن که به طور مداوم کدهای برای آنزیم رخ می دهد. اگر یک ژن یک محصول را تولید و بدون هر گونه مهار این است که به عنوان فعالیت ساختاری شناخته شده است. این شکل جهش یافته خاص برای جداسازی و آنزیم ALP استفاده می شود.

DNA برش التراسونیک

نیروهای برشی التراسونیک یک روش معمول استفاده می شود به جدا شدن از سلول و شکستن رشته DNA را به قطعات می باشد. کاویتاسیون صوتی می شکند دیواره های سلولی و غشاء به استخراج DNA از سلول ها و تولید قطعه در حدود 600 – 800 جفت در طول، ایده آل است که برای تجزیه و تحلیل.
اینجا را کلیک کنید برای کسب اطلاعات بیشتر در مورد اسیاب سونوگرافی، قطعه قطعه شدن DNA!