لیز فراصوتی E. Coli

باکتری‌های E. coli پرکاربردترین باکتری‌ها در میکروبیولوژی و زیست‌فناوری هستند.
دستگاه‌های تخریب سلولی فراصوتی، نتایجی قابل‌اعتماد و تکرارپذیر برای لیز E. coli ارائه می‌دهند.
کاویتاسیون و نیروهای برشی شدید، اما قابل‌کنترل با دقت بالا، به تخریب کامل و بازده بالای استخراج (برای مثال پروتئین‌ها و DNA) منجر می‌شوند.

چرا تخریب سلولی فراصوتی E. coli روش ترجیحی است؟

هموژنایزرهای فراصوتی یا سونیکاتورهای پروبی مزایای متعددی برای لیز E. coli دارند، زیرا فراصوت شدید دیواره‌ها و غشاهای سلولی را به‌طور مؤثر تخریب می‌کند. سونیکاتورهای پروبی به دلایل زیر به‌طور گسترده برای لیز E. coli به کار می‌روند:

تخریب مؤثر دیواره‌های سلولی: E. coli دیوارهٔ سلولی نیمه‌صلبی از جنس پپتیدوگلیکان دارد که شکستن آن با روش‌های سنتی لیز می‌تواند دشوار باشد. سونیکاتور پروبی امواج فراصوت شدیدی تولید می‌کند که در مایع پیرامون سلول‌ها حباب‌های کاویتاسیون ایجاد می‌کنند. با فروپاشی این حباب‌ها، جت‌های پرسرعت مایع و امواج ضربه‌ای ایجاد می‌شوند که دیواره‌های سلولی را به‌صورت مکانیکی تخریب می‌کنند و محتویات سلولی، مانند زیست‌مولکول‌ها، را به‌طور مؤثر آزاد می‌سازند.

نفوذ بیشتر: امواج فراصوت تولیدشده توسط پروب / سونوتْرود می‌توانند به عمق نمونه نفوذ کنند، به تعداد بیشتری از سلول‌های E. coli برسند و آن‌ها را به‌طور یکنواخت پردازش کنند. این امر به یکنواخت‌تر شدن لیز در سراسر نمونه کمک می‌کند و در نتیجه کارایی تخریب سلولی افزایش می‌یابد.

کاهش زمان پردازش: انرژی تحویلی سونیکاتور پروبی بسیار متمرکز و موضعی است و به لیز سریع و مؤثر سلول‌ها منجر می‌شود. در مقایسه با روش‌های دیگر، مانند تخریب با مهره یا لیز آنزیمی، فراصوت‌دهی می‌تواند لیز E. coli را ظرف چند دقیقه یا حتی چند ثانیه انجام دهد. در حالی که بسیاری از روش‌های جایگزین، مانند انجماد و ذوب، به چندین دور پردازش نیاز دارند، لیز فراصوتی سلول‌ها را در یک مرحلهٔ فرایندی باز می‌کند.

کنترل دما: سونیکاتورهای پیشرفته به حسگرهای دما و نرم‌افزار هوشمند مجهز هستند که امکان تعیین حداکثر دمای فرایند را فراهم می‌کنند. وقتی دما به حد تعیین‌شده برسد، سونیکاتور به‌طور خودکار متوقف می‌شود و هنگامی که دما به نقطهٔ تنظیم‌شده برسد، فرایند فراصوت‌دهی را آغاز می‌کند. خنک‌کردن نمونه‌ها در حمام یخ روشی ساده برای پایین نگه‌داشتن دمای نمونه و جلوگیری از تخریب ناشی از گرماست.

مقیاس‌پذیری: سونیکاتورهای پروبی در اندازه‌های گوناگون، از دستگاه‌های قابل نگه‌داشتن در دست تا مدل‌های صنعتی بزرگ‌مقیاس، عرضه می‌شوند. بنابراین، برای پردازش حجم‌های کم در آزمایشگاه یا افزایش مقیاس برای کاربردهای بزرگ‌تر زیست‌فرایندی، مانند تولید واکسن یا زیست‌سنتز مولکول‌ها، مناسب هستند.

چندمنظوره بودن: سونیکاتورها علاوه بر لیز سلولی، در کاربردهای گوناگونی مانند برش DNA، استخراج پروتئین، همگن‌سازی بافت، پراکنده‌سازی نانوذرات و امولسیون‌سازی به کار می‌روند. بنابراین، سرمایه‌گذاری برای تهیهٔ یک سونیکاتور پروبی، امکان انجام کاربردهای متنوع را در محیط‌های پژوهشی یا صنعتی فراهم می‌کند.

سونیکاتورهای پروبی مانند UP200St، هموژنایزرهای بافت و خردکن‌های سلولی قابل‌اعتمادی هستند و ازاین‌رو به‌طور گسترده برای آماده‌سازی نمونه در ژنتیک، برای مثال لیز E.coli، به کار می‌روند

استخراج پروتئین از سلول‌های E.coli با استفاده از پروب فراصوتی UP200St به‌طور مؤثر انجام می‌شود

سونیکاتور پروبی مزایای بسیاری برای لیز E. coli دارد. کنترل دقیق و قابل‌اعتماد پارامترهای فرایند فراصوتی، امکان بهینه‌سازی پارامترهای عملیاتی مانند توان، مدت‌زمان و نحوهٔ کار با نمونه را برای دستیابی به نتایج مطلوب فراهم می‌کند.

این آموزش توضیح می‌دهد که کدام نوع سونیکاتور برای کارهای آماده‌سازی نمونهٔ شما، مانند لیز، تخریب سلولی، جداسازی پروتئین و قطعه‌قطعه‌سازی DNA و RNA در آزمایشگاه، آنالیز و پژوهش مناسب‌تر است. نوع سونیکاتور ایدئال را متناسب با کاربرد، حجم نمونه، تعداد نمونه‌ها و ظرفیت پردازش نمونه‌ها انتخاب کنید. Hielscher Ultrasonics هموژنایزر فراصوتی ایدئال شما را دارد!

قطعه‌قطعه‌سازی فراصوتی DNA اغلب به‌عنوان مرحلهٔ آماده‌سازی نمونه در توالی‌یابی نسل جدید (NGS) به کار می‌رود

آنالیزهای الکتروفورزی DNA ژنومی E. coli EDL933 پس از 0 – 15 min فراصوت‌دهی. L نشان‌دهندهٔ نردبان DNA است.
(پژوهش و تصویر: ©Basselet et al. 2008)

تخریب سلولی با استفاده از کاویتاسیون فراصوتی

هموژنایزرهای فراصوتی پروبی با حدود 20٬000 چرخه در ثانیه (در 20kHz) کار می‌کنند و در مایعات یا سوسپانسیون‌ها کاویتاسیون ایجاد می‌کنند. کاویتاسیون آکوستیکی نواحی میکروسکوپی با فشارهای شبه‌خلأ و دماهای بالا ایجاد می‌کند که سلول‌ها را از هم می‌درند. اگرچه دما ممکن است به چندین هزار درجهٔ سلسیوس برسد، حجم نواحی کاویتاسیون چنان کوچک است که فرایند را به‌طور قابل‌توجهی گرم نمی‌کند. کاویتاسیون آکوستیکی و نیروهای برشی ناشی از فراصوت، غشای سلولی باکتری‌هایی مانند E.coli را سوراخ می‌کنند یا می‌شکنند. سونیکاتورهای Hielscher امکان کنترل دقیق پارامترهای فرایند، مانند شدت فراصوت، دامنه، انرژی ورودی و دما را فراهم می‌کنند. به این ترتیب، فرایند لیز فراصوتی را می‌توان متناسب با نوع سلول، کشت سلولی و هدف فرایند به‌طور بهینه تنظیم کرد.

مزایای لیز فراصوتی

کنترل دقیق لیز (شدت، دامنه، دما)
نتایج قابل‌اعتماد و تکرارپذیر
سازگارسازی بهینه با نمونه‌های خاص
کنترل دما
برای نمونه‌های بسیار کوچک تا بسیار بزرگ (از µL تا لیتر)
پردازش کاملاً مکانیکی
کاربری آسان و ایمن
افزایش مقیاس خطی از آزمایشگاه تا تولید

دستگاه فراصوتی VialTweeter امکان آماده‌سازی هم‌زمان نمونه‌ها در حداکثر 10 ویال را تحت شرایط فرایندی یکسان فراهم می‌کند. (برای بزرگ‌نمایی کلیک کنید!)

VialTweeter برای لیز فراصوتی

هموژنایزر فراصوتی در مقایسه با دیگر روش‌های لیز

در حالی که لیز شیمیایی و آنزیمی می‌توانند مشکل‌ساز باشند – زیرا لیز شیمیایی ممکن است ساختار پروتئین‌ها را تغییر دهد و مشکلاتی در خالص‌سازی ایجاد کند و لیز آنزیمی به زمان‌های انکوباسیون طولانی نیاز دارد و تکرارپذیر نیست – تخریب فراصوتی روشی پیشرفته و سریع برای تخریب سلولی است.
لیز فراصوتی فقط بر نیروهای مکانیکی متکی است. هیچ مادهٔ شیمیایی اضافه نمی‌شود و فراصوت‌دهی با نیروهای برشی دیوارهٔ سلولی را می‌شکند. لیز شیمیایی می‌تواند ساختار پروتئین را تغییر دهد و مشکلاتی در خالص‌سازی ایجاد کند. تخریب آنزیمی به زمان‌های انکوباسیون طولانی نیاز دارد و تکرارپذیر نیست. تخریب فراصوتی سلول‌های باکتری E.coli سریع، ساده، قابل‌اعتماد و تکرارپذیر است. به همین دلیل، سونیکاتورهای Hielscher در آزمایشگاه‌های زیست‌شناسی و زیست‌شیمی سراسر جهان برای آماده‌سازی نمونه، مراحل پیش‌تحلیلی، تشخیص برون‌تنی و سنجش‌های گوناگون به کار می‌روند.

توصیه‌های عمومی برای لیز فراصوتی

فراصوت‌دهی پرطرفدارترین روش برای لیز مقادیر بسیار کم، متوسط و زیاد سوسپانسیون‌های سلولی است – از پیکولیتر تا 100L/hr (با استفاده از سلول جریان فراصوتی). سلول‌ها بر اثر برش مایع و کاویتاسیون لیز می‌شوند. DNA نیز در طی فراصوت‌دهی برش می‌خورد، بنابراین نیازی به افزودن DNase به سوسپانسیون سلولی نیست.

کنترل دما هنگام لیز فراصوتی E.coli
با پیش‌خنک‌کردن نمونه و نگه‌داشتن آن روی یخ در طول فراصوت‌دهی، می‌توان به‌سادگی از تخریب حرارتی نمونه جلوگیری کرد.
در حالت ایدئال، نمونه‌ها باید در طول لیز در دمای نزدیک به یخ نگه داشته شوند، اما برای بیشتر نمونه‌ها کافی است که دما از دمای کشت یا منبع بافت بالاتر نرود. بنابراین توصیه می‌شود سوسپانسیون روی یخ نگه داشته شود و فراصوت‌دهی با چند پالس کوتاه فراصوتی به مدت 5–10 sec و وقفه‌های 10–30 sec انجام شود. در طول وقفه‌ها، گرما می‌تواند دفع شود تا دمای پایین دوباره برقرار گردد. برای نمونه‌های سلولی بزرگ‌تر، انواع راکتورهای سلول جریان با ژاکت خنک‌کننده در دسترس هستند.
نکات و توصیه‌های مفصل برای لیز فراصوتی موفق را اینجا بخوانید!

پروتکل‌های آماده‌سازی فراصوتی لیزات‌های E. Coli

پژوهشگران از هموژنایزرهای فراصوتی Hielscher برای تخریب سلولی E.coli استفاده می‌کنند. در ادامه، پروتکل‌های مختلف آزمایش‌شده و تأییدشده برای لیز E.coli با استفاده از هموژنایزرهای فراصوتی Hielscher در کاربردهای گوناگون مرتبط با E. coli ارائه شده‌اند.

رشد سلولی، اتصال عرضی و آماده‌سازی عصاره‌های سلولی E. coli با استفاده از فراصوت

برای ChIP-Chip مربوط به SeqA و RNA پلیمراز، E. coli MG1655 یا MG1655 ΔseqA در 37°C کشت داده شد تا به OD₆₀₀ حدود 0٫15 در 50 ml محیط LB (+ 0٫2% گلوکز) برسد؛ سپس به ازای هر ml محیط، 27 μl فرمالدهید (37%) اضافه شد (غلظت نهایی 1%). اتصال عرضی با تکان‌دادن آهسته (100 rpm) در دمای اتاق به مدت 20 min انجام شد و پس از آن، واکنش با 10 ml گلیسین 2٫5 M متوقف شد (غلظت نهایی 0٫5 M). برای آزمایش‌های شوک حرارتی، E. coli MG1655 در 65 ml محیط LB در 30°C کشت داده شد تا به OD₆₀₀ حدود 0٫3 برسد. سپس 30 ml از کشت به یک فلاسک ازپیش‌گرم‌شده در 43°C منتقل شد و باقی‌مانده در 30°C نگه داشته شد. اتصال عرضی و توقف واکنش مطابق توضیحات بالا انجام شد، با این تفاوت که سلول‌ها پیش از ادامهٔ تکان‌دادن آهسته در دمای اتاق، به مدت 5 min در 30 یا 43°C نگه داشته شدند. سلول‌ها با سانتریفیوژ جمع‌آوری و دو بار با TBS سرد (pH7.5) شسته شدند. پس از تعلیق مجدد در 1 ml بافر لیز (10 mM تریس (pH 8٫0)، 20% ساکارز، 50 mM NaCl، 10 mM EDTA، 10 mg/ml لیزوزیم) و انکوباسیون در 37°C به مدت 30 min و سپس افزودن 4 ml بافر IP، سلول‌ها روی یخ با پردازشگر فراصوتی Hielscher مدل UP400St با تنظیم توان 100%، طی 12 نوبت 30 sec و با وقفه‌های 30 sec فراصوت‌دهی شدند. پس از سانتریفیوژ به مدت 10 min در 9000 g، بخش‌های 800 μl از مایع رویی در -20°C نگهداری شدند. (Waldminghaus 2010)

تولید بیش‌ازحد و خالص‌سازی آنزیم‌ها با پروب فراصوتی

برای تولید بیش‌ازحد پروتئین‌های دارای برچسب دکاهیستیدین (His10)، E. coli BL21(DE3) با سازه‌های pET19b ترانسفورم شد. یک پیش‌کشت شبانه با سانتریفیوژ برداشت شد و 1% از آن برای تلقیح کشت بیان استفاده شد. سلول‌های حامل pET19mgtB در 22°C رشد داده شدند تا چگالی نوری در 600 nm (OD600) به 0٫7 برسد. کشت به 17°C منتقل شد و با 100 μM IPTG القا شد. پس از 16 h، کشت با سانتریفیوژ در 7٬500 × g و 4°C برداشت شد. سلول‌ها در محلول نمکی بافر فسفات (PBS) با غلظت 50 mM، حاوی 0٫3 M NaCl در pH 7٫4 مجدداً معلق شدند و با فراصوت‌دهی توسط سونوتْرود میکروتیپ S2 متصل به سونیکاتور Hielscher مدل UP200St، با چرخهٔ 0٫5 و دامنهٔ 75% تخریب شدند.
تولید بیش‌ازحد GtfC دارای برچسب دکاهیستیدین، در 37°C و در OD₆₀₀ برابر با 0٫6، با 100 μM IPTG القا شد. سپس سلول‌ها به مدت 4 h انکوبه و برداشت شدند و مطابق روشی که در بالا برای MgtB توضیح داده شد، لیز شدند.
عصاره‌های خام سلولی در 15٬000 × g و 4°C سانتریفیوژ شدند تا بقایای سلولی ته‌نشین شوند. عصاره‌های شفاف‌شده با استفاده از سامانهٔ ÄKTAprime Plus روی ستون‌های 1-ml HisTrap FF Crude بارگذاری شدند. آنزیم‌ها مطابق پروتکل سازنده برای واجذب گرادیانی پروتئین‌های دارای برچسب His خالص‌سازی شدند. محلول‌های پروتئینی واجذب‌شده، دو بار در برابر 1٬000 برابر حجم خود از PBS با غلظت 50 mM، در pH 7٫4 و حاوی 0٫3 M NaCl، در 4°C دیالیز شدند. خالص‌سازی با SDS-PAGE با غلظت 12% بررسی شد. غلظت پروتئین با روش Bradford و با استفاده از Roti-Quant تعیین شد. (Rabausch et al. 2013)

استخراج فراصوتی پروتئین از باکتری‌های E. coli
پروتئین طعمهٔ موردنظر (در این مورد MTV1 از Arabidopsis thaliana) به یک برچسب GST متصل و در سلول‌های BL21 Escherichia coli (E. coli) بیان می‌شود.

از GST-MTV1 و GST، از هرکدام یک رسوب سلولی (معادل 50 ml کشت باکتریایی) بردارید و هرکدام را در 2٫5 mL بافر استخراج سردشده تا دمای یخ، مجدداً معلق کنید.
از سونیکاتور UP100H (مجهز به سونوتْرود میکروتیپ MS3 برای حجم‌های کم در حدود 2–5mL) برای تخریب سلول‌های باکتریایی تا زمان لیزشدن آن‌ها استفاده کنید؛ کاهش کدورت و افزایش گران‌روی نشانهٔ لیز است. این کار باید روی یخ انجام شود و توصیه می‌شود فراصوت‌دهی به‌صورت متناوب انجام گیرد (برای مثال 10 sec فراصوت‌دهی و سپس 10 sec وقفه روی یخ و ادامه به همین ترتیب). باید مراقب بود شدت فراصوت‌دهی بیش‌ازحد بالا نباشد. اگر کف‌کردن یا تشکیل رسوب سفید مشاهده شد، شدت باید کاهش یابد.
محلول باکتری‌های لیزشده را به لوله‌های میکروسانتریفیوژ 1٫5 mL منتقل کنید و در 4°C و 16٬000 x g به مدت 20 min سانتریفیوژ کنید.

پروب‌های فراصوتی از نیروهای کاویتاسیون آکوستیکی برای تخریب سلول و استخراج مولکول‌ها و DNA از E.coli استفاده می‌کنند.

سونیکاتورهای پروبی مانند UP400St برای لیز مؤثر E.coli از اصل عملکرد کاویتاسیون آکوستیکی استفاده می‌کنند.

آنالیز بیان و خالص‌سازی پروتئین نوترکیب با استفاده از فراصوت‌دهی

رسوب سلولی E. coli با سونیکاتور Hielscher مدل UP100H فراصوت‌دهی شد. برای این منظور، رسوب سلولی در بافر لیز سردشده (50 mM Tris-HCl با pH=7٫5، 100 mM NaCl، 5 mM DTT، 1 mM PMSF) مجدداً معلق شد و به مدت 10 min روی یخ خنک شد. سپس سوسپانسیون سلولی با 10 پالس کوتاه 10 s، با فاصلهٔ 30 s برای خنک‌شدن پس از هر پالس، فراصوت‌دهی شد. در پایان، بقایای سلولی با اولتراسانتریفیوژ در 4°C به مدت 15 min و با سرعت 14٬000 rpm حذف شدند. برای تأیید بیان rPR، مایع رویی روی ژل پلی‌آکریل‌آمید 12% الکتروفورز شد و با SDS-PAGE و وسترن بلات بررسی شد. خالص‌سازی rPR با رزین Ni2+-NTA (Invitrogen, USA) مطابق راهنمای سازنده انجام شد. در این مرحله از روش خالص‌سازی در شرایط طبیعی استفاده شد. خلوص پروتئین خالص‌شده با الکتروفورز روی ژل پلی‌آکریل‌آمید 12% و سپس رنگ‌آمیزی با کوماسی بلو ارزیابی شد. غلظت پروتئین خالص‌شده با کیت سنجش پروتئین Micro BCA (PIERCE, USA) اندازه‌گیری شد. (Azarnezhad et al. 2016)

این ویدئو CupHorn فراصوتی 200 واتی را برای پراکنده‌سازی، همگن‌سازی، استخراج یا گاززدایی نمونه‌های آزمایشگاهی نشان می‌دهد.

هموژنایزرهای فراصوتی برای لیز E. coli

Hielscher Ultrasonics هموژنایزرهای فراصوتی با عملکرد بالا را برای لیز قابل‌اعتماد و مؤثر باکتری‌های E. coli و دیگر انواع سلول‌ها، بافت‌ها و کشت‌های سلولی طراحی، تولید و عرضه می‌کند.
مجموعهٔ گستردهٔ پروب‌های فراصوتی و سامانه‌های فراصوت‌دهی غیرمستقیم به ما امکان می‌دهد هموژنایزر فراصوتی بافت ایدئال را برای کاربرد تخریب سلولی و استخراج شما ارائه کنیم.

طراحی، تولید و مشاوره – کیفیت ساخت آلمان

سونیکاتورهای Hielscher به برخورداری از بالاترین استانداردهای کیفیت و طراحی شناخته می‌شوند. نرم‌افزار هوشمند، منوی کاربرپسند، تنظیمات قابل‌برنامه‌ریزی و ثبت خودکار داده‌ها تنها چند ویژگی از سونیکاتورهای Hielscher هستند. استحکام و کاربری آسان، ادغام بی‌دردسر سونیکاتورهای ما را در مراکز پژوهشی و زیست‌فناوری امکان‌پذیر می‌کند. سونیکاتورهای Hielscher حتی در شرایط سخت و محیط‌های دشوار نیز به‌خوبی عمل می‌کنند.

Hielscher Ultrasonics شرکتی دارای گواهی ISO است و بر سونیکاتورهای با عملکرد بالا، مجهز به فناوری روز و دارای کاربری آسان تأکید ویژه دارد. البته سونیکاتورهای Hielscher با CE انطباق دارند و الزامات UL، CSA و RoHs را برآورده می‌کنند.

جدول زیر نمایی از ظرفیت تقریبی پردازش سونیکاتورهای ما ارائه می‌دهد:

حجم بچ	دبی	دستگاه‌های پیشنهادی
پلیت‌های چندچاهکی / میکروتیتر	قابل‌اعمال نیست	UIP400MTP
CupHorn برای ویال‌ها یا بشر	قابل‌اعمال نیست	CupHorn فراصوتی
میکروراکتور جریان فراصوتی	قابل‌اعمال نیست	GDmini2
حداکثر 10 ویال با حجم 0٫5 تا 1٫5mL	قابل‌اعمال نیست	VialTweeter
0٫5 تا 1٫5mL	قابل‌اعمال نیست	VialTweeter
1 تا 500mL	10 تا 200mL/min	UP100H
10 تا 2000mL	20 تا 400mL/min	UP200Ht, UP400St
0٫1 تا 20L	0٫2 تا 4L/min	UIP2000hdT
10 تا 100L	2 تا 10L/min	UIP4000
قابل‌اعمال نیست	10 تا 100L/min	UIP16000
قابل‌اعمال نیست	بیشتر	مجموعه‌ای از UIP16000

با ما تماس بگیرید! / از ما بپرسید!

این ویدئو سامانه آماده‌سازی فراصوتی نمونه UIP400MTP را نشان می‌دهد که آماده‌سازی قابل اعتماد نمونه‌ها را در هر نوع پلیت چندچاهکی استاندارد با استفاده از فراصوت با شدت بالا امکان‌پذیر می‌سازد. کاربردهای متداول UIP400MTP شامل لیز سلولی، برش DNA، RNA و کروماتین و نیز استخراج پروتئین است.

پروتکل‌های تکمیلی برای لیز فراصوتی E. coli

پروتئین‌های اصلاح‌شده با آلیسین در E. coli با استفاده از VialTweeter فراصوتی

تعیین محتوای سولفیدریل با سنجش 5,5′-دی‌تیوبیس(2-نیتروبنزوئیک اسید) (DTNB)
از یک کشت شبانهٔ E. coli MG1655 برای تلقیح محیط حداقل MOPS (1:100) استفاده شد. کشت در شرایط هوازی رشد داده شد تا A600 به 0٫4 برسد. کشت برای اعمال تنش به سه کشت 15-ml تقسیم شد. یک کشت تیمارنشده به‌عنوان شاهد منفی استفاده شد. به یکی از دو کشت باقی‌مانده 0٫79 mM آلیسین (128 μg ml-1) و به دیگری 1 mM دی‌آمید اضافه شد. کشت‌ها به مدت 15 min انکوبه شدند. از هر کشت، 5 ml با سانتریفیوژ (8٬525 × g، 4°C، 10 min) برداشت شد. سلول‌ها دو بار با 1 ml از PBS (137 mM NaCl، 2٫7 mM KCl، 10 mM Na2HPO4، 2 mM KH2PO4، pH 7٫4، نگهداری‌شده در شرایط بی‌هوازی پیش از استفاده) شسته و سانتریفیوژ شدند (13٬000 × g، 4°C، 10 min). سلول‌ها در بافر لیز (PBS حاوی 6 mM گوانیدینیوم HCl، pH 7٫4) مجدداً معلق شدند و سپس در 4°C با فراصوت‌دهی (سونیکاتور VialTweeter ، Hielscher GmbH، آلمان) (3 × 1 min) تخریب شدند. بقایای سلولی با سانتریفیوژ (13٬000 × g، 4 °C، 15 min) رسوب داده شدند. مایع رویی به یک کووت QS-macro با حجم 3٫5-ml ‏(10 mm) و دارای میلهٔ همزن مغناطیسی منتقل شد و با 1 ml بافر لیز مخلوط شد. جذب نوری نمونه‌ها در 412 nm با اسپکتروفتومتر Jasco V-650 مجهز به نگهدارندهٔ سلول PSC-718 با قابلیت کنترل دما، در دمای اتاق پایش شد. مقدار 100μl از محلول 3 mM دی‌تیوبیس(2-نیتروبنزوئیک اسید) اضافه شد. جذب نوری تا رسیدن به اشباع پایش شد. محاسبهٔ غلظت تیول با استفاده از ضریب جذب ϵ₄₁₂ = 13٬700 M^-1 cm^-1 برای تیو-2-نیتروبنزوئیک اسید (TNB) انجام شد. غلظت‌های تیول سلولی بر اساس حجم سلول‌های E. coli برابر با 6٫7 × 10^-15 لیتر و چگالی سلولی A600 = 0٫5 (معادل 1 × 10⁸ سلول ml^-1 کشت) محاسبه شدند. (Müller et al. 2016)

تعیین درون‌تنی گلوتاتیون با استفاده از خردکن سلولی فراصوتی

E.coli MG1655 در محیط حداقل MOPS با حجم کل 200ml رشد داده شد تا A600 به 0٫5 برسد. کشت برای اعمال تنش به کشت‌های 50-ml تقسیم شد. پس از 15 min انکوباسیون با 0٫79 mM آلیسین، 1 mM دی‌آمید یا دی‌متیل سولفوکسید (شاهد)، سلول‌ها در 4٬000g و 4°C به مدت 10 min برداشت شدند. سلول‌ها پیش از تعلیق مجدد رسوب‌ها در 700µl بافر KPE، دو بار با بافر KPE شسته شدند. برای پروتئین‌زدایی، 300l سولفوسالیسیلیک اسید 10% (w/v) اضافه شد و سپس سلول‌ها با فراصوت‌دهی تخریب شدند (3 x 1 min؛ سونیکاتور VialTweeter ). مایعات رویی پس از سانتریفیوژ (30 min، 13٬000g، 4°C) جمع‌آوری شدند. غلظت سولفوسالیسیلیک اسید با افزودن 3 برابر حجم بافر KPE به 1% کاهش یافت. اندازه‌گیری گلوتاتیون کل و GSSG مطابق توضیحات بالا انجام شد. غلظت‌های گلوتاتیون سلولی بر اساس حجم سلول‌های E. coli برابر با 6٫7×10^-15 لیتر و چگالی سلولی A600 0٫5 (معادل 1×10⁸ سلول ml^-1 کشت) محاسبه شدند. غلظت‌های GSH با کم‌کردن 2[GSSG] از گلوتاتیون کل محاسبه شدند. (Müller et al. 2016)

بیان mAspAT انسانی در E. coli با استفاده از هموژنایزر فراصوتی

یک کلنی منفرد از E. coli BL21 (DE3) حامل ناقل بیان، در 30 mL محیط Luria-Bertani (LB) حاوی 100μg/mL آمپی‌سیلین قرار داده شد و سپس در 37ºC کشت داده شد تا چگالی نوری (OD₆₀₀) به 0٫6 برسد. سلول‌ها با سانتریفیوژ در 4٬000 × g به مدت 10 min برداشت شدند و در 3L محیط تازهٔ LB حاوی 100μg/mL آمپی‌سیلین مجدداً معلق شدند.
سپس بیان پروتئین با 1 mM ایزوپروپیل β-ᴅ-1-تیوگالاکتوپیرانوزید (IPTG) به مدت 20 h در 16ºC القا شد. سلول‌ها با سانتریفیوژ در 8٬000 × g به مدت 15 min برداشت و با بافر A (20 mM NaH2PO4، 0٫5 M NaCl، pH 7٫4) شسته شدند. از 3 L کشت، حدود 45g سلول (وزن تر) به دست آمد. پس از سانتریفیوژ، رسوب‌های سلولی در 40 mL (به ازای 1 L کشت) بافر استخراج A سردشده تا دمای یخ مجدداً معلق شدند و با فراصوت‌دهی در دمای نزدیک به یخ، با استفاده از خردکن سلولی فراصوتی Hielscher مدل UP400St لیز شدند. لیزات سلولی در 12٬000 rpm به مدت 15 min سانتریفیوژ شد تا بخش‌های محلول (مایع رویی) و رسوب‌کرده (رسوب) جدا شوند. (Jiang et al. 2015)

موضوعات مرتبط

دانستنی‌های مفید

E.coli

Escherichia coli (E. coli) باکتری‌ای گرم‌منفی، بی‌هوازی اختیاری، میله‌ای‌شکل و کلی‌فرم از جنس Escherichia است که معمولاً در بخش پایینی رودهٔ جانداران خون‌گرم (درون‌گرما) یافت می‌شود. تعداد زیادی سویه (یا زیرنوع) E. coli با ویژگی‌های متنوع وجود دارد. بیشتر سویه‌های E. coli برای انسان بی‌ضرر هستند؛ برای مثال سویه‌های B و K-12 که معمولاً برای کاربردهای پژوهشی در آزمایشگاه‌ها استفاده می‌شوند. بااین‌حال، برخی سویه‌ها زیان‌آورند و می‌توانند بیماری جدی ایجاد کنند.
E. coli نقش مهمی در مهندسی زیستی نوین و میکروبیولوژی صنعتی دارد، زیرا دست‌کاری این باکتری آسان است. از کاربردهای رایج آزمایشگاهی که اغلب در آن‌ها از E. coli استفاده می‌شود، می‌توان به تولید دئوکسی‌ریبونوکلئیک اسید (DNA) نوترکیب یا استفاده از آن به‌عنوان جاندار مدل اشاره کرد.
E. coli میزبانی بسیار چندمنظوره برای تولید پروتئین‌های هترولوگ است و سامانه‌های گوناگون بیان پروتئین برای تولید پروتئین‌های نوترکیب در E. coli وجود دارند. با استفاده از پلاسمیدهایی که بیان پروتئین در سطوح بالا را امکان‌پذیر می‌کنند، می‌توان ژن‌ها را به باکتری وارد کرد و از این طریق چنین پروتئین‌هایی را در مقادیر زیاد، در فرایندهای تخمیر صنعتی تولید نمود.
از E.coli به‌عنوان کارخانهٔ سلولی برای تولید انسولین استفاده می‌شود. کاربردهای دیگر شامل استفاده از سلول‌های اصلاح‌شدهٔ E. coli برای توسعه و تولید واکسن‌ها و آنزیم‌های تثبیت‌شده، تولید سوخت‌های زیستی و نیز زیست‌پالایی است.
سویهٔ K-12 شکلی جهش‌یافته از E. coli است که آنزیم آلکالین فسفاتاز (ALP) را بیش‌ازحد بیان می‌کند. این جهش به‌دلیل نقص در ژنی رخ می‌دهد که به‌طور مداوم این آنزیم را کد می‌کند. اگر ژنی بدون هیچ‌گونه مهاری محصول تولید کند، این وضعیت فعالیت دائمی نامیده می‌شود. از این شکل جهش‌یافتهٔ خاص برای جداسازی و خالص‌سازی آنزیم ALP استفاده می‌شود.
باکتری‌های E. coli همچنین به‌طور گسترده به‌عنوان کارخانه‌های سلولی به کار می‌روند. میکروب‌های مهندسی‌شده (برای مثال باکتری‌ها) و سلول‌های گیاهی را می‌توان به‌عنوان آنچه کارخانهٔ سلولی نامیده می‌شود به کار برد. این سلول‌های اصلاح‌شدهٔ ژنتیکی، مولکول‌ها، مواد شیمیایی، پلیمرها، پروتئین‌ها و مواد دیگری تولید می‌کنند که برای مثال در صنایع دارویی، غذایی و شیمیایی استفاده می‌شوند. برای آزادسازی مولکول‌های تولیدشده درون چنین سلول‌های مهندسی‌شدهٔ زیستی، لیز فراصوتی روشی رایج برای تخریب دیواره‌های سلولی و انتقال مواد هدف به مایع پیرامون است. دربارهٔ لیز سلول‌های مهندسی‌شدهٔ زیستی بیشتر بخوانید!

برش فراصوتی DNA

استفاده از نیروهای برشی فراصوتی، روشی رایج برای آزادسازی مولکول‌ها، اندامک‌ها و پروتئین‌ها از درون سلول و نیز شکستن رشته‌های DNA به قطعات کوچک‌تر است. کاویتاسیون آکوستیکی دیواره‌ها و غشاهای سلولی را می‌شکند تا DNA از سلول‌ها استخراج شود و قطعاتی به طول حدود 600 – 800 bp ایجاد شوند که برای آنالیز ایدئال هستند.
برای آشنایی بیشتر با هموژنایزرهای فراصوتی برای قطعه‌قطعه‌سازی DNA اینجا کلیک کنید!

منابع علمی / مراجع

Azarnezhad A., Sharifi Z., Seyedabadi R., Hosseini A., Johari B., Sobhani Fard M. (2016): Cloning and Expression of Soluble Recombinant HIV-1 CRF35 Protease-HP Thioredoxin Fusion Protein. Avicenna J Med Biotechnol. 8(4), 2016. 175–181.
Jiang X., Wang J., Chang H.; Zhou Y. (2016): Recombinant expression, purification and crystallographic studies of the mature form of human mitochondrial aspartate aminotransferase. BioScience Trends 2016.
Müller A., Eller J., Albrecht F., Prochnow P., Kuhlmann K., Bandow J.E., Slusarenko A.J., Leichert L.I.O. (2016): Allicin Induces Thiol Stress in Bacteria through S-Allylmercapto Modification of Protein Cysteines. Journal of Biological Chemistry Vol. 291, No. 22, 2016. 11477–11490.
Rabausch U., Juergensen J., Ilmberger N., Böhnke S., Fischer S., Schubach B., Schulte M., Streit W. R. (2013): Functional Screening of Metagenome and Genome Libraries for Detection of Novel Flavonoid-Modifying Enzymes. Applied and Environmental Microbiology 79(15), 2013. 4551–4563.
Sauer M. (2014): MTV1 Pull-down Assay in Arabidopsis. bio-protocol Vol 4, Iss 12, Jun 20, 2014.
Waldminghaus T., Skarstad K. (2010): ChIP on Chip: surprising results are often artifacts. BMC Genomics 11, 2010. 414.

فناوری فراصوت با عملکرد بالا! مجموعهٔ محصولات Hielscher طیف کاملی از سونیکاتورهای آزمایشگاهی جمع‌وجور و دستگاه‌های رومیزی تا سامانه‌های فراصوتی تمام‌صنعتی را پوشش می‌دهد.

Hielscher Ultrasonics هموژنایزرهای فراصوتی با عملکرد بالا را در اندازه‌های مختلف، از آزمایشگاهی تا صنعتی، تولید می‌کند.