برش فراصوتی DNA

در فرایند برش DNA و RNA، مولکول‌های بلند DNA به قطعات کوچک‌تر تقسیم می‌شوند؛ این کار گامی حیاتی در آماده‌سازی نمونه‌ها برای ساخت کتابخانه‌های توالی‌یابی نسل جدید (NGS) است. در برش فراصوتی DNA، از نیروهای کاویتاسیون آکوستیکی برای شکستن DNA یا RNA به قطعاتی در محدودهٔ 100 bp تا 5 kb استفاده می‌شود. این روش امکان کنترل دقیق اندازهٔ قطعات را فراهم می‌کند و تنظیم طول DNA بر اساس نیاز را برای دستیابی به نتایج بهینهٔ توالی‌یابی تسهیل می‌کند.

برش DNA با استفاده از فراصوت‌دهی

Hielscher Ultrasonics راهکارهای گوناگونی مبتنی بر فراصوت برای برش DNA، RNA و کروماتین ارائه می‌دهد. می‌توانید یک سونیکاتور پروبی (مانند UP100H) را برای فراصوت‌دهی مستقیم با استفاده از میکروتیپ انتخاب کنید، یا برای آماده‌سازی غیرمستقیم و هم‌زمان DNA در چندین نمونه از VialTweeeter یا کاپ‌هورن فراصوتی استفاده کنید. Hielscher با در نظر گرفتن نیازهای شما دستگاه ایدئال را ارائه می‌دهد: چه 1 نمونه داشته باشید و چه تا 10 نمونه، با حجم‌هایی از میکرولیتر تا لیتر – سونیکاتورهای Hielscher نیازهای شما را برای تهیهٔ قطعات DNA، RNA و کروماتین با طول مناسب برآورده می‌کنند. تکرارپذیری، کاربری آسان و کنترل دقیق، تهیهٔ کتابخانه‌ای قابل‌اعتماد برای توالی‌یابی نسل جدید را امکان‌پذیر می‌کنند.
برخلاف قطعه‌قطعه‌سازی آنزیمی DNA، برش فراصوتی صرفاً نیروهای برشی مکانیکی را بدون افزودن هیچ مادهٔ شیمیایی اعمال می‌کند. با تنظیم دقیق پارامترهای فرایند، برش فراصوتی قطعات DNA با وزن مولکولی بالا (DNA پلاسمیدی و ژنومی) تولید می‌کند.
اسیدهای نوکلئیک خالص‌شده را می‌توان پیش یا پس از مرحلهٔ قطعه‌قطعه‌سازی تکثیر کرد.
پارامترهای فراصوت‌دهی (توان، چرخهٔ پالس / قطارهای پالس، زمان و دما) را می‌توان به‌طور ایمن از طریق تنظیمات نرم‌افزار کنترل کرد.

پروتکل‌های برش فراصوتی DNA

برای آزمون رسوب‌دهی ایمنی کروماتین

به‌اختصار، سلول‌ها در ظروفی با قطر 60mm کشت داده شدند (400٬000 سلول در هر ظرف) و با RhoA siRNA ترانسفکت شدند (طبق شرح ارائه‌شده)؛ پس از 72 h، برای ایجاد پیوند عرضی میان پروتئین‌ها و DNA، با فرمالدهید (غلظت نهایی 1%) به‌مدت 10 min در 37°C انکوبه شدند. واکنش ایجاد پیوند عرضی با افزودن گلیسین 1٫25 mol/L به‌میزان یک‌دهم حجم متوقف شد و غلظت نهایی به 125 mmol/L رسید. سلول‌ها دو بار با PBS سردشده تا دمای یخ شسته شدند، دوباره در بافر آزمون رسوب‌دهی ایمنی رادیویی [150 mmol/L NaCl، 1% NP40، 0٫5% دئوکسی‌کولات، 0٫1% SDS، 5 mmol/L EDTA، 50 mmol/L Tris-HCl ‏(pH 8٫0)] حاوی 1 mmol/L فنیل‌متیل‌سولفونیل فلوراید، 1 Ag/mL آپروتینین و 1 Ag/mL پپستاتین A معلق شدند و به‌مدت 30 min روی یخ نگه داشته شدند. سپس لیزات‌های سلولی روی یخ با دستگاه Hielscher UP200S سونیکاتور فراصوتی (3 x 40 s، دامنهٔ 40%، چرخهٔ 1؛ Hielscher Ultrasonics GmbH) فراصوت‌دهی شدند تا کروماتین‌های دارای پیوند عرضی برش خورده و قطعات DNA با اندازهٔ 200 تا 1٬000 bp ایجاد شوند. یک‌دهم کل لیزات برای اندازه‌گیری مقدار DNA موجود در نمونه‌های مختلف استفاده شد و به‌عنوان «کل DNA ورودی» در نظر گرفته شد. برای کاهش زمینهٔ غیراختصاصی، مایع‌های رویی با سوسپانسیون 50% DNA اسپرم ماهی سالمون/پروتئین آگاروز انکوبه شدند. سپس رسوب‌دهی ایمنی طی شب در 4°C با 5 Ag از anti-NF-nB p65 ‏(Upstate) یا بدون آنتی‌بادی (کنترل منفی) انجام شد. به این مایع‌های رویی NaCl با غلظت 5 mol/L افزوده شد و برای بازگرداندن پیوندهای عرضی پروتئین–DNA، طی شب در 65°C حرارت داده شدند. کمپلکس‌های ایمنی سپس با پروتئیناز K عاری از DNase و RNase تیمار شدند و DNA با استخراج فنول/کلروفرم و رسوب‌دهی با اتانول خالص‌سازی شد. PCR با آغازگرهای اختصاصی متناظر با توالی‌ای در ناحیهٔ پروموتر ژن انسانی iNOS انجام شد (آغازگر p1: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶؛ آغازگر p2: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et al., 2008)

مطالعات بیان EGFP

برای مطالعات بیان، سویهٔ نوترکیب L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat#12 ‏(Jena Bioscience، آلمان)، دارای ژن EGFP (پروتئین فلورسنت سبز تقویت‌شده) ادغام‌شده در جایگاه کروموزومی ssu، طبق شرح پیشین در محیط‌های مختلف کشت داده شد و علاوه بر آن، محیط‌ها با 100 mg l^-1 نورسئوتریسین (Jena Bioscience، آلمان) تکمیل شدند. طی کشت، نمونه‌های 1 ml برداشته، سانتریفیوژ (2000 × g، ‏20°C، ‏10 min) و با محلول 0٫9% NaCl شسته شدند. رسوب دوباره در بافر (20 mM HEPES، ‏5 mM EDTA، ‏2 mM DTT) معلق شد و با فراصوت‌دهی به‌وسیلهٔ پردازشگر فراصوتی UP400S متلاشی شد (اعمال انرژی ∼ 400 Ws). بقایای سلولی با سانتریفیوژ (6000 × g، ‏4°C، ‏5 min) حذف شدند و با الکتروفورز ژل پلی‌آکریل‌آمید – سدیم دودسیل سولفات (SDS-PAGE) در شرایط احیایی طبق روش Laemmli (1970)، با ژل‌های پلی‌آکریل‌آمید 12٫5% بررسی شدند. بیان EGFP در کشت تحت هم‌زدن بررسی شد. (Fritsche et al. 2007)

رسوب‌دهی ایمنی کروماتین

آزمون رسوب‌دهی ایمنی کروماتین با استفاده از ChIP-IT^TM Express ‏(Active Motif، کارلزبد، CA، ایالات متحدهٔ آمریکا) طبق دستورالعمل سازنده با برخی تغییرات انجام شد. به‌اختصار، در پودوسیت‌های انسانی تمایزیافته با استفاده از فرمالدهید 1% به‌مدت 10 min در دمای اتاق پیوند عرضی ایجاد شد. سلول‌ها با PBS سردشده تا دمای یخ شسته شدند و واکنش تثبیت با افزودن گلیسین 0٫125 M به‌مدت 5 min در دمای اتاق متوقف شد. سلول‌ها دوباره با PBS سردشده تا دمای یخ شسته شدند و با تراشیدن از ظرف جدا شدند. سلول‌ها با سانتریفیوژ رسوب داده شدند و دوباره در بافر لیز معلق شدند. پس از سانتریفیوژ، هسته‌های رسوب‌کرده دوباره در بافر برش معلق شدند، به‌مدت 30 min روی یخ انکوبه شدند و کروماتین با فراصوت‌دهی، برای مثال با UP100H ‏(Hielscher Ultrasonics GmbH، تلتو، آلمان) با توان 25% و 5 پالس، هر یک به‌مدت 20 sec، روی یخ به قطعاتی با اندازهٔ تقریبی 200–600 bp برش داده شد. سپس کروماتین برش‌خورده سانتریفیوژ و مایع رویی جمع‌آوری شد. برای رسوب‌دهی ایمنی، 60 μl کروماتین با 1 μg از آنتی‌بادی‌های Sp1 ‏(Santa Cruz Biotechnology، سانتا کروز، CA، ایالات متحدهٔ آمریکا)، NF-κB p65 ‏(Abcam، کمبریج، بریتانیا) یا NF-κB p50 ‏(Abcam)، یا با IgG خرگوش (Zymed Laboratories) به‌عنوان کنترل منفی، طی شب در 4°C با چرخش ملایم انکوبه شد. کمپلکس‌های ایمنی متصل به مهره‌های مغناطیسی با استفاده از پایهٔ مغناطیسی جمع‌آوری و به‌طور کامل شسته شدند؛ پیوندهای عرضی پروتئین/DNA بازگردانده شدند و DNA برای آنالیز با PCR زمان واقعی واجذب شد. (Ristola et al. 2009)

آماده‌سازی DNA باکتری EHEC برای آنالیز آرایهٔ تراشه

تهیهٔ لیزات‌های سلولی و DNAهای استخراج‌شده
رسوب‌های باکتریایی که تا غلظت نهایی مطلوب در PBS معلق شده بودند، با دستگاه تخریب فراصوتی UP100H ‏(Hielscher GmbH، آلمان) مجهز به میکروتیپ MS1 (با قطر 1mm) تیمار شدند. فرکانس کار 30 kHz و توان خروجی مؤثر 100 W بود. طی عملیات، نمونه‌ها در حمام آب و یخ خنک، مخلوط و سانتریفیوژ شدند. نمونه‌ها برای مطالعات فلوسایتومتری استفاده شدند، درحالی‌که برای مراحل بعدی، نمونه‌ها تحت تیمار حرارتی (95°C، ‏5 min) قرار گرفتند. لیزات‌های خام سلولی با مخلوط فنول:کلروفرم:ایزوآمیل الکل (25:24:1) پردازش شدند. حجمی برابر از این مخلوط به نمونهٔ لیزات افزوده شد، محلول به‌مدت 15 s به‌شدت ورتکس شد و به‌مدت 2 min با 15٬000 x g در دمای اتاق (RT)، حدود 22°C، سانتریفیوژ شد. فاز آبی بالایی حاوی DNA ژنومی با دقت جدا و در یک لولهٔ استریل جدید Eppendorf جمع‌آوری شد.
سپس نمونه‌ها برای قطعه‌قطعه‌سازی DNA فراصوت‌دهی شدند. مرحلهٔ فراصوت‌دهی تحت همان شرایط شرح‌داده‌شده در بالا انجام شد. برای ارزیابی اثرات قطعه‌قطعه‌سازی بر DNA ژنومی، نمونه‌ها با الکتروفورز ژل آگاروز بررسی شدند.
(…) نمونه‌هایی که پیش‌تر به‌مدت 2٫5 min فراصوت‌دهی شده بودند، پس از تیمار حرارتی و سانتریفیوژ تحت مرحلهٔ استخراج قرار گرفتند. DNA آزادشده دو بار با مخلوط فنول:کلروفرم:ایزوآمیل الکل استخراج شد و سپس به‌مدت 0 – 15 min تحت فراصوت‌دهی دوم قرار گرفت. برای تعیین توزیع اندازهٔ DNA که پس از استخراج تحت قطعه‌قطعه‌سازی فراصوتی قرار گرفته بود، از الکتروفورز ژل آگاروز استفاده شد (شکل در بالا سمت راست). وجود اسمیر DNA به‌جای باندهای با وزن مولکولی بالا، که در نمونه‌های فراصوت‌دهی‌شده به‌مدت 2٫5 min یا بیشتر حذف شده بودند، نشان‌دهندهٔ قطعه‌قطعه‌شدن شدید DNA بود. فراصوت‌دهی طولانی‌تر به‌تدریج طول قطعات را به حدود 150 – 600 bp کاهش داد و فراصوت‌دهی به‌مدت 15 min این قطعات را بیشتر تخریب کرد؛ این موضوع عمدتاً در بخش بالایی اسمیر قابل مشاهده است. بنابراین، میانگین اندازهٔ قطعات DNA با افزایش زمان فراصوت‌دهی به‌تدریج کاهش یافت و تیمار 5 min امکان دستیابی به مناسب‌ترین اندازهٔ قطعات DNA برای آزمون‌های آرایهٔ تراشه را فراهم کرد. در نهایت، روش آماده‌سازی آنالیت DNA شامل ابتدا 2 min تیمار فراصوتی، استخراج DNA ‏(2×) و سپس 5 min فراصوت‌دهی تعیین شد. (Basselet et al. 2008)

رسوب‌دهی ایمنی کروماتین (ChIP)

سلول‌های HEK293 طبق شرح بالا کشت داده شدند و با 2 mM دی‌سوکسینیمیدیل گلوتارات به‌مدت 45 min در دمای اتاق تثبیت شدند. سپس سلول‌ها دو بار با PBS شسته شدند. در کروماتین با استفاده از فرمالدهید 1% (v/v) به‌مدت 10 min در دمای اتاق پیوند عرضی ایجاد شد و دو بار با PBS سردشده تا دمای یخ شست‌وشو انجام گرفت. واکنش ایجاد پیوند عرضی با انکوباسیون با گلیسین در غلظت نهایی 0٫125 M به‌مدت 5 min در دمای اتاق متوقف شد. پس از انکوباسیون با تریپسین، سلول‌ها با تراشیدن از ظرف کشت سلولی جدا و دو بار با PBS شسته شدند. رسوب سلولی دوباره در بافر لیز (5 mM Pipes، ‏pH 8٫0، ‏85 mM KCl و 0٫5% (v/v) Nonidet P-40) معلق شد، به‌مدت 10 min روی یخ انکوبه و با هموژنایزر Dounce همگن شد. سپس هسته‌ها با سانتریفیوژ (3500 x g، ‏5 min، ‏4 °C) رسوب داده شدند و دوباره در بافر هسته (50 mM Tris-HCl، ‏pH 8٫1، ‏10 mM EDTA و 1% (w/v) SDS) معلق شدند. هسته‌ها با فراصوت‌دهی با سه پالس 20-s در یک سونیکاتور UP50H ‏(Hielscher Ultraschall Technologie) با تنظیم چرخهٔ 0٫5 و دامنهٔ 30% تخریب شدند و قطعات DNA ژنومی ایجاد شد که عمدهٔ آن‌ها اندازه‌ای در محدودهٔ 200 – 1000 bp داشتند. برای ChIP، مقدار 50g از DNA در بافر رسوب‌دهی ایمنی (16٫7 mM Tris-HCl، ‏pH 8٫1، ‏167 mM NaCl، ‏1٫2 mM EDTA، ‏1٫1% (v/v) Triton X-100 و 0٫01% (w/v) SDS) به‌میزان 4 برابر رقیق شد. (Weiske et al. 2006)

آنالیز تغییرات هیستون با رسوب‌دهی ایمنی کروماتین (ChIP)

به‌اختصار، 6 x 10⁶ سلول دو بار با PBS شسته شدند و روی پلیت کشت به‌مدت 15 min در دمای اتاق در حضور فرمالدهید 0٫5% در آن‌ها پیوند عرضی ایجاد شد. واکنش ایجاد پیوند عرضی با افزودن گلیسین 0٫125 M متوقف شد. تمام مراحل بعدی در 48°C انجام شدند. همهٔ بافرها از پیش سرد شده بودند و حاوی مهارکننده‌های پروتئاز (Complete Mini، Roche) بودند. سلول‌ها دو بار با PBS شسته شدند و سپس با تراشیدن جدا شدند. رسوب‌های جمع‌آوری‌شده در 1 ml بافر لیز (1% SDS، ‏5 mM EDTA، ‏50 mM Tris با pH 8) حل شدند و در حمام اتانول سرد طی 10 چرخه با دامنهٔ 100% با استفاده از یک سونیکاتور UP50H ‏(Hielscher، تلتو، آلمان) فراصوت‌دهی شدند. قطعه‌قطعه‌شدن کروماتین در ژل آگاروز 1% مشاهده شد. قطعات حاصل در محدودهٔ 200–500pb بودند. کروماتین محلول با سانتریفیوژ نمونه‌های فراصوت‌دهی‌شده در 14٬000g به‌مدت 10 min در 48°C به دست آمد. کسر محلول در بافر رقیق‌سازی (1% Triton X-100، ‏2 mM EDTA، ‏20 mM Tris با pH 8، ‏150 mM NaCl) به نسبت 1/10 رقیق شد، سپس به بخش‌های کوچک تقسیم شد و تا زمان استفاده در 80°C نگهداری شد. (Rodriguez et al. 2008)