فن آوری اولتراسوند Hielscher

DNA برش التراسونیک

  • در DNA و RNA برش، مولکول های DNA را به قطعات کوچکتر شکسته. DNA قطعه قطعه شدن / RNA یکی از مهم مراحل آمادگی نمونه مورد نیاز ایجاد کتابخانه برای توالی نسل بعدی (NGS) است.
  • قیچی و برش DNA التراسونیک با استفاده از نیروهای کاویتاسیون صوتی برای شکستن DNA یا RNA را به قطعات 100 – جفت باز 5KB.
  • قیچی و برش آلتراسونیک اجازه می دهد تا قطعه قطعه شدن DNA دقیق و انطباق به طول DNA مورد نظر.

DNA برش التراسونیک

Hielscher فرا صوت ارائه می دهد راه حل های مختلف مبتنی بر سونوگرافی برای DNA، RNA و قیچی کروماتین. را انتخاب کنید بین یک کاوشگر نوع ultrasonicators (به عنوان مثال UP100H) برای فراصوت مستقیم با استفاده از یک microtip، و یا استفاده از VialTweeeter یا cuphorn مافوق صوت برای آماده سازی DNA غیرمستقیم نمونه های مختلف به طور همزمان. Hielscher ارائه می دهد دستگاه ایده آل با توجه به نیازهای شما: آب و هوا شما 1 یا 10 نمونه، جلد از میکرولیتر به حجم لیتر – پردازنده مافوق صوت Hielscher دسترس به نیازهای خود برای آماده سازی DNA، RNA و قطعات کروماتین در طول سمت راست هستند. تکرار پذیری، بهره برداری آسان و کنترل دقیق برای یک کتابخانه قابل اعتماد برای تعیین توالی نسل بعدی اجازه می دهد.
در مقابل به قطعه قطعه شدن DNA آنزیمی، قیچی اولتراسونیک نیروهای برشی مکانیکی خالص بدون اضافه کردن هر گونه مواد شیمیایی می شود. توسط تنظیم دقیق پارامترهای فرایند، قیچی مافوق صوت تولید مولکولی قطعات DNA وزن بالا (پلاسمید و DNA ژنومی).
اسیدهای نوکلئیک خالص را می توان قبل یا پس از یک مرحله تکه تکه شدن تقویت شده.
پارامترهای روش فراصوت (قدرت، چرخه پالس / انفجار، زمان و درجه حرارت) را می توان با خیال راحت از طریق تنظیمات نرم افزار کنترل می شود.

مزایای:

  • کنترل دقیق
  • چرخه فراصوت و زمان دقیقا سازگار به اندازه DNA مورد نظر
  • قطعات DNA با وزن مولکولی بالا
  • کنترل دما
  • سریع
  • نتایج تجدید پذیر
  • اتوکلاو
  • راه حل های مختلف: پروب نوع، VialTweeter(ویال گروهی) . Cuphorn

پروتکل برای التراسونیک DNA برش

برای کروماتین Immunoprecipitation سنجش

به طور خلاصه، سلول ها در ظرف های 60 میلیمتر قطر (400000 در هر ظرف) قرار داده و با siRNA RhoA transfected (همانطور که شرح داده شد)؛ پس از 72 ساعت، آنها با فرمالدئید (غلظت نهایی، 1٪) به مدت 10 دقیقه در دمای 37 درجه سانتیگراد به پروتئین متقاطع اتصال به DNA با DNA انکوباتور شدند. واکنش متقابل اتصال با افزودن یک دهم حجم گلیسین 25/1 مولار / لیتر، با غلظت نهایی 125 میلی مول در لیتر، خنک شد. سلول ها دو بار با PBS یخ شستشو شدند و در بافر تست رادیو ايمونوپراکساسيون 150 ميلیلیون ليتر، 1٪ NP40، 0.5٪ دکسي کولول، 0.1٪ SDS، 5 mmol / L EDTA، 50 mmol / L Tris-HCl (pH 8.0 )] حاوی 1 mmol / L فنیل متیل سولفونیل فلوراید، 1 Ag / mL aprotinin و 1 Ag / mL pepstatin A و 30 دقیقه در یخ نگه داشته شد. سپس، لیزات سلول با یك با یك سكوكال مقایسه شد شرکت Hielscher UP200S سونوگرافی sonicator (3 × 40، دامنه 40٪، چرخه 1؛ Hielscher فرا صوت شرکت) تا رنگینه متقابل مربوط به عملکرد قطعات DNA بین 200 تا 1000 جفت باز چیده شد. یک دهم طیف عصاره به quantitate که میزان وجود DNA در نمونه های مختلف مورد استفاده قرار گرفت و به عنوان در نظر گرفته “کل DNA ورودی”. رویی با ماهی قزل آلا اسپرم DNA / پروتئین آگارز-50٪ دوغاب به کاهش پس زمینه غیر اختصاصی انکوبه شدند. Immunoprecipitation سپس یک شب در 4 درجه سانتی گراد و 5 نقره از P65 ضد NF-NB (شمال ایالت) و یا بدون آنتی بادی (کنترل منفی) انجام شد. این مایع رویی با 5 مول / L نمک طعام تکمیل و یک شب در 65 درجه سانتی گراد گرم می شود به برگرداندن پروتئین DNA لینک متقابل شد. immunocomplexes بیشتر با DNase- و بدون گروه RNase پروتئیناز K درمان شدند و DNA به روش فنل / استخراج کلروفرم و اتانول بارش خالص شد. PCR با پرایمرهای اختصاصی مربوط به یک دنباله در داخل منطقه پروموتر ژن iNOS به انسان انجام شده (p1 آستر: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶، P2 آستر: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier و همکاران، 2008)

مطالعات EGFP بیان

برای مطالعه بیان، نوترکیب P10 فشار L. tarentolae :: F9Begfp1.4dBsat # 12 (ینا علوم زیستی، آلمان) با ژن EGFP (پیشرفته پروتئین فلورسنت سبز)، کروموزومی، یکپارچه SSU که قبلا شرح داده شده در رسانه های مختلف کشت و علاوه بر این با 100 میلی گرم در لیتر تکمیل-1 Nourseothricin (ینا علوم زیستی، آلمان). در طول کشت، 1 میلی لیتر نمونه گرفته شد، سانتریفوژ (2000 × گرم، 20 درجه سانتی گراد، 10 دقیقه) و شسته شده با محلول NaCl 0.9٪. پلت در بافر (20 میلی HEPES، 5 میلی متر EDTA، 2 میلی متر DTT) اتفاده بود و با پردازنده مافوق صوت از هم پاشیده شده توسط sonification UP400S (استفاده از انرژی ~ 400 WS). با توجه به روش Laemmli (1970) با 12.5 درصد ژل polyacralamide الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید (SDS-PAGE) در شرایط کاهش - بقایای سلول توسط سانتریفوژ (6000 × گرم، 4 درجه سانتی گراد، 5 دقیقه) خارج شد و از سدیم دودسیل سولفات مورد بررسی قرار گرفت . EGFP بیان در فرهنگ آشفته بررسی قرار گرفت. دهند (Fritsche و همکاران 2007)

Hielscher's UP100H was used to prepare EHEC DNA for chip array analysis

الکتروفورتیک تجزیه و تحلیل DNA ژنومی از E. coli EDL933 قرار 0 - 15 دقیقه امواج فراصوت. L نشان می دهد نردبان DNA است. (Basselet و همکاران 2008).

درخواست اطلاعات




توجه داشته باشید ما سیاست حفظ حریم خصوصی.


immunoprecipitation کروماتین

التراسونیک UP100H مختل سلول (100W) برای لیز، اختلال سلول و قیچی DNA.سنجش کروماتین immunoprecipitation با استفاده از تراشه-IT انجام شدTm با توجه به دستورالعمل کارخانه سازنده با برخی تغییرات اکسپرس (موتیف فعال، کارلسبد، CA، USA). به طور خلاصه، podocytes انسان متفاوت کراس لینک شد با 1٪ فرمالدئید به مدت 10 دقیقه در دمای اتاق. سلول ها با سرد PBS شسته شده و واکنش ثابت با اضافه کردن 0.125 M گلیسین برای 5 دقیقه در دمای اتاق متوقف شد. سلول های دوباره با سرد PBS شسته شده و خراشیده از ظرف. سلولها توسط سانتریفوژ پلت و مجددا در بافر لیز شد. پس از سانتریفیوژ، هسته پلت در بافر هربرش اتفاده بود، بر روی یخ به مدت 30 دقیقه در انکوباتور و کروماتین توسط فراصوت، به عنوان مثال، چیده شد UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH، Teltow، آلمان) در 25٪ قدرت 5 پالس 20 ثانیه هر بر روی یخ به قطعات تقریبا 200-600 bp. سپس کروماتین خرد شده سانتریفیوژ شد و سوپرناتانت جمع آوری شد. برای immunoprecipitations، 60μl کروماتین با 1 میکروگرم اسپکتروفتومتری (Santa Cruz Biotechnology، Santa Cruz، CA، USA)، NF-κB p65 (Abcam، Cambridge، UK) یا آنتی بادیهای NF-κB p50 (Abcam) یا با خرگوش IgG (Zymed Laboratories، South San Francisco، CA، USA)، به عنوان یک کنترل منفی، شبانه در دمای 4 درجه سانتیگراد با چرخش ملایم. Immunocomplexes که به دانه های مغناطیسی متصل می شوند با استفاده از یک ایستگاه مغناطیسی جمع آوری شد، به طور گسترده ای شسته شد و پیوند پروتئین / DNA متوقف شد و DNA برای تجزیه و تحلیل زمان واقعی PCR زنده شد. (Ristola et al 2009)

آماده سازی DNA EHEC برای تجزیه و تحلیل مجموعه تراشه

طراحی از cell lysate و استخراج DNA استخراج
گلوله های باکتریایی معلق در PBS به غلظت نهایی مورد نظر را با تحت درمان قرار گرفتند سونوگرافی UP100H مختل (Hielscher GmbH، آلمان) مجهز به میکروتیپ MS1 (قطر 1 میلیمتر). فرکانس کار 30 کیلو هرتز بود و قدرت خروجی موثر 100 وات بود. در طی عملیات، نمونه ها در یک حمام یخ آب خنک شدند، مخلوط و سانتریفوژ شدند. نمونه ها برای مطالعات جریان سیاتومتری مورد استفاده قرار گرفتند، در حالیکه برای دست زدن به بعد، نمونه ها تحت درمان حرارتي (95 درجه سانتی گراد، 5 دقیقه) قرار گرفتند. لیزات سلول خام با مخلوطی از فنل: کلروفرم: ایزوآمیل الکل (25: 24: 1) مورد پردازش قرار گرفت. حجم مساوی از این مخلوط به نمونه لسیات اضافه شد، محلول به سرعت 15 ثانیه چرخانده شد و در دماي اتاق (RT) حدود 22 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ شد. فاز آبی بالا حاوی ژنوم DNA به دقت جدا شده و در یک لوله عصبی مرکزی Eppendorf قرار داده شد.
پس از آن، نمونه ها برای تجزیه DNA به کار گرفته شدند. مرحله آمیزش در شرایط مشابه همانطور که در بالا توضیح داده شد متوجه شد. برای ارزیابی اثرات قطعی بر روی ژنوم DNA، نمونه ها با استفاده از الکتروفورز ژل آگارز مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند.
(…) نمونه هایی که به مدت 2.5 دقیقه به صورت سونیک کار می کردند، پس از عملیات حرارتی و سانتریفیوژ، یک مرحله استخراج تحت عمل جراحی قرار گرفتند. DNA آزاد شده دو بار با ترکیب فنل: کلروفرم: ایزوآمیل الکل استخراج می شود و سپس به مدت 0 تا 15 دقیقه به عصاره گیری دوم اعمال می شود. الکتروفورز ژل آگارز برای تعیین توزیع اندازه DNA مورد استفاده در قطعه اولتراسونیک پس از استخراج (شکل در سمت راست بالا) مورد استفاده قرار گرفت. DNA بسیار جداسازی شده از حضور یک اسمیر DNA به جای نوارهای با وزن مولکولی بالا که از نمونه هایی که به مدت 2.5 دقیقه یا بیشتر کار می کردند، حذف شد. طولانی تر شدن دستگاه های عصبی به تدریج طول قطعه را به تقریبا 150 تا 600 بیتی کاهش دادند و پس از 15 دقیقه و بعد از سانتریفوژ، این قطعات بیشتر تخریب شدند، که بیشتر آن را می توان از قسمت فوقانی اسمور مشاهده کرد. بنابراین، اندازه قطعه متوسط ​​DNA به تدریج با زمان فراصوت گیری کاهش یافت و 5 دقیقه درمان اجازه می دهد اندازه قطعه های DNA را که مناسب ترین روش برای ارزیابی تراشه ها است، بدست آوریم. در نهایت، روش آماده سازی آنالیت DNA شامل 2 دقیقه اول درمان اولتراسونیک، استخراج DNA (2 ×) و پس از آن 5 دقیقه با دستگاه سانتریفوژ ایجاد شد. (Basselet et al 2008)

کروماتین Immunoprecipitation (تراشه)

UP100H پردازنده التراسونیک برای DNA ، RNA و قیچی کروماتین. (برای بزرگنمایی کلیک کنید!)سلول های HEK293 به صورت بالا شرح داده شده و با دمای 2 میلی متری disuccinimidyl-glutarate به مدت 45 دقیقه در دمای اتاق ثابت می شوند. سپس سلولها دو بار با PBS شسته شدند. کروماتین به مدت 10 دقیقه در دمای اتاق با استفاده از 1٪ (V / V) فرمالدئید و دو بار با PBS یخ شستشو می شود. واکنش متقابل اتصال با انکوباسيون با گليسين در غلظت نهايي 0.125 ميکرومتر در دماي اتاق 5 دقيقه متوقف شد. پس از انكوباسيون با تريپسين، سلول ها از ظرف غذاي سلولي كاشته شده و دو بار با PBS شسته شدند. پودر سلولی در بافر لیز (لوله های 5 میلیمتری، pH 8،0، 85 میلی متر KCl و 5/0 درصد (V / V) Nonidet P-40)، انکوباتور بر روی یخ به مدت 10 دقیقه، و همگن ساز با هوموژنایزر Dounce مجددا احیا شد. سپس، با استفاده از سانتریفوژ (3500xg، 5min، 4 درجه سانتیگراد)، هسته ها به وسیله سانتریفیوژ پراکنده شدند و در بافر هسته ای (50 میلی متری تریس-HCl، pH 8.1، 10 میلیمتر EDTA و 1٪ (w / v) SDS) دوباره باقیمانده شدند. با استفاده از دستگاه های عصبی با سه پالس 20 ثانیه در هسته، یک هسته مختل شد sonicator UP50H (Hielscher Ultraschall Technologie از) در یک محیط از چرخه 0.5 و دامنه 30٪، بازده قطعات DNA ژنومی با اندازه بخش عمده ای از 200-1000 جفت باز. برای تراشه، 50G از DNA 4 برابر در بافر immunoprecipitation (رقیق شد 16.7 میلی تریس هیدروکلراید، pH برابر 8.1، 167 میلی مولار، 1.2 میلی متر EDTA، 1.1٪ (V / V) تریتون X-100، و 0.01٪ (W / V) SDS). (Weiske و همکاران 2006).

تجزیه و تحلیل اصلاح هیستون توسط immunoprecipitation کروماتین (تراشه)

به طور خلاصه، 6 * 106 سلول ها دو بار با PBS شستشو داده شده و در دمای اتاق در دمای اتاق در حضور 0.5٪ فرمالدئید به مدت 15 دقیقه در بشقاب های کشت قرار گرفتند. واکنش متقاطع با اضافه کردن 0.125 میلی گرمی گلیسین متوقف شد. تمام مراحل بعدی در دمای 48 درجه سانتیگراد انجام شد. تمام بافر ها قبل از سرد شدن و حاوی مهار کننده های پروتئاز (Complete Mini، Roche) بودند. سلولها دو بار با PBS شسته شدند و سپس از بین برده شدند. گلوله های جمع آوری شده در 1 میلی لیتر بافر لیز (1٪ SDS، 5 میلیمتر EDTA، 50 میلی متری Tris pH 8) و در حمام اتانول سرد برای 10 سیکل با دامنه 100٪ با استفاده از یک sonicator UP50H (Hielscher، تلتو، آلمان). تکه تکه شدن کروماتین در ژل آگارز 1٪ مشاهده شد. قطعات به دست آمده در محدوده 200-500pb بود. کروماتین محلول های سانتریفوژ نمونه فراصوت داده در 14،000g مدت 10 دقیقه در 48 درجه سانتی گراد به دست آمد. قسمت محلول 1/10 در بافر رقیق رقیق شده (1٪ تریتون X-100، 2 میلی متر EDTA، 20 میلی متر تریس با pH 8، 150 میلی مولار) پس از آن aliquoted و در 80 درجه تا زمان استفاده ذخیره می شود. (رودریگز و همکاران 2008).

دستگاه قدرت [W] نوع حجم [میلی لیتر]
VialTweeter(ویال گروهی) ۲۰۰ مستقل 00.5 ۱/۵
UP50H ۵۰ دستی یا standmounted 0.01 ۲۵۰
UP100H ۱۰۰ دستی یا standmounted 0.01 ۵۰۰
UP200Ht ۲۰۰ دستی یا standmounted 00.1 ۱۰۰۰
UP200St ۲۰۰ ایستاده است 00.1 ۱۰۰۰
UP400St ۴۰۰ ایستاده است ۵/۰ ۲۰۰۰
Cuphorn ۲۰۰ CupHorn، sonoreactor 10 ۲۰۰
GDmini2 ۲۰۰ سلول جریانی بدون آلاینده

درخواست اطلاعات




توجه داشته باشید ما سیاست حفظ حریم خصوصی.


Hielscher's VialTweeter is is´deal for the simultaneous preparation of multiple samples

VialTweeter(ویال گروهی) برای آمادگی نمونه مافوق صوت

تماس با ما! / از ما بپرسید!

برای اطلاعات بیشتر بپرسید

لطفاجهت کسب اطلاعات بیشتراز فرم زیر استفاده کنید .









لطفا توجه داشته باشید ما سیاست حفظ حریم خصوصی.


ادبیات / منابع

  • Basselet ص، Wegrzyn به پایان رسانده G.، Enfors S.-O.، Gabig-Ciminska M. (2008): پردازش نمونه برای تجزیه و تحلیل مبتنی بر آرایه تراشه DNA از اشرشیاکلی enterohemorrhagic انتروهموراژیک میباشد. کارخانه همراه میکروبی 07:29. 2008.
  • . Doublier S.، Riganti کانال، Voena C.، Costamagna C.، Aldieri E.، Pescarmona G.، Ghigo D.، Bosia A. (008): RhoA خاموش را باز میگرداند مقاومت به دوکسوروبیسین در سلول های سرطان کولون انسانی. مولکولی تحقیقات سرطان 6 (10)، 2008.
  • فردلاند E.، Gidlund A.، اولسن M.، Börjesson از T.، Spliid NHH، Simonsson با M. (2008): بررسی روش استخراج DNA از قارچ Fusarium قارچ و گندم برای پایین جریان زمان واقعی کمی PCR و همبستگی به سطح مایکوتوکسین . مجله مواد و روش ها میکروبیولوژیکی 2008.
  • Fritsche C.، نشسته M.، ویلند N.، Breitling می R.، پل H.-D. (2007): خواص رفتار رشد tarentolae لیشمانیا - یک سیستم بیان جدید برای پروتئین های نوترکیب. مجله پایه میکروبشناسی 47، 2007. 384-393.
  • Ristola M.، Arpiainen S.، سلیم M. A.، ماتیسون ص دبلیو، ولزی G. I.، لیتونین S.، Holthöfer H. (2009): مقررات Neph3 ژن در podocytes - نقش های کلیدی رونویسی عوامل NF-kB و SP1. BMC بیولوژی مولکولی 10:83، 2009.
  • رودریگز J.، ویوز L.، JORDA M.، مورالس C.، مونوز M.، وندرل E.، Peinado M. A. (2008): ردیابی در سراسر ژنوم از unmethylated DNA Alu با تکرار در سلول های طبیعی و سرطان. اسیدهای نوکلئیک تحقیقات جلد. 36، شماره 3، سال 2008. 770-784.
  • Weiske J. هوبر O. (2006): هیستیدین تایی پروتئین Hint1 باعث آپوپتوز مستقل از آن فعالیت آنزیمی. مجله شیمی زیستی. جلد 281، شماره 37، 2006. 27356-27366.


آمار ارزشمند دانستن

التراسونیک / کاویتاسیون آکوستیک نیروهای بسیار شدید است که به ترویج تبلور و بارش فرآیندهای ایجاد (برای بزرگنمایی کلیک کنید!)

قیچی و برش DNA التراسونیک است کاویتاسیون آکوستیک و نیروهای برشی هیدرودینامیک خود را بر اساس