برش DNA اولتراسونیک
در طول برش DNA و RNA، مولکول های DNA بلند به قطعات کوچکتر تقسیم می شوند، که گامی مهم در آماده سازی نمونه ها برای ساخت کتابخانه توالی یابی نسل بعدی (NGS) است. برش DNA اولتراسونیک از نیروهای حفره صوتی برای شکستن DNA یا RNA به قطعات مختلف از 100 جفت باز تا 5 کیلوبایت استفاده می کند. این روش کنترل دقیق اندازه قطعه را امکان پذیر می کند و سفارشی سازی به طول DNA مورد نظر را برای نتایج توالی یابی بهینه تسهیل می کند.
برش DNA با استفاده از اولتراسونیک
Hielscher اولتراسونیک ارائه می دهد راه حل های مختلف مبتنی بر سونوگرافی برای DNA ، RNA و برش کروماتین. یکی از بین یک پروب نوع ultrasonicators (به عنوان مثال UP100H) برای فراصوت مستقیم با استفاده از microtip را انتخاب کنید، و یا استفاده از VialTweeeter و یا cuphorn مافوق صوت برای آماده سازی DNA غیر مستقیم از نمونه های مختلف به طور همزمان. Hielscher ارائه می دهد دستگاه ایده آل با توجه به نیازهای شما: اگر شما 1 یا تا 10 نمونه, حجم از میکرولیتر به حجم لیتر – فراصوت Hielscher نیازهای خود را برای آماده سازی DNA، RNA و قطعات کروماتین در طول مناسب برآورده می کند. تکرارپذیری، عملکرد آسان و کنترل دقیق امکان یک کتابخانه قابل اعتماد برای توالی یابی نسل بعدی را فراهم می کند.
برخلاف تکه تکه شدن DNA آنزیمی، برش اولتراسونیک نیروهای برشی مکانیکی خالص را بدون اضافه کردن هر گونه مواد شیمیایی اعمال می کند. با تنظیم دقیق پارامترهای فرآیند، برش اولتراسونیک قطعات DNA با وزن مولکولی بالا (پلاسمید و DNA ژنومی) را تولید می کند.
اسیدهای نوکلئیک خالص شده را می توان قبل یا بعد از مرحله تکه تکه شدن تقویت کرد.
پارامترهای فراصوت (قدرت، چرخه نبض? انفجار، زمان و دما) را می توان با خیال راحت از طریق تنظیمات نرم افزار کنترل کرد.
- کنترل دقیق
- چرخه فراصوت و زمان دقیقا سازگار با اندازه DNA مورد نظر
- قطعات DNA با وزن مولکولی بالا
- کنترل دما
- سریع
- نتایج قابل تکرار
- اتوکلاو
- راه حل های مختلف: نوع کاوشگر، VialTweeter(ویال گروهی) . کاپ هورن
پروتکل های برش DNA اولتراسونیک
برای سنجش رسوب ایمنی کروماتین
به طور خلاصه، سلول ها در ظروف با قطر 60 میلی متر (400,000 در هر ظرف) آبکاری شدند و با RhoA siRNA (همانطور که توضیح داده شد) ترانسفکت شدند. پس از 72 ساعت، آنها با فرمالدئید (غلظت نهایی، 1 درصد) به مدت 10 دقیقه در دمای 37 درجه سانتی گراد انکوبه شدند تا پروتئین ها به DNA متصل شوند. واکنش اتصال عرضی با افزودن حجم یک دهم 1.25 مول بر لیتر گلیسین خاموش شد و غلظت نهایی 125 میلی مول در لیتر را به دست آورد. سلول ها دو بار با PBS سرد یخی شسته شدند و در بافر سنجش رادیوایمونورسوب [150 میلی مول در لیتر NaCl، 1٪ NP40، 5/0٪ دئوکسی کولات، 1/0 درصد SDS، 5 میلی مول در لیتر EDTA، 50 میلی مول در لیتر Tris-HCl (pH 8.0)] حاوی 1 میلی مول در لیتر فنیل متیل سولفونیل فلوراید، 1 Ag/mL آپروتینین و 1 Ag/mL پپستاتین A معلق شدند و به مدت 30 دقیقه روی یخ نگهداری شدند. سپس، لیزات سلولی بر روی یخ با یک فراصوت شدند Hielscher UP200S سونوگرافی سونوگرافی (3 X 40 ثانیه, دامنه 40٪, چرخه 1; Hielscher Ultrasonics GmbH) تا زمانی که کروماتین های متقاطع برش داده شدند تا قطعات DNA بین 200 تا 1,000 جفت باز تولید شوند. یک دهم لیزات کل برای تعیین کمیت مقدار DNA موجود در نمونه های مختلف استفاده شد و به عنوان در نظر گرفته شد “کل DNA ورودی”. مایع رویی با DNA/پروتئین آگارز-50 درصد دوغاب اسپرم ماهی قزل آلا برای کاهش زمینه غیراختصاصی انکوبه شدند. سپس رسوب ایمنی شبانه در دمای 4 درجه سانتی گراد با 5 Ag anti-NF-nB p65 (Upstate) یا بدون آنتی بادی (کنترل منفی) انجام شد. این مایع رویی ها با 5 مول در لیتر NaCl تکمیل شدند و یک شب در دمای 65 درجه سانتی گراد حرارت داده شدند تا پیوندهای عرضی پروتئین-DNA را برگردانند. ایمونوکمپلکس ها بیشتر با پروتئیناز بدون DNase و RNase تیمار شدند و DNA با استخراج فنل/کلروفرم و رسوب اتانول خالص سازی شد. PCR با پرایمرهای اختصاصی متناظر با یک توالی در ناحیه پروموتر ژن iNOS انسانی انجام شد (پرایمر p1: 5¶-GAGGGCTTTCCCA-GAACCAAG-3¶؛ آغازگر p2: GCTGGGCTACTGACCCAG-CAGTTCCAG-3¶). (دابلیر و همکاران، 2008)
مطالعات بیان EGFP
برای مطالعات بیان، سویه نوترکیب L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat#12 (Jena Bioscience، آلمان) با ژن EGFP (پروتئین فلورسنت سبز پیشرفته)، کروموزومی ssu یکپارچه، در محیط های مختلف همانطور که قبلا توضیح داده شد کشت شد و علاوه بر این با 100 میلی گرم لیتر تکمیل شد.-1 Nourseothricin (ینا Bioscience, آلمان). در طول کشت، 1 میلی لیتر نمونه، سانتریفیوژ (2000 × گرم، 20 درجه سانتی گراد، 10 دقیقه) برداشت و با محلول کلرید سدیم 9/0 درصد شستشو داده شد. پلت در بافر (20 میلی مولار HEPES، 5 میلی مولار EDTA، 2 میلی مولار DTT) معلق و با فراصوت با پردازنده اولتراسونیک متلاشی شد UP400S (کاربرد انرژی ∼ 400 Ws). بقایای سلولی به روش سانتریفیوژ (6000 × گرم، 4 درجه سانتی گراد، 5 دقیقه) حذف و با الکتروفورز ژل سدیم دودسیل سولفات – پلی آکریل آمید (SDS-PAGE) تحت شرایط احیا کننده طبق روش Laemmli (1970) با ژل های پلی آکرالامید 12.5 درصد مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. بیان EGFP در کشت آشفته مورد بررسی قرار گرفت. (فریچه و همکاران 2007)
تجزیه و تحلیل الکتروفورتیک DNA ژنومی E. coli EDL933 تحت 0 تا 15 دقیقه سونوگرافیکاسیون L نردبان DNA را نشان می دهد. (باسلت و همکاران 2008)
چند چاه صفحه ماسونیکاتور UIP400MTP برای برش DNA با توان بالا
رسوب ایمنی کروماتین
سنجش رسوب ایمنی کروماتین با استفاده از ChIP-IT انجام شدTm اکسپرس (Active Motif، Carlsbad، CA، ایالات متحده آمریکا) طبق دستورالعمل سازنده با برخی تغییرات. به طور خلاصه، پودوسیت های انسانی تمایز یافته با فرمالدئید 1 درصد به مدت 10 دقیقه در دمای اتاق ارتباط عرضی داشتند. سلول ها با PBS سرد یخ شسته شدند و با افزودن 125/0 مولار گلیسین به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق، واکنش تثبیت متوقف شد. سلول ها دوباره با PBS سرد یخی شسته شدند و از ظرف خراشیده شدند. سلول ها با سانتریفیوژ پلت شدند و در بافر لیز معلق شدند. پس از سانتریفیوژ، هسته های پلت شده در بافر برشی معلق شدند، به مدت 30 دقیقه روی یخ انکوبه شدند و کروماتین با فراصوت بریده شد، به عنوان مثال. UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH، Teltow، آلمان) با قدرت 25٪ 5 پالس 20 ثانیه ای هر کدام روی یخ به قطعات تقریبا 200-600 جفت باز. سپس کروماتین برش خورده سانتریفیوژ شد و مایع رویی جمع آوری شد. برای رسوبات ایمنی، 60 میکرولیتر کروماتین با 1 میکروگرم از آنتی بادی های Sp1 (سانتا کروز، سانتا کروز، کالیفرنیا، ایالات متحده آمریکا)، NF-κB p65 (Abcam، کمبریج، انگلستان) یا NF-κB p50 (Abcam) یا با IgG خرگوش (Zymed Laboratories)، به عنوان یک کنترل منفی، یک شب در دمای 4 درجه سانتی گراد با چرخش ملایم انکوبه شد. ایمونوکمپلکس های متصل به دانه های مغناطیسی با استفاده از پایه مغناطیسی جمع آوری و به طور گسترده شستشو داده شدند و پیوندهای عرضی پروتئین/DNA معکوس شدند و DNA برای آنالیز Real-time PCR شسته شد. (ریستولا و همکاران 2009)
آماده سازی EHEC DNA برای تجزیه و تحلیل آرایه تراشه
آرایش لیزات سلولی و DNA استخراج شده
پلت های باکتریایی معلق در PBS تا غلظت نهایی مورد نظر با مختل کننده سونوگرافی UP100H (Hielscher GmbH، آلمان) مجهز به میکرونوک MS1 (قطر 1 میلی متر). فرکانس کارکرد 30 کیلوهرتز و توان خروجی موثر 100 وات بود. در طول عمل، نمونه ها در حمام آب یخ خنک شدند، مخلوط و سانتریفیوژ شدند. نمونه ها برای مطالعات فلوسایتومتری مورد استفاده قرار گرفتند و برای جابجایی بعدی، نمونه ها تحت عملیات حرارتی (95 درجه سانتی گراد، 5 دقیقه) قرار گرفتند. لیزات های سلولی خام با مخلوطی از فنل:کلروفرم:ایزوآمیل الکل (25:24:1) فرآوری شدند. حجم مساوی از این مخلوط به نمونه لیزات اضافه شد، محلول به مدت 15 ثانیه به شدت گرگردان شد و در دمای 15000 گرم به مدت 2 دقیقه در دمای اتاق (RT) در حدود 22 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ شد. فاز آبی بالایی حاوی DNA ژنومی با دقت جدا و در یک لوله استریل جدید اپندورف جمع آوری شد.
پس از آن، نمونه ها برای قطعه قطعه DNA فراصوت شدند. مرحله فراصوت در همان شرایطی که در بالا توضیح داده شد محقق شد. به منظور بررسی اثرات قطعه قطعه شدن بر DNA ژنومی، نمونه ها با استفاده از الکتروفورز ژل آگارز مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند.
(…) نمونه های فراصوت شده قبلا به مدت 2.5 دقیقه پس از عملیات حرارتی و سانتریفیوژ تحت مرحله استخراج قرار گرفتند. DNA آزاد شده دو بار با مخلوط فنل:کلروفرم:ایزوآمیل الکل استخراج شد و پس از آن به مدت 0 تا 15 دقیقه تحت فراصوت دوم قرار گرفت. الکتروفورز ژل آگارز برای تعیین توزیع اندازه DNA تحت تکه تکه شدن اولتراسونیک پس از استخراج استفاده شد (شکل در سمت راست بالا). DNA بسیار تکه تکه شده از حضور یک اسمیر DNA به جای باندهای با وزن مولکولی بالا که از نمونه های فراصوت شده برای حذف شد 2.5 دقیقه یا بیشتر مشهود بود. فراصوت طولانی تر به تدریج کاهش طول قطعه به حدود 150 - 600 جفت باز, و فراصوت برای 15 دقیقه بیشتر این قطعات تخریب, به عنوان می تواند بیشتر توسط قسمت بالایی از لکه دیده می شود. بدین ترتیب, به طور متوسط اندازه قطعه DNA به تدریج با زمان فراصوت کاهش می یابد و درمان 5 دقیقه اجازه می دهد برای به دست آوردن اندازه قطعات DNA مناسب ترین برای سنجش آرایه تراشه. در نهایت، روش آماده سازی آنالیت DNA شامل 2 دقیقه اول درمان اولتراسونیک، استخراج DNA (2×) و پس از آن 5 دقیقه فراصوت ایجاد شد. (باسلت و همکاران 2008)
رسوب ایمنی کروماتین (ChIP)
سلول های HEK293 همانطور که در بالا توضیح داده شد کشت داده شدند و با 2 میلی مولار دی سوکسینیمیدیل-گلوتارات به مدت 45 دقیقه در دمای اتاق تثبیت شدند. سپس سلول ها دو بار با PBS شسته شدند. کروماتین به مدت 10 دقیقه در دمای اتاق با استفاده از فرمالدئید 1 درصد (حجمی/حجمی) به هم متصل شد و دو بار با PBS سرد یخی شسته شد. واکنش اتصال عرضی با انکوباسیون با گلیسین در غلظت نهایی 125/0 مولار به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق متوقف شد. پس از انکوباسیون با تریپسین، سلول ها از ظرف کشت سلولی خراشیده شدند و دو بار با PBS شسته شدند. پلت سلولی در بافر لیز (لوله های لیز 5 میلی مولار، pH 0/8، 85 میلی مولار KCl و 5/0 درصد (حجمی/حجمی) Nonidet P-40 معلق شد، به مدت 10 دقیقه روی یخ انکوبه و با هموژنایزر Dounce همگن شد. سپس هسته ها با سانتریفیوژ (3500 × گرم، 5 دقیقه، 4 درجه سانتی گراد) پلت و در بافر هسته ها (50 میلی مولار Tris-HCl، pH 1/8، 10 میلی مولار EDTA و 1 درصد (وزنی/حجمی) SDS) معلق شدند. هسته ها با فراصوت با سه پالس 20 ثانیه در یک مختل شدند سونیکاتور UP50H (Hielscher Ultraschall Technologie) در یک تنظیم از چرخه 0.5 و دامنه 30٪, بازده قطعات DNA ژنومی با اندازه فله 200 – 1000 جفت باز. برای ChIP، 50 گرم DNA 4 برابر در بافر رسوب ایمنی رقیق شد (7/16 میلی مولار Tris-HCl، pH 1/8، 167 میلی مولار NaCl، 2/1 میلی مولار EDTA، 1/1 درصد (حجمی/حجمی) تریتون X-100 و 01/0 درصد (وزنی/حجمی) SDS). (وایسکه و همکاران 2006)
آنالیز اصلاح هیستون با استفاده از رسوب ایمنی کروماتین (ChIP)
به طور خلاصه، 6 x 106 سلول ها دو بار با PBS شسته شدند و به مدت 15 دقیقه در دمای اتاق و در حضور فرمالدئید 5/0 درصد روی صفحه کشت به هم متصل شدند. واکنش اتصال عرضی با افزودن 125/0 مولار گلیسین متوقف شد. تمام مراحل بعدی در دمای 48 درجه سانتی گراد انجام شد. همه بافرها از پیش سرد شده و حاوی مهارکننده های پروتئاز (Complete Mini، Roche) بودند. سلول ها دو بار با PBS شسته و سپس خراشیده شدند. گلوله های جمع آوری شده در بافر لیز 1 میلی لیتر (1٪ SDS، 5 میلی مولار EDTA، 50 میلی مولار سه pH 8) حل شدند و در حمام اتانول سرد به مدت 10 سیکل در دامنه 100٪ با استفاده از یک سونیکاتور UP50H (هیلشر ، تلتو ، آلمان). قطعه قطعه شدن کروماتین در ژل آگارز 1 درصد مشاهده شد. قطعات به دست آمده در محدوده 200 تا 500 سرب بودند. کروماتین محلول با سانتریفیوژ نمونه های فراصوت در دمای 14000 گرم به مدت 10 دقیقه در دمای 48 درجه سانتیگراد به دست آمد. بخش محلول 10/1 در بافر رقیق سازی (1 درصد تریتون X-100، 2 میلی مولار EDTA، 20 میلی مولار سه pH 8 و 150 میلی مولار NaCl) رقیق و سپس در دمای 80 درجه سانتی گراد تا زمان استفاده نگهداری شد. (رودریگز و همکاران 2008)
| دستگاه | توان [W] | نوع | حجم [میلی لیتر] | ||
|---|---|---|---|---|---|
| UIP400MTP | 400 | برای میکروپلیت ها | از 6 | – | 3465 چاه | VialTweeter(ویال گروهی) | 200 | مستقل | 0.5 | – | 1.5 |
| UP50H | 50 | دستی یا ایستاده | 0.01 | – | 250 |
| UP100H | 100 | دستی یا ایستاده | 0.01 | – | 500 |
| تا 200 هرتز | 200 | دستی یا ایستاده | 0.1 | – | 1000 |
| 200 خیابان | 200 | ایستاده | 0.1 | – | 1000 |
| UP400St | 400 | ایستاده | 5.0 | – | 2000 |
| کاپ هورن | 200 | CupHorn، سونوراکتر | 10 | – | 200 |
| GDmini2 | 200 | سلول جریانی بدون آلاینده | |||
VialTweeter(ویال گروهی) برای آماده سازی نمونه اولتراسونیک، به عنوان مثال تکه تکه شدن پلاسمید (pDNA).
تماس با ما!? از ما بپرسید!
ادبیات/منابع
- Basselet P.، Wegrzyn G.، Enfors S.-O.، Gabig-Ciminska M. (2008): پردازش نمونه برای آنالیز مبتنی بر آرایه تراشه DNA اشریشیا کلی انتروهموراژیک (EHEC). کارخانه های سلول های میکروبی 7:29. 2008.
- Doublier S. ، Riganti Ch. ، Voena C. ، Costamagna C. ، Aldieri E. ، Pescarmona G. ، Ghigo D. ، Bosia A. (008): خاموش کردن RhoA مقاومت به دوکسوروبیسین را در سلول های سرطانی روده بزرگ انسان برمی گرداند. تحقیقات سرطان مولکولی 6(10)، 2008.
- Fredlund E. ، Gidlund A. ، Olsen M. ، Börjesson T. ، Spliid N.H.H. ، سیمونسون م. (2008): روش (ارزیابی) استخراج DNA فوزاریوم از میسلیوم و گندم برای کمی سازی PCR در زمان واقعی پایین دست و همبستگی با سطوح مایکوتوکسین. مجله روش های میکروبیولوژیکی 2008.
- Fritsche C. ، Sitz M. ، Weiland N. ، Breitling R. ، Pohl H.-D. (2007): خصوصیات رفتار رشد تارنتول لیشمانیا - یک سیستم بیان جدید برای پروتئین های نوترکیب. مجله میکروبیولوژی پایه 47 ، 2007. 384–393.
- Ristola M.، Arpiainen S.، Saleem M. A.، Mathieson P. W.، Welsh G. I.، Lehtonen S.، Holthöfer H. (2009): تنظیم ژن Neph3 در پودوسیت ها - نقش کلیدی فاکتورهای رونویسی NF-κB و Sp1. زیست شناسی مولکولی BMC 10:83 ، 2009.
- رودریگز جی ، ویوز ال ، جوردا م. ، مورالس سی ، مونوز م. ، وندرل ای ، پینادو م. آ. (2008): ردیابی گسترده ژنوم DNA بدون متیله Alu در سلول های طبیعی و سرطانی تکرار می شود. تحقیقات اسیدهای نوکلئیک جلد 36 ، شماره 3 ، 2008. 770-784.
- Weiske J. Huber O. (2006): پروتئین سه گانه هیستیدین Hint1 مستقل از فعالیت آنزیمی خود آپوپتوز را تحریک می کند. مجله شیمی بیولوژیکی. جلد 281 ، شماره 37 ، 2006. 27356–27366.
حقایقی که ارزش دانستن دارند
برش DNA چیست؟
برش DNA فرآیندی است که برای تکه تکه کردن مولکول های DNA به قطعات کوچکتر، معمولا از طریق نیروهای مکانیکی مانند فراصوت استفاده می شود. این تکنیک معمولا در زیست شناسی مولکولی برای آماده سازی DNA برای توالی یابی یا سایر تجزیه و تحلیل ها استفاده می شود و اطمینان حاصل می شود که قطعات از اندازه های قابل کنترل و سازگار هستند. برش رشته های طولانی DNA را بدون برش های خاص توالی مختل می کند، برخلاف هضم آنزیمی که در مکان های خاصی شکافته می شود.
برش DNA التراسونیک بر اساس حفره صوتی و نیروهای برشی هیدرودینامیکی آن است.
چرا DNA باید برش داده شود؟
DNA باید برش داده شود تا قطعاتی با اندازه های یکنواخت و قابل کنترل ایجاد شود که برای توالی یابی ، آماده سازی کتابخانه و سایر تکنیک های زیست شناسی مولکولی مناسب هستند. در کاربردهایی مانند توالی یابی نسل بعدی، DNA تکه تکه شده امکان تولید توالی های همپوشانی را فراهم می کند که می توانند به صورت محاسباتی برای بازسازی توالی DNA اصلی مونتاژ شوند. برش همچنین به تصادفی سازی DNA کمک می کند و امکان نمونه برداری جامع از مواد ژنتیکی را فراهم می کند، که برای تجزیه و تحلیل دقیق و شناسایی تغییرات ژنتیکی بسیار مهم است.
چگونه DNA ژنومی را برش دهیم؟
DNA ژنومی را می توان با اعمال نیروهای مکانیکی مانند فراصوت که از امواج اولتراسوند برای شکستن DNA استفاده می کند، برش داد. از طرف دیگر، از برش آنزیمی با اندونوکلئازها می توان برای تکه تکه شدن کنترل شده استفاده کرد. انتخاب روش و شرایط، مانند مدت زمان و شدت، به اندازه قطعه مورد نظر و کاربردهای پایین دست بستگی دارد.