لیز اولتراسونیک از نمونه های Drosophila melanogaster
دروزوفیلا ملانوگاستر به طور گسترده ای در آزمایشگاه ها به عنوان ارگانیسم مدل استفاده می شود. بنابراین مراحل آماده سازی قبل از آنالیز مانند لیز، اختلال سلولی، استخراج پروتئین و برش DNA نمونه های دروزوفیلا ملانوگاستر باید به طور مکرر انجام شود. dismembrators مافوق صوت قابل اعتماد و کارآمد هستند و می تواند مورد استفاده برای انجام وظایف مختلف مانند لیز ، استخراج پروتئین و یا تکه تکه شدن DNA در سهولت تنها با تنظیم پارامترهای فرایند مافوق صوت. هموژنایزرهای اولتراسونیک در نتیجه ابزارهای انعطاف پذیر با طیف گسترده ای از برنامه های کاربردی هستند.
لیز التراسونیک و استخراج پروتئین
لیز ، حل شدن سلول ، همگن سازی بافت و استخراج پروتئین وظایف معمولی برای dismembators مافوق صوت در آزمایشگاه های بیولوژیکی است. dismembrators مافوق صوت و مختل کننده سلول به خوبی مناسب برای همگن کردن بافت های حیوانی, حشرات (به عنوان مثال،, drosophila melanogaster, C. elegans) و یا نمونه های گیاهی. کاربردهای بعدی از سونوگرافی لیز سوسپانسیون سلولی و گلوله و همچنین استخراج پروتئین های داخل سلولی است.
لیز اولتراسونیک و استخراج پروتئین فرآیندهای بسیار قابل اعتماد و تکرارپذیر هستند که می توانند بر اساس پروتکل های تعیین شده انجام شوند. از آنجا که شدت فرایند مافوق صوت را می توان دقیقا از طریق پارامترهای فراصوت مانند دامنه، چرخه / حالت پالس، دما و حجم نمونه تنظیم، یک بار پروتکل های اثبات شده را می توان با همان نتیجه بارها و بارها تکرار کرد.
- بسیار کارآمد
- قابل تنظیم برای مواد نمونه خاص
- مناسب برای هر حجمی
- درمان غیر حرارتی
- نتایج قابل تکرار
- ساده و ایمن
تکه تکه شدن DNA و RNA التراسونیک
پس از لیز سلولی و استخراج پروتئین، یک مرحله رایج مورد نیاز در آماده سازی نمونه، برش و تکه تکه شدن DNA، RNA و کروماتین است، به عنوان مثال قبل از رسوب ایمنی کروماتین (ChIP). تکه تکه شدن DNA و RNA را می توان با شکستن پیوندهای کووالانسی که DNA را توسط نیروهای فیزیکی در کنار هم نگه می دارد، به طور قابل اعتماد به دست آورد. با استفاده از برش فیزیکی مانند فراصوت ، ابتدا رشته های DNA شکسته می شوند ، سپس DNA به قطعات کوچکتر تقسیم می شود.
تکه تکه شدن DNA اولتراسونیک قابل اعتماد و کارآمد در برش DNA به طول هدف است، به عنوان مثال 500bp (جفت باز). مزایای عمده تکه تکه شدن DNA اولتراسونیک شامل کنترل دقیق پارامترهای فرآیند اولتراسونیک و شدت است. پارامترهای فرآیند مافوق صوت را می توان با تنظیم شدت فراصوت، چرخه و زمان دقیق تنظیم کرد. این امکان ایجاد اندازه های DNA مورد نظر را فراهم می کند و طول DNA مورد نظر را می توان به طور قابل اعتماد تولید و همچنین تکثیر کرد. برش DNA اولتراسونیک نیز ایده آل برای ایجاد قطعات DNA با وزن مولکولی بالا است.
ultrasonicator تا 200 هرتز با microtip 2mm S26d2 برای فراصوت از نمونه های دروزوفیلا
پروتکل های لیز اولتراسونیک دروزوفیلا ملانوگاستر
در زیر شما می توانید پروتکل های مختلف برای لیز اولتراسونیک کمک, استخراج پروتئین, و DNA یا تکه تکه شدن کروماتین از نمونه های دروزوفیلا پیدا.
لیز اولتراسونیک برای سنجش رسوب ایمنی متقابل (CLIP).
سنجش CLIP همانطور که قبلا گزارش شده بود با برخی تغییرات انجام شد. تخمدان های تقریبا 20 میلی گرم از ماده های وحشی 0 تا 1 روزه به صورت فرابنفش (3 × 2000 میکروژول بر سانتی متر مربع) به هم متصل شدند و روی یخ در بافر RCB 1 میلی لیتر همگن شدند (50 میلی مولار HEPES pH 4/7، کلرید سدیم 200 میلی مولار، 5/2 میلی مولار کلرید منیزم، 1/0 درصد تریتون X-100، ساکارز 250 میلی مولار، 1 میلی مولار DTT، 1× مهارکننده های پروتئاز کامل بدون EDTA، 1 میلی مولار PMSF) با 300 واحد RNAseOUT مکمل شده و به مدت 30 دقیقه روی یخ قرار گرفتند. همگن بر روی یخ فراصوت شد, در 80٪ قدرت, پنج بار در 20 ثانیه پشت سر هم با 60 ثانیه استراحت در بین با استفاده از پردازنده مافوق صوت Hielscher UP100H (100 وات، 30 کیلوهرتز) و سانتریفیوژ (16000 × گرم به مدت 5 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد). عصاره محلول با 20 میکرولیتر دینابید پروتئین-G به مدت 20 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی گراد پیش پاک شد. پس از حذف نمونه ها برای ایمونوبلات و تعیین کمیت ورودی RNA (1 درصد)، HP1 با آنتی بادی ضد HP1 9A9 از عصاره 450 میکرولیتر پیش کلیر شده به صورت انکوباسیون به مدت 4 ساعت با 50 میکرولیتر داینابید پروتئین-G رسوب شد. رسوب های ایمنی 4 بار با RCB شسته شدند. برای شستشوی RNAهای رسوب ایمنی، دانه های پلت شده در 100 میکرولیتر آب تیمار شده با DEPC UltraPure به مدت 5 دقیقه جوشانده شدند. از RNA خالص شده به عنوان الگو برای سنتز cDNA با استفاده از oligo dT، هگزامرها تصادفی و SuperScript reverse transcriptase III طبق پروتکل سازنده استفاده شد.
(کاسال و همکاران 2019)
لیز اولتراسونیک برای سنجش رسوب ایمنی کروماتین
رسوب ایمنی کروماتین طبق روش توصیف شده توسط منه با تغییرات جزئی انجام شد. تخمدان های تقریبا 20 میلی گرم از ماده های وحشی 0 تا 1 روزه در 1 میلی لیتر بافر NEB (10 میلی مولار HEPES-Na در pH 8.0، 10 میلی مولار NaCl، 0.1 میلی مولار EGTA-Na در pH 8، 0.5 میلی مولار EDTA-Na در pH 8، 1 میلی مولار DTT، 0.5 درصد NP-40، 0.5 میلی مولار اسپرمیدین، 0.15 میلی مولار اسپرمین، 1× مهارکننده پروتئاز کامل بدون EDTA) با هموژنایزر / پراکنده کننده غوطه وری 1 دقیقه (در 3000 دور در دقیقه). هموژنات به یک قطره شیشه ای از پیش سرد شده منتقل شد و 15 ضربه کامل با یک گلدان محکم اعمال شد. سپس هسته های آزاد در دمای 6000xg به مدت 10 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی گراد سانتریفیوژ شدند. پلت های حاوی هسته در 1 میلی لیتر NEB معلق شدند و در دمای 20000 × گرم به مدت 20 دقیقه بر روی گرادیان ساکارز سانتریفیوژ شدند (65/0 میلی لیتر از 6/1 مولار ساکارز در NEB، 35/0 میلی لیتر از 8/0 مولار ساکارز در NEB). پلت در 1 میلی لیتر NEB و فرمالدئید تا غلظت نهایی 1 درصد معلق شد. هسته ها به مدت 10 دقیقه در دمای اتاق به هم متصل شدند و با افزودن 1/10 حجم 1.375 مولار گلیسین خاموش شدند. هسته ها با سانتریفیوژ در دمای 6000 × گرم به مدت 5 دقیقه جمع آوری شدند. هسته ها دو بار در 1 میلی لیتر NEB شسته شدند و در 1 میلی لیتر بافر لیز (15 میلی مولار HEPES-Na در pH 6/7، 140 میلی مولار NaCl، 5/0 میلی مولار EGTA، 1 میلی مولار EDTA در pH 8، 1 درصد تریتون X-100، 5/0 میلی مولار DTT، 1/0 درصد سدیم دئوکسی کولات، 1/0 درصد SDS، 5/0 درصد N-lauroylsarcosine و 1× مهارکننده پروتئاز کامل بدون EDTA) معلق شدند. هسته ها با استفاده از پردازنده مافوق صوت Hielscher فراصوت شدند UP100H (100 وات، 30 کیلوهرتز) شش بار به مدت 20 ثانیه روشن و 1 دقیقه روی یخ. هسته های فراصوت در دمای 13000 × گرم به مدت 4 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی گراد سانتریفیوژ شدند. اکثر کروماتین فراصوت 500 تا 1000 جفت باز (bp) در طول بود. برای هر رسوب ایمنی، 15 میکروگرم کروماتین در حضور 10 میکروگرم آنتی بادی مونوکلونال HP1 9A9 (3 ساعت در دمای 4 درجه سانتی گراد در یک چرخ چرخان) انکوبه شد. سپس 50 میکرولیتر پروتئین داینابید G اضافه شد و انکوباسیون شبانه در دمای 4 درجه سانتی گراد ادامه یافت. مایع رویی ها دور ریخته شدند و نمونه ها دو بار در بافر لیز (هر شستشو 15 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی گراد) و دو بار در بافر TE (1 میلی مولار EDTA، 10 میلی مولار TrisHCl در pH 8) شستشو داده شدند. کروماتین در دو مرحله از مهره ها شسته شد. ابتدا در 100 میکرولیتر بافر Eluition 1 (10 میلی مولار EDTA، 1٪ SDS، 50 میلی مولار TrisHCl در pH 8) در دمای 65 درجه سانتیگراد به مدت 15 دقیقه، به دنبال سانتریفیوژ و بازیابی مایع رویی. ماده دانه ها در غلظت 100 میکرولیتر TE + 67/0 درصد SDS مجددا استخراج شدند. لوئات ترکیبی (200 میکرولیتر) یک شب در دمای 65 درجه سانتی گراد برای معکوس کردن پیوندهای عرضی انکوبه شد و با 50 میکروگرم در میلی لیتر RNaseA به مدت 15 دقیقه در دمای 65 درجه سانتی گراد و با 500 میکروگرم در میلی لیتر پروتئیناز پتاسیم به مدت 3 ساعت در دمای 65 درجه سانتی گراد تیمار شد. نمونه ها استخراج فنل-کلروفرم و اتانول رسوب کردند. DNA در 25 میکرولیتر آب معلق شد. برای به حداکثر رساندن آنالیزهای مولکولی با DNA immunoprecipited، ژن های کاندید از طریق یک پروتکل دوبلکس-PCR بهینه شده با استفاده از دو مجموعه مختلف از آغازگرها با دمای ذوب مشابه در یک واکنش واحد، به صورت جفت تکثیر شدند.
(کاسال و همکاران 2019)
UP200St TD_CupHorn برای فراصوت غیر مستقیم نمونه هایی مانند DNA و برش کروماتین
مختل کننده های سلول اولتراسونیک با کارایی بالا برای نمونه های بیولوژیکی
Hielscher مافوق صوت شریک طولانی با تجربه خود را که آن را به ultrasonicators با کارایی بالا برای اختلال سلول می آید ، لیز ، استخراج پروتئین ، DNA ، RNA ، و تکه تکه شدن کروماتین و همچنین سایر مراحل آماده سازی نمونه قبل از تجزیه و تحلیل است. ارائه یک نمونه کارها جامع از هموژنایزرهای آزمایشگاه اولتراسونیک و واحدهای آماده سازی نمونه، Hielscher دارای دستگاه اولتراسونیک ایده آل برای کاربرد بیولوژیکی و مورد نیاز خود را.
کلاسیک پروب نوع ultrasonicator با میکرو نوک مانند 200 خیابان (200 وات؛ تصویر سمت چپ را ببینید) یا یکی از واحدهای آماده سازی نمونه اولتراسونیک VialTweeter(ویال گروهی) یا UP200St_TD_CupHorn با VialHolder مدل های مورد علاقه در آزمایشگاه های تحقیقاتی و تحلیلی هستند. پروب اولتراسونیک کلاسیک ایده آل است، زمانی که نمونه های کمتری باید لیز شوند، استخراج یا تکه تکه شوند. واحدهای آماده سازی نمونه VialTweeter و UP200St_TD_CupHorn به ترتیب برای فراصوت همزمان تا 10 یا 5 ویال اجازه می دهند.
اگر تعداد نمونه های بالا (به عنوان مثال صفحات 96 چاهی، صفحات میکروتیتر و غیره) باید پردازش شود، UIP400MTP راه اندازی فراصوت ایده آل است. UIP400MTP مانند یک شاخ بزرگ تر عمل می کند که با آب پر شده و فضای کافی برای نگهداری صفحات میکرو چاه دارد. طراحی شده توسط یک پردازنده مافوق صوت 400 وات قدرتمند، UIP400MTP ارائه فراصوت بسیار یکنواخت و شدید از صفحات چند خوبی به منظور مختل کردن سلول، لیز نمونه، حل گلوله ها، استخراج پروتئین ها و یا برشی DNA.
کنترل دقیق از طریق نرم افزار هوشمند
همه راه حل های فراصوت Hielscher از 200 وات به بالا با یک صفحه نمایش لمسی رنگی دیجیتال و یک نرم افزار هوشمند مجهز. از طریق پروتکل داده های هوشمند تمام پارامترهای فرآیند مافوق صوت به طور خودکار به عنوان فایل CSV بر روی یک کارت SD ساخته شده به محض اینکه ultrasonicator شروع شده است ذخیره می شود. این امر تحقیق و پروتکل سازی را بسیار راحت تر می کند. پس از آزمایشات فراصوت و یا آماده سازی نمونه، شما به سادگی می توانید پارامترهای فراصوت از هر اجرای فراصوت را بررسی و مقایسه آنها.
از طریق منوی بصری ، پارامترهای متعددی را می توان قبل از فراصوت از پیش تعیین کرد: به عنوان مثال ، برای کنترل دما در نمونه و جلوگیری از تخریب حرارتی آن ، می توان حد بالایی از دمای نمونه را تنظیم کرد. سنسور دما قابل اتصال، که همراه با واحد اولتراسونیک، می دهد بازخورد پردازنده اولتراسونیک در دمای فراصوت واقعی. هنگامی که حد درجه حرارت بالا رسیده است، دستگاه اولتراسونیک مکث می کند تا حد پایین تر از مجموعه ∆T رسیده است و شروع می شود و سپس به طور خودکار فراصوت دوباره.
اگر فراصوت با یک ورودی انرژی خاص مورد نیاز است، شما می توانید انرژی مافوق صوت نهایی از اجرای فراصوت از پیش تنظیم. البته، ضربان اولتراسونیک و حالت چرخه را می توان به صورت جداگانه تنظیم کرد, هم.
برای استفاده مجدد از پارامترهای فراصوت موفق ترین خود ، می توانید حالت های مختلف فراصوت (به عنوان مثال زمان فراصوت ، شدت ، حالت چرخه و غیره) را به عنوان حالت های از پیش تعیین شده ذخیره کنید ، به طوری که آنها می توانند آسان و به سرعت دوباره شروع شوند.
برای راحتی بیشتر عملیاتی، تمام واحدهای اولتراسونیک دیجیتال را می توان از طریق کنترل از راه دور مرورگر در هر مرورگر مشترک (به عنوان مثال، InternetExplorer، Safari، Chrome و غیره) کار کرد. اتصال LAN یک راه اندازی ساده plug-n-play است و نیازی به نصب نرم افزار اضافی ندارد.
ما در Hielscher می دانیم که فراصوت موفقیت آمیز نمونه های بیولوژیکی نیاز به دقت و تکرارپذیری. از این رو، ما ultrasonicators ما به عنوان دستگاه های هوشمند با تمام ویژگی های است که قادر می سازد کارآمد، قابل اعتماد، تکرارپذیر و راحت آماده سازی نمونه.
جدول زیر به شما نشانه ای از ظرفیت پردازش تقریبی سیستم های اولتراسونیک ما از میکرو نوک مافوق صوت و هموژنایزرهای اولتراسونیک کلاسیک به ultrasonicators MultiSample برای آماده سازی راحت و قابل اعتماد از نمونه های متعدد می دهد:
| حجم دسته ای | نرخ جریان | دستگاه های توصیه شده |
|---|---|---|
| صفحات 96 چاه / میکروتیتر | ن.ا. | UIP400MTP |
| 10 ویال à 0.5 تا 1.5 میلی لیتر | ن.ا. | VialTweeter در UP200St |
| CupHorn برای فراصوت غیر مستقیم، به عنوان مثال تا 5 ویال | ن.ا. | UP200St_TD_CupHorn |
| 00.01 تا 250 میلی لیتر | 5 تا 100 میلی لیتر در دقیقه | UP50H |
| 00.01 تا 500 میلی لیتر | 10 تا 200 میلی لیتر در دقیقه | UP100H |
| 00.02 تا 1 لیتر | 20 تا 400 میلی لیتر در دقیقه | تا 200 هرتز / 200 خیابان |
| 10 تا 2000 میلی لیتر | 20 تا 400 میلی لیتر در دقیقه | تا 200 هرتز، UP400St |
| 0.25 تا 5 لیتر | 00.05 تا 1 لیتر در دقیقه | UIP500hdT |
تماس با ما! / از ما بپرسید!
واحد آماده سازی چند نمونه اولتراسونیک VialTweeter(ویال گروهی) اجازه می دهد تا برای فراصوت همزمان تا 10 ویال. با دستگاه گیره دار VialPress، حداکثر 4 لوله اضافی را می توان به جلو برای فراصوت شدید فشار داد.
حقایقی که ارزش دانستن دارند
متابولومیک
متابولومیک مطالعه مولکول های کوچکی است که به عنوان متابولیت ها شناخته می شوند و در سلول ها ، مایعات زیستی ، بافت ها یا ارگانیسم ها وجود دارند. این مولکول های کوچک و فعل و انفعالات آنها در یک سیستم بیولوژیکی تحت عنوان چتر "متابولوم" خلاصه می شوند و زمینه تحقیق متابولومیک نامیده می شود. تحقیقات متابولوم ارتباط نزدیکی با حوزه پزشکی دقیق دارد که به سرعت در حال ظهور است. درک متابولوم و ارتباط آن با بیماری های مختلف به توسعه استراتژی های پیشگیری از بیماری و مراقبت بالینی کمک می کند و در عین حال تنوع فردی در محیط، سبک زندگی، ژنتیک و فنوتیپ مولکولی وجود دارد. به منظور انتشار مولکول های متابولیت از سلول ها، امواج فراصوت است که اغلب در آزمایشگاه های بیولوژیکی برای آماده سازی نمونه قبل از تجزیه و تحلیل مانند اختلال سلولی، لیز و استخراج پروتئین ها، لیپیدها و مولکول های دیگر استفاده می شود.
ادبیات / منابع
- Casale, A.M.; Cappucci, U.; Fanti, L.; Piacentini, L. (2019): Heterochromatin protein 1 (HP1) is intrinsically required for post-transcriptional regulation of Drosophila Germline Stem Cell (GSC) maintenance. Sci Rep 9, 4372 (2019).
- Ristola, M.; Arpiainen, S., Saleem, M.A.; Mathieson, P.W.; Welsh, G.I.; Lehtonen, S.; Holthöfer, H.(2009): Regulation of Neph3 gene in podocytes – key roles of transcription factors NF-κB and Sp1. BMC Molecular Biol 10, 83 (2009).
- Kharchenko, P.V: et al. (2011): Comprehensive analysis of the chromatin landscape in Drosophila. Nature. 2011 Mar 24; 471(7339): 480–485.
اولتراسونیک با کارایی بالا! محدوده محصول Hielscher را پوشش می دهد طیف کامل از ultrasonicator آزمایشگاه جمع و جور بیش از واحدهای نیمکت بالا به سیستم های اولتراسونیک تمام صنعتی.