لیز فراصوتی نمونه‌های Drosophila Melanogaster
Drosophila melanogaster به‌طور گسترده در آزمایشگاه‌ها به‌عنوان جاندار مدل استفاده می‌شود. بنابراین، مراحل آماده‌سازی پیش از آنالیز، مانند لیز، تخریب سلولی، استخراج پروتئین و برش DNA نمونه‌های Drosophila melanogaster، باید به‌دفعات انجام شوند. دستگاه‌های متلاشی‌کنندهٔ فراصوتی قابل‌اعتماد و کارآمد هستند و تنها با تنظیم پارامترهای فرایند فراصوتی می‌توان از آن‌ها برای انجام آسان کارهای گوناگونی مانند لیز، استخراج پروتئین یا قطعه‌قطعه‌سازی DNA استفاده کرد. ازاین‌رو، هموژنایزرهای فراصوتی ابزارهایی انعطاف‌پذیر با طیف گسترده‌ای از کاربردها هستند.
لیز فراصوتی و استخراج پروتئین
لیز، محلول‌سازی سلول‌ها، همگن‌سازی بافت و استخراج پروتئین از کارهای معمول دستگاه‌های متلاشی‌کنندهٔ فراصوتی در آزمایشگاه‌های زیست‌شناسی هستند. دستگاه‌های متلاشی‌کنندهٔ فراصوتی و تخریب‌کنندهٔ سلولی برای همگن‌سازی بافت‌های جانوری، حشرات (مانند Drosophila melanogaster، C. elegans) یا نمونه‌های گیاهی بسیار مناسب‌اند. از دیگر کاربردهای فراصوت‌دهی می‌توان به لیز سوسپانسیون‌ها و رسوب‌های سلولی و نیز استخراج پروتئین‌های درون‌سلولی اشاره کرد.
لیز فراصوتی و استخراج پروتئین فرایندهایی بسیار قابل‌اعتماد و بازتولیدپذیر هستند که می‌توان آن‌ها را بر پایهٔ پروتکل‌های تثبیت‌شده انجام داد. ازآنجاکه شدت فرایند فراصوتی را می‌توان با پارامترهای فراصوت‌دهی، مانند دامنه، حالت چرخه‌ای / پالسی، دما و حجم نمونه، به‌دقت تنظیم کرد، پروتکل‌هایی که کارایی آن‌ها تأیید شده است می‌توانند بارها با نتیجه‌ای یکسان تکرار شوند.
- کارایی بسیار بالا
- قابل‌تنظیم متناسب با مادهٔ خاص نمونه
- مناسب برای هر حجم
- تیمار غیرحرارتی
- نتایج بازتولیدپذیر
- ساده و ایمن
قطعه‌قطعه‌سازی فراصوتی DNA و RNA
پس از لیز سلولی و استخراج پروتئین، یکی از مراحل معمول و ضروری در آماده‌سازی نمونه، برش و قطعه‌قطعه‌سازی DNA، RNA و کروماتین است؛ برای مثال، پیش از رسوب‌دهی ایمنی کروماتین (ChIP). قطعه‌قطعه‌سازی DNA و RNA را می‌توان با شکستن پیوندهای کووالانسی نگه‌دارندهٔ DNA به‌وسیلهٔ نیروهای فیزیکی، به‌طور قابل‌اعتماد انجام داد. با استفاده از برش فیزیکی مانند فراصوت‌دهی، ابتدا رشته‌های DNA شکسته می‌شوند و سپس DNA به قطعات کوچک‌تر تقسیم می‌شود.
قطعه‌قطعه‌سازی فراصوتی DNA روشی قابل‌اعتماد و کارآمد برای برش DNA تا طول هدف، مثلاً 500bp (جفت‌باز)، است. از مزایای اصلی قطعه‌قطعه‌سازی فراصوتی DNA می‌توان به کنترل دقیق پارامترها و شدت فرایند فراصوتی اشاره کرد. پارامترهای فرایند فراصوتی را می‌توان با تنظیم دقیق شدت، چرخه‌ها و زمان فراصوت‌دهی تنظیم کرد. این امر تولید DNA با اندازه‌های دلخواه را امکان‌پذیر می‌کند و می‌توان DNA با طول هدف را به‌طور قابل‌اعتماد تولید و بازتولید کرد. برش فراصوتی DNA برای تولید قطعات DNA با وزن مولکولی بالا نیز ایدئال است.
سونیکاتور UP200Ht با میکروتیپ 2mm مدل S26d2 برای فراصوت‌دهی نمونه‌های Drosophila
پروتکل‌های لیز فراصوتی Drosophila melanogaster
در ادامه، پروتکل‌های گوناگونی برای لیز، استخراج پروتئین و قطعه‌قطعه‌سازی DNA یا کروماتین نمونه‌های Drosophila به کمک فراصوت ارائه شده است.
لیز فراصوتی برای آزمون رسوب‌دهی ایمنی همراه با اتصال عرضی (CLIP)
آزمون CLIP با برخی تغییرات مطابق گزارش قبلی انجام شد. حدود 20 mg تخمدان از ماده‌های تیپ وحشی با سن 0 تا 1 روز با پرتو UV اتصال عرضی داده شد (3 × 2000 μJ/cm2)، روی یخ در 1 mL بافر RCB (50 mM HEPES با pH 7٫4، 200 mM NaCl، 2٫5 mM MgCl2، 0٫1% Triton X-100، 250 mM ساکارز، 1 mM DTT، 1× مهارکننده‌های پروتئاز Complete فاقد EDTA، 1 mM PMSF) حاوی 300 U RNAseOUT همگن شد و به‌مدت 30 min روی یخ قرار گرفت. هموژنات روی یخ، با توان 80%، پنج بار در پالس‌های 20 s با فاصلهٔ استراحت 60 s و با استفاده از پردازشگر فراصوتی Hielscher UP100H (100 W, 30 kHz) فراصوت‌دهی شد و سانتریفیوژ شد (16٬000 × g به‌مدت 5 min در 4°C). عصارهٔ محلول با 20 μl از Protein-G dynabeads به‌مدت 20 min در 4°C پیش‌پاک‌سازی شد. پس از برداشتن نمونه‌ها برای ایمونوبلاتینگ و اندازه‌گیری کمی RNA ورودی (1%)، HP1 از 450 μl عصارهٔ پیش‌پاک‌سازی‌شده، با آنتی‌بادی anti-HP1 9A9 و از طریق انکوباسیون به‌مدت 4 h با 50 μl از Protein-G dynabeads، رسوب‌دهی ایمنی شد. رسوب‌های ایمنی 4 بار با RCB شسته شدند. برای واجذب RNAهای رسوب‌داده‌شده به روش ایمنی، مهره‌های ته‌نشین‌شده در 100 μL آب UltraPure تیمارشده با DEPC به‌مدت 5 min جوشانده شدند. مقدار 900 μL معرف Qiazol به مایع رویی بازیابی‌شده برای آماده‌سازی RNA افزوده شد. RNA خالص‌شده مطابق پروتکل سازنده به‌عنوان الگو برای سنتز cDNA با استفاده از oligo dT، هگزامرهای تصادفی و آنزیم رونوشت‌بردار معکوس SuperScript III به کار رفت.
(Cassale et al. 2019)
لیز فراصوتی برای آزمون رسوب‌دهی ایمنی کروماتین
رسوب‌دهی ایمنی کروماتین مطابق روش توصیف‌شده توسط Menet و با تغییرات جزئی انجام شد. حدود 20 mg تخمدان از ماده‌های تیپ وحشی با سن 0 تا 1 روز در 1 mL بافر NEB (10 mM HEPES-Na با pH 8٫0، 10 mM NaCl، 0٫1 mM EGTA-Na با pH 8، 0٫5 mM EDTA-Na با pH 8، 1 mM DTT، 0٫5% NP-40، 0٫5 mM اسپرمیدین، 0٫15 mM اسپرمین، 1× مهارکننده‌های پروتئاز Complete فاقد EDTA) با یک هموژنایزر / دیسپرسر غوطه‌وری به‌مدت 1 min (در 3000 rpm) همگن شد. هموژنات به هموژنایزر شیشه‌ای داونس ازپیش‌سردشده منتقل شد و 15 حرکت کامل با دسته‌هاون با لقی کم اعمال شد. سپس هسته‌های آزاد در 6000xg به‌مدت 10 min در 4°C سانتریفیوژ شدند. رسوب‌های حاوی هسته در 1 mL از NEB مجدداً معلق شدند و در 20٬000 × g به‌مدت 20 min روی گرادیان ساکارز (0٫65 mL ساکارز 1٫6 M در NEB، 0٫35 mL ساکارز 0٫8 M در NEB) سانتریفیوژ شدند. رسوب در 1 mL از NEB و فرمالدهید با غلظت نهایی 1% مجدداً معلق شد. هسته‌ها به‌مدت 10 min در دمای اتاق اتصال عرضی داده شدند و واکنش با افزودن 1/10 vol گلیسین 1٫375 M متوقف شد. هسته‌ها با سانتریفیوژ در 6000 × g به‌مدت 5 min جمع‌آوری شدند. هسته‌ها دو بار در 1 mL از NEB شسته شدند و در 1 mL بافر لیز (15 mM HEPES-Na با pH 7٫6، 140 mM NaCl، 0٫5 mM EGTA، 1 mM EDTA با pH 8، 1% Triton X-100، 0٫5 mM DTT، 0٫1% دئوکسی‌کولات سدیم، 0٫1% SDS، 0٫5% N-لائوریل‌سارکوزین و 1× مهارکننده‌های پروتئاز Complete فاقد EDTA) مجدداً معلق شدند. هسته‌ها با استفاده از پردازشگر فراصوتی Hielscher UP100H (100 W, 30 kHz) در شش نوبت، هر نوبت شامل 20 s فراصوت‌دهی و 1 min نگهداری روی یخ، فراصوت‌دهی شدند. هسته‌های فراصوت‌دهی‌شده در 13٬000 × g به‌مدت 4 min در 4°C سانتریفیوژ شدند. طول بیشتر کروماتین فراصوت‌دهی‌شده 500 تا 1000 جفت‌باز (bp) بود. برای هر رسوب‌دهی ایمنی، 15 μg کروماتین در حضور 10 μg آنتی‌بادی مونوکلونال HP1 9A9 انکوبه شد (3 h در 4°C روی چرخ گردان). سپس 50 μl از dynabeads protein G افزوده شد و انکوباسیون در 4°C طی شب ادامه یافت. مایعات رویی دور ریخته شدند و نمونه‌ها دو بار در بافر لیز (هر شست‌وشو 15 min در 4 °C) و دو بار در بافر TE (1 mM EDTA، 10 mM TrisHCl با pH 8) شسته شدند. کروماتین در دو مرحله از مهره‌ها واجذب شد؛ ابتدا در 100 μl بافر واجذب 1 (10 mM EDTA، 1% SDS، 50 mM TrisHCl با pH 8) در 65°C به‌مدت 15 min، و سپس سانتریفیوژ و بازیابی مایع رویی انجام شد. مواد روی مهره‌ها مجدداً در 100 μl از TE + 0٫67% SDS استخراج شدند. محلول واجذب ترکیبی (200 μl) برای برگشت اتصال‌های عرضی طی شب در 65°C انکوبه شد و با 50 μg/ml RNaseA به‌مدت 15 min در 65°C و با 500 μg/ml پروتئیناز K به‌مدت 3 h در 65°C تیمار شد. نمونه‌ها با فنول–کلروفرم استخراج و با اتانول رسوب داده شدند. DNA در 25 μl آب مجدداً معلق شد. برای به‌حداکثررساندن آنالیزهای مولکولی با DNA رسوب‌داده‌شده به روش ایمنی، ژن‌های کاندید به‌صورت جفتی از طریق یک پروتکل بهینه‌شدهٔ duplex-PCR، با استفاده از دو مجموعهٔ متفاوت از پرایمرها با دماهای ذوب مشابه در یک واکنش، تکثیر شدند.
(Casale et al. 2019)
UP200St TD_CupHorn برای فراصوت‌دهی غیرمستقیم نمونه‌ها، مانند برش DNA و کروماتین
دستگاه‌های تخریب سلولی فراصوتی با عملکرد بالا برای نمونه‌های زیستی
Hielscher Ultrasonics در زمینهٔ سونیکاتورهای با عملکرد بالا برای تخریب سلولی، لیز، استخراج پروتئین، قطعه‌قطعه‌سازی DNA، RNA و کروماتین و نیز دیگر مراحل آماده‌سازی نمونه پیش از آنالیز، شریک باسابقهٔ شماست. Hielscher با ارائهٔ مجموعه‌ای جامع از هموژنایزرهای فراصوتی آزمایشگاهی و واحدهای آماده‌سازی نمونه، دستگاه فراصوتی ایدئال برای کاربرد زیستی و نیازهای شما را در اختیار دارد.
سونیکاتور پروبی متداول با میکروتیپ، مانند UP200St (200W؛ تصویر سمت چپ را ببینید) یا یکی از واحدهای آماده‌سازی فراصوتی نمونه VialTweeter یا UP200ST_TD_CupHorn با VialHolder، از مدل‌های محبوب در آزمایشگاه‌های پژوهشی و آنالیز هستند. پروب فراصوتی متداول هنگامی ایدئال است که تعداد کمتری نمونه نیاز به لیز، استخراج یا قطعه‌قطعه‌سازی داشته باشند. واحدهای آماده‌سازی نمونهٔ VialTweeter و UP200St_TD_CupHorn به‌ترتیب امکان فراصوت‌دهی هم‌زمان تا 10 یا 5 ویال را فراهم می‌کنند.
اگر تعداد زیادی نمونه (مانند پلیت‌های 96 خانه‌ای، پلیت‌های میکروتیتر و غیره) باید پردازش شوند، دستگاه UIP400MTP سامانهٔ ایدئال فراصوت‌دهی است. UIP400MTP مانند یک کاپ‌هورن بزرگ‌تر عمل می‌کند که با آب پر می‌شود و فضای کافی برای جای‌دادن پلیت‌های میکرووِل دارد. UIP400MTP با بهره‌گیری از یک پردازشگر فراصوتی پرقدرت با توان 400 وات، فراصوت‌دهی بسیار یکنواخت و شدیدی را برای پلیت‌های چندخانه‌ای فراهم می‌کند تا سلول‌ها تخریب، نمونه‌ها لیز، رسوب‌ها محلول، پروتئین‌ها استخراج یا DNA برش داده شود.
کنترل دقیق با نرم‌افزار هوشمند
تمام راهکارهای فراصوت‌دهی Hielscher از 200 وات به بالا به صفحه‌نمایش لمسی رنگی دیجیتال و نرم‌افزار هوشمند مجهز هستند. با ثبت هوشمند داده‌ها، به‌محض راه‌اندازی سونیکاتور، همهٔ پارامترهای فرایند فراصوتی به‌طور خودکار در قالب فایل CSV روی کارت SD داخلی ذخیره می‌شوند. این قابلیت، پژوهش و ثبت مستندات را بسیار آسان‌تر می‌کند. پس از آزمایش‌های فراصوت‌دهی یا آماده‌سازی نمونه، می‌توانید به‌سادگی پارامترهای هر نوبت فراصوت‌دهی را بررسی و با یکدیگر مقایسه کنید.
از طریق منوی ساده و قابل‌فهم، می‌توان پارامترهای متعددی را پیش از فراصوت‌دهی از پیش تنظیم کرد: برای مثال، برای کنترل دمای نمونه و جلوگیری از تخریب حرارتی آن، می‌توان حد بالایی برای دمای نمونه تعیین کرد. حسگر دمای قابل‌اتصال که همراه واحد فراصوتی عرضه می‌شود، دمای واقعی فراصوت‌دهی را به پردازشگر فراصوتی بازخورد می‌دهد. هنگامی که دما به حد بالایی می‌رسد، دستگاه فراصوتی متوقف می‌شود تا دما به حد پایینی ∆T تنظیم‌شده برسد و سپس فراصوت‌دهی را به‌طور خودکار از سر می‌گیرد.
اگر فراصوت‌دهی با انرژی ورودی مشخصی لازم باشد، می‌توانید انرژی نهایی فراصوتی نوبت فراصوت‌دهی را از پیش تنظیم کنید. البته، پالس‌دهی فراصوتی و حالت چرخه‌ای نیز به‌طور جداگانه قابل‌تنظیم هستند.
برای استفادهٔ مجدد از موفق‌ترین پارامترهای فراصوت‌دهی خود، می‌توانید حالت‌های گوناگون فراصوت‌دهی (مانند زمان فراصوت‌دهی، شدت، حالت چرخه‌ای و غیره) را به‌صورت حالت‌های ازپیش‌تنظیم‌شده ذخیره کنید تا بتوان آن‌ها را به‌آسانی و به‌سرعت دوباره اجرا کرد.
برای سهولت بیشتر در کار، تمام واحدهای فراصوتی دیجیتال را می‌توان از طریق کنترل از راه دور مرورگری در هر مرورگر رایج (مانند InternetExplorer، Safari، Chrome و غیره) به کار گرفت. اتصال LAN با راه‌اندازی سادهٔ وصل‌و‌اجرا انجام می‌شود و نیازی به نصب نرم‌افزار اضافی ندارد.
ما در Hielscher می‌دانیم که فراصوت‌دهی موفق نمونه‌های زیستی به دقت و تکرارپذیری نیاز دارد. به همین دلیل، سونیکاتورهای خود را به‌صورت دستگاه‌های هوشمند با تمام قابلیت‌های لازم برای آماده‌سازی کارآمد، قابل‌اعتماد، بازتولیدپذیر و آسان نمونه طراحی کرده‌ایم.
جدول زیر نمایی از ظرفیت تقریبی پردازش سامانه‌های فراصوتی ما، از میکروتیپ‌های فراصوتی و هموژنایزرهای فراصوتی متداول تا سونیکاتورهای MultiSample، برای آماده‌سازی آسان و قابل‌اعتماد تعداد زیادی نمونه ارائه می‌دهد:
| حجم بچ | دبی | دستگاه‌های پیشنهادی |
|---|---|---|
| پلیت‌های 96 خانه‌ای / میکروتیتر | کاربرد ندارد | UIP400MTP |
| 10 ویال، هرکدام با حجم 0٫5 تا 1٫5mL | کاربرد ندارد | VialTweeter متصل به UP200St |
| CupHorn برای فراصوت‌دهی غیرمستقیم، مثلاً تا 5 ویال | کاربرد ندارد | UP200St_TD_CupHorn |
| 0٫01 تا 250mL | 5 تا 100mL/min | UP50H |
| 0٫01 تا 500mL | 10 تا 200mL/min | UP100H |
| 0٫02 تا 1L | 20 تا 400mL/min | UP200Ht / UP200St |
| 10 تا 2000mL | 20 تا 400mL/min | UP200Ht, UP400St |
| 0٫25 تا 5L | 0٫05 تا 1L/min | UIP500hdT |
با ما تماس بگیرید! / از ما بپرسید!
واحد فراصوتی آماده‌سازی چندنمونه‌ای VialTweeter امکان فراصوت‌دهی هم‌زمان تا 10 ویال را فراهم می‌کند. با ابزار گیره‌ای VialPress می‌توان تا 4 لولهٔ دیگر را برای فراصوت‌دهی شدید به بخش جلویی فشرد.
دانستنی‌های مفید
متابولومیکس
متابولومیکس مطالعهٔ مولکول‌های کوچکی است که متابولیت نام دارند و درون سلول‌ها، مایعات زیستی، بافت‌ها یا جانداران وجود دارند. این مولکول‌های کوچک و برهم‌کنش‌های آن‌ها در یک سامانهٔ زیستی، در اصطلاح جامع «متابولوم» گنجانده می‌شوند و حوزهٔ پژوهش آن‌ها متابولومیکس نام دارد. پژوهش متابولوم ارتباط نزدیکی با حوزهٔ به‌سرعت درحال‌ظهور پزشکی دقیق دارد. شناخت متابولوم و ارتباط آن با بیماری‌های گوناگون به توسعهٔ راهبردهای پیشگیری از بیماری و مراقبت بالینی، با درنظرگرفتن تفاوت‌های فردی در محیط، سبک زندگی، ژنتیک و فنوتیپ مولکولی، کمک می‌کند. برای آزادسازی مولکول‌های متابولیت از سلول‌ها، فراصوت‌دهی به‌دفعات در آزمایشگاه‌های زیست‌شناسی برای آماده‌سازی نمونه پیش از آنالیز، مانند تخریب سلولی، لیز و استخراج پروتئین‌ها، لیپیدها و دیگر مولکول‌ها، استفاده می‌شود.
منابع علمی / مراجع
- Casale, A.M.; Cappucci, U.; Fanti, L.; Piacentini, L. (2019): Heterochromatin protein 1 (HP1) is intrinsically required for post-transcriptional regulation of Drosophila Germline Stem Cell (GSC) maintenance. Sci Rep 9, 4372 (2019).
- Ristola, M.; Arpiainen, S., Saleem, M.A.; Mathieson, P.W.; Welsh, G.I.; Lehtonen, S.; Holthöfer, H.(2009): Regulation of Neph3 gene in podocytes – key roles of transcription factors NF-κB and Sp1. BMC Molecular Biol 10, 83 (2009).
- Kharchenko, P.V: et al. (2011): Comprehensive analysis of the chromatin landscape in Drosophila. Nature. 2011 Mar 24; 471(7339): 480–485.
فناوری فراصوت با عملکرد بالا! طیف محصولات Hielscher تمام گستره را از سونیکاتور آزمایشگاهی جمع‌وجور و واحدهای رومیزی تا سامانه‌های فراصوتی کاملاً صنعتی پوشش می‌دهد.