پروتکل غیرفعال‌سازی کروناویروس SARS-CoV-2 با فراصوت‌دهی

VialTweeter شرکت Hielscher دستگاهی منحصربه‌فرد برای آماده‌سازی فراصوتی چند نمونه است که برای غیرفعال‌سازی کروناویروس SARS-COV-2 استفاده می‌شود. VialTweeter امکان آماده‌سازی هم‌زمان حداکثر 10 ویال نمونه را فراهم می‌کند و ازاین‌رو دستگاهی ایدئال برای پردازش انبوه نمونه‌ها است.

غیرفعال‌سازی کروناویروس SARS-CoV-2 با VialTweeter

پس از برداشتن مادهٔ تثبیت‌کننده، تک‌لایه‌های سلولی سه بار با محلول نمکی بافرشده با فسفات (PBS) شسته شدند؛ سپس سلول‌ها با خراشیدن سطح جمع‌آوری و به 1mL MEM/5% FBS منتقل شدند و تحت فراصوت‌دهی قرار گرفتند (3 × 10 ثانیه روشن، 10 ثانیه خاموش، با توان و دامنهٔ 100%). برای این کار از پردازشگر فراصوتی Hielscher مدل UP200St همراه با VialTweeter به‌عنوان متعلقه استفاده شد. مایع‌های رویی با سانتریفیوژ در 3000 × g به‌مدت 10 دقیقه شفاف‌سازی شدند.

پروتکل کامل غیرفعال‌سازی کروناویروس SARS-CoV-2 توسط Welch et al. (2020) را در ادامه بخوانید:

سلول‌ها و ویروس

سلول‌های Vero E6 ‏(Vero C1008; ATCC CRL-1586) در محیط حداقل ضروری اصلاح‌شدهٔ ایگل (MEM)، حاوی 10% (v/v) سرم جنین گوساله (FCS)، کشت داده شدند. ویروس مورد استفاده، سویهٔ hCOV-19/England/2/2020 از SARS-CoV-2 بود که PHE آن را در تاریخ 29/01/2020 از نخستین خوشهٔ بیماران در بریتانیا جداسازی کرده بود. این ویروس در پاساژ 1 دریافت شد و در پاساژ 2 یا 3 برای مطالعات غیرفعال‌سازی استفاده شد.
برای اطلاع از معرف‌ها و مواد شیمیایی مورد استفاده برای غیرفعال‌سازی SARS-CoV-2 و نیز رفع سمیت سلولی معرف‌ها، لطفاً به گزارش علمی Welch et al. (2020) مراجعه کنید.

غیرفعال‌سازی ویروس با شوینده‌ها – پروتکل غیرفعال‌سازی کروناویروس SARS-CoV-2 توسط Welch et al. 2020

غیرفعال‌سازی SARS-CoV-2


برای محصولات تجاری، سوسپانسیون‌های ویروسی (مایع کشت بافت، با تیترهایی در محدودهٔ 1 × 10⁶ تا 1 × 10⁸ PFU/ml) در سه تکرار با معرف‌ها تیمار شدند؛ غلظت‌ها و زمان‌های تماس مطابق توصیه‌های دستورالعمل استفادهٔ سازنده، در صورت موجود بودن، یا مطابق غلظت‌ها و زمان‌هایی بود که آزمایشگاه‌های آزمون مشخصاً درخواست کرده بودند. هنگامی که سازنده محدوده‌ای از غلظت‌ها را ارائه کرده بود، کمترین نسبت محصول به نمونه آزمایش شد (یعنی کمترین غلظت توصیه‌شدهٔ محصول مورد آزمون). معرف‌های لولهٔ انتقال نمونه با نسبت یک حجم مایع کشت بافت به ده حجم معرف آزمایش شدند، مگر آنکه سازنده نسبت حجمی مایع نمونه به معرف را مشخص کرده بود. شوینده‌ها، تثبیت‌کننده‌ها و حلال‌ها با غلظت‌ها و برای مدت‌زمان‌های مشخص‌شده آزمایش شدند. همهٔ مراحل غیرفعال‌سازی در دمای محیط اتاق (18 – 25°C) انجام شدند. برای آزمایش انواع دیگر نمونه، ویروس با نسبت 1:9 به ماتریس نمونهٔ مشخص‌شده افزوده شد و سپس مطابق روش بالا با معرف‌های مورد آزمون تیمار شد. همهٔ آزمایش‌ها شامل نمونه‌های شاهد با تیمار صوری در سه تکرار بودند که در آن‌ها حجم معادلی از PBS جایگزین معرف مورد آزمون شده بود. بلافاصله پس از سپری‌شدن زمان تماس مورد نیاز، 1mL از نمونهٔ تیمارشده با استفاده از ماتریس فیلتراسیون مناسبِ انتخاب‌شده پردازش شد. حذف معرف برای آزمون غیرفعال‌سازی در قالب ستون سانتریفیوژی بزرگ‌تر، با استفاده از ستون‌های سانتریفیوژی حذف شویندهٔ Pierce 4mL ‏(Thermo Fisher) انجام شد؛ یا ستون‌های سانتریفیوژی خالی Pierce با ظرفیت 10mL ‏(Thermo Fisher) با SM2 Bio-Beads، ‏Sephacryl S-400HR یا Sephadex LH-20 پر شدند تا 4mL مهره/رزین متراکم فراهم شود. برای خالص‌سازی با فیلترهای Amicon، نمونه‌های 2 × 500μl با استفاده از دو فیلتر سانتریفیوژی به روش شرح‌داده‌شده در بالا خالص‌سازی و سپس با یکدیگر ترکیب شدند. برای حذف فرمالدهید و فرمالدهید همراه با گلوتارآلدهید، یک فیلتر با حجم نمونهٔ 1× 500μl استفاده شد؛ نمونه پس از پردازش مجدداً در 500μl PBS معلق و به 400ul MEM/5% FBS افزوده شد. برای غیرفعال‌سازی تک‌لایه‌های آلوده، فلاسک‌هایی با مساحت 12٫5 cm² حاوی سلول‌های Vero E6 ‏(2٫5 × 10⁶ سلول/فلاسک در 2٫5mL MEM/5% FBS) با MOI 0٫001 آلوده شدند و در شرایط 37°C/5% CO₂ به‌مدت 24 ساعت انکوبه شدند. مایع رویی برداشته شد و سلول‌ها با استفاده از 5mL فرمالدهید، یا فرمالدهید و گلوتارآلدهید، در دمای اتاق به‌مدت 15 یا 60 دقیقه تثبیت شدند. مادهٔ تثبیت‌کننده برداشته شد و تک‌لایه‌ها سه بار با PBS شسته شدند؛ سپس سلول‌ها با خراشیدن سطح جمع‌آوری و به 1mL MEM/5% FBS منتقل شدند و با استفاده از UP200St مجهز به متعلقهٔ VialTweeter ‏(Hielscher Ultrasound Technology) تحت فراصوت‌دهی قرار گرفتند (3 × 10 ثانیه روشن، 10 ثانیه خاموش، با توان و دامنهٔ 100%). مایع‌های رویی با سانتریفیوژ در 3000 × g به‌مدت 10 دقیقه شفاف‌سازی شدند.


جزئیات معرف مورد استفاده برای غیرفعال‌سازی کروناویروس SARS-CoV-2 با VialTweeter فراصوتی، مطابق پروتکل Welch et al. 2020

پروتکل کامل، شامل نحوهٔ استفاده از VialTweeter شرکت Hielscher، در اینجا در دسترس است:
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

دستگاه‌های پیشرفتهٔ متلاشی‌کننده و تخریب‌کنندهٔ سلولی فراصوتی

سونیکاتور چندنمونه‌ای VialTweeter تنها یکی از راهکارهای فراصوتی متعدد برای آماده‌سازی نمونه در آزمایشگاه‌های زیستی، بیوشیمیایی و بالینی است. Hielscher Ultrasonics دستگاه متلاشی‌کنندهٔ فراصوتی ایدئال را برای کاربرد شما، از جمله لیز سلولی، استخراج از سلول، همگن‌سازی بافت، محلول‌سازی لیزات، حل‌کردن، گاززدایی نمونه و غیره، ارائه می‌کند.
به ما بگویید در هر ساعت و هر روز چه تعداد نمونه را باید پردازش کنید، فراصوت‌دهی مستقیم را ترجیح می‌دهید یا غیرمستقیم، و هدف از تیمار فراصوتی نمونه چیست. ما مناسب‌ترین دستگاه فراصوتی را برای روال کاری روزانهٔ شما پیشنهاد خواهیم کرد!
پردازشگرهای فراصوتی دیجیتال Hielscher Ultrasonics به نرم‌افزار هوشمند، ثبت خودکار داده‌ها، گزینه‌های آسان پیش‌تنظیم برای کنترل دما، مدت فراصوت‌دهی و حالت چرخه/پالس، و نیز روشنایی نمونه و کنترل از راه دور از طریق مرورگر مجهز هستند. ما تلاش می‌کنیم دستگاه‌های فراصوتی خود را تا حد امکان هوشمند کنیم تا پژوهش و روال کاری شما تا حد امکان راحت و موفقیت‌آمیز باشد.
برای آشنایی با کاربردهای بیشتر، از جمله پروتکل‌های آماده‌سازی فراصوتی نمونه با VialTweeter، اینجا کلیک کنید!