پروتکل فعال سازی کروناویروس SARS-CoV-2 با فراصوت

غیر فعال شدن کروناویروس SARS-CoV-2 با VialTweeter

پس از از بین بردن ثابت, monolayers سه بار با فسفات بافر سالین (PBS) شسته شد قبل از خراش سلول ها را به 1mL MEM/5% FBS و فراصوت (3 × 10 ثانیه در, 10 ثانیه خاموش در قدرت 100% و دامنه) با استفاده از پردازنده مافوق صوت Hielscher UP200St با VialTweeter پیوست. سوپرناتانت ها با سنتریفیوژ در ۳۰۰۰ گرم × به مدت ۱۰ دقیقه روشن شدند. 

پروتکل کامل را در اینجا برای غیر فعال سازی کروناویروس SARS-CoV-2 توسط ولش و همکاران (2020) در زیر بخوانید:

سلول ها و ویروس

سلول های Vero E6 (Vero C1008; ATCC CRL-1586) در حداقل محیط ضروری عقاب اصلاح شده (MEM) به همراه 10 درصد (v/v) سرم گوساله جنین (FCS) کشت داده شد. ویروس مورد استفاده SARS-CoV-2 کرنش hCOV-19/England/2/2020 بود که توسط PHE از اولین خوشه بیمار در بریتانیا در تاریخ 29/01/2020 جدا شد. این ویروس در پاساژ ۱ به دست آمده و برای مطالعات غیر فعال سازی در پاساژ ۲ یا ۳ مورد استفاده قرار می گیرد.
برای واکنشگرها و مواد شیمیایی مورد استفاده برای غیر فعال سازی SARS-CoV-2 و همچنین حذف سیتو سمی واکنشگر لطفا به گزارش علمی ولش و همکاران (2020) نگاه کنید.

غیر فعال سازی ویروس توسط شوینده ها – SARS-CoV-2 Coronavirus Inactivation protocol by Welch et al. 2020

غیر فعال سازی SARS-CoV-2

برای محصولات تجاری، آماده سازی ویروس (مایع کشت بافت، تیتر از 1 × 10⁶ به 1 × 10⁸ PFU / میلی لیتر) در سه برابر با نایب السلطنه در غلظت و برای زمان تماس توصیه می شود در دستورالعمل تولید کنندگان برای استفاده، که در آن در دسترس، و یا برای غلظت و زمان به طور خاص با آزمایش آزمایشگاه درخواست درمان شد. در جایی که طیف وسیعی از غلظت ها توسط تولیدکننده داده شد، کمترین نسبت محصول به نمونه مورد آزمایش قرار گرفت (به عنوان یکی از کمترین غلظت توصیه شده محصول آزمون). نمونه ها با استفاده از نسبت یک حجم مایع کشت بافت به ده حجم ریجنت مورد آزمایش قرار گرفتند، مگر اینکه نسبت حجمی مایع نمونه به نایب السلطنه توسط تولیدکننده مشخص شود. مواد شوینده، تثبیت کننده ها و حلال ها در غلظت های نشان داده شده برای زمان های نشان داده شده مورد آزمایش قرار گرفتند. تمام مراحل غیر فعال سازی در دمای اتاق محیط (18 تا 25 درجه سانتی گراد) انجام شد. برای آزمایش انواع نمونه های جایگزین، ویروس به ماتریس نمونه نشان داده شده با نسبت 1:9 خوشه شد، سپس با نایب السلطنه های آزمایش به عنوان بالا درمان شد. تمام آزمایش ها شامل نمونه های درمان شده با مسخره کنترل سه ظریف با حجم معادل PBS به جای نایب السلطنه آزمایش بودند. بلافاصله پس از زمان تماس مورد نیاز، 1mL نمونه تصفیه شده با استفاده از ماتریس تصفیه مناسب انتخاب شده پردازش شد. حذف واکنشگر برای تست غیر فعال سازی در قالب ستون اسپین بزرگتر با استفاده از پیرس 4mL شوینده حذف ستون اسپین (ترمو فیشر) انجام شد، و یا با پر کردن خالی پیرس 10mL ظرفیت ستون های سنتریفیوژ (ترمو فیشر) با SM2 بیو مهره، Sephacryl S-400HR یا Sephadex LH-20 به مهره های بسته بندی شده 4mL / resin. برای تصفیه با استفاده از فیلترهای ×، 2 نمونه 500 میکرول با استفاده از دو فیلتر سانتیریفوژ با روشی که قبلاً توصیف شده بود تصفیه شد و سپس با هم جمع شدند. برای فرمالدهید و فرمالدهید با حذف گلوتارالدهید، از یک فیلتر با حجم نمونه 1× 500 میکرول استفاده شد، پس از پردازش در PBS 500μl دوباره صرف شد و به 400ul MEM/5٪ FBS اضافه شد. برای غیر فعال شدن آلوده تک رنگ، 12.5 سانتی متر^H2S فلاسک سلول های Vero E6 (2.5 × 10⁶ سلول ها/فلاسک در 5/2mL MEM/5% FBS) در MOI 0.001 آلوده شدند و در CO 37 درجه سانتی گراد/5 درصد انکوبه شدند_H2S به مدت 24 ساعت . سوپرناتانت حذف شد، و سلول های ثابت با استفاده از 5mL فرمالدهید، یا فرمالدهید و گلوتارالدهید در دمای اتاق به مدت 15 یا 60 دقیقه. تثبیت کننده حذف شد، و monolayers شسته شده سه بار با PBS قبل از خراش سلول ها را به 1mL MEM/5٪ FBS و فراصوت (3 × 10 ثانیه در، 10 ثانیه خاموش در 100٪ قدرت و دامنه) با استفاده از UP200St با دلبستگی VialTweeter (Hielscher سونوگرافی فن آوری). سوپرناتانت ها با سنتریفیوژ در ۳۰۰۰ گرم × به مدت ۱۰ دقیقه روشن شدند.

جزئیات واکنشگر مورد استفاده برای SARS-CoV-2 غیر فعال سازی کروناویروس با ویال توئتر مافوق صوت با توجه به پروتکل توسط ولش و همکاران 2020

پروتکل کامل از جمله استفاده از Hielscher VialTweeter را می توان در اینجا یافت:
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

تکه تکه کننده های مافوق صوت پیچیده و مختل کننده سلول

چند نمونه مافوق صوت VialTweeter تنها یکی از بسیاری از راه حل های مافوق صوت برای آماده سازی نمونه در آزمایشگاه های بیولوژیکی، بیوشیمیایی و بالینی است. Hielscher Ultrasonics ارائه می دهد تجزیه کننده مافوق صوت ایده آل برای برنامه شما, به عنوان نمونه لیز سلول, استخراج سلول, همگن سازی بافت, محلول سازی لایزات, حل, گاز زدایی نمونه و غیره.
به ما اطلاع دهید که چگونه بسیاری از نمونه های شما باید به پردازش در هر ساعت و روز، اگر شما ترجیح می دهند فراصوت مستقیم یا غیر مستقیم و چه هدف از درمان نمونه مافوق صوت است. ما به شما مناسب ترین واحد مافوق صوت برای روال کار روزانه خود را توصیه!
Hielscher مافوق صوت 'پردازنده های مافوق صوت دیجیتال با نرم افزار هوشمند مجهز, ضبط خودکار داده ها, گزینه های آسان قبل از تنظیم برای کنترل دما, مدت زمان فراصوت, چرخه / حالت پالس و همچنین روشنایی نمونه و مرورگر کنترل از راه دور. ما تلاش می کنیم تا دستگاه های مافوق صوت ما را به عنوان هوشمند که ممکن است به طوری که تحقیقات و روال کار خود را می شود به عنوان راحت و موفق که ممکن است.
اینجا را کلیک کنید، برای پیدا کردن برنامه های کاربردی بیشتر از جمله پروتکل های آماده سازی نمونه مافوق صوت با VialTweeter!