پروتکل غیرفعال سازی ویروس کرونا SARS-CoV-2 با فراصوت

Hielscher VialTweeter یک واحد آماده سازی چند نمونه اولتراسونیک منحصر به فرد است که برای غیرفعال کردن ویروس کرونا SARS-COV-2 استفاده می شود. VialTweeter اجازه می دهد تا حداکثر 10 ویال نمونه را به طور همزمان آماده کنید و در نتیجه واحد ایده آل برای پردازش نمونه انبوه است.

غیرفعال کردن ویروس کرونا SARS-CoV-2 با VialTweeter

پس از از بین بردن تثبیت, تک لایه سه بار با فسفات بافر نمک شسته شد (PBS) قبل از خراش دادن سلول ها به 1 میلی لیتر MEM / 5٪ FBS و فراصوت (3 × 10 ثانیه در, 10 ثانیه خاموش در 100٪ قدرت و دامنه) با استفاده از پردازنده مافوق صوت Hielscher UP200St با VialTweeter پیوست. مایع رویی ها با سانتریفیوژ در دمای 3000 × گرم به مدت 10 دقیقه شفاف شدند. 

پروتکل کامل را برای غیرفعال سازی ویروس کرونا SARS-CoV-2 توسط Welch و همکاران (2020) در اینجا بخوانید:

سلول ها و ویروس ها

سلول های Vero E6 (Vero C1008; ATCC CRL-1586) در محیط کشت حداقل ضروری عقاب اصلاح شده (MEM) حاوی 10 درصد (حجمی/حجمی) سرم جنین گوساله (FCS) کشت داده شد. ویروس مورد استفاده SARS-CoV-2 سویه hCOV-19/England/2/2020 بود که توسط PHE از اولین خوشه بیمار در انگلستان در 29/01/2020 جدا شد. این ویروس در گذرگاه 1 به دست آمد و برای مطالعات غیرفعال سازی در گذرگاه 2 یا 3 استفاده شد.
برای معرف ها و مواد شیمیایی مورد استفاده برای غیرفعال سازی SARS-CoV-2 و همچنین از بین بردن سمیت سلولی معرف لطفا به گزارش علمی ولش و همکاران (2020) مراجعه کنید.

غیرفعال سازی ویروس توسط مواد شوینده – پروتکل غیرفعال سازی ویروس کرونا SARS-CoV-2 توسط ولش و همکاران 2020

غیرفعال سازی SARS-CoV-2

برای محصولات تجاری، آماده سازی ویروس (مایع کشت بافت، تیتر از 1 × 10⁶ تا 1 × 10⁸ PFU/ml) به صورت سه تکرار با معرف ها در غلظت ها و برای زمان تماس توصیه شده در دستورالعمل های تولید کنندگان برای استفاده، در صورت وجود، یا برای غلظت ها و زمان های درخواست شده توسط آزمایشگاه های آزمایش تیمار شدند. در جایی که طیف وسیعی از غلظت ها توسط سازنده داده شد، کمترین نسبت محصول به نمونه مورد آزمایش قرار گرفت (یعنی کمترین غلظت توصیه شده محصول test). معرف های لوله انتقال نمونه با استفاده از نسبت یک حجم مایع کشت بافت به ده حجم معرف مورد آزمایش قرار گرفتند، مگر اینکه نسبت حجمی مایع نمونه به معرف توسط سازنده مشخص شده باشد. مواد شوینده، تثبیت کننده ها و حلال ها در غلظت های مشخص شده برای زمان های مشخص شده مورد آزمایش قرار گرفتند. تمام مراحل غیرفعال سازی در دمای محیط اتاق (18 تا 25 درجه سانتی گراد) انجام شد. برای آزمایش انواع نمونه های جایگزین، ویروس به نسبت 1:9 به ماتریس نمونه نشان داده شده قرار گرفت، سپس با معرف های test مانند بالا درمان شد. تمام آزمایش ها شامل نمونه های تیمار شده با ساختگی سه تکرار با حجم معادل PBS به جای معرف test بودند. بلافاصله پس از زمان تماس مورد نیاز، 1 میلی لیتر از نمونه تیمار شده با استفاده از ماتریس فیلتراسیون مناسب پردازش شد. حذف معرف برای آزمایش غیرفعال سازی در قالب ستون چرخشی بزرگتر با استفاده از ستون های اسپین حذف مواد شوینده Pierce 4mL (Thermo Fisher) یا با پر کردن ستون های سانتریفیوژ خالی Pierce با ظرفیت 10 میلی لیتر (Thermo Fisher) با SM2 Bio-Beads، Sephacryl S-400HR یا Sephadex LH-20 انجام شد تا مهره ها/رزین بسته بندی شده 4 میلی لیتری به دست آید. برای خالص سازی با استفاده از فیلترهای آمیکون، 2 × 500 میکرولیتر نمونه با استفاده از دو فیلتر گریز از مرکز به روشی که قبلا توضیح داده شد، تخلیص شدند و سپس با هم ترکیب شدند. برای فرمالدئید و فرمالدئید با حذف گلوتارآلدئید از یک فیلتر با حجم نمونه 500 میکرولیتر 1× استفاده شد که پس از فرآوری در 500 میکرولیتر PBS معلق شد و به 400 لیتر MEM/5 درصد FBS اضافه شد. برای غیرفعال کردن آلوده تک لایه، 12.5 سانتی متر^H2S فلاسک سلول های Vero E6 (2.5 × 10⁶ سلول ها/فلاسک در 2.5 میلی لیتر MEM/5٪ FBS) در MOI 0.001 آلوده و در دمای 37 درجه سانتی گراد/5 درصد CO انکوبه شدند_H2S به مدت 24 ساعت. مایع رویی برداشته شد و سلول ها با استفاده از 5 میلی لیتر فرمالدئید یا فرمالدئید و گلوتارآلدئید در دمای اتاق به مدت 15 یا 60 دقیقه تثبیت شدند. تثبیت کننده حذف شد, و تک لایه سه بار با PBS قبل از خراش دادن سلول ها به 1mL MEM / 5٪ FBS و فراصوت (3 × 10 ثانیه در, 10 ثانیه خاموش در 100٪ قدرت و دامنه) با استفاده از UP200St با پیوست VialTweeter (Hielscher سونوگرافی تکنولوژی). مایع رویی ها با سانتریفیوژ در دمای 3000 × گرم به مدت 10 دقیقه شفاف شدند.

جزئیات معرف مورد استفاده برای غیرفعال کردن ویروس کرونا SARS-CoV-2 با VialTweeter اولتراسونیک طبق پروتکل Welch و همکاران 2020

پروتکل کامل از جمله استفاده از Hielscher VialTweeter را می توان در اینجا یافت:
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

پیچیده التراسونیک dismembrators و مختل کننده های سلول

چند نمونه اولتراسونیک VialTweeter تنها یکی از بسیاری از راه حل های اولتراسونیک برای آماده سازی نمونه در آزمایشگاه های بیولوژیکی، بیوشیمیایی و بالینی است. Hielscher مافوق صوت ارائه می دهد dismembrator مافوق صوت ایده آل برای نرم افزار خود را، به عنوان مثال لیز سلول، استخراج سلول، همگن سازی بافت، حل کننده لیزات، انحلال ، گاز زدایی نمونه و غیره.
به ما اطلاع دهید که چگونه بسیاری از نمونه شما باید به پردازش در هر ساعت و روز، اگر شما ترجیح می دهید فراصوت مستقیم و یا غیر مستقیم و چه هدف از درمان نمونه اولتراسونیک است. ما مناسب ترین واحد اولتراسونیک را برای روال کار روزانه خود به شما توصیه می کنیم!
پردازنده های مافوق صوت دیجیتال Hielscher Ultrasonics با نرم افزار هوشمند، ضبط خودکار داده ها، گزینه های آسان پیش تنظیم برای کنترل دما، مدت زمان فراصوت، حالت چرخه / پالس و همچنین روشنایی نمونه و کنترل از راه دور مرورگر مجهز شده اند. ما در تلاش هستیم تا دستگاه های اولتراسونیک خود را تا حد امکان هوشمند کنیم تا روال تحقیق و کار شما تا حد امکان راحت و موفق شود.
برای یافتن برنامه های بیشتر از جمله پروتکل های آماده سازی نمونه اولتراسونیک با VialTweeter اینجا را کلیک کنید!