لیز سلول‌های BL21 با فراصوت‌دهی

سلول‌های BL21 سویه‌ای از E. coli هستند که به‌دلیل توانایی بیان پروتئین با بازده بسیار بالا، در آزمایشگاه‌های تحقیقاتی، زیست‌فناوری و تولید صنعتی به‌طور گسترده استفاده می‌شوند. تخریب سلولی، لیز و استخراج پروتئین به روش فراصوتی، روش رایجی برای جداسازی و جمع‌آوری پروتئین‌های هدف از درون سلول‌های BL21 است. فراصوت‌دهی سلول را به‌طور کامل تخریب می‌کند و تمام پروتئین‌های محبوس را آزاد می‌سازد؛ در نتیجه، 100% پروتئین در دسترس قرار می‌گیرد.

سلول‌های BL21 برای بیان پروتئین

سلول BL21 یک سویهٔ باکتریایی E. coli با قابلیت پذیرش DNA به روش شیمیایی است که برای ترانسفورماسیون و بیان پروتئین در سطح بالا با استفاده از سامانهٔ القایی T7 RNA polymerase-IPTG مناسب است. سلول‌های BL21 امکان بیان پربازده پروتئین از هر ژنی را که تحت کنترل پروموتر T7 باشد، فراهم می‌کنند. سویهٔ BL21(DE3) از E. coli، سویه‌ای برای تولید پروتئین بر پایهٔ RNA پلیمراز T7 است که همراه با وکتورهای بیان مبتنی بر پروموتر T7 به کار می‌رود و در آزمایشگاه‌ها و صنعت برای تولید پروتئین‌های نوترکیب کاربرد گسترده‌ای دارد. در BL21(DE3)، بیان ژن کدکنندهٔ پروتئین نوترکیب توسط RNA پلیمراز T7 کدشده در کروموزوم (T7 RNAP) رونویسی می‌شود؛ این پلیمراز هشت برابر سریع‌تر از RNAP معمول E. coli رونویسی می‌کند. این ویژگی، سویهٔ BL21(DE3) را بسیار کارآمد می‌سازد و آن را به یکی از محبوب‌ترین سامانه‌های سلولی بیان پروتئین تبدیل می‌کند.

پروتکل لیز فراصوتی و استخراج پروتئین از سلول‌های BL21

لیز سلول‌های BL21 عمدتاً با فراصوت‌دهی همراه با سدیم لائوروئیل سارکوزینات (که با نام سارکوزیل نیز شناخته می‌شود) به‌عنوان بافر لیز انجام می‌شود. مزایای تخریب سلولی و استخراج پروتئین به روش فراصوتی شامل قابلیت اطمینان، تکرارپذیری و همچنین کارکرد ساده، ایمن و سریع دستگاه‌های فراصوتی است. پروتکل زیر دستورالعمل گام‌به‌گام لیز فراصوتی سلول‌های BL21 را ارائه می‌کند:

• برای حذف پروتئین‌های شاپرون، رسوب‌های باکتریایی BL21 در 50 ml بافر سدیم تریس–EDTA (STE) سردشده تا دمای یخ مجدداً معلق شدند؛ این بافر شامل 10 mM Tris-HCL، با pH 8٫0، مقدار 1 mM EDTA و 150 mM NaCl بود و 100 mM PMSF نیز به آن افزوده شد.
• سپس، 500 ul لیزوزیم (10 mg/ ml) افزوده می‌شود و سلول‌ها به‌مدت 15 min روی یخ انکوبه می‌شوند.
• پس از آن، 500 ul از DTT و 7 ml سارکوزیل (10% (w/v) تهیه‌شده در بافر STE) افزوده می‌شود.
• ضروری است که تمام بافرهای خالص‌سازی در دمای یخ نگه داشته شوند و نمونه‌ها در تمام مدت روی یخ باقی بمانند. در صورت امکان، تمام مراحل خالص‌سازی باید در اتاق سرد انجام شوند.



• برای لیز فراصوتی و استخراج پروتئین، نمونه‌ها در دستگاه فراصوتی چندنمونه‌ای VialTweeter به‌مدت 4 x 30 sec با دامنهٔ 100% و فاصلهٔ 2 min بین هر نوبت، فراصوت‌دهی می‌شوند. همچنین می‌توان از یک هموژنایزر فراصوتی پروبی با میکروتیپ، برای مثال UP200Ht مجهز به S26d2 استفاده کرد (3 x 30 sec، مکث 2 min. بین چرخه‌های فراصوتی، دامنهٔ 80%).
• برای مراحل بعدی خالص‌سازی، نمونه‌ها باید روی یخ نگه داشته شوند یا تا زمان پردازش بعدی در دمای -80°C ذخیره شوند.

لیز فراصوتی با کنترل دقیق دما

کنترل دقیق و قابل‌اعتماد دما هنگام کار با نمونه‌های زیستی ضروری است. دماهای بالا، تخریب حرارتی پروتئین‌ها را در نمونه‌ها آغاز می‌کنند.
فراصوت‌دهی نیز مانند تمام روش‌های مکانیکی آماده‌سازی نمونه، گرما تولید می‌کند. بااین‌حال، هنگام استفاده از VialTweeter می‌توان دمای نمونه‌ها را به‌خوبی کنترل کرد. در ادامه، گزینه‌های مختلفی را برای پایش و کنترل دمای نمونه‌ها هنگام آماده‌سازی آن‌ها با VialTweeter و VialPress برای آنالیز معرفی می‌کنیم.

1. پایش دمای نمونه: پردازشگر فراصوتی UP200St که VialTweeter را به کار می‌اندازد، به نرم‌افزار هوشمند و حسگر دمای قابل‌اتصال مجهز است. حسگر دما را به UP200St وصل کنید و نوک حسگر را در یکی از لوله‌های نمونه قرار دهید. از طریق نمایشگر لمسی رنگی دیجیتال، می‌توانید در منوی UP200St بازهٔ دمایی مشخصی را برای فراصوت‌دهی نمونه تنظیم کنید. دستگاه فراصوتی با رسیدن به بیشینهٔ دما، به‌طور خودکار متوقف می‌شود و تا زمانی که دمای نمونه به مقدار پایین بازهٔ دمایی تنظیم‌شدهٔ ∆ برسد، در حالت مکث باقی می‌ماند. سپس فراصوت‌دهی به‌طور خودکار دوباره آغاز می‌شود. این قابلیت هوشمند از تخریب ناشی از گرما جلوگیری می‌کند.
2. بلوک VialTweeter را می‌توان از پیش سرد کرد. بلوک VialTweeter را (فقط سونوتْرود، بدون مبدل!) در یخچال یا فریزر قرار دهید؛ پیش‌سرد کردن بلوک تیتانیومی به تأخیر انداختن افزایش دمای نمونه کمک می‌کند. در صورت امکان، خود نمونه را نیز می‌توان از پیش سرد کرد.
3. برای خنک‌سازی حین فراصوت‌دهی از یخ خشک استفاده کنید. یک سینی کم‌عمق را با یخ خشک پر کنید و VialTweeter را روی یخ قرار دهید تا گرما به‌سرعت دفع شود.

مشتریان در سراسر جهان از VialTweeter و VialPress برای آماده‌سازی روزانهٔ نمونه‌ها در آزمایشگاه‌های زیستی، بیوشیمیایی، پزشکی و بالینی استفاده می‌کنند. با نرم‌افزار هوشمند و قابلیت کنترل دمای پردازشگر UP200St، دما به‌طور قابل‌اعتماد کنترل می‌شود و از تخریب نمونه بر اثر گرما جلوگیری می‌شود. آماده‌سازی فراصوتی نمونه با VialTweeter و VialPress نتایجی بسیار قابل‌اعتماد و تکرارپذیر ارائه می‌دهد!
 

دستگاه تخریب فراصوتی بهینه را برای کاربرد لیز خود بیابید

Hielscher Ultrasonics سازنده‌ای با سابقهٔ طولانی در تولید دستگاه‌های تخریب سلولی و هموژنایزرهای فراصوتی با عملکرد بالا برای آزمایشگاه‌ها و سامانه‌های رومیزی و صنعتی است. اندازهٔ کشت سلول‌های باکتریایی، هدف پژوهشی یا تولیدی شما و حجم سلول‌هایی که باید در هر ساعت یا روز پردازش شوند، عوامل اساسی برای یافتن دستگاه تخریب سلولی فراصوتی مناسب کاربرد شما هستند.
Hielscher Ultrasonics راهکارهای مختلفی برای فراصوت‌دهی هم‌زمان چندین نمونه (تا 10 ویال با VialTweeter) و تعداد زیادی نمونه (یعنی پلیت‌های میکروتیتر / پلیت‌های ELISA با UIP400MTP) ارائه می‌کند. همچنین، محصولات این شرکت از دستگاه فراصوتی آزمایشگاهی پروبی متداول با سطوح توان مختلف از 50 تا 400 وات تا پردازشگرهای فراصوتی کاملاً صنعتی با توان حداکثر 16٬000 وات برای هر واحد را شامل می‌شوند که برای تخریب سلولی تجاری و استخراج پروتئین در تولید انبوه به کار می‌روند. تمام دستگاه‌های فراصوتی Hielscher برای کارکرد 24/7/365 زیر بار کامل ساخته شده‌اند. استحکام و قابلیت اطمینان از ویژگی‌های اصلی دستگاه‌های فراصوتی ما هستند.
تمام هموژنایزرهای فراصوتی دیجیتال به نرم‌افزار هوشمند، نمایشگر لمسی رنگی و ثبت خودکار داده‌ها مجهز هستند؛ این ویژگی‌ها دستگاه فراصوتی را به ابزاری کاربردی در آزمایشگاه و تأسیسات تولیدی تبدیل می‌کنند.
به ما بگویید نمونه‌های زیستی شما شامل چه نوع سلول‌هایی هستند، چه حجمی دارند، با چه تناوبی و با چه هدفی باید پردازش شوند. ما مناسب‌ترین دستگاه تخریب سلولی فراصوتی را برای نیازهای فرایند شما پیشنهاد خواهیم کرد.

جدول زیر نمایی از ظرفیت تقریبی پردازش سامانه‌های فراصوتی ما ارائه می‌دهد؛ از هموژنایزرهای جمع‌وجور قابل نگه‌داشتن در دست و دستگاه‌های فراصوتی چندنمونه‌ای تا پردازشگرهای فراصوتی صنعتی برای کاربردهای تجاری:

منابع / مراجع

• Cheraghi S.; Akbarzade A.; Farhangi A.; Chiani M.; Saffari Z.; Ghassemi S.; Rastegari H.; Mehrabi M.R. (2010): Improved Production of L-lysine by Over-expression of Meso-diaminopimelate Decarboxylase Enzyme of Corynebacterium glutamicum in Escherichia coli. Pak J Biol Sci. 2010 May 15; 13(10), 2010. 504-508.
• LeThanh, H.; Neubauer, P.; Hoffmann, F. (2005): The small heat-shock proteins IbpA and IbpB reduce the stress load of recombinant Escherichia coli and delay degradation of inclusion bodies. Microb Cell Fact 4, 6; 2005.
• Martínez-Gómez A.I.; Martínez-Rodríguez S.; Clemente-Jiménez J.M.; Pozo-Dengra J.; Rodríguez-Vico F.; Las Heras-Vázquez F.J. (2007): Recombinant polycistronic structure of hydantoinase process genes in Escherichia coli for the production of optically pure D-amino acids. Appl Environ Microbiol. 73(5); 2007. 1525-1531.
• Kotowska M.; Pawlik K.; Smulczyk-Krawczyszyn A.; Bartosz-Bechowski H.; Kuczek K. (2009): Type II Thioesterase ScoT, Associated with Streptomyces coelicolor A3(2) Modular Polyketide Synthase Cpk, Hydrolyzes Acyl Residues and Has a Preference for Propionate. Appl Environ Microbiol. 75(4); 2009. 887-896.