لیز سلول از سلول های BL21 توسط امواج فراصوت
سلول های BL21 سویه ای از ای کلی هستند که به دلیل قابلیت بیان پروتئین های بسیار کارآمد، به طور گسترده ای در آزمایشگاه های تحقیقاتی، بیوتکنولوژی و تولید صنعتی مورد استفاده قرار می گیرند. اختلال سلول های مافوق صوت، لیز و استخراج پروتئین روش رایج برای جداسازی و جمع آوری پروتئین های هدفمند از فضای داخلی سلولی سلول های BL21 است. امواج فراصوت سلول را به طور کامل مختل می کند و تمام پروتئین های محصور شده را آزاد می کند و ۱۰۰٪ پروتئین را در دسترس قرار می دهد.
سلول های BL21 برای بیان پروتئین
سلول BL21 یک سویه باکتریایی E. coli با صلاحیت شیمیایی مناسب برای تبدیل و بیان پروتئین سطح بالا با استفاده از یک سیستم القایی T7 RNA پلیمراز-IPTG است. سلول های BL21 اجازه بیان پروتئین با کارایی بالا از هر ژنی را می دهند که تحت کنترل یک مروج T7 باشد. سویه E. coli BL21 (DE3) یک سویه تولید پروتئین مبتنی بر پلیمراز T7 RNA همراه با بردارهای بیان مبتنی بر پروموتر T7 است و به طور گسترده ای در آزمایشگاه ها و صنعت برای تولید پروتئین های ترکیبی به کار می رود. در BL21(DE3)، بیان ژن کد کننده پروتئین recombinant توسط پلیمراز T7 RNA کد شده کروموزومی (T7 RNAP) رونویسی می شود که هشت برابر سریع تر از RNAP E. coli معمولی رونویسی می شود. این امر کرنش BL21(DE3) را بسیار کارآمد می کند و آن را به یکی از ترجیح داده شده ترین سیستم های سلولی بیان پروتئین تبدیل می کند.
پروتکل برای لیز مافوق صوت و استخراج پروتئین از سلول های BL21
لیز سلولی سلول های BL21 بیشتر با استفاده از فراصوت در ترکیب با سدیم لوریل سارکوزینات (همچنین به عنوان سارکوزیل شناخته می شود) به عنوان بافر لیز انجام می شود. مزایای اختلال سلول های مافوق صوت و استخراج پروتئین نهفته در قابلیت اطمینان, قابلیت تکثیر و همچنین ساده, ایمن و سریع عمل مافوق صوت. پروتکل زیر می دهد گام به گام جهت برای لیز سلول BL21 مافوق صوت:
- به منظور حذف پروتئین های شاپرون، گلوله های باکتریایی BL21 در 50 میلی لیتر بافر سدیم سرد سدیم تریس-EDTA (STE) (متشکل از 10 میلی متر تریس-HCL، pH 8.0، 1 میلی متر EDTA، 150 میلی متر NaCl به همراه 100 میلی متر PMSF) احیا شدند.
- 500 ul از ليزوزيم (10 میلی گرم در میلی لیتر) اضافه شده و سلول ها بر روی یخ به مدت 15 دقیقه انکوبه.
- پس از آن 500 ul از DTT و 7 میلی لیتر سارکوزیل (10٪ (w/v) ساخته شده در بافر STE) اضافه می شود.
- نگه داشتن تمام بافرهای تصفیه یخ سرد و حفظ نمونه ها بر روی یخ در تمام مدت ضروری است. تمام مراحل تصفیه باید در صورت امکان در سرد خانه انجام شود.
- برای لیز مافوق صوت و استخراج پروتئین، نمونه ها در فراصوت ویال توئتر چند نمونه سونوگرافی برای 4 x 30 ثانیه در دامنه 100٪ با فاصله 2 دقیقه بین هر فراصوت. متناوبا، یک هموژنیزر مافوق صوت از نوع کاوشگر با میکرو نوک به عنوان مانند، UP200Ht با S26d2 (3 x 30 ثانیه، 2 دقیقه مکث بین چرخه مافوق صوت، دامنه 80٪) می تواند مورد استفاده قرار گیرد.
- برای مراحل تصفیه بیشتر، نمونه ها باید بر روی یخ نگه داشته شوند یا به طور جایگزین در دمای ۸۰- درجه سانتی گراد تا پردازش بیشتر ذخیره شوند.
مختل کننده سلول مافوق صوت UP200St با میکرو نوک S26d2 برای لیز و استخراج پروتئین
لیز مافوق صوت تحت کنترل دما Prescise
کنترل دقیق و قابل اعتماد دما در هنگام دست زدن به نمونه های بیولوژیکی بسیار مهم است. دماهای بالا تجزیه پروتئین ناشی از حرارتی را در نمونه ها آغاز می کنند.
به عنوان تمام تکنیک های آماده سازی نمونه مکانیکی، فراصوت گرما ایجاد می کند. با این حال، دمای نمونه ها را می توان به خوبی در هنگام استفاده از VialTweeter کنترل کرد. ما به شما گزینه های مختلف برای نظارت و کنترل دمای نمونه های خود را در حالی که آماده سازی آنها را با VialTweeter و VialPress برای تجزیه و تحلیل ارائه.
- نظارت بر دمای نمونه: پردازنده مافوق صوت UP200St، که درایو VialTweeter، با یک نرم افزار هوشمند و سنسور درجه حرارت قابل اتصال مجهز شده است. سنسور دما را به UP200St وصل کنید و نوک حسگر دما را در یکی از لوله های نمونه قرار کنید. از طریق صفحه نمایش لمسی رنگی دیجیتال، شما می توانید در منوی UP200St یک محدوده دمایی خاص برای فراصوت نمونه خود را تنظیم کنید. مافوق صوت به طور خودکار متوقف خواهد شد زمانی که حداکثر درجه حرارت رسیده است و مکث تا دمای نمونه پایین به ارزش پایین تر از دمای مجموعه ∆. سپس فراصوت دوباره به طور خودکار شروع می شود. این ویژگی هوشمند از تخریب ناشی از گرما جلوگیری می کند.
- بلوک VialTweeter را می توان از پیش سرد کرد. قرار دادن بلوک VialTweeter (تنها sonotrode بدون transducer!) را به یخچال یا فریزر برای قبل از خنک کردن بلوک تیتانیوم کمک می کند تا به تعویق انداختن افزایش دما در نمونه. در صورت امکان، خود نمونه نیز می تواند از پیش سرد شود.
- استفاده از یخ خشک برای خنک کردن در طول فراصوت. از سینی کم عمق پر از یخ خشک استفاده کنید و VialTweeter را روی یخ قرار دهید تا گرما به سرعت از بین برد.
مشتریان در سراسر جهان استفاده از VialTweeter و VialPress برای کار آماده سازی نمونه روزانه خود را در آزمایشگاه های بیولوژیکی، بیوشیمیایی، پزشکی و بالینی. نرم افزار هوشمند و کنترل دما پردازنده UP200St، دما به طور قابل اعتمادی کنترل می شود و از تخریب نمونه ناشی از گرما اجتناب می شود. آماده سازی نمونه مافوق صوت با VialTweeter و VialPress ارائه نتایج بسیار قابل اعتماد و قابل تکثیر!
پیدا کردن مختل کننده مافوق صوت مطلوب برای نرم افزار لیز خود را
Hielscher Ultrasonics طولانی مدت تولید کننده با تجربه از مختل کننده سلول های مافوق صوت با کارایی بالا و هموژنیزر برای آزمایشگاه ها، نیمکت بالا و سیستم های مقیاس صنعتی است. اندازه کشت سلول های باکتریایی شما، هدف تحقیق یا تولید شما و حجم سلول برای پردازش در هر ساعت یا روز از عوامل ضروری برای پیدا کردن مختل کننده سلول مافوق صوت مناسب برای برنامه شما هستند.
Hielscher Ultrasonics ارائه می دهد راه حل های مختلف برای فراصوت همزمان از چند نمونه (تا 10 ویال با VialTweeter) و نمونه های جرم (به عنوان نمونه، صفحات میکروتیتر / صفحات الیزا با UIP400MTP) ، و همچنین کلاسیک کاوشگر نوع آزمایشگاه مافوق صوت با سطوح قدرت مختلف از 50 تا 400 وات به پردازنده های مافوق صوت کاملا صنعتی با تا 16،000watts در واحد برای اختلال در سلول های تجاری و استخراج پروتئین در تولید بزرگ است. همه Hielscher ultrasonicators برای عملیات ساخته شده 24/7/365 تحت بار کامل. استحکام و قابلیت اطمینان از ویژگی های اصلی دستگاه های مافوق صوت ما هستند.
همه هموژنیزرهای مافوق صوت دیجیتال با نرم افزار هوشمند مجهز, صفحه نمایش لمسی رنگی و پروتکل خودکار داده ها, که دستگاه مافوق صوت را به یک ابزار کار مناسب در آزمایشگاه و امکانات تولید.
به ما اطلاع دهید، چه نوع سلول هایی، چه حجمی، با چه فرکانسی و با چه هدفی باید نمونه های بیولوژیکی خود را پردازش کنید. ما به شما توصیه می شود مناسب ترین مختل کننده سلول مافوق صوت برای نیازهای فرایند خود را.
جدول زیر به شما می دهد نشانه ای از ظرفیت پردازش تقریبی از سیستم های مافوق صوت ما از هموژنیزرهای دست جمع و جور و چند نمونه Ultrasonicators به پردازنده های صنعتی مافوق صوت برای برنامه های کاربردی تجاری:
| دسته ای دوره | نرخ جریان | دستگاه های توصیه شده |
|---|---|---|
| 96 چاه / صفحات میکروتیتر | خب | UIP400MTP |
| 10 ویال à 0.5 به 1.5mL | خب | VialTweeter در UP200St |
| 0.01 تا 250mL | 5 تا 100mL/min | UP50H |
| 0.01 تا 500mL | 10 تا پوست 200ml / دقیقه | UP100H |
| 10 به 2000mL | 20 تا 400ML / دقیقه | UP200Ht، UP400St |
| 00.1 به 20L | 00.2 به 4L / دقیقه | UIP2000hdT |
| 10 تا 100L | 2 تا 10L / دقیقه | UIP4000hdT |
| خب | 10 تا 100L / min و | UIP16000 |
| خب | بزرگتر | خوشه UIP16000 |
تماس با ما! / از ما بپرسید!
UIP400MTP صفحه Sonicator برای اختلال سلول با توان بالا در صفحات 96 چاه
اولتراسونیکاتور UP200Ht با میکروتیپ 2mm S26d2 برای فراصوت از نمونه های کوچک
اطلاعات بیشتر در مورد چگونه شما می توانید هموژنایزر بافت مافوق صوت خود را برای اماده سازی کارامد و قابل اعتماد از راه حل های بافر استفاده کنید!
آمار ارزشمند دانستن
باکتری اشریشیا کلی
اشریشیا کلی یک نوع باکتری است، که غیر اسپور شکل، گرم منفی است و با شکل آن از یک میله مستقیم مشخص می شود. باکتری های ای.کلی در محیط زیست، غذاها، و روده های انسان و حیوانات وجود دارند. E. coli است که معمولا با استفاده از پرچم peritrichous، اما انواع غیر موتیله وجود دارد، بیش از حد. ای.کلی به اصطلاح ارگانیسم های شیمیورگانوتروف بی هوازی دانشکده ای هستند و این بدان معناست که هم قادر به سوخت و ساز تنفسی و هم سوخت و ساز تخمیری هستند. بیشتر انواع ای.کلی عملکردهای مفید خوش خیم و انجام شده در بدن هستند، به عنوان مانند سرکوب رشد گونه های باکتریایی مضر، سنتز ویتامین ها و غیره.
سلول باکتری اشریشیا کلی از نوع به اصطلاح B دسته ویژه ای از سویه های ای.کلی هستند که به طور گسترده ای در تحقیقات برای بررسی مکانیسم هایی مانند حساسیت باکتریوفاژ یا سیستم های تغییر محدودیت استفاده می شوند. علاوه بر این، باکتری E.coli به عنوان اسب کار قابل اعتماد برای بیان پروتئین در آزمایشگاه های بیوتکنولوژی و علوم زندگی ارزش گذاری شده است. به عنوان مثال، E.coli برای سنتز ترکیباتی مانند پروتئین ها و الیگو ساکریدها در مقیاس صنعتی استفاده می شود. با توجه به ویژگی های خاص مانند کمبود پروتاز، تولید استات پایین در سطح بالایی از گلوکز، و نفوذ پذیری افزایش یافته، سلول های E. coli B او اغلب سلول های میزبان برای تولید پروتئین های مهندسی ژنتیکی استفاده می شود.
پروتئین بازترکب
پروتئین های Recombinant (rProt) در حال کسب اهمیت قابل توجهی در شاخه های چند برابر، از جمله در تولید شیمیایی، داروسازی، آرایشی، پزشکی انسانی و حیوانی، کشاورزی، مواد غذایی و همچنین صنایع تصفیه زباله است.
تولید پروتئین ترکیب مجدد نیاز به استفاده از یک سیستم بیان دارد. به عنوان بیان سیستم های سلولی برای تولید DNA recombinant، هر دو سلول پروکاریوتی و یوکاریوتی می تواند مورد استفاده قرار گیرد. در حالی که سلول باکتریایی به طور گسترده ای برای بیان پروتئین استفاده می شود با توجه به عواملی مانند هزینه کم، مقیاس پذیری آسان و شرایط رسانه ای ساده، پستانداران، مخمر، جلبک ها، حشرات و سیستم های بدون سلول جایگزین تاسیس شده است. نوع پروتئین، فعالیت عملکردی، و همچنین عملکرد مورد نیاز پروتئین بیان شده بر انتخاب سیستم سلولی مورد استفاده برای بیان پروتئین تأثیر می گذارد.
به منظور بیان پروتئین recombinant، یک سلول خاص باید با یک بردار DNA حاوی قالب DNA recombinant منتقل شود. سپس سلول های منتقل شده با قالب کشت می شوند. به عنوان پیامد مکانیسم سلولی، سلول ها پروتئین مورد علاقه را رونویسی و ترجمه می کنند و در نتیجه پروتئین هدفمند را تولید می کنند.
همان طور که پروتئین های بیان شده در ماتریس سلولی محصور می شوند، سلول باید lysed (مختل و شکسته) شود تا پروتئین ها آزاد شوند. در یک مرحله تصفیه بعدی، پروتئین از هم جدا و تصفیه می شود.
اولین پروتئین بازترکب مورد استفاده در درمان، انسولین انسان در سال ۱۹۸۲ بود. امروزه بیش از ۱۷۰ نوع پروتئین ترکیب کننده در سراسر جهان برای درمان های پزشکی تولید می شود. پروتئین های نوترکابی مورد استفاده در پزشکی به عنوان مثال هورمون های نوترکبین، اینترفرون ها، اینترلوکین ها، عوامل رشد، عوامل نکروز تومور، عوامل لخته شدن خون، داروهای ترومبولیتیک، و آنزیم هایی برای درمان بیماری های عمده ای مانند دیابت، کوتوله، سکته قلبی، نارسایی اضطراری قلب، آپوپلکسی مغزی، مولتیپل اسکلروزیس، نوتروپنی، ترومبوسیتوپنی، کم خونی، هپاتیت، آرتریت روماتوئید، آسم، بیماری کرون، و درمان های سرطانی. (cf. Phuc V. Pham, in Omics Technologies and Bio-Engineering, 2018)
ادبیات/منابع
- Cheraghi S.; Akbarzade A.; Farhangi A.; Chiani M.; Saffari Z.; Ghassemi S.; Rastegari H.; Mehrabi M.R. (2010): Improved Production of L-lysine by Over-expression of Meso-diaminopimelate Decarboxylase Enzyme of Corynebacterium glutamicum in Escherichia coli. Pak J Biol Sci. 2010 May 15; 13(10), 2010. 504-508.
- LeThanh, H.; Neubauer, P.; Hoffmann, F. (2005): The small heat-shock proteins IbpA and IbpB reduce the stress load of recombinant Escherichia coli and delay degradation of inclusion bodies. Microb Cell Fact 4, 6; 2005.
- Martínez-Gómez A.I.; Martínez-Rodríguez S.; Clemente-Jiménez J.M.; Pozo-Dengra J.; Rodríguez-Vico F.; Las Heras-Vázquez F.J. (2007): Recombinant polycistronic structure of hydantoinase process genes in Escherichia coli for the production of optically pure D-amino acids. Appl Environ Microbiol. 73(5); 2007. 1525-1531.
- Kotowska M.; Pawlik K.; Smulczyk-Krawczyszyn A.; Bartosz-Bechowski H.; Kuczek K. (2009): Type II Thioesterase ScoT, Associated with Streptomyces coelicolor A3(2) Modular Polyketide Synthase Cpk, Hydrolyzes Acyl Residues and Has a Preference for Propionate. Appl Environ Microbiol. 75(4); 2009. 887-896.
VialTweeter sonicator (ویال گروهی) برای فراصوت به طور همزمان از 10 نمونه، به عنوان مثال برای مختل کردن سلول های BL21
مافوق صوت با کارایی بالا! محدوده محصول Hielscher را پوشش می دهد طیف کامل از سونوگرافی آزمایشگاه جمع و جور بیش از نیمکت بالا واحد به سیستم های مافوق صوت تمام صنعتی.