لیز سلولی سلول های BL21 با امواج فراصوت
سلول های BL21 سویه ای از E. coli هستند که به دلیل توانایی بیان پروتئین ها بسیار کارآمد در آزمایشگاه های تحقیقاتی، بیوتکنولوژی و تولیدات صنعتی بسیار مورد استفاده قرار می گیرند. اختلال سلول های اولتراسونیک، لیز و استخراج پروتئین روش رایج برای جداسازی و جمع آوری پروتئین های هدف از داخل سلولی سلول های BL21 است. امواج فراصوت سلول را به طور کامل مختل می کند و تمام پروتئین های به دام افتاده را آزاد می کند و 100٪ پروتئین را در دسترس قرار می دهد.
سلول های BL21 برای بیان پروتئین
سلول BL21 یک سویه باکتریایی E. coli با صلاحیت شیمیایی است که برای تبدیل و بیان پروتئین سطح بالا با استفاده از سیستم القایی T7 RNA پلیمراز-IPTG مناسب است. سلول های BL21 امکان بیان پروتئین با راندمان بالا را برای هر ژنی که تحت کنترل یک پروموتر T7 است فراهم می کنند. سویه E. coli BL21 (DE3) یک سویه تولید پروتئین مبتنی بر پلیمراز T7 RNA است که با بردارهای بیانی مبتنی بر پروموتر T7 ترکیب شده است و به طور گسترده در آزمایشگاه ها و صنعت برای تولید پروتئین های نوترکیب استفاده می شود. در BL21 (DE3)، بیان ژن کد کننده پروتئین نوترکیب توسط T7 RNA پلیمراز کدگذاری شده کروموزومی (T7 RNAP) رونویسی می شود که هشت برابر سریعتر از E. coli RNAP معمولی رونویسی می شود. این باعث می شود سویه BL21 (DE3) بسیار کارآمد باشد و آن را به یکی از محبوب ترین سیستم های سلولی بیان پروتئین تبدیل کند.
پروتکل برای لیز التراسونیک و استخراج پروتئین از سلول های BL21
لیز سلولی سلول های BL21 است که عمدتا با استفاده از سونوگرافی در ترکیب با سدیم لوروئیل سارکوزینات (همچنین به عنوان sarkosyl شناخته شده) به عنوان بافر لیز انجام. مزایای استفاده از اختلال سلول های مافوق صوت و استخراج پروتئین در قابلیت اطمینان، تکرارپذیری و همچنین ساده، ایمن و سریع عملیات مافوق صوت نهفته است. پروتکل زیر یک جهت گام به گام برای لیز سلول اولتراسونیک BL21 می دهد:
- به منظور حذف پروتئین های چاپرون، پلت های باکتریایی BL21 در 50 میلی لیتر بافر سدیم سرد Tris-EDTA (شامل 10 میلی مولار Tris-HCL، pH 8.0، 1 میلی مولار EDTA، 150 میلی مولار کلرید سدیم همراه با 100 میلی مولار PMSF) آویزان شدند.
- 500 لیزوزیم (10 میلی گرم در میلی لیتر) اضافه می شود و سلول ها به مدت 15 دقیقه روی یخ انکوبه می شوند.
- سپس 500 لیتر DTT و 7 میلی لیتر سارکوزیل (10 درصد (وزنی/حجمی) تشکیل شده در بافر STE) اضافه می شود.
- ضروری است که تمام بافرهای تصفیه یخ سرد نگه دارید و نمونه ها را همیشه روی یخ نگه دارید. در صورت امکان تمام مراحل تصفیه باید در اتاق سرد انجام شود.
- برای لیز اولتراسونیک و استخراج پروتئین، نمونه ها در فراصوت VialTweeter MultiSample Ultrasonicator برای 4 × 30 ثانیه در دامنه 100٪ با فاصله 2 دقیقه بین هر فراصوت. از طرف دیگر، یک هموژنایزر اولتراسونیک از نوع پروب با میکرو نوک به عنوان مثال، تا 200 هرتز با S26d2 (3 × 30 ثانیه، 2 دقیقه مکث بین چرخه های اولتراسونیک، دامنه 80٪) می توان استفاده کرد.
- برای مراحل تصفیه بیشتر، نمونه ها باید روی یخ نگهداری شوند یا در دمای -80 درجه سانتیگراد تا پردازش بیشتر نگهداری شوند.
مختل کننده سلول اولتراسونیک UP200St با میکرو نوک S26d2 برای لیز و استخراج پروتئین
لیز اولتراسونیک تحت کنترل دما Prescise
کنترل دقیق و قابل اعتماد دما هنگام رسیدگی به نمونه های بیولوژیکی بسیار مهم است. دمای بالا باعث تخریب پروتئین ناشی از حرارت در نمونه ها می شود.
به عنوان تمام تکنیک های آماده سازی نمونه مکانیکی، فراصوت ایجاد گرما. با این حال، دمای نمونه ها را می توان هنگام استفاده از VialTweeter به خوبی کنترل کرد. ما گزینه های مختلفی را برای نظارت و کنترل دمای نمونه های شما در حین آماده سازی آنها با VialTweeter و VialPress برای تجزیه و تحلیل به شما ارائه می دهیم.
- نظارت بر دمای نمونه: پردازنده اولتراسونیک UP200St که VialTweeter را هدایت می کند، مجهز به نرم افزار هوشمند و سنسور دما قابل اتصال است. سنسور دما را به UP200St وصل کنید و نوک سنسور دما را در یکی از لوله های نمونه قرار دهید. از طریق صفحه نمایش لمسی رنگی دیجیتال، می توانید در منوی UP200St یک محدوده دما خاص برای فراصوت نمونه خود را تنظیم کنید. اولتراسونیک به طور خودکار متوقف می شود زمانی که حداکثر دما رسیده است و مکث می کند تا زمانی که دمای نمونه به مقدار پایین تر از دمای تنظیم شده ∆. سپس فراصوت دوباره به طور خودکار شروع می شود. این ویژگی هوشمند از تخریب ناشی از گرما جلوگیری می کند.
- بلوک VialTweeter را می توان از قبل خنک کرد. بلوک VialTweeter (فقط سونوترود بدون مبدل!) را در یخچال یا فریزر قرار دهید تا بلوک تیتانیوم از قبل خنک شود و به تعویق انداختن افزایش دما در نمونه کمک می کند. در صورت امکان، خود نمونه را می توان از قبل خنک کرد.
- استفاده از یخ خشک برای خنک شدن در طول فراصوت. از یک سینی کم عمق پر از یخ خشک استفاده کنید و VialTweeter را روی یخ قرار دهید تا گرما به سرعت از بین برود.
مشتریان در سراسر جهان از VialTweeter و VialPress برای کارهای آماده سازی نمونه روزانه خود در آزمایشگاه های بیولوژیکی، بیوشیمیایی، پزشکی و بالینی استفاده می کنند. نرم افزار هوشمند و کنترل دما پردازنده UP200St، دما به طور قابل اعتماد کنترل می شود و از تخریب نمونه ناشی از گرما جلوگیری می شود. آماده سازی نمونه اولتراسونیک با VialTweeter و VialPress نتایج بسیار قابل اعتماد و قابل تکرار را ارائه می دهد!
مختل کننده اولتراسونیک بهینه را برای برنامه لیز خود پیدا کنید
Hielscher مافوق صوت طولانی مدت تولید کننده با تجربه از اختلالات سلول اولتراسونیک با کارایی بالا و هموژنایزرها برای آزمایشگاه ها، نیمکت بالا و سیستم های مقیاس صنعتی است. اندازه کشت سلولی باکتریایی شما، هدف تحقیق یا تولید شما و حجم سلول برای پردازش در ساعت یا روز عوامل ضروری برای یافتن مختل کننده سلول اولتراسونیک مناسب برای برنامه شما هستند.
Hielscher مافوق صوت ارائه می دهد راه حل های مختلف برای فراصوت همزمان از چند نمونه (تا 10 ویال با VialTweeter) و نمونه های توده (به عنوان مثال، صفحات میکروتیتر / صفحات ELISA با UIP400MTP)، و همچنین کلاسیک پروب نوع آزمایشگاه ultrasonicator با سطوح مختلف قدرت از 50 تا 400 وات به پردازنده های مافوق صوت به طور کامل صنعتی با تا 16،000 وات در هر واحد برای اختلال سلول های تجاری و استخراج پروتئین در تولید بزرگ. همه مافوق صوت Hielscher برای عملیات 24/7/365 تحت بار کامل ساخته شده است. استحکام و قابلیت اطمینان از ویژگی های اصلی دستگاه های اولتراسونیک ما است.
تمام هموژنایزرهای اولتراسونیک دیجیتال مجهز به نرم افزار هوشمند، صفحه نمایش لمسی رنگی و پروتکل سازی خودکار داده ها هستند که دستگاه اولتراسونیک را به یک ابزار کار مناسب در آزمایشگاه و امکانات تولید تبدیل می کند.
به ما اطلاع دهید ، چه نوع سلول ها ، چه حجمی ، با چه فرکانس و با چه هدفی برای پردازش نمونه های بیولوژیکی خود دارید. ما به شما مناسب ترین مختل کننده سلول اولتراسونیک را برای نیازهای فرآیند خود توصیه می کنیم.
جدول زیر به شما نشانه ای از ظرفیت پردازش تقریبی سیستم های اولتراسونیک ما از هموژنایزرهای دستی جمع و جور و MultiSample Ultrasonicators به پردازنده های اولتراسونیک صنعتی برای کاربردهای تجاری می دهد:
| حجم دسته ای | نرخ جریان | دستگاه های توصیه شده |
|---|---|---|
| صفحات 96 چاه / میکروتیتر | ن.ا. | UIP400MTP |
| 10 ویال à 0.5 تا 1.5 میلی لیتر | ن.ا. | VialTweeter در UP200St |
| 00.01 تا 250 میلی لیتر | 5 تا 100 میلی لیتر در دقیقه | UP50H |
| 00.01 تا 500 میلی لیتر | 10 تا 200 میلی لیتر در دقیقه | UP100H |
| 10 تا 2000 میلی لیتر | 20 تا 400 میلی لیتر در دقیقه | تا 200 هرتز، UP400St |
| 0.1 تا 20 لیتر | 0.2 تا 4 لیتر در دقیقه | UIP2000hdT |
| 10 تا 100 لیتر | 2 تا 10 لیتر در دقیقه | UIP4000hdT |
| ن.ا. | 10 تا 100 لیتر در دقیقه | UIP16000 |
| ن.ا. | بزرگتر | خوشه ای از UIP16000 |
تماس با ما! / از ما بپرسید!
UIP400MTP صفحه صوتی برای اختلال سلولی با توان بالا در صفحات 96 چاهی
ultrasonicator تا 200 هرتز با microtip 2mm S26d2 برای فراصوت نمونه های کوچک
بیشتر بخوانید در مورد اینکه چگونه می توانید از هموژنایزر بافت اولتراسونیک خود برای آماده سازی کارآمد و قابل اعتماد محلول های بافر استفاده کنید!
حقایقی که ارزش دانستن دارند
باکتری اشریشیا کلی
اشریشیا کلی یک نوع باکتری است که غیر اسپور تشکیل دهنده ، گرم منفی است و با شکل میله مستقیم مشخص می شود. باکتری E.coli در محیط، غذاها و روده های انسان و حیوانات وجود دارد. E. coli معمولا با استفاده از تاژک های پریتریکوس متحرک است، اما انواع غیر متحرک نیز وجود دارد. E.coli به اصطلاح ارگانیسم های شیمی ارگانوتروپ بی هوازی اختیاری هستند، به این معنی که آنها قادر به متابولیسم تنفسی و تخمیری هستند. اکثر انواع E.coli خوش خیم هستند و عملکردهای مفیدی را در بدن انجام می دهند، به عنوان مثال سرکوب رشد گونه های باکتریایی مضر، سنتز ویتامین ها و غیره.
سلول باکتری اشریشیا کلی از نوع B به اصطلاح دسته خاصی از سویه های E.coli است که به طور گسترده ای در تحقیقات برای بررسی مکانیسم هایی مانند حساسیت باکتریوفاژ یا سیستم های اصلاح محدودیت استفاده می شود. علاوه بر این، باکتری E.coli به عنوان اسب کار قابل اعتماد برای بیان پروتئین در آزمایشگاه های بیوتکنولوژی و علوم زیستی ارزشمند است. به عنوان مثال، از E.coli برای سنتز ترکیباتی مانند پروتئین ها و الیگوساکاریدها در مقیاس صنعتی استفاده می شود. با توجه به ویژگی های خاص مانند کمبود پروتئاز ، تولید کم استات در سطح بالای گلوکز و افزایش نفوذپذیری ، سلولهای E. coli B بیشترین استفاده را از سلولهای میزبان برای تولید پروتئین های مهندسی ژنتیکی دارند.
پروتئین نوترکیب
پروتئین های نوترکیب (rProt) در شاخه های مختلف از جمله در صنایع تولید مواد شیمیایی، دارویی، آرایشی و بهداشتی، پزشکی انسانی و حیوانی، کشاورزی، مواد غذایی و همچنین صنایع تصفیه زباله اهمیت قابل توجهی پیدا می کنند.
تولید پروتئین نوترکیب نیاز به استفاده از یک سیستم بیان دارد. به عنوان بیان سیستم های سلولی برای تولید DNA نوترکیب ، می توان از سلول های پروکاریوتی و یوکاریوتی استفاده کرد. در حالی که سلول های باکتریایی به دلیل عواملی مانند هزینه کم، مقیاس پذیری آسان و شرایط محیطی ساده به طور گسترده ای برای بیان پروتئین استفاده می شوند، پستانداران، مخمرها، جلبک ها، حشرات و سیستم های عاری از سلول جایگزین هایی هستند. نوع پروتئین، فعالیت عملکردی و همچنین بازده مورد نیاز پروتئین بیان شده بر انتخاب سیستم سلولی مورد استفاده برای بیان پروتئین تأثیر می گذارد.
به منظور بیان پروتئین نوترکیب، یک سلول خاص باید با یک بردار DNA حاوی الگوی DNA نوترکیب ترانسفکت شود. سپس سلول های ترانسفکت شده با الگو کشت داده می شوند. در نتیجه مکانیسم سلولی ، سلول ها پروتئین مورد نظر را رونویسی و ترجمه می کنند و در نتیجه پروتئین مورد نظر تولید می کنند.
از آنجا که پروتئین های بیان شده در ماتریکس سلولی به دام می افتند ، سلول باید لیز شود (مختل و شکسته) تا پروتئین ها آزاد شوند. در مرحله تصفیه بعدی ، پروتئین جدا و خالص می شود.
اولین پروتئین نوترکیب مورد استفاده در درمان، انسولین نوترکیب انسانی در سال 1982 بود. امروزه بیش از 170 نوع پروتئین نوترکیب در سراسر جهان برای درمان های پزشکی تولید می شود. پروتئین های نوترکیب که معمولا در پزشکی مورد استفاده قرار می گیرند عبارتند از: هورمون های نوترکیب، اینترفرون ها، اینترلوکین ها، فاکتورهای رشد، فاکتورهای نکروز تومور، فاکتورهای لخته شدن خون، داروهای ترومبولیتیک و آنزیم هایی برای درمان بیماری های عمده مانند دیابت، کوتولگی، انفارکتوس میوکارد، نارسایی احتقانی قلب، آپوپلکسی مغزی، مولتیپل اسکلروزیس، نوتروپنی (neutropenia)، ترومبوسیتوپنی، کم خونی، هپاتیت، آرتریت روماتوئید، آسم، بیماری کرون و درمان های سرطان. (رجوع کنید به Phuc V. Pham، در Omics Technologies and Bio-Engineering، 2018)
ادبیات / منابع
- Cheraghi S.; Akbarzade A.; Farhangi A.; Chiani M.; Saffari Z.; Ghassemi S.; Rastegari H.; Mehrabi M.R. (2010): Improved Production of L-lysine by Over-expression of Meso-diaminopimelate Decarboxylase Enzyme of Corynebacterium glutamicum in Escherichia coli. Pak J Biol Sci. 2010 May 15; 13(10), 2010. 504-508.
- LeThanh, H.; Neubauer, P.; Hoffmann, F. (2005): The small heat-shock proteins IbpA and IbpB reduce the stress load of recombinant Escherichia coli and delay degradation of inclusion bodies. Microb Cell Fact 4, 6; 2005.
- Martínez-Gómez A.I.; Martínez-Rodríguez S.; Clemente-Jiménez J.M.; Pozo-Dengra J.; Rodríguez-Vico F.; Las Heras-Vázquez F.J. (2007): Recombinant polycistronic structure of hydantoinase process genes in Escherichia coli for the production of optically pure D-amino acids. Appl Environ Microbiol. 73(5); 2007. 1525-1531.
- Kotowska M.; Pawlik K.; Smulczyk-Krawczyszyn A.; Bartosz-Bechowski H.; Kuczek K. (2009): Type II Thioesterase ScoT, Associated with Streptomyces coelicolor A3(2) Modular Polyketide Synthase Cpk, Hydrolyzes Acyl Residues and Has a Preference for Propionate. Appl Environ Microbiol. 75(4); 2009. 887-896.
سونیکاتور VialTweeter برای فراصوت همزمان 10 نمونه، به عنوان مثال برای مختل کردن سلول های BL21
اولتراسونیک با کارایی بالا! محدوده محصول Hielscher را پوشش می دهد طیف کامل از ultrasonicator آزمایشگاه جمع و جور بیش از واحدهای نیمکت بالا به سیستم های اولتراسونیک تمام صنعتی.