آمادگی نمونه مافوق صوت برای الایزا Assays
آزمون هایی مانند الیزا به طور گسترده ای برای تشخیص های درون آزمایشگاهی، تشخیص پروتئین مرتبط با بیماری و کنترل کیفیت (مانند نظارت بر مواد آلرژی زا مواد غذایی) مورد استفاده قرار می گیرند. آماده سازی نمونه مافوق صوت یک تکنیک سریع، قابل اعتماد و قابل تکثیر برای lyse سلول و جداسازی پروتئین های داخل سلولی، DNA، RNA و اندامک است. Hielscher مافوق صوت ارائه می دهد راه حل های مختلف مافوق صوت برای آماده سازی مناسب از نمونه های تنها, ویال های متعدد و همچنین برای صفحات میکروتیتر و صفحات 96 چاه.
Elisa – آنزیم مرتبط با ایمونوسوربنت Assay
الیزا مخفف آزمون ایمونوسوربنت مرتبط با آنزیم است و یک تکنیک تجزیه و تحلیل بیوشیمیایی به طور گسترده ای مورد استفاده از رده آزمون های اتصال لیگاند است. در الایزا، یک نمونه مایع بر روی یک فاز جامد ثابت با خواص اتصال ویژه اضافه می شود. به طور معمول فاز ثابت جامد به صورت پوشش به یک صفحه چاه یا صفحه الایزا اعمال می شود. سپس واکنشگرهای مختلف مایع به صورت پی در پی اضافه، انکوبه، و شسته می شوند، به طوری که در نهایت یک تغییر نوری (به عنوان مانند توسعه رنگ توسط محصول یک واکنش آنزیمی) در مایع نهایی در چاه رخ می دهد. تغییر نوری اجازه می دهد تا کمیت آنالیت را توسط یک به اصطلاح کمی اندازه گیری کند “خواندن". برای خواندن کمی از یک طیف سنج، فلوئورومتر، یا لومینومتر برای تشخیص و اندازه گیری شدت نور منتقل شده استفاده می شود. حساسیت تشخیص تحت تأثیر تقویت سیگنال در طول واکنش های تحلیلی قرار می گیرد. از آنجا که واکنش های آنزیمی به خوبی بررسی می شوند و فرایندهای تقویت قابل اعتمادی دارند، از آنزیم ها برای ایجاد سیگنال استفاده می شود. آنزیم ها به رجنت های تشخیص به نسبت های ثابت مرتبط هستند تا اجازه کمی سازی دقیق را دهند که نام ارزیابی ایمونوسوربنت مرتبط با آنزیم را نیز توضیح می دهد.
از آنجا که الایزا در صفحات میکروتیتر / صفحات 96 چاه انجام می شود، به عنوان تکنیک اندازه گیری مبتنی بر صفحه شناخته می شود و به عنوان مانند در تشخیص بالینی در شرایط آزمایشگاهی، تحقیق، توسعه دارو و غیره برای تشخیص و کمی سازی آنتی بادی ها، پپتیدها، پروتئین ها، و هورمون ها استفاده می شود.
تکنیک الیزا اغلب به عنوان یک ابزار تشخیصی در پزشکی، بیوتک، آسیب شناسی گیاهی مورد استفاده قرار می گیرد و همچنین یک اندازه گیری کنترل کیفیت مهم در صنایع متعدد است.
نمونه مافوق صوت واحد آمادگی VialTweeter(ویال گروهی) برای لیز سلولی و استخراج پروتئین قبل از الایزا استفاده می شود
آمادگی نمونه مافوق صوت قبل از الیزا
قبل از انجام آزمون الایزا، نمونه ها نیاز به مراحل آماده سازی چنین لیز سلولی و استخراج پروتئین های داخل سلولی، DNA، RNA و غیره دارند. مزیت لیز سلول مافوق صوت و جداسازی پروتئین بهره وری بالا، قابلیت اطمینان و قابلیت تکثیر آن است. همه این عوامل به منظور به دست آوردن تشخیص با کیفیت بالا و نتایج تحقیقات مهم هستند
- درمان نمونه همگن
- لیز کامل
- استخراج کامل پروتئین (مانند آنتی بادی، DNA)
- سازگاری بهینه با نوع سلول
- برای هر حجم نمونه
- تجدید پذیر
- کنترل دما
- پروتکل خودکار داده ها بر روی کارت SD
پروتکل برای لیز سلول مافوق صوت قبل از الیزا
- برای کشت سلول: قبل از لیز سلول مافوق صوت، سلول های سنتریفیوژ به مدت 5 دقیقه در 270 x g در میکروسنتریفیوژ. حذف supernatant توسط آسپیراسیون و سلول های resuspend در 30 -- 100 میکرول بافر RIPA. سپس گلوله سلول را به مدت 30 دقیقه روی یخ جوجه کشی کنید.
- در حال حاضر، نمونه سلول آماده برای لیز مافوق صوت:
استفاده از یک مافوق صوت از نوع کاوشگر (به عنوان مانند. UP200Ht با کاوشگر S26d2) و یا دستگاه چند نمونه مافوق صوت (به عنوان نمونه VialTweeter برای فراصوت همزمان تا 10 ویال و یا UIP400MPT برای صفحات میکروتیتر / 96 - صفحات چاه) بسته به مقدار نمونه شما نیاز به آماده سازی.
برای فراصوت از نوع کاوشگر یک نمونه واحد، سلول ها را در لوله های میکروسنتریفیوژ ۱٫۵ میلیL قرار می دهند. - از پیش تنظیم مدت زمان مافوق صوت خود را، ورودی انرژی کل، حالت چرخه و / یا محدودیت های درجه حرارت در منوی دیجیتال از مافوق صوت. این امر فراصوت و تکرار پذیری بسیار قابل اعتمادی را تضمین می کند.
- شروع sonotrode و سوئیچ دستگاه مافوق صوت در. به آرامی حرکت میکرو نوک کاوشگر مافوق صوت را از طریق نمونه به sonicate نمونه به طور یکنواخت.
برای اکثر سلول ها, لیز مافوق صوت خواهد شد پس از 2 -4 چرخه از 10 ثانیه فراصوت تکمیل. - پس از فراصوت، sonotrode را از نمونه بردارید. نمونه ها باید به مدت ۵ دقیقه روی یخ جوجه کشی شوند. سپس، سنتریفیوژ در 10،000 x گرم به مدت 20 دقیقه به گلوله باقی مانده است. انتقال supernatants به یک لوله میکروسنترریفوژ جدید. برچسب تجزیه و تحلیل و ذخیره در -20 درجه سانتی گراد.
- sonotrode مافوق صوت را می توان با پاک کردن آن را به درستی با الکل و یا sonicate در beaker پر از الکل تمیز, به عنوان مانند 70% اتانول. تمام پروب های مافوق صوت ساخته شده از تیتانیوم اتوکلاوبل هستند.
برای همگن های بافتی:
- بافت را با PBS سرد یخ (0.01M، pH=7.4) شستشو دهید تا خون همولیز اضافی به طور کامل حذف شود.
- وزن بافت (کلیه، قلب، ریه، طحال و غیره) و macerate آن را به قطعات کوچک، که در PBS همگن. حجم PBS مورد نیاز مربوط به وزن بافت است. به عنوان یک قاعده شست، 1g بافت نیاز به تقریبا 9mL PBS. توصیه می شود مقداری مهارکننده پروتاز به پی بی اس اضافه شود. (ریپا یا بافر لیز هیپوتونیک حاوی پروتاز و کوکتل مهارکننده فسفاتاز می تواند به طور جایگزین مورد استفاده قرار گیرد.)
- بسته به اندازه بافت، یک درمان گرداب کوتاه (تقریباً ۱ تا ۲ دقیقه در ۱۵ ثانیه پالس) می تواند برای پیش درمان بافت مفید باشد.
- سوار نوک میکرو، به عنوان مانند S26d2، به مافوق صوت خود را. لوله نمونه را با بافت در حمام یخ قرار می دهد.
- Sonicate نمونه با مافوق صوت خود را، به عنوان نمونه UP200St (80٪ دامنه) برای 1 دقیقه. در حالت پالس (15sec در، مکث 15sec). نمونه را در حمام یخ نگه دارید.
- سپس هموژنات ها برای به دست آوردن استخرهای خاص (سیتوزولیک، هسته ای، میتوکندری یا lysosomal) به منظور غنی سازی پروتئین برای تجزیه و تحلیل، سنتریفوژ می شوند. با سنتریفوژ کردن نمونه به مدت ۵ دقیقه در ۵۰۰۰× گرم، ابرناتاانت بازیابی می شود.
Sonotrode MTP-24-8-96 دارای هشت پروب مافوق صوت برای فراصوت از چاه های صفحات میکروتیتر.
کنترل دما قابل اعتماد در طول فراصوت
دما یک عامل بسیار مهم تأثیرگذار بر فرایند است که به ویژه برای درمان نمونه های بیولوژیکی مهم است، به عنوان نمونه برای جلوگیری از تخریب حرارتی پروتئین ها. به عنوان تمام تکنیک های آماده سازی نمونه مکانیکی، فراصوت گرما ایجاد می کند. با این حال، دمای نمونه ها را می توان به خوبی در هنگام استفاده از دستگاه های اولتراسونیک Hielscher کنترل کرد. ما به شما گزینه های مختلف برای نظارت و کنترل درجه حرارت از نمونه های خود را در حالی که آماده سازی آنها را با مافوق صوت نوع کاوشگر و یا VialTweeter قبل از تجزیه و تحلیل ارائه.
- نظارت بر دمای نمونه: تمام پردازنده های مافوق صوت دیجیتال Hielscher مجهز به یک نرم افزار هوشمند و سنسور دمای قابل وصل هستند. سنسور دما را به دستگاه مافوق صوت وصل کنید (به عنوان مانند، UP200Ht، UP200St، VialTweeter(ویال گروهی), UIP400MTP) و قرار دادن نوک سنسور دما در یکی از لوله های نمونه. از طریق دیجیتال رنگی لمسی صفحه نمایش، شما می توانید در منوی پردازنده مافوق صوت محدوده درجه حرارت خاص برای فراصوت نمونه خود را تنظیم کنید. مافوق صوت به طور خودکار متوقف خواهد شد زمانی که حداکثر درجه حرارت رسیده است و مکث تا دمای نمونه پایین به ارزش پایین تر از دمای مجموعه ∆. سپس فراصوت دوباره به طور خودکار شروع می شود. این ویژگی هوشمند از تخریب ناشی از گرما جلوگیری می کند.
- با توجه به اولتراسونیک چند نمونه واحد VialTweeter، بلوک تیتانیوم، که نگه داشتن لوله نمونه، می تواند از پیش سرد شده است. قرار دادن بلوک VialTweeter (تنها sonotrode بدون transducer!) را به یخچال یا فریزر برای قبل از خنک کردن بلوک تیتانیوم کمک می کند تا به تعویق انداختن افزایش دما در نمونه. در صورت امکان، خود نمونه نیز می تواند از پیش سرد شود.
- استفاده از حمام یخ و یا یخ خشک برای خنک شدن در طول فراصوت. لوله نمونه (ها) خود را در طول فراصوت را به حمام یخ قرار داده است. برای VialTweeter از سینی کم عمق پر از یخ خشک استفاده کنید و VialTweeter را روی یخ خشک قرار دهید تا گرما به سرعت از بین برد.
مشتریان در سراسر جهان استفاده از Hielscher پروب مافوق صوت و همچنین چند نمونه واحدهای فراصوت VialTweeter و UIP400MTP برای کار آماده سازی نمونه روزانه خود را در آزمایشگاه های بیولوژیکی، بیوشیمیایی، پزشکی و بالینی. نرم افزار هوشمند و کنترل دما پردازنده های هایلشر، دما به طور قابل اعتمادی کنترل می شود و از تخریب نمونه ناشی از گرما اجتناب می شود. آماده سازی نمونه مافوق صوت با Hielscher راه حل های مافوق صوت ارائه نتایج بسیار قابل اعتماد و قابل تکثیر!
تماس با ما! / از ما بپرسید!
Hielscher مافوق صوت تولید هموژنایزر مافوق صوت با عملکرد بالا برای مخلوط کردن برنامه های کاربردی، پراکنده، تقلید و استخراج در آزمایشگاه، خلبان و مقیاس صنعتی است.
ادبیات/منابع
- Brandy Verhalen , Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
- Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
- Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed. Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.
- Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.
آمار ارزشمند دانستن
انواع الیزا
انواع مختلفی از ELISA وجود دارد که با اصل عملکرد آن ها متمایز می شوند. آن ها به عنوان الیزا مستقیم، الیزا غیر مستقیم، ساندویچ الیزا، الیزا رقابتی، و الیزا معکوس شناخته می شوند. در زیر ، ما به شما ارائه یک بررسی اجمالی بیش از انواع مختلف الایزا و ویژگی های اصلی و تفاوت های آنها.
الیزا ممکن است به صورت کیفی یا کمی اجرا شود. نتایج کیفی یک نتیجه مثبت یا منفی ساده را فراهم می کند، در حالی که در الیزا کمی چگالی نوری (OD) نمونه با یک منحنی استاندارد مقایسه می شود، که به طور معمول یک رقیق سازی سریالی از یک محلول غلظت شناخته شده مولکول هدف است.
الیزابت مستقیم
الیزا مستقیم ساده ترین شکل اندازه گیری الیزا است، جایی که تنها از یک آنتی بادی اولیه با برچسب آنزیم استفاده می شود و آنتی بادی های ثانویه مورد نیاز نیست. آنتی بادی اولیه با برچسب آنزیم مستقیماً به هدف متصل می شود، مانند آنتیژن. محلول آنتی ژن بافر شده به هر چاه یک صفحه میکروتیتر (معمولاً صفحات ۹۶ چاهی، الیزا-صفحات) اضافه می شود، جایی که از طریق برهم کنش های بار به سطح پلاستیک می چسبد. هنگامی که آنزیم مرتبط با آنتی بادی اولیه با بستر خود واکنش نشان می دهد، سیگنال قابل مشاهده ای تولید می کند که می تواند از طریق اسپکتروفتومتر، فلورومتر، یا لومینومتر اندازه گیری شود.
الیزا غیر مستقیم
برای آزمایش غیر مستقیم الایزا، هم به یک آنتی بادی اولیه و هم یک آنتی بادی ثانویه نیاز است. با این حال، بر خلاف الیزا مستقیم، نه آنتی بادی اولیه، بلکه آنتی بادی ثانویه با یک آنزیم برچسب گذاری شده است. آنتیژن به صفحه چاه بی حرکت می شود و توسط آنتی بادی اولیه محدود می شود. متعاقباً آنتی بادی ثانویه با برچسب آنزیم به آنتی بادی اولیه متصل می شود. در نهایت آنزیم مرتبط با آنتی بادی ثانویه با بستر خود واکنش می دهد تا سیگنال قابل مشاهده ای تولید کند که قابل تشخیص باشد.
ساندویچ الیزا
در حالی که در آزمایش های مستقیم و غیر مستقیم الیزا، آنتیژن بی حرکت و پوشش داده شده به سطح صفحه چاه، در ساندویچ الیزا آنتی بادی به سطح پلاستیکی صفحه الیزا بی حرکت است. آنتی بادی های بی حرکت در ساندویچ الیزا به عنوان آنتی بادی های ضبط شناخته می شوند. علاوه بر این به آنتی بادی ضبط، در ساندویچ الیزا نیز به اصطلاح آنتی بادی تشخیص مورد نیاز است. آنتی بادی های تشخیص شامل یک آنتی بادی تشخیص اولیه بدون برچسب و یک آنتی بادی تشخیص ثانویه با برچسب آنزیم است.
گام به گام، آنتیژن مورد علاقه به آنتی بادی ضبط بی حرکت به صفحه متصل می شود. سپس آنتی بادی تشخیص اولیه به آنتی ژن متصل می شود. پس از آن آنتی بادی تشخیص ثانویه به آنتی بادی تشخیص اولیه متصل می شود. در مرحله واکنش نهایی، آنزیم با بستر خود واکنش می دهد تا یک سیگنال مرئی تولید کند که می تواند به صورت نوری تشخیص داده شود.
رقابتی الیزا
الیزا رقابتی که با نام مهار الیزا نیز شناخته می شود، پیچیده ترین نوع الیزا است زیرا شامل استفاده از یک آنتیژن مهارکننده است. هر یک از سه فرمت، مستقیم، غیر مستقیم، و ساندویچ ELISA، می تواند با فرمت رقابتی الایزا سازگار شده است. در الیزا رقابتی، آنتیژن مهارکننده و آنتیژن مورد علاقه برای اتصال به آنتی بادی اولیه رقابت می کنند.
برای الایزا رقابتی، آنتی بادی بدون نشان در حضور آنتیژن آن، به عنوان نمونه انکوبه می شود. سپس این مجتمع های آنتی بادی/آنتیژن مقید به یک چاه با پوشش آنتیژن اضافه می شوند.
بشقاب شسته می شود، به طوری که آنتی بادی های بی کران برداشته می شوند. الیزا رقابتی به دلیل این که هر چه آنتیژن بیشتری در نمونه باشد نام خود را دارد، مجتمع های آنتیژن-آنتی بادی بیشتری تشکیل می شوند. این بدان معنی است که آنتی بادی های بی کران کمتری برای اتصال به آنتیژن در چاه در دسترس هستند و آنتیژن ها باید برای یک آنتی بادی در دسترس رقابت کنند. یک آنتی بادی ثانویه، مطابق با آنتی بادی اولیه، اضافه می شود. این آنتی بادی دوم به آنزیم مرتبط است. هنگامی که بستر اضافه می شود، آنزیم های باقی مانده یک سیگنال کروموژنیک یا فلورسنت تولید می کنند.
در این مرحله واکنش متوقف می شود تا از اشباع نهایی سیگنال جلوگیری شود.
برخی کیت های رقابتی الیزا شامل یک آنتیژن مرتبط با آنزیم به جای یک آنتی بادی مرتبط با آنزیم هستند. آنتیژن برچسب دار برای سایت های اتصال آنتی بادی اولیه با آنتیژن نمونه (بدون برچسب) رقابت می کند. هر چه آنتیژن در نمونه کمتر باشد، آنتیژن برچسب دارتر در چاه حفظ می شود و سیگنال قوی تر می شود.
الایزا معکوس
الیزا معکوس از صفحات خوبی استفاده نمی کند، اما آنتیژن های معلق در مایع آزمایش را ترک می کند. آزمون الیزا معکوس میزان آنتی بادی کران دار را از طریق آنتیژن اندازه گیری می کند. به طور خاص برای تشخیص و بررسی پروتئین پاکت ویروس نیل غربی و چگونگی یافتن آنتی بادی های خاص ویروس توسعه یافت.
نشانگر آنزیمی مورد استفاده برای الیزا
لیست زیر شایع ترین نشانگرهای آنزیمی مورد استفاده در سنجش الیزا را می دهد که اجازه می دهد نتایج سنجش پس از تکمیل اندازه گیری شود.
- OPD (o-phenylenediamine dihydrochloride) تبدیل کهربا برای تشخیص HRP (Horseradish Peroxidase) ، که اغلب به عنوان یک پروتئین مزدواژ استفاده می شود.
- TMB (3,3′,5,5′-تترا متیل بنزیدین) هنگام تشخیص HRP آبی می شود و پس از اضافه شدن اسید فسفریک یا فسفریک زرد می شود.
- ABTS (2,2′-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-سولفونیک اسید]-نمک دی آمونیوم) در هنگام تشخیص HRP سبز می شود.
- PNPP (p-Nitrophenyl Phosphate, Disodium Salt) هنگام تشخیص فسفاتاز قلیایی زرد می شود.