آماده سازی نمونه اولتراسونیک برای سنجش ELISA
سنجش هایی مانند ELISA به طور گسترده ای برای تشخیص آزمایشگاهی، تشخیص پروتئین مرتبط با بیماری و کنترل کیفیت (به عنوان مثال پایش آلرژن های غذایی) استفاده می شود. آماده سازی نمونه اولتراسونیک سریع، قابل اعتماد و تکرارپذیر برای لیز سلول و جداسازی پروتئین های داخل سلولی، DNA، RNA و اندامک ها است. Hielscher مافوق صوت ارائه می دهد راه حل های مختلف اولتراسونیک برای آماده سازی مناسب از نمونه های تک، ویال های متعدد و همچنین برای صفحات microtiter و صفحات 96 چاه.
Elisa – سنجش جاذب ایمنی مرتبط با آنزیم
ELISA مخفف سنجش ایمونوسوربنت مرتبط با آنزیم است و یک تکنیک تجزیه و تحلیل بیوشیمیایی پرکاربرد در دسته سنجش های متصل به لیگاند است. در الایزا، یک نمونه مایع به یک فاز جامد ثابت با خاصیت اتصال خاص اضافه می شود. به طور معمول، فاز جامد ثابت به عنوان پوشش به یک صفحه چاه یا صفحه الایزا اعمال می شود. سپس، معرف های مایع مختلف به طور متوالی اضافه می شوند، انکوبه می شوند و شسته می شوند، به طوری که در نهایت یک تغییر نوری (به عنوان مثال، توسعه رنگ توسط محصول یک واکنش آنزیمی) در مایع نهایی در چاه رخ می دهد. تغییر نوری اجازه می دهد تا مقدار آنالیت را با اصطلاحا کمی اندازه گیری کنید “خواندن". برای قرائت کمی، از اسپکتروفتومتر، فلورومتر یا لومینومتر برای تشخیص و اندازه گیری شدت نور ارسالی استفاده می شود. حساسیت تشخیص تحت تأثیر تقویت سیگنال در طول واکنش های تحلیلی است. از آنجایی که واکنش های آنزیمی به خوبی بررسی شده و فرآیندهای تقویت قابل اعتماد هستند، از آنزیم ها برای ایجاد سیگنال استفاده می شود. آنزیم ها به نسبت های ثابت به معرف های تشخیص متصل می شوند تا امکان اندازه گیری دقیق را فراهم کنند ، که نام سنجش جاذب ایمنی "مرتبط با آنزیم" را نیز توضیح می دهد.
از آنجایی که سنجش های الایزا در صفحات میکروتیتر / صفحات 96 چاهی انجام می شود، به عنوان تکنیک سنجش مبتنی بر صفحه شناخته می شود و به عنوان مثال در تشخیص بالینی آزمایشگاهی، تحقیقات، توسعه دارو و غیره برای تشخیص و تعیین کمیت آنتی بادی ها، پپتیدها، پروتئین ها و هورمون ها استفاده می شود.
تکنیک الایزا اغلب به عنوان یک ابزار تشخیصی در پزشکی، بیوتکنولوژی، آسیب شناسی گیاهی استفاده می شود و همچنین یک اندازه گیری مهم کنترل کیفیت در صنایع مختلف است.
واحد آماده سازی نمونه اولتراسونیک VialTweeter برای لیز سلولی و استخراج پروتئین قبل از سنجش الایزا استفاده می شود
التراسونیک نمونه آماده سازی قبل از ELISA
قبل از انجام سنجش الایزا، نمونه ها نیاز به مراحل آماده سازی مانند لیز سلولی و استخراج پروتئین های داخل سلولی، DNA، RNA و غیره دارند. مزیت لیز سلول اولتراسونیک و جداسازی پروتئین راندمان بالا، قابلیت اطمینان و تکرارپذیری آن است. همه این عوامل به منظور به دست آوردن نتایج تشخیصی و تحقیقاتی با کیفیت بالا مهم هستند
- درمان نمونه همگن
- لیز کامل
- استخراج کامل پروتئین (به عنوان مثال آنتی بادی ها، DNA)
- سازگاری بهینه با نوع سلول
- برای هر اندازه نمونه
- قابل تکرار
- کنترل دما
- پروتکل خودکار داده ها روی کارت SD
پروتکل لیز سلول اولتراسونیک قبل از ELISA
- برای کشت سلولی: قبل از لیز سلول اولتراسونیک، سلول های سانتریفیوژ به مدت 5 دقیقه در دمای 270 x گرم در یک میکرو سانتریفیوژ. مایع رویی را با آسپیراسیون بردارید و سلول ها را در 30 تا 100 میکرولیتر بافر RIPA معلق کنید. سپس، پلت سلول را به مدت 30 دقیقه روی یخ انکوبه کنید.
- اکنون، نمونه سلول برای لیز اولتراسونیک آماده است:
از یک اولتراسونیک از نوع پروب استفاده کنید (به عنوان مثال تا 200 هرتز با کاوشگر S26d2) یا یک دستگاه چند نمونه اولتراسونیک (به عنوان مثال VialTweeter برای فراصوت همزمان تا 10 ویال یا UIP400MPT برای صفحات میکروتیتر / صفحات 96 چاه) بسته به مقدار نمونه شما نیاز به آماده سازی.
برای فراصوت پروب نوع از یک نمونه واحد ، سلول ها را در لوله های میکرو سانتریفیوژ 1.5 میلی لیتر قرار دهید. - مدت زمان اولتراسونیک خود را از قبل تنظیم کنید، کل ورودی انرژی، حالت چرخه و / یا محدودیت دما در منوی دیجیتال اولتراسونیکاتور را تنظیم کنید. این فراصوت و تکرارپذیری بسیار قابل اعتماد را تضمین می کند.
- sonotrode را وارد کنید و دستگاه اولتراسونیک را روشن کنید. به آرامی میکرو نوک پروب اولتراسونیک را از طریق نمونه حرکت دهید تا نمونه به طور یکنواخت فراصوت شود.
برای اکثر سلول ها، لیز اولتراسونیک پس از 2 -4 چرخه از 10 ثانیه فراصوت تکمیل خواهد شد. - پس از فراصوت ، سونوترود را از نمونه حذف کنید. نمونه ها باید به مدت 5 دقیقه روی یخ انکوبه شوند. سپس، سانتریفیوژ در 10000 x g به مدت 20 دقیقه برای گلوله کردن زباله ها. مایع رویی را به یک لوله میکرو سانتریفیوژ جدید منتقل کنید. آنالیت ها را برچسب بزنید و در دمای -20 درجه سانتیگراد نگهداری کنید.
- سونوترود اولتراسونیک را می توان با پاک کردن آن را به درستی با الکل یا فراصوت در یک لیوان پر از الکل ، به عنوان مثال 70٪ اتانول تمیز کرد. تمام پروب های اولتراسونیک ساخته شده از تیتانیوم اتوکلاو هستند.
استخراج پروتئین از سلول های E.coli با پروب اولتراسونیک UP200St
- بافت را با PBS سرد یخی (0.01M، pH=7.4) بشویید تا خون اضافی همولیز به طور کامل حذف شود.
- بافت (کلیه ، قلب ، ریه ، طحال و غیره) را وزن کرده و آن را به قطعات کوچک خیس کنید که در PBS همگن می شوند. حجم PBS مورد نیاز مربوط به وزن بافت است. به عنوان یک قاعده کلی، 1 گرم بافت تقریبا به 9 میلی لیتر PBS نیاز دارد. توصیه می شود مقداری مهارکننده پروتئاز به PBS اضافه کنید. (RIPA یا بافر لیز هیپوتونیک حاوی کوکتل مهارکننده پروتئاز و فسفاتاز را می توان به طور متناوب استفاده کرد.)
- بسته به اندازه بافت، یک درمان گردابی کوتاه (تقریبا 1-2 دقیقه در پالس های 15 ثانیه) می تواند برای پیش درمان بافت مفید باشد.
- یک میکرو نوک، به عنوان مثال S26d2، را به اولتراسونیک خود نصب کنید. لوله نمونه را با دستمال در حمام یخ قرار دهید.
- Sonicate نمونه با ultrasonicator خود را، به عنوان مثال UP200St (دامنه 80٪) به مدت 1 دقیقه. نمونه را در حمام یخ نگه دارید.
- سپس هموژنات ها سانتریفیوژ می شوند تا استخرهای خاصی (سیتوزولی، هسته ای، میتوکندری یا لیزوزومی) به دست آورند تا پروتئین برای تجزیه و تحلیل غنی شود. با سانتریفیوژ کردن نمونه به مدت 5 دقیقه در دمای 5000×گرم، مایع رویی بازیابی می شود.
سونوترود MTP-24-8-96 دارای هشت پروب اولتراسونیک برای فراصوت چاه از صفحات میکروتیتر.
کنترل دما قابل اعتماد در هنگام فراصوت
دما یک عامل تأثیرگذار بر فرآیند است که به ویژه برای درمان نمونه های بیولوژیکی مهم است، به عنوان مثال برای جلوگیری از تخریب حرارتی پروتئین ها. به عنوان تمام تکنیک های آماده سازی نمونه مکانیکی، فراصوت ایجاد گرما. با این حال, درجه حرارت نمونه ها را می توان به خوبی کنترل در هنگام استفاده از دستگاه های مافوق صوت Hielscher. ما به شما ارائه گزینه های مختلف برای نظارت و کنترل درجه حرارت نمونه های خود را در حالی که آنها را با یک پروب نوع ultrasonicator و یا VialTweeter پیش تحلیلی.
- نظارت بر دمای نمونه: تمام پردازنده های اولتراسونیک دیجیتال Hielscher با یک نرم افزار هوشمند و یک سنسور دما قابل اتصال مجهز. سنسور دما را به دستگاه اولتراسونیک وصل کنید (به عنوان مثال، تا 200 هرتز، 200 خیابان، VialTweeter(ویال گروهی)، چند چاه صفحه ماسونیکاتور UIP400MTP) و نوک سنسور دما را در یکی از لوله های نمونه قرار دهید. از طریق صفحه نمایش لمسی رنگی دیجیتال، شما می توانید در منوی پردازنده اولتراسونیک یک محدوده دما خاص برای فراصوت نمونه خود را تنظیم کنید. اولتراسونیک به طور خودکار متوقف می شود زمانی که حداکثر دما رسیده است و مکث می کند تا زمانی که دمای نمونه به مقدار پایین تر از دمای تنظیم شده ∆. سپس فراصوت دوباره به طور خودکار شروع می شود. این ویژگی هوشمند از تخریب ناشی از گرما جلوگیری می کند.
- با توجه به واحد چند نمونه اولتراسونیک VialTweeter، بلوک تیتانیوم، که لوله های نمونه را نگه می دارد، می تواند از قبل خنک شود. بلوک VialTweeter (فقط سونوترود بدون مبدل!) را در یخچال یا فریزر قرار دهید تا بلوک تیتانیوم از قبل خنک شود و به تعویق انداختن افزایش دما در نمونه کمک می کند. در صورت امکان، خود نمونه را می توان از قبل خنک کرد.
- از حمام یخ یا یخ خشک برای خنک شدن در طول فراصوت استفاده کنید. محل نمونه خود را لوله(بازدید کنندگان) در طول فراصوت در حمام یخ. برای VialTweeter، از یک سینی کم عمق پر از یخ خشک استفاده کنید و VialTweeter را روی یخ خشک قرار دهید تا گرما به سرعت از بین برود.
مشتریان در سراسر جهان استفاده از Hielscher پروب نوع ultrasonicators و همچنین چند نمونه واحد فراصوت VialTweeter و UIP400MTP برای کار آماده سازی نمونه روزانه خود را در آزمایشگاه های بیولوژیکی، بیوشیمیایی، پزشکی و بالینی. نرم افزار هوشمند و کنترل دما از پردازنده های Hielscher, دما قابل اعتماد کنترل و تخریب نمونه ناشی از گرما جلوگیری از. آماده سازی نمونه اولتراسونیک با راه حل های اولتراسونیک Hielscher ارائه می دهد نتایج بسیار قابل اعتماد و تکرار!
اطلاعات بیشتر در مورد فراصوت با توان بالا با استفاده از UIP400MTP سونیکاتور صفحه چند چاه برای سنجش!
تماس با ما! / از ما بپرسید!
Hielscher مافوق صوت تولید کننده هموژنایزرهای مافوق صوت با کارایی بالا برای مخلوط کردن برنامه های کاربردی، پراکندگی، امولسیون و استخراج در آزمایشگاه، خلبان و مقیاس صنعتی.
ادبیات / منابع
- Brandy Verhalen , Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
- Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
- Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed. Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.
- Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.
حقایقی که ارزش دانستن دارند
چه نوع الایزا وجود دارد؟
انواع مختلفی از ELISA وجود دارد که با اصل عملکرد خود متمایز می شوند. آنها به نام های الایزا مستقیم، الایزا غیرمستقیم، الایزا ساندویچ، الایزا رقابتی و الایزا معکوس شناخته می شوند. در زیر، مروری بر انواع مختلف الایزا و ویژگی ها و تفاوت های اصلی آنها به شما ارائه می دهیم.
الایزا ممکن است در قالب کیفی یا کمی اجرا شود. نتایج کیفی یک نتیجه مثبت یا منفی ساده ارائه می دهد، در حالی که در الایزا کمی چگالی نوری (OD) نمونه با یک منحنی استاندارد مقایسه می شود، که معمولا یک رقت سریال از محلول با غلظت شناخته شده مولکول هدف است.
الایزا مستقیم
الایزا مستقیم ساده ترین شکل سنجش الایزا است که در آن فقط از یک آنتی بادی اولیه با برچسب آنزیم استفاده می شود و آنتی بادی های ثانویه مورد نیاز نیستند. آنتی بادی اولیه با برچسب آنزیم مستقیما به هدف یعنی آنتی ژن متصل می شود. محلول آنتی ژن بافر به هر چاه از یک صفحه میکروتیتر (معمولا صفحات 96 چاهی، صفحات الیزا) اضافه می شود، جایی که از طریق فعل و انفعالات بار به سطح پلاستیک می چسبد. هنگامی که آنزیم مرتبط با آنتی بادی اولیه با بستر خود واکنش نشان می دهد، یک سیگنال قابل مشاهده تولید می کند که می تواند از طریق اسپکتروفتومتر، فلورومتر یا لومینومتر اندازه گیری شود.
الایزا غیرمستقیم
برای test الایزا غیرمستقیم، هم آنتی بادی اولیه و هم آنتی بادی ثانویه مورد نیاز است. با این حال، برخلاف الایزا مستقیم، آنتی بادی اولیه نیست، بلکه آنتی بادی ثانویه با یک آنزیم برچسب گذاری می شود. آنتی ژن به صفحه چاه بی حرکت می شود و توسط آنتی بادی اولیه متصل می شود. متعاقبا، آنتی بادی ثانویه با برچسب آنزیم به آنتی بادی اولیه متصل می شود. سرانجام ، آنزیم مرتبط با آنتی بادی ثانویه با بستر خود واکنش داده و یک سیگنال قابل مشاهده تولید می کند که قابل تشخیص است.
ساندویچ الایزا
در حالی که در آزمایش های الایزا مستقیم و غیرمستقیم، آنتی ژن بی حرکت شده و به سطح صفحه چاه پوشانده می شود، در ساندویچ الایزا آنتی بادی به سطح پلاستیک صفحه الایزا بی حرکت می شود. آنتی بادی های تثبیت شده در ساندویچ الایزا به عنوان آنتی بادی های جذب کننده شناخته می شوند. علاوه بر آنتی بادی های جذب ، در ساندویچ الایزا نیز به اصطلاح آنتی بادی های تشخیص مورد نیاز است. آنتی بادی های تشخیص شامل یک آنتی بادی تشخیص اولیه بدون برچسب و یک آنتی بادی تشخیص ثانویه با برچسب آنزیم است.
به صورت گام به گام، آنتی ژن مورد نظر به آنتی بادی جذب شده که به صفحه بی حرکت شده است، متصل می شود. سپس، آنتی بادی تشخیص اولیه به آنتی ژن متصل می شود. پس از آن، آنتی بادی تشخیص ثانویه به آنتی بادی تشخیص اولیه متصل می شود. در مرحله واکنش نهایی، آنزیم با بستر خود واکنش می دهد و یک سیگنال قابل مشاهده تولید می کند که می تواند به صورت نوری تشخیص داده شود.
الایزا رقابتی
الایزا رقابتی، که به عنوان الایزا مهاری نیز شناخته می شود، پیچیده ترین نوع الایزا است زیرا شامل استفاده از یک آنتی ژن مهارکننده است. هر یک از سه فرمت مستقیم، غیرمستقیم و ساندویچی الایزا را می توان با فرمت رقابتی الایزا تطبیق داد. در الایزا رقابتی، آنتی ژن مهارکننده و آنتی ژن مورد نظر برای اتصال به آنتی بادی اولیه با هم رقابت می کنند.
برای الایزا رقابتی، آنتی بادی بدون برچسب در حضور آنتی ژن آن، یعنی نمونه، انکوبه می شود. سپس این کمپلکس های آنتی بادی/آنتی ژن متصل به چاه پوشش داده شده با آنتی ژن اضافه می شوند.
صفحه شسته می شود، به طوری که آنتی بادی های باز نشده برداشته می شوند. الایزا رقابتی به این دلیل نام خود را دارد که هرچه آنتی ژن بیشتری در نمونه وجود داشته باشد ، کمپلکس های آنتی ژن-آنتی بادی بیشتری تشکیل می شود. این بدان معناست که آنتی بادی های نامحدود کمتری برای اتصال به آنتی ژن در چاه وجود دارد و آنتی ژن ها باید برای آنتی بادی موجود رقابت کنند. یک آنتی بادی ثانویه، مطابق با آنتی بادی اولیه، اضافه می شود. این آنتی بادی دوم به آنزیم مرتبط است. هنگامی که بستر اضافه می شود ، آنزیم های باقیمانده یک سیگنال کروموژنیک یا فلورسنت تولید می کنند.
در این مرحله، واکنش متوقف می شود تا از اشباع نهایی سیگنال جلوگیری شود.
برخی از کیت های رقابتی الایزا شامل یک آنتی ژن مرتبط با آنزیم به جای آنتی بادی مرتبط با آنزیم هستند. آنتی ژن برچسب گذاری شده برای مکان های اتصال اولیه آنتی بادی با آنتی ژن نمونه (بدون برچسب) رقابت می کند. هرچه آنتی ژن در نمونه کمتر باشد، آنتی ژن برچسب گذاری شده بیشتری در چاه حفظ می شود و سیگنال قوی تر است.
الایزا معکوس
الایزا معکوس از صفحات چاه استفاده نمی کند، اما آنتی ژن ها را در مایع test معلق می گذارد. test معکوس ELISA میزان آنتی بادی متصل شده را از طریق آنتی ژن اندازه گیری می کند. این به طور خاص برای شناسایی و بررسی پروتئین پاکت ویروس نیل غربی و چگونگی یافتن آنتی بادی های خاص ویروس ساخته شده است.
کدام نشانگرهای آنزیمی برای الایزا استفاده می شود؟
لیست زیر رایج ترین نشانگرهای آنزیمی مورد استفاده در سنجش های الایزا را ارائه می دهد که اجازه می دهد نتایج سنجش پس از اتمام اندازه گیری شود.
- OPD (o-phenylenediamine dihydrochloride) به نوبه خود کهربایی برای تشخیص HRP (ترب کوهی پراکسیداز), که اغلب به عنوان یک پروتئین مزدوج استفاده می شود.
- TMB (3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine) هنگام تشخیص HRP آبی می شود و پس از افزودن اسید سولفوریک یا فسفریک زرد می شود.
- ABTS (2,2)′-آزینوبیس [3-اتیل بنزوتیازولین-6-اسید سولفونیک]-نمک دی آمونیوم) هنگام تشخیص HRP سبز می شود.
- PNPP (p-نیتروفنیل فسفات، نمک دی سدیم) هنگام تشخیص فسفاتاز قلیایی زرد می شود.