آماده‌سازی فراصوتی نمونه برای آزمون‌های ELISA
آزمون‌هایی مانند ELISA به‌طور گسترده برای تشخیص برون‌تنی، شناسایی پروتئین‌های مرتبط با بیماری و کنترل کیفیت (برای مثال، پایش آلرژن‌های غذایی) استفاده می‌شوند. آماده‌سازی فراصوتی نمونه، روشی سریع، قابل‌اعتماد و تکرارپذیر برای لیز سلول و جداسازی پروتئین‌های درون‌سلولی، DNA، RNA و اندامک‌ها است. Hielscher Ultrasonics راهکارهای فراصوتی متنوعی برای آماده‌سازی آسان نمونه‌های تکی، چندین ویال و همچنین پلیت‌های میکروتیتر و پلیت‌های 96 خانه‌ای ارائه می‌دهد.
ELISA – سنجش ایمونوسوربنت متصل به آنزیم
ELISA مخفف سنجش ایمونوسوربنت متصل به آنزیم است و یکی از روش‌های پرکاربرد تجزیه‌وتحلیل بیوشیمیایی در گروه آزمون‌های اتصال لیگاند به‌شمار می‌رود. در ELISA، نمونه‌ای مایع به یک فاز جامد ثابت با ویژگی‌های اتصال ویژه افزوده می‌شود. معمولاً فاز جامد ثابت به‌صورت پوشش روی یک پلیت خانه‌دار یا پلیت ELISA اعمال می‌شود. سپس معرف‌های مایع مختلف به‌ترتیب افزوده می‌شوند، انکوباسیون و شست‌وشو انجام می‌شود و در نهایت تغییری نوری (برای مثال، ایجاد رنگ به‌واسطهٔ محصول یک واکنش آنزیمی) در مایع نهایی داخل خانه رخ می‌دهد. این تغییر نوری امکان اندازه‌گیری مقدار آنالیت را از طریق آنچه «خوانش» کمی نامیده می‌شود، فراهم می‌کند. برای خوانش کمی، از اسپکتروفتومتر، فلورومتر یا لومینومتر برای آشکارسازی و اندازه‌گیری شدت نور عبوری استفاده می‌شود. حساسیت آشکارسازی تحت‌تأثیر تقویت سیگنال طی واکنش‌های تحلیلی قرار دارد. از آنجا که واکنش‌های آنزیمی فرایندهای تقویتیِ به‌خوبی مطالعه‌شده و قابل‌اعتمادی هستند، از آنزیم‌ها برای تولید سیگنال استفاده می‌شود. آنزیم‌ها با نسبت‌های ثابت به معرف‌های آشکارسازی متصل می‌شوند تا اندازه‌گیری کمی دقیق امکان‌پذیر شود؛ نام سنجش ایمونوسوربنت «متصل به آنزیم» نیز به همین موضوع اشاره دارد.
از آنجا که آزمون‌های ELISA در پلیت‌های میکروتیتر / پلیت‌های 96 خانه‌ای انجام می‌شوند، این روش به‌عنوان یک روش سنجش مبتنی بر پلیت شناخته می‌شود و برای مثال، در تشخیص بالینی برون‌تنی، پژوهش، توسعهٔ دارو و غیره برای شناسایی و اندازه‌گیری کمی آنتی‌بادی‌ها، پپتیدها، پروتئین‌ها و هورمون‌ها کاربرد دارد.
روش ELISA اغلب به‌عنوان ابزار تشخیصی در پزشکی، زیست‌فناوری و بیماری‌شناسی گیاهی استفاده می‌شود و همچنین یکی از سنجش‌های مهم کنترل کیفیت در صنایع مختلف است.
واحد آماده‌سازی فراصوتی نمونه VialTweeter برای لیز سلولی و استخراج پروتئین پیش از آزمون‌های ELISA استفاده می‌شود
آماده‌سازی فراصوتی نمونه پیش از ELISA
پیش از انجام آزمون ELISA، نمونه‌ها به مراحل آماده‌سازی مانند لیز سلولی و استخراج پروتئین‌های درون‌سلولی، DNA، RNA و غیره نیاز دارند. مزیت لیز سلولی و جداسازی پروتئین به روش فراصوتی، کارایی بالا، قابلیت اعتماد و تکرارپذیری آن است. همهٔ این عوامل برای دستیابی به تشخیص و نتایج پژوهشی باکیفیت اهمیت دارند
- تیمار یکنواخت نمونه
- لیز کامل
- استخراج کامل پروتئین (برای مثال، آنتی‌بادی‌ها، DNA)
- تطبیق بهینه با نوع سلول
- برای هر اندازهٔ نمونه
- تکرارپذیر
- با دمای کنترل‌شده
- ثبت خودکار داده‌ها روی کارت SD
پروتکل لیز فراصوتی سلول پیش از ELISA
- برای کشت‌های سلولی: پیش از لیز فراصوتی سلول، سلول‌ها را به‌مدت 5 mins با 270 x g در میکروسانتریفیوژ سانتریفیوژ کنید. مایع رویی را با آسپیراسیون خارج کنید و سلول‌ها را در 30 – 100 μL بافر RIPA دوباره معلق کنید. سپس رسوب سلولی را به‌مدت 30 min روی یخ انکوبه کنید.
- اکنون نمونهٔ سلولی برای لیز فراصوتی آماده است:
از یک دستگاه فراصوتی پروبی (برای مثال، UP200Ht با پروب S26d2) یا یک دستگاه فراصوتی چندنمونه‌ای (برای مثال، VialTweeter برای فراصوت‌دهی هم‌زمان حداکثر 10 ویال یا UIP400MPT برای پلیت‌های میکروتیتر / پلیت‌های 96 خانه‌ای) متناسب با تعداد نمونه‌هایی که باید آماده کنید، استفاده کنید.
برای فراصوت‌دهی پروبی یک نمونهٔ تکی، سلول‌ها را در لوله‌های میکروسانتریفیوژ 1٫5 mL قرار دهید. - مدت‌زمان فراصوت‌دهی، کل انرژی ورودی، حالت چرخه و/یا حدود دما را از پیش در منوی دیجیتال دستگاه فراصوتی تنظیم کنید. این کار فراصوت‌دهی بسیار قابل‌اعتماد و تکرارپذیری را تضمین می‌کند.
- سونوتْرود را وارد نمونه کنید و دستگاه فراصوتی را روشن کنید. نوک میکروی پروب فراصوتی را به‌آرامی درون نمونه حرکت دهید تا نمونه به‌طور یکنواخت تحت فراصوت‌دهی قرار گیرد.
برای بیشتر سلول‌ها، لیز فراصوتی پس از 2 –4 چرخهٔ فراصوت‌دهی 10 sec کامل می‌شود. - پس از فراصوت‌دهی، سونوتْرود را از نمونه خارج کنید. نمونه‌ها باید به‌مدت 5 min روی یخ انکوبه شوند. سپس به‌مدت 20 min با 10٬000 x g سانتریفیوژ کنید تا بقایا به‌صورت رسوب جمع شوند. مایعات رویی را به یک لولهٔ میکروسانتریفیوژ جدید منتقل کنید. آنالیت‌ها را برچسب‌گذاری کنید و در -20°C نگهداری کنید.
- سونوتْرود فراصوتی را می‌توان با پاک‌کردن کامل آن با الکل یا فراصوت‌دهی در یک بشر پر از الکل، برای مثال اتانول 70%، تمیز کرد. همهٔ پروب‌های فراصوتی ساخته‌شده از تیتانیوم قابلیت اتوکلاو شدن دارند.
استخراج پروتئین از سلول‌های E.coli با پروب فراصوتی UP200St
- بافت را با PBS سردشده تا دمای یخ (0٫01M، pH=7٫4) شست‌وشو دهید تا خون همولیزشدهٔ اضافی کاملاً حذف شود.
- بافت (کلیه، قلب، ریه، طحال و غیره) را وزن کنید و با له‌کردن به قطعات کوچک تقسیم کنید؛ این قطعات در PBS همگن می‌شوند. حجم PBS موردنیاز به وزن بافت بستگی دارد. به‌عنوان یک قاعدهٔ تقریبی، 1g بافت به حدود 9mL PBS نیاز دارد. توصیه می‌شود مقداری مهارکنندهٔ پروتئاز به PBS اضافه کنید. (به‌جای آن می‌توان از RIPA یا بافر لیز هیپوتونیک حاوی مخلوط مهارکننده‌های پروتئاز و فسفاتاز استفاده کرد.)
- بسته به اندازهٔ بافت، یک تیمار کوتاه با ورتکس (حدود 1–2 min. در پالس‌های 15 sec.) می‌تواند برای پیش‌تیمار بافت مفید باشد.
- یک نوک میکرو، برای مثال S26d2، روی دستگاه فراصوتی خود نصب کنید. لولهٔ نمونهٔ حاوی بافت را در حمام یخ قرار دهید.
- نمونه را با دستگاه فراصوتی خود، برای مثال UP200St (دامنهٔ 80%)، به‌مدت 1 min. در حالت پالسی (15sec روشن، 15sec مکث) فراصوت‌دهی کنید. نمونه را در حمام یخ نگه دارید.
- سپس هموژنات‌ها برای به‌دست‌آوردن بخش‌های مشخص (سیتوزولی، هسته‌ای، میتوکندریایی یا لیزوزومی) سانتریفیوژ می‌شوند تا پروتئین برای تجزیه‌وتحلیل غنی‌سازی شود. با سانتریفیوژ کردن نمونه به‌مدت 5 دقیقه با 5000×g، مایع رویی جمع‌آوری می‌شود.
سونوتْرود MTP-24-8-96 دارای هشت پروب فراصوتی برای فراصوت‌دهی خانه‌های پلیت‌های میکروتیتر است.
کنترل قابل‌اعتماد دما حین فراصوت‌دهی
دما عاملی تعیین‌کننده و مؤثر بر فرایند است که به‌ویژه در تیمار نمونه‌های زیستی، برای مثال برای جلوگیری از تخریب حرارتی پروتئین‌ها، اهمیت دارد. فراصوت‌دهی نیز مانند همهٔ روش‌های مکانیکی آماده‌سازی نمونه، گرما تولید می‌کند. بااین‌حال، هنگام استفاده از دستگاه‌های Hielscher Ultrasonics می‌توان دمای نمونه‌ها را به‌خوبی کنترل کرد. در ادامه، گزینه‌های مختلفی برای پایش و کنترل دمای نمونه‌ها هنگام آماده‌سازی آن‌ها پیش از تجزیه‌وتحلیل با دستگاه فراصوتی پروبی یا VialTweeter ارائه می‌کنیم.
- پایش دمای نمونه: همهٔ پردازشگرهای فراصوتی دیجیتال Hielscher به نرم‌افزار هوشمند و حسگر دمای قابل‌اتصال مجهز هستند. حسگر دما را به دستگاه فراصوتی (برای مثال، UP200Ht, UP200St, VialTweeter, سونیکاتور پلیت چندخانه‌ای UIP400MTP) متصل کنید و نوک حسگر دما را در یکی از لوله‌های نمونه قرار دهید. از طریق نمایشگر لمسی رنگی دیجیتال، می‌توانید در منوی پردازشگر فراصوتی محدودهٔ دمایی مشخصی را برای فراصوت‌دهی نمونه تنظیم کنید. دستگاه فراصوتی با رسیدن به حداکثر دما به‌طور خودکار متوقف می‌شود و تا زمانی که دمای نمونه به مقدار پایین‌ترِ ∆ دمای تنظیم‌شده برسد، در حالت مکث باقی می‌ماند. سپس فراصوت‌دهی دوباره به‌طور خودکار آغاز می‌شود. این قابلیت هوشمند از تخریب ناشی از گرما جلوگیری می‌کند.
- در واحد فراصوتی چندنمونه‌ای VialTweeter، بلوک تیتانیومی نگهدارندهٔ لوله‌های نمونه را می‌توان از پیش سرد کرد. بلوک VialTweeter (فقط سونوتْرود، بدون مبدل!) را در یخچال یا فریزر قرار دهید؛ سردکردن اولیهٔ بلوک تیتانیومی به تأخیر انداختن افزایش دمای نمونه کمک می‌کند. در صورت امکان، خود نمونه را نیز می‌توان از پیش سرد کرد.
- برای خنک‌کردن حین فراصوت‌دهی، از حمام یخ یا یخ خشک استفاده کنید. لوله یا لوله‌های نمونه را هنگام فراصوت‌دهی در حمام یخ قرار دهید. برای VialTweeter، از یک سینی کم‌عمق پر از یخ خشک استفاده کنید و VialTweeter را روی یخ خشک قرار دهید تا گرما به‌سرعت دفع شود.
مشتریان در سراسر جهان از دستگاه‌های فراصوتی پروبی Hielscher و همچنین واحدهای فراصوت‌دهی چندنمونه‌ای VialTweeter و UIP400MTP برای آماده‌سازی روزانهٔ نمونه‌های خود در آزمایشگاه‌های زیستی، بیوشیمیایی، پزشکی و بالینی استفاده می‌کنند. با نرم‌افزار هوشمند و قابلیت کنترل دمای پردازشگرهای Hielscher، دما به‌طور قابل‌اعتماد کنترل می‌شود و از تخریب نمونه بر اثر گرما جلوگیری می‌شود. آماده‌سازی فراصوتی نمونه با راهکارهای فراصوتی Hielscher نتایجی بسیار قابل‌اعتماد و تکرارپذیر به‌دست می‌دهد!
دربارهٔ فراصوت‌دهی با ظرفیت پردازش بالا با استفاده از سونیکاتور پلیت چندخانه‌ای UIP400MTP برای آزمون‌ها بیشتر بخوانید!
با ما تماس بگیرید! / از ما بپرسید!
Hielscher Ultrasonics هموژنایزرهای فراصوتی با عملکرد بالا برای کاربردهای اختلاط، پراکنده‌سازی، امولسیون‌سازی و استخراج در مقیاس آزمایشگاهی، پایلوت و صنعتی تولید می‌کند.
منابع علمی / مراجع
- Brandy Verhalen , Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
- Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
- Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed. Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.
- Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.
دانستنی‌های مفید
انواع ELISA کدام‌اند؟
ELISA انواع مختلفی دارد که بر اساس اصل عملکردشان از یکدیگر متمایز می‌شوند. این انواع با نام‌های ELISA مستقیم، ELISA غیرمستقیم، ELISA ساندویچی، ELISA رقابتی و ELISA معکوس شناخته می‌شوند. در ادامه، مروری بر انواع مختلف ELISA و ویژگی‌ها و تفاوت‌های اصلی آن‌ها ارائه می‌کنیم.
ELISA را می‌توان به‌صورت کیفی یا کمی انجام داد. نتایج کیفی صرفاً نتیجه‌ای مثبت یا منفی ارائه می‌دهند، درحالی‌که در ELISA کمی، چگالی نوری (OD) نمونه با یک منحنی استاندارد مقایسه می‌شود که معمولاً از رقت‌های سریالی محلولی با غلظت معلوم از مولکول هدف به‌دست می‌آید.
ELISA مستقیم
ELISA مستقیم ساده‌ترین شکل آزمون الایزا است که در آن فقط از یک آنتی‌بادی اولیهٔ نشان‌دارشده با آنزیم استفاده می‌شود و به آنتی‌بادی‌های ثانویه نیازی نیست. آنتی‌بادی اولیهٔ نشان‌دارشده با آنزیم مستقیماً به هدف، یعنی آنتی‌ژن، متصل می‌شود. محلول بافری آنتی‌ژن به هر خانهٔ یک پلیت میکروتیتر (معمولاً پلیت‌های 96 خانه‌ای، پلیت‌های ELISA) افزوده می‌شود و در آنجا از طریق برهم‌کنش‌های بار الکتریکی به سطح پلاستیکی می‌چسبد. هنگامی که آنزیم متصل به آنتی‌بادی اولیه با سوبسترای خود واکنش می‌دهد، سیگنالی قابل‌مشاهده تولید می‌کند که می‌توان آن را با اسپکتروفتومتر، فلورومتر یا لومینومتر اندازه‌گیری کرد.
ELISA غیرمستقیم
برای آزمون ELISA غیرمستقیم، هم آنتی‌بادی اولیه و هم آنتی‌بادی ثانویه لازم است. بااین‌حال، برخلاف ELISA مستقیم، آنتی‌بادی ثانویه با آنزیم نشان‌دار می‌شود، نه آنتی‌بادی اولیه. آنتی‌ژن روی پلیت خانه‌دار تثبیت می‌شود و آنتی‌بادی اولیه به آن متصل می‌شود. سپس آنتی‌بادی ثانویهٔ نشان‌دارشده با آنزیم به آنتی‌بادی اولیه متصل می‌شود. در نهایت، آنزیم متصل به آنتی‌بادی ثانویه با سوبسترای خود واکنش می‌دهد تا سیگنالی قابل‌مشاهده و قابل‌آشکارسازی تولید کند.
ELISA ساندویچی
در آزمون‌های ELISA مستقیم و غیرمستقیم، آنتی‌ژن روی سطح پلیت خانه‌دار تثبیت می‌شود و آن را می‌پوشاند، اما در ELISA ساندویچی، آنتی‌بادی روی سطح پلاستیکی پلیت ELISA تثبیت می‌شود. آنتی‌بادی‌های تثبیت‌شده در ELISA ساندویچی، آنتی‌بادی‌های گیرانداز نامیده می‌شوند. علاوه بر آنتی‌بادی‌های گیرانداز، در ELISA ساندویچی به آنتی‌بادی‌های موسوم به آشکارساز نیز نیاز است. آنتی‌بادی‌های آشکارساز شامل یک آنتی‌بادی آشکارساز اولیهٔ بدون نشان و یک آنتی‌بادی آشکارساز ثانویهٔ نشان‌دارشده با آنزیم هستند.
مراحل به این ترتیب پیش می‌روند: آنتی‌ژن موردنظر به آنتی‌بادی گیرانداز تثبیت‌شده روی پلیت متصل می‌شود. سپس آنتی‌بادی آشکارساز اولیه به آنتی‌ژن متصل می‌شود. پس از آن، آنتی‌بادی آشکارساز ثانویه به آنتی‌بادی آشکارساز اولیه متصل می‌شود. در مرحلهٔ نهایی واکنش، آنزیم با سوبسترای خود واکنش می‌دهد تا سیگنالی قابل‌مشاهده تولید کند که به‌صورت نوری قابل‌آشکارسازی است.
ELISA رقابتی
ELISA رقابتی که با نام ELISA مهاری نیز شناخته می‌شود، پیچیده‌ترین نوع ELISA است، زیرا در آن از یک آنتی‌ژن مهارکننده استفاده می‌شود. هر یک از سه قالب ELISA مستقیم، غیرمستقیم و ساندویچی را می‌توان با قالب ELISA رقابتی سازگار کرد. در ELISA رقابتی، آنتی‌ژن مهارکننده و آنتی‌ژن موردنظر برای اتصال به آنتی‌بادی اولیه با یکدیگر رقابت می‌کنند.
برای ELISA رقابتی، آنتی‌بادی بدون نشان در حضور آنتی‌ژن خود، یعنی نمونه، انکوبه می‌شود. سپس این کمپلکس‌های متصل آنتی‌بادی/آنتی‌ژن به یک خانهٔ پوشیده‌شده با آنتی‌ژن افزوده می‌شوند.
پلیت شست‌وشو داده می‌شود تا آنتی‌بادی‌های متصل‌نشده حذف شوند. نام ELISA رقابتی از این واقعیت گرفته شده است که هرچه آنتی‌ژن بیشتری در نمونه وجود داشته باشد، کمپلکس‌های آنتی‌ژن–آنتی‌بادی بیشتری تشکیل می‌شوند. این بدان معناست که آنتی‌بادی‌های متصل‌نشدهٔ کمتری برای اتصال به آنتی‌ژن داخل خانه در دسترس هستند و آنتی‌ژن‌ها باید برای یک آنتی‌بادی در دسترس رقابت کنند. یک آنتی‌بادی ثانویهٔ متناسب با آنتی‌بادی اولیه اضافه می‌شود. این آنتی‌بادی دوم به آنزیم متصل است. هنگامی که سوبسترا اضافه می‌شود، آنزیم‌های باقی‌مانده سیگنالی رنگ‌زا یا فلورسانس تولید می‌کنند.
در این مرحله، واکنش متوقف می‌شود تا از اشباع نهایی سیگنال جلوگیری شود.
برخی کیت‌های ELISA رقابتی به‌جای آنتی‌بادی متصل به آنزیم، حاوی آنتی‌ژن متصل به آنزیم هستند. آنتی‌ژن نشان‌دار برای جایگاه‌های اتصال آنتی‌بادی اولیه با آنتی‌ژن نمونه (بدون نشان) رقابت می‌کند. هرچه آنتی‌ژن کمتری در نمونه وجود داشته باشد، آنتی‌ژن نشان‌دار بیشتری در خانه باقی می‌ماند و سیگنال قوی‌تر می‌شود.
ELISA معکوس
در ELISA معکوس از پلیت‌های خانه‌دار استفاده نمی‌شود و آنتی‌ژن‌ها در مایع آزمون معلق باقی می‌مانند. آزمون ELISA معکوس مقدار آنتی‌بادی متصل‌شده را از طریق آنتی‌ژن اندازه‌گیری می‌کند. این روش به‌طور اختصاصی برای شناسایی و بررسی پروتئین پوششی ویروس نیل غربی و چگونگی توانایی آن در یافتن آنتی‌بادی‌های اختصاصی ویروس توسعه یافته است.
چه نشانگرهای آنزیمی در ELISA استفاده می‌شوند؟
فهرست زیر رایج‌ترین نشانگرهای آنزیمی مورد استفاده در آزمون‌های ELISA را معرفی می‌کند که امکان اندازه‌گیری نتایج آزمون را پس از تکمیل آن فراهم می‌کنند.
- OPD (اورتو فنیلن‌دی‌آمین دی‌هیدروکلرید) برای آشکارسازی HRP (پراکسیداز ترب کوهی) به رنگ کهربایی درمی‌آید؛ HRP اغلب به‌عنوان پروتئین کونژوگه استفاده می‌شود.
- TMB (3,3′,5,5′-تترامتیل‌بنزیدین) هنگام آشکارسازی HRP آبی می‌شود و پس از افزودن اسید سولفوریک یا اسید فسفریک به رنگ زرد درمی‌آید.
- ABTS (نمک دی‌آمونیوم 2,2′-آزینوبیس [3-اتیل‌بنزوتیازولین-6-سولفونیک اسید]) هنگام آشکارسازی HRP سبز می‌شود.
- PNPP (پارا نیتروفنیل فسفات، نمک دی‌سدیم) هنگام آشکارسازی آلکالین فسفاتاز زرد می‌شود.