آماده سازی التراسونیک از C. Elegans نمونه
C. elegans، یک کرم نماتد، یک ارگانیسم مدل پرکاربرد در زیست شناسی است. آماده سازی نمونه قبل از تجزیه و تحلیل نیاز به لیز ، استخراج پروتئین و چربی و همچنین تکه تکه شدن RNA دارد که می تواند به طور قابل اعتماد از طریق فراصوت انجام شود. مختل کننده های سلول اولتراسونیک دستگاه های قابل اعتماد، پیچیده و آسان برای استفاده برای آماده سازی سریع نمونه های C. elegans هستند.
آماده سازی التراسونیک از C. Elegans نمونه
C. elegans کرم های گرد هستند که به طور گسترده در آزمایشگاه های تحقیقاتی برای بررسی ژنومیک، زیست شناسی رشد و بیماری ها استفاده می شوند. بسیاری از ژن ها در ژنوم C. elegans همتایان عملکردی در انسان دارند. بنابراین، کرم نماتد یک مدل بسیار مفید برای بیماری های انسانی است. از دیگر مزایای استفاده گسترده از C. elegans می توان به کشت آسان و ارزان آن در بشقاب های حاوی باکتری (به عنوان مثال E. coli)، شفافیت آن، جابجایی راحت و همچنین امکان انجماد و نگهداری کرم ها برای مدت طولانی تری اشاره کرد.
تجزیه و تحلیل پروتئین و چربی روش های منظم در آزمایشگاه ها و آماده سازی نمونه اولتراسونیک روش تاسیس برای لیز C. elegans نماتدها در هر مرحله رشد (به عنوان مثال،. جنین, لارو L1 - L4, بزرگسالان). از آنجایی که C. elegans همچنین به عنوان سیستم بیان پروتئین برای بیان بیش از حد پروتئین های هدفمند استفاده می شود، یک روش قابل اعتماد و قابل تکرار لیز و استخراج پروتئین که بازده پروتئین بالایی را ارائه می دهد، مورد نیاز است. سیستم های اختلال و استخراج سلول های مافوق صوت به عنوان هموژنایزرهای نوع پروب و به عنوان مافوق صوت چند نمونه در دسترس هستند. پذیرایی به آماده سازی نمونه مناسب و انواع اعداد اندازه نمونه، Hielscher مافوق صوت دارای مختل کننده سلول اولتراسونیک ایده آل برای روش آزمایشگاه خود را.
- تهیه همگنات های کرم
- استخراج پروتئین
- استخراج چربی
- کمی سازی پروتئین
- رسوب ایمنی
- وسترن بلات
- استخراج RNA
- سنجش های آنزیمی
پروتکل های اولتراسونیک برای C. Elegans اختلال و لیز
همگن سازی التراسونیک و لیز C. elegans و پس از آن استخراج پروتئین و چربی را می توان با استفاده از روش های مختلف با استفاده از همگن سازی و لیز بافرهای مختلف و غیره انجام داد. همه پروتکل های لیز مشترک این است که نمونه ها باید به طور مداوم روی یخ نگهداری شوند تا از تخریب پروتئین جلوگیری شود. در زیر، ما به شما برخی از پروتکل های قابل اعتماد و سریع لیز اولتراسونیک و استخراج برای تهیه نمونه های C. elegans حاوی پروتئین یا چربی با کیفیت بالا ارائه می دهیم.
مزایای استفاده از التراسونیک C. elegans لیز
- قابل اعتماد
- قابل تکرار
- دقیقا دما کنترل می شود
- کنترل فرآیند قابل اعتماد
- روش ملایم
- آسان برای استفاده
- امن
استخراج پروتئین التراسونیک از C. elegans نمونه
لیز التراسونیک و استخراج پروتئین از کرم C. elegans را می توان با استفاده از پروتکل های مختلف انجام. در زیر چند پروتکل لیز قابل اعتماد و سریع را برای نتایج استخراج پروتئین قابل تکرار به شما ارائه می دهیم.
آماده سازی سریع عصاره سیتوزولی از کرم های C. elegans به روش فراصوت
با پروتکل زیر می توانید C. elegans lysates را در کمتر از 30 دقیقه تهیه کنید.
مجموعه ای از C. elegans
کرم های C. elegans مورد نظر را در یک لوله 1.5 میلی لیتری نمک بافر فسفات (PBS) انتخاب کنید یا آنها را از یک بشقاب با 1.5 میلی لیتر PBS بشویید. سانتریفیوژ به مدت 1 دقیقه در 2000 دور در دقیقه به گلوله. نمونه ها را همیشه روی یخ نگه دارید.
سپس کرم ها را دو بار با PBS بشویید.
پس از آن ، کرم ها را دو بار با ddH بشوییدH2SO.
کرم ها را در حداقل 500 لیتر بافر همگن سازی (HB) معلق کنید. نمونه های کرم اکنون برای لیز اولتراسونیک آماده هستند.
برای کیفیت بالاتر عصاره پروتئین، ممکن است بخواهید آلودگی باکتریایی را با شستن کرم ها به مدت 5 دقیقه در PBS و آب استریل و فوق خالص (ddH) کاهش دهید.H2SO) یا شناور شدن ساکارز را انجام دهید. نمونه های کرم را به طور مداوم روی یخ نگه دارید.
التراسونیک C. elegans پروتکل لیز
- اطمینان حاصل کنید که شما مافوق صوت را آماده جلو به طوری که هموژنایزر مافوق صوت آماده برای استفاده است (پروب نصب شده، برنامه فراصوت از پیش تنظیم).
- برای C. elegans لیز با UP200St یا UP200HT، سونوگرافی باید با استفاده از یک microtip انجام شود (به عنوان مثال، پروب 2mm S26d2؛ نگاه کنید به تصویر سمت چپ) در دامنه 40٪ برای 1 ثانیه با مکث 30sec در بین. 5 چرخه فراصوت برای هر 1 ثانیه با مکث 30 ثانیه ایده آل برای C. elegans لیز است. اگر لیز را برای اولین بار انجام دهید، می توانید پیشرفت لیز را در مقادیر کوچک نمونه پس از هر پالس با استفاده از میکروسکوپ بررسی کنید.
- هنگامی که کرم ها مختل می شوند، لیز با موفقیت انجام می شود. بیش از حد فراصوت منجر به شکستگی هسته ها می شود و زمانی که نمونه چسبناک یا فوم می شود قابل مشاهده می شود. برای جلوگیری از تخریب نمونه، در صورت نیاز از پالس های بیشتری استفاده کنید. زمان هر چرخه پالس اولتراسونیک را برای دریافت عصاره های پروتئینی با کیفیت بالا افزایش ندهید.
- لیز سلول پاک با سانتریفیوژ کرم های لیز شده اولتراسونیک در 14,000 دور در دقیقه به مدت 10 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد.
- سپس، مایع رویی را به یک لوله تازه منتقل کنید و برای رسوب ایمنی یا سنجش های دیگر آماده شوید.
اگر اولتراسونیک خود را ایستاده نصب شده است، حمام یخ را با لوله های نمونه خود را در زیر پروب اولتراسونیک قرار دهید و پروب اولتراسونیک را به لوله 1.5 میلی لیتری وارد کنید.
توجه داشته باشید برای بافر همگن سازی: بافر همگن سازی را برای پروتکل لیز اولتراسونیک در بالا به شرح زیر آماده کنید:
- 15 میلی مولار هپس pH 7.6 – 15 میلی لیتر 0.5 متر
- 10 میلی مولار KCl – 2.5 میلی لیتر 2 متر
- 1.5 میلی مولار MgCl2 – 0.75 میلی لیتر از 1 متر
- 0.1 میلی متر EDTA – 100 واحد از 0.5 متر
- 0.5 میلی مولار EGTA – 2.5 میلی لیتر 0.1 متر
- 44 میلی مولار ساکارز – 14.7 میلی لیتر از 50٪
- درست قبل از استفاده اضافه کنید: 1mM DTT – 1000 برابر از 1 متر
- به علاوه یک مهارکننده پروتئاز
لیز با توان عملیاتی بالا C. elegans در صفحات 96 چاهی با استفاده از سونیکاتور صفحه UIP400MTP
C. elegans لیز (نماتد بزرگسالان)
UIP400MTP دامنه 80٪ ، 20 چرخه (هر چرخه فراصوت: 30 ثانیه روشن ، 30 ثانیه خاموش)
بافر لیز:
- گزینه 1) 4٪ SDS، 0.1 M Tris/HCl pH 8.0، 1 میلی مولار EDTA
- گزینه 2) برای رسوب ایمنی (co-IP): 10 میلی مولار Tris HCl (pH 7.5)، 150 میلی مولار NaCl، 0.5 میلی مولار EDTA، 0.5٪ NP-40 (کوکتل مهارکننده کامل پروتئیناز)
تکه تکه شدن DNA با توان عملیاتی بالا
C. elegans (نماتد بزرگسالان) DNA 200-300bp: UIP400MTP سونیکاتور صفحه – دامنه 80٪، 30 پالس را تنظیم کنید – هر 30 ثانیه روشن، 30 ثانیه خاموش
لیز التراسونیک C. elegans برای سنجش تصفیه میل کمی
جنین C. elegans (∼2 میلیون در هر تکرار) به تازگی در سه تکرار بیولوژیکی با سفید کردن هرمافرودیت های جوان باردار برداشت شدند و روی یخ فراصوت شدند (چرخه: 0.5 ثانیه، دامنه: 40-45٪، 5 سکته مغزی در جلسه، 5 جلسه، فاصله بین جلسات: 30 ثانیه; پردازنده اولتراسونیک UP200S با میکرو نوک S26d2 (Hielscher Ultrasonics GmbH)) در بافر لیز (حجم کل: ∼600 میکرولیتر؛ 50 میلی متر Tris-HCl، pH 7.4، 100 میلی متر KCl، 1 میلی متر MgCl2، 1 میلی متر EGTA، 1 میلی متر DTT، 10٪ گلیسرول، مخلوط مهارکننده پروتئاز، 0.1٪ جایگزین Nonidet P-40). پس از فراصوت ، Nonidet P-40 Substitute تا 1٪ اضافه شد و lysates با چرخش سر بیش از دم در 4 درجه سانتیگراد به مدت 30 دقیقه انکوبه شدند و به دنبال آن سانتریفیوژ در 20،000 × گرم به مدت 20 دقیقه در 4 درجه سانتیگراد انجام شد. سپس لیزات پاک شده بدون ایجاد مزاحمت در لایه چربی فوقانی آسپیره شد و به نصف تقسیم شد به دانه های آگارز ضد GFP یا دانه های کنترل مسدود شده (40-50 میکرولیتر). پس از چرخش سر روی دم در دمای 4 درجه سانتی گراد به مدت 60 تا 90 دقیقه، مهره ها یک بار با بافر لیز حاوی 0.1 درصد جایگزین Nonidet P-40 شسته شدند و به دنبال آن دو بار شستشو در بافر I (25 میلی متر Tris-HCl، pH 7.4، 300 میلی متر NaCl، 1 میلی متر MgCl2) یا بافر II (1 میلی متر Tris-HCl، pH 7.4، 150 میلی متر NaCl، 1 میلی متر MgCl2) یا هر دو. برای کشش های GFP:MBK-2، دو آزمایش جداگانه با استفاده از شرایط شستشوی مختلف انجام شد. پروتئین ها با تکان دادن اوربیتال در 50 میکرولیتر 6 متر اوره در 2 مولار تیوره در دمای اتاق شسته شدند. برای آزمایش های کشویی MBK-1::GFP، پروتئین ها دو بار با تکان دادن در 50 میکرولیتر از 8 متر کلرید گوانیدینیوم در دمای 90 درجه سانتیگراد و به دنبال آن رسوب اتانول شسته شدند. سپس نمونه های پروتئین شسته شده در محلول هضم شدند.
(رجوع کنید به چن و همکاران، 2016)
همگن سازی کرم التراسونیک و لیز
برای لیز C.elegans و روش استخراج پروتئین، 30000 نموتد مرحله مربوطه در هر نمونه جمع آوری و در S-بازال سرد یخی شستشو داده شد، به روش سانتریفیوژ در 1500 دور در دقیقه به مدت 2 دقیقه غلیظ شد، شش بار با S-basal سرد شسته شد تا باکتری های باقیمانده حذف شود و سپس روی یخ نگهداری شد تا آماده استفاده شود. برای استخراج پروتئین، به کرم های بالغ باردار اجازه داده شد تا پس از آخرین شستشوی پایه S، یک گلوله فشرده تشکیل دهند. سپس گلوله های کرم در 1 میلی لیتر بافر استخراج یخ سرد [20 میلی مولار فسفات پتاسیم، pH 7.4، 2 میلی مولار EDTA، 1 درصد تریتون-X-100، مهارکننده های پروتئاز (سیگما P2714)] آویزان و بلافاصله پردازش شدند.
∼30،000 کرم بالغ باردار (مربوط به ∼100 میلی گرم وزن مرطوب)، بر روی یخ با استفاده از یک اولتراسونیک نوع پروب (به عنوان مثال UP50H با microtip MS2) در دامنه 40٪ برای 10 چرخه 3 ثانیه در، 30 ثانیه خاموش، در 1 میلی لیتر بافر استخراج یخ سرد فراصوت شد. (رجوع کنید به باسخاران و همکاران 2012)
استخراج چربی التراسونیک از C. elegans
در لیپیدومیکس ، شاخه ای از متابولومیک ، مکمل لیپیدی سیستم های بیولوژیکی مشخص و تجزیه و تحلیل می شود. C. elegans به طور گسترده ای در لیپیدومیکس برای بررسی برهمکنش لیپیدهای متابولیک و اثرات آنها بر سلامت و طول عمر استفاده می شود.
لیز التراسونیک و استخراج استفاده می شود برای انتشار چربی مانند sphingolipids از C. elegans جنین, لارو, و کرم بالغ. سونوگرافی استفاده می شود برای آماده سازی همگن کرم و پس از آن برای استخراج چربی از نمونه.
پروتکل برای استخراج چربی التراسونیک از C. elegans
گلوله C. elegans را روی یخ ذوب کرده و با 0.5 میلی لیتر فوق آب آویزان کنید.
نمونه های C. elegans را در لوله های test 1,5 میلی لیتری فراخوانی کنید، در حالی که نمونه ها را به طور مداوم روی یخ نگه می دارید.
فراصوت را می توان با استفاده از یک کاوشگر اولتراسونیک مانند تا 200 هرتز، واحد آماده سازی نمونه اولتراسونیک VialTweeter(ویال گروهی) (فراصوت همزمان از 10 نمونه) و یا UIP400MTP (برای فراصوت صفحات چند چاه مانند صفحات 96 به چاه). برای لیز اولتراسونیک با UP200Ht از میکرو نوک S26d2 استفاده کنید. حالت چرخه اولتراسونیک را در منوی دیجیتال از پیش تنظیم کنید. تنظیم دامنه به 10٪ و حالت چرخه فراصوت از 2 پالس ثانیه از 20 چرخه با مکث 30 ثانیه.
مایع رویی را به لوله های شیشه ای با درپوش پیچ منتقل کنید.
استخراج فولچ را با افزودن 1 میلی لیتر فوق آب به هر لوله شیشه ای و سپس افزودن 6 میلی لیتر مخلوط کلروفرم/متانول (نسبت = 2:1) به هر لوله شیشه ای انجام دهید.
هر لوله شیشه ای را به مدت 30 ثانیه به مدت 4 بار گرداب کنید.
سانتریفیوژ لوله ها را در 1,258 x g به مدت 15 دقیقه (Eppendorf, 5810 R) برای افزایش بیشتر جداسازی فاز.
کسر آبگریز پایین را توسط یک پیپت پاستور شیشه ای به یک لوله شیشه ای تمیز منتقل کنید.
کسر آبگریز پایینی را تحت جریان نیتروژن در یک اواپراتور نیتروژن خشک کنید.
گلوله خشک شده را تا زمان استفاده در فریزر 80- درجه سانتی گراد نگهداری کنید.
آماده سازی التراسونیک از Lysates کرم
لیزات کرم: کرم های مرحله L4 برداشت و سه بار با بافر M9 (26/42 میلی مولار سدیم) شسته شدندH2SHPO4، 22.04 میلی متر کیلو ساعتH2Sصندوق4، 85.56 میلی مولار NaCl و 0.87 میلی مولار MgSO4) به منظور از بین بردن تمام باکتری ها. پس از حذف هرچه بیشتر بافر M9، کرم ها مجددا در بافر لیز معلق شدند: 50 میلی مولار HEPES، 50 میلی مولار KCl، 1 میلی مولار EDTA، 1 میلی مولار EGTA، 5 میلی مولار فسفات β-گلیسرول، 1/0 درصد (حجمی/حجمی) تریتون X-100، 50 میلی مولار سدیم فلوراید، 1 میلی مولار ارتووانادات سدیم، 5 میلی مولار پیروفسفات سدیم، 2/0 میلی مولار فنیل متان سولفونیل فلوراید و مهارکننده پروتئاز. کرم ها در نیتروژن مایع منجمد شدند و در دمای 37 درجه سانتیگراد برای سه بار ذوب شدند، سپس کرم ها بر روی یخ خشک با یک واحد ویال توییتر اولتراسونیک برای آماده سازی همزمان 10 لوله نمونه فراصوت شدند. فراصوت در دامنه 50 درصد در 10 سیکل 2 ثانیه ای با مکث 30 ثانیه بین انفجار فراصوت انجام شد. سپس نمونه ها در دمای 12000 دور در دقیقه در دمای 4 درجه سانتی گراد به مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ شدند. مایع رویی جمع آوری و در دمای 70- درجه سانتی گراد نگهداری شد. برای کمی سازی پروتئین با روش برادفورد از یک نقل استفاده شد.
تعیین گلوتاتیون کل، GSH و GSSG: برای کمی سازی گلوتاتیون لیز و تعیین در همان روز انجام شد. لاروهای تغذیه شده با گلوکز و شاهد L4 سه بار برداشت و با بافر M9 شسته شدند. پس از حذف تا آنجا که ممکن است از بافر M9 ، کرم ها در اسید متاسفریک سرد یخ (5٪ وزنی/حجمی) تعلیق شدند ، سپس کرم ها در یخ با یک ویال توییتر اولتراسونیک در دامنه 50٪ در ده چرخه فراصوت 2 ثانیه با مکث 30 ثانیه بین هر چرخه فراصوت شدند. پس از آن، سانتریفیوژ در دمای 12000 دور در دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد به مدت 15 دقیقه انجام شد.
(رجوع کنید به آلکانتار-فرناندز و همکاران، 2018)
C. elegans آماده سازی نمونه قبل از رسوب ایمنی و وسترن بلات
به طور خلاصه، برای عصاره های جنینی، لاروهای C. elegans L1 در کشت های مایع S-medium در مقیاس بزرگ تا بزرگسالی رشد کردند. جنین ها با استفاده از روش استاندارد سفید کننده جمع آوری شدند و در بافر لیز (50 میلی مولار تریس ، pH 7.5 ، 100 میلی مولار KCl ، 1 میلی مولار EDTA ، 1 میلی مولار MgCl2 ، 8.7٪ گلیسرول ، 0.05٪ NP-40 ، کوکتل مهارکننده پروتئاز 1 و کوکتل مهارکننده فسفاتاز 1 و II ) ، به سرعت در نیتروژن مایع منجمد شدند و با اختلال سلول های اولتراسونیک با استفاده از یک مافوق صوت با میکرونوک مانند لیز شدند تا 200 هرتز با S26d2 برای 10 پالس بیش از 10 ثانیه در دامنه 30٪. اگر تعداد بیشتری از نمونه ها باید آماده شود اولتراسونیک VialTweeter(ویال گروهی) یا UIP400MTP MultiSample-Ultrasonicator برای صفحات خوب توصیه می شود. پس از فراصوت ، عصاره ها با سانتریفیوژ در دمای 30000 گرم به مدت 20 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد از قبل پاک شدند. عصاره از پیش پاکسازی شده (300 میکروگرم پروتئین کل) با 40 میکروگرم آنتی بادی ضد CDC-25.1 تخیلی خالص شده (این مطالعه) متصل به پروتئین A-آگارز یا به عنوان شاهد، مقدار مشابهی از ایمونوگلوبولین خرگوش (Ig)G متصل به پروتئین A-آگارز در حجم کل 200 میکرولیتر بافر لیز حاوی 1 درصد NP-40 استفاده شد که گنجاندن آن اتصال غیراختصاصی پروتئین ها به ماتریکس را کاهش داد. نمونه ها به مدت 1 ساعت در دمای 4 درجه سانتی گراد چرخانده شدند، دانه ها سه بار با بافر لیز شسته شدند و با 30 میکرولیتر گلیسین در هیدروکلریک و 200 میلی مولار NaCl و pH 2.2 شسته شدند. پس از رسوب ایمنی، لوئات ها در 30 میکرولیتر بافر نمونه SDS رقیق شدند و به مدت 4 دقیقه تا 95 درجه سانتی گراد حرارت داده شدند و به طور معمول 3 درصد از کل برای ورودی و 30 درصد برای آلوئات ها روی SDS-PAGE و پس از آن وسترن بلات با آنتی بادی های ضد CDC-25.1 (1:400)، ضد LIN-23 (1:750)، آنتی یوبیکوئیتین (1:1000)، ضد GSK3 (1:500) یا آنتی β-اکتین (1:2000) اعمال شد. در مواردی که عصاره ها تحت رسوب ایمنی قرار نگرفتند، همان مقدار پروتئین کل مشتق شده از آن عصاره ها در بافر نمونه SDS معلق شد، تا دمای 95 درجه سانتی گراد حرارت داده شد و سپس مستقیما روی SDS-PAGE اعمال شد و با وسترن بلات تجزیه و تحلیل شد. (رجوع کنید به Segref و همکاران 2020)
لیز اولتراسونیک تحت کنترل دما Prescise
کنترل دقیق و قابل اعتماد دما هنگام رسیدگی به نمونه های بیولوژیکی بسیار مهم است. دمای بالا باعث تخریب پروتئین ناشی از حرارت در نمونه ها می شود.
به عنوان تمام تکنیک های آماده سازی نمونه مکانیکی، فراصوت ایجاد گرما. با این حال، دمای نمونه ها را می توان هنگام استفاده از VialTweeter به خوبی کنترل کرد. ما گزینه های مختلفی را برای نظارت و کنترل دمای نمونه های شما در حین آماده سازی آنها با VialTweeter و VialPress برای تجزیه و تحلیل به شما ارائه می دهیم.
- نظارت بر دمای نمونه: پردازنده اولتراسونیک UP200St که VialTweeter را هدایت می کند، مجهز به نرم افزار هوشمند و سنسور دما قابل اتصال است. سنسور دما را به UP200St وصل کنید و نوک سنسور دما را در یکی از لوله های نمونه قرار دهید. از طریق صفحه نمایش لمسی رنگی دیجیتال، می توانید در منوی UP200St یک محدوده دما خاص برای فراصوت نمونه خود را تنظیم کنید. اولتراسونیک به طور خودکار متوقف می شود زمانی که حداکثر دما رسیده است و مکث می کند تا زمانی که دمای نمونه به مقدار پایین تر از دمای تنظیم شده ∆. سپس فراصوت دوباره به طور خودکار شروع می شود. این ویژگی هوشمند از تخریب ناشی از گرما جلوگیری می کند.
- بلوک VialTweeter را می توان از قبل خنک کرد. بلوک VialTweeter (فقط سونوترود بدون مبدل!) را در یخچال یا فریزر قرار دهید تا بلوک تیتانیوم از قبل خنک شود و به تعویق انداختن افزایش دما در نمونه کمک می کند. در صورت امکان، خود نمونه را می توان از قبل خنک کرد.
- استفاده از یخ خشک برای خنک شدن در طول فراصوت. از یک سینی کم عمق پر از یخ خشک استفاده کنید و VialTweeter را روی یخ خشک قرار دهید تا گرما به سرعت از بین برود.
پیدا کردن مختل کننده سلول اولتراسونیک بهینه برای برنامه لیز خود را
Hielscher مافوق صوت طولانی مدت تولید کننده با تجربه از اختلالات سلول اولتراسونیک با کارایی بالا و هموژنایزرها برای آزمایشگاه ها، نیمکت بالا و سیستم های مقیاس صنعتی است. اندازه کشت سلولی باکتریایی شما، هدف تحقیق یا تولید شما و حجم سلول برای پردازش در ساعت یا روز عوامل ضروری برای یافتن مختل کننده سلول اولتراسونیک مناسب برای برنامه شما هستند.
Hielscher مافوق صوت ارائه می دهد راه حل های مختلف برای فراصوت همزمان از چند نمونه (تا 10 ویال) و همچنین نمونه های توده (به عنوان مثال، صفحات microtiter / صفحات 96 به چاه)، کلاسیک پروب نوع آزمایشگاه ultrasonicator با سطوح مختلف قدرت از 50 به 400 وات به پردازنده های مافوق صوت به طور کامل صنعتی با تا 16،000 وات در هر واحد برای اختلال سلول های تجاری و استخراج پروتئین در تولید بزرگ. همه مافوق صوت Hielscher برای عملیات 24/7/365 تحت بار کامل ساخته شده است. استحکام و قابلیت اطمینان از ویژگی های اصلی دستگاه های اولتراسونیک ما است.
تمام هموژنایزرهای اولتراسونیک دیجیتال مجهز به نرم افزار هوشمند، صفحه نمایش لمسی رنگی و پروتکل سازی خودکار داده ها هستند که دستگاه اولتراسونیک را به یک ابزار کار مناسب در آزمایشگاه و امکانات تولید تبدیل می کند.
به ما اطلاع دهید ، چه نوع سلول ها ، چه حجمی ، با چه فرکانس و با چه هدفی برای پردازش نمونه های بیولوژیکی خود دارید. ما به شما مناسب ترین مختل کننده سلول اولتراسونیک را برای نیازهای فرآیند خود توصیه می کنیم.
جدول زیر به شما نشانه ای از ظرفیت پردازش تقریبی سیستم های اولتراسونیک ما از هموژنایزرهای دستی جمع و جور و MultiSample Ultrasonicators به پردازنده های اولتراسونیک صنعتی برای کاربردهای تجاری می دهد:
حجم دسته ای | نرخ جریان | دستگاه های توصیه شده |
---|---|---|
صفحات 96 چاه / میکروتیتر | ن.ا. | UIP400MTP |
10 ویال à 0.5 تا 1.5 میلی لیتر | ن.ا. | VialTweeter در UP200St |
00.01 تا 250 میلی لیتر | 5 تا 100 میلی لیتر در دقیقه | UP50H |
00.01 تا 500 میلی لیتر | 10 تا 200 میلی لیتر در دقیقه | UP100H |
10 تا 2000 میلی لیتر | 20 تا 400 میلی لیتر در دقیقه | تا 200 هرتز، UP400St |
0.1 تا 20 لیتر | 0.2 تا 4 لیتر در دقیقه | UIP2000hdT |
10 تا 100 لیتر | 2 تا 10 لیتر در دقیقه | UIP4000hdT |
ن.ا. | 10 تا 100 لیتر در دقیقه | UIP16000 |
ن.ا. | بزرگتر | خوشه ای از UIP16000 |
تماس با ما! / از ما بپرسید!
ادبیات / منابع
- Chen J.-X; Cipriani P.G.; Mecenas D.; Polanowska J.; Piano F.; Gunsalus K.C.; Selbach M. (2016): In Vivo Interaction Proteomics in Caenorhabditis elegans Embryos Provides New Insights into P Granule Dynamics. Molecular & Cellular Proteomics 15.5; 2016. 1642-1657.
- Jonathan Alcántar-Fernández, Rosa E. Navarro, Ana María Salazar-Martínez, Martha Elva Pérez-Andrade, Juan Miranda-Ríos (2018): Caenorhabditis elegans respond to high-glucose diets through a network of stress-responsive transcription factors. PLoS One 13(7); 2018.
- Segref, A.; Cabello, J.; Clucas, C.; Schnabel, R.; Johnstone I.L. (2010): Fate Specification and Tissue-specific Cell Cycle Control of the Caenorhabditis elegans Intestine. Molecular Biology of the Cell Vol. 21, 2010. 725–738.
- Henderson S.T., Bonafe M., Johnson T.E. (2006): daf-16 protects the nematode Caenorhabditis elegans during food deprivation. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 2006; 61:444–60.
حقایقی که ارزش دانستن دارند
Caenorhabditis elegans
C. elegans یک نماتد شفاف (کرم گرد) با طول حدود 1 میلی متر است که از باکتری ها (به عنوان مثال E. coli) تغذیه می کند و چرخه عمر نسبتا کوتاهی دارد. در دمای 20 درجه سانتی گراد، سویه آزمایشگاهی C. elegans (N2) دارای طول عمر متوسط حدود 2 تا 3 هفته و زمان نسل 3 تا 4 روز است. هنگامی که C. elegans به تعداد زیاد رشد می کند، که به راحتی می تواند در شرایط آزمایشگاهی دقیق کنترل شده انجام شود، می توان آنها را به راحتی از نظر اصل کار داروهای جدید و همچنین اثرات و تعامل آنها در فرآیندهای مولکولی پیچیده در بیماری های انسانی غربالگری کرد. ژنوم کوتاه، چرخه عمر کوتاه و دست زدن به ساده در محیط های آزمایشگاهی، C. elegans را به یک ارگانیسم مدل ایده آل برای تحقیقاتی مانند ژنومیک، پروتئومیکس، زیست شناسی رشد، تحقیقات بیماری، توسعه دارو و غیره تبدیل می کند.
کرم های Caenorhabditis elegans می توانند نر یا هرمافرودیت باشند. هرمافرودیت ها دارای اندام های تناسلی زن و مرد هستند. با این حال، کرم های ماده وجود ندارند. هرمافرودیت ها می توانند خود بارور شوند یا همچنین می توانند با کرم های نر تولید مثل کنند. C. elegans می تواند روزانه بیش از 1000 تخم مرغ تولید کند.
از آنجا که C. elegans یکی از ساده ترین موجودات با سیستم عصبی است ، کرم نماتد از سال 1963 به عنوان ارگانیسم مدل برای تحقیق استفاده می شود. نورون ها پتانسیل های عمل را شلیک نمی کنند و هیچ کانال سدیم با ولتاژ را بیان نمی کنند. در هرمافرودیت ، این سیستم شامل 302 نورون است که الگوی آنها به طور جامع نقشه برداری شده است ، در آنچه به عنوان کانکتوم شناخته می شود.
بسیاری از ژن های موجود در ژنوم C. elegans همتایان عملکردی در انسان دارند که آن را به یک مدل بسیار مفید برای بیماری های انسانی تبدیل می کند و به عنوان مثال برای مطالعه زیست شناسی رشد، پیری و عوامل موثر بر طول عمر استفاده می شود. علاوه بر این، جهش یافته های C. elegans مدل هایی را برای بسیاری از بیماری های انسانی از جمله اختلالات عصبی (مانند آلزایمر)، بیماری های مادرزادی قلب و بیماری های کلیوی ارائه می دهند.
این عوامل C. elegans را به یک مدل بسیار ارزشمند برای بسیاری از زمینه های تحقیقاتی تبدیل کرد. در نتیجه، C. elegans اولین ارگانیسم چند سلولی بود که کل ژنوم خود را توالی یابی کرد. این ژنوم شامل حدود 20,470 ژن کد کننده پروتئین است. حدود 35 درصد از ژن های C. elegans دارای همولوگ انسانی هستند. قابل توجه است که ژن های انسانی بارها و بارها نشان داده شده اند که جایگزین همولوگ های C. elegans خود می شوند که به C. elegans معرفی می شوند. برعکس، بسیاری از ژن های C. elegans می توانند مشابه ژن های پستانداران عمل کنند.
طول عمر C. elegans تقریبا 3 هفته است و شامل شش مرحله زندگی جنین زایی (مرحله تخم مرغ)، چهار مرحله لاروی (L1 تا L4) و مرحله بلوغ است. نماتدها از تخم ها به صورت لارو L1 متشکل از 560 سلول بیرون می آیند. رشد در هر مرحله لارو با تقسیم سلولی و هیپرتروفی سلولی اتفاق می افتد. پوست اندازی کوتیکولی هر مرحله لارو را نقطه گذاری می کند. اگر شرایط محیطی سخت به کرم در حال رشد سیگنال دهد که بعید است شرایط از باروری بزرگسالان حمایت کند، C. elegans می تواند رشد آن را تغییر دهد و یک مرحله لارو L3 جایگزین را تشکیل دهد، جایی که لاروها به مرحله داور می روند. در این حالت، حیوانات فوق العاده مقاوم در برابر استرس و عمر طولانی هستند و می توانند سه تا نه ماه زنده بمانند. لاروهای داور با مهر و موم کردن حفره های باکال و مقعدی خود، کوچک کردن روده و روشن کردن یک برنامه ژنتیکی وابسته به daf-16/FOXO که از جمله موارد دیگر، منجر به بیان کوتیکول مخصوص داور می شود، خود را از ناملایمات جدا می کنند. (نگاه کنید به هندرسون و همکاران، 2006)
C. elegans لارو Dauer
لارو داور اصطلاحی برای لارو نماتد است که وارد مرحله رشد جایگزین شده است. اصطلاح "لارو Dauer" به ویژه برای کرم های خانواده رابدیتیدها از جمله Caenorhabditis elegans استفاده می شود. کلمه "Dauer" ریشه آلمانی دارد و به معنای "مدت زمان" است” به معنای “یک دوره زمانی". لاروهای داور وارد نوعی سکون می شوند و می توانند در شرایط سخت زنده بمانند. اگر و زمانی که لارو وارد مرحله داور می شود به شرایط محیطی بستگی دارد. لاروهای داور به طور گسترده در زیست شناسی مورد مطالعه قرار می گیرند زیرا لاروها توانایی فوق العاده ای برای زنده ماندن در محیط های سخت و زندگی طولانی مدت نشان می دهند. به عنوان مثال، C. elegans dauer لاروها می توانند تا چهار ماه زنده بمانند، بسیار بیشتر از میانگین طول عمر آنها در حدود سه هفته در طول رشد تولید مثل.
مروری بر چرخه زندگی C. elegans
C. توسعه در محیط های مطلوب:
Caenorhabditis elegans (C. elegans) پیشرفت تکاملی متفاوتی را در شرایط محیطی مطلوب و نامطلوب نشان می دهد.
C. elegans پاسخ به شرایط مطلوب:
در شرایط مطلوب ، کرم گرد میکروسکوپی Caenorhabditis elegans (C. elegans) یک مسیر رشد کاملا مشخص را دنبال می کند. نماتد معمولا زمانی که شرایط محیطی بهینه است، معمولا در دمای بین 15 تا 20 درجه سانتیگراد، چرخه زندگی خود را به سرعت طی می کند.
- رشد تولید مثل: C. elegans چرخه زندگی خود را به عنوان یک جنین آغاز می کند. سپس از طریق چهار مرحله لاروی مجزا پیشرفت می کند که به اختصار L1 تا L4 نامیده می شود.
- مرحله بزرگسالان: پس از اتمام چهار مرحله لارو، C. elegans تنها در 3 تا 5 روز به مرحله بزرگسالی می رسد. در این مرحله ، آنها بسته به عوامل محیطی قادر به تولید مثل هستند و 2 تا 3 هفته دیگر به زندگی خود ادامه می دهند.
C. elegans پاسخ به شرایط نامطلوب:
با این حال ، C. elegans یک ارگانیسم انعطاف پذیر است و می تواند از طریق فرآیندی به نام تشکیل داور با شرایط نامطلوب سازگار شود.
- شکل گیری داور: هنگامی که شرایط محیطی نامساعد می شود، مانند ازدحام بیش از حد، عرضه محدود مواد غذایی یا دمای بالا، C. elegans می تواند وارد مرحله سوم لاروی فوق العاده ای به نام “داور,” به اختصار L3d است.
- بقای داور: لاروهای داور به ویژه برای زنده ماندن در شرایط سخت سازگار هستند. آنها می توانند چندین ماه در این مرحله زندگی کنند، انرژی را حفظ کنند و در برابر محیط های چالش برانگیز مقاومت کنند.
بهبودی در محیط های مطلوب:
جنبه قابل توجه C. elegans توانایی آن در بازگشت به چرخه زندگی عادی در هنگام بهبود شرایط است.
- بازگشت به شرایط مطلوب: هنگامی که C. elegans dauer لاروها دوباره با شرایط مطلوبی مانند غذای فراوان، تراکم جمعیت کمتر و دمای مناسب مواجه می شوند، تغییر محیط را احساس می کنند.
- بازیابی و تولید مثل: در پاسخ به این شرایط بهبود یافته، لاروهای داور تحت فرآیندی به نام “بازیابی.” در طول بهبودی، آنها به مراحل لارو باز می گردند و در نهایت به بزرگسالان باروری با طول عمر طبیعی تبدیل می شوند.
این توانایی برای جابجایی بین مراحل رشد در پاسخ به شرایط محیطی، جنبه خاصی از زیست شناسی C. elegans است. این به آنها اجازه می دهد تا در طیف گسترده ای از شرایط به طور موثر زنده بمانند و تولید مثل کنند و آنها را به یک ارگانیسم مدل ارزشمند برای تحقیقات علمی، به ویژه در مطالعه توسعه، ژنتیک و پیری تبدیل می کند.