لیز فراصوتی برای وسترن بلات

• وسترن بلات روشی تحلیلی برای شناسایی پروتئین‌های اختصاصی در نمونه‌ای از هموژنات بافت یا عصارهٔ سلولی است.
• برای انجام وسترن بلات یا اندازه‌گیری فعالیت آنزیمی، بسیاری از سنجش‌ها به دسترسی به مواد محصور در سلول (مانند پروتئین‌ها، DNA و قطعات زیرسلولی) نیاز دارند.
• فراصوت‌دهی روشی قابل‌اعتماد و آسان برای تخریب و لیز کنترل‌شدهٔ سلولی است.

تخریب سلولی فراصوتی

استخراج پروتئین از بافت‌ها و سلول‌های کشت‌شده، نخستین گام در بسیاری از روش‌های زیستی، بیوشیمیایی و تحلیلی (PAGE، وسترن بلات، ELISA، طیف‌سنجی جرمی و غیره) یا خالص‌سازی پروتئین است. برای دستیابی به بازده بالای پروتئین، مواد سلولی و بافت باید به‌طور مؤثر تخریب/لیز شوند. چه با سلول گیاهی کار کنید و چه با بافت جانوری، فراصوت‌دهی روشی برای تهیهٔ آسان و سریع لیزات سلولی است.

مزایای فراصوت‌دهی

• سریع و کارآمد
• کاربری آسان
• بازده بالای پروتئین
• بازتولیدپذیر/تکرارپذیر
• با کنترل دقیق
• مقیاس‌پذیر

پروتکل رسوب‌دهی ایمنی برای ایمونوبلاتینگ وسترن

A. معرف‌ها

برای تهیهٔ محلول‌ها، از آب خالص‌شده مانند Milli-Q استفاده کنید.

• محلول نمکی بافرشده با فسفات (PBS) با غلظت 1X
• بافر لیز سلولی 1X: ‏20 mM Tris (pH 7٫5)، ‏150 mM NaCl، ‏1 mM EDTA، ‏1 mM EGTA، ‏1% Triton X-100، ‏2٫5 mM پیروفسفات سدیم، ‏1 mM β-گلیسروفسفات، ‏1 mM Na3VO4، ‏1 μg/ml لوپپتین
  مهم: درست پیش از مصرف، 1 mM PMSF اضافه کنید.
• 15 μl پروتئین A+15 μl پروتئین G برای IP کافی است، اما مقدار لازم ممکن است به آنتی‌بادی اولیه و حجم نمونهٔ شما بستگی داشته باشد. همچنین می‌توانید از آگاروز پروتئین A/ G ازپیش‌مخلوط‌شده استفاده کنید (برای مثال، پروتئین A برای پایین‌کشی IgG خرگوش و پروتئین G برای پایین‌کشی IgG موش).
• بافر نمونهٔ SDS با غلظت 3X: ‏187٫5 mM Tris-HCl (pH 6٫8 در 25°C)، ‏6% w/v SDS، ‏30% گلیسرول، ‏150 mM DTT، ‏0٫03% w/v بروموفنول بلو

B. تهیهٔ لیزات‌های سلولی

• سلول‌ها را جمع‌آوری کنید. برای جمع‌آوری سلول‌ها در شرایط غیردناتوره‌کننده، محیط کشت را بردارید و سلول‌ها را یک بار با PBS سردشده تا دمای یخ آبکشی کنید.
• PBS را بردارید و به هر پلیت (10 cm)، مقدار 0٫5 ml بافر لیز سلولی 1X سردشده تا دمای یخ اضافه کنید و پلیت‌ها را به‌مدت 5 دقیقه روی یخ انکوبه کنید.
• سلول‌ها را با خراشیدن از پلیت‌ها جدا کنید و به لوله‌های میکروسانتریفیوژ انتقال دهید. روی یخ نگه دارید.
• در بافر رسوب‌دهی ایمنی سردشده تا دمای یخ، دو بار و هر بار به‌مدت 10 ثانیه فراصوت‌دهی کنید (بافر IP: ‏50 mM Tris-HCl [pH 7٫4]، ‏150 mM NaCl، ‏5 mM EDTA، ‏0٫1% NP-40 و مخلوط مهارکننده‌های پروتئاز). برای فراصوت‌دهی، VialTweeter یا دستگاه فراصوت پروبی مانند UP100H یا UP200Ht مناسب‌ترین گزینه‌ها هستند.
• لیزات‌ها را با 15٬000 g به‌مدت 10 دقیقه در 4°C سانتریفیوژ کنید.
• مایع رویی را به لوله‌ای جدید منتقل کنید. (در صورت لزوم، می‌توان لیزات را در –80°C نگهداری کرد.)
• آنتی‌بادی اولیه را به مایع رویی اضافه کنید. مایع رویی حاوی آنتی‌بادی اولیه به‌مدت 1 h در 4°C با هم‌زدن ملایم انکوبه می‌شود. آنتی‌بادی اولیه معمولاً با غلظت 10x بیشتر از غلظت مورد استفاده در وسترن بلات اضافه می‌شود. (می‌توانید با 1μg به‌ازای 100μL شروع کنید.)
• سپس مایع رویی همراه با مخلوطی از مقادیر برابر آگاروز پروتئین A ‏(Invitrogen) و آگاروز پروتئین G، به‌مدت 1 h دیگر انکوبه می‌شود.
• رسوب‌های آگاروز را سه بار با بافر IP بشویید. سپس پروتئین‌های متصل‌شده را با بافر بارگذاری SDS-PAGE، با حرارت‌دادن در 95°C به‌مدت 5 دقیقه استخراج کنید.

C. رسوب‌دهی ایمنی

• 200 μl لیزات سلولی بردارید و آنتی‌بادی اولیه اضافه کنید. یک شب در 4°C با حرکت نوسانی ملایم انکوبه کنید.
• مهره‌های آگاروز پروتئین A یا G را اضافه کنید (20 μl از سوسپانسیون غلیظ مهره‌ها با غلظت 50%). به‌مدت 1–3 ساعت در 4°C با حرکت نوسانی ملایم انکوبه کنید.
• به‌مدت 30 ثانیه در 4°C میکروسانتریفیوژ کنید. رسوب را پنج بار با 500 µl بافر لیز سلولی 1X بشویید. در طول شست‌وشوها روی یخ نگه دارید.
• رسوب را با 20 μl بافر نمونهٔ SDS با غلظت 3X مجدداً معلق کنید. ورتکس کنید و سپس به‌مدت 30 ثانیه میکروسانتریفیوژ کنید.
• نمونه را به‌مدت 2–5 دقیقه تا 95–100°C گرم کنید و به‌مدت 1 دقیقه با 14٬000 X g میکروسانتریفیوژ کنید.
• نمونه (15–30 μl) را روی ژل SDS-PAGE ‏(12–15%) بارگذاری کنید.
• نمونه را با وسترن بلات تحلیل کنید.

تحلیل وسترن بلات با سونیکاتور UP50H

پروتکل زیر با استفاده از سونیکاتور پروبی UP50H در مطالعهٔ Kriebisch و همکاران (2011) به کار گرفته شد:
پروتئین کل از سلول‌های MC3T3-E1 تیمارشده با 1,25(OH)₂D₃ (10⁻⁸ M) یا حامل جدا شد. سلول‌ها با بافری حاوی 50 mM Tris HCl، ‏pH 8 ‏(Sigma-Aldrich)؛ ‏150 mM NaCl ‏(Fisher Scientific)؛ ‏0٫1% سدیم دودسیل سولفات (SDS) ‏(Fisher Scientific)؛ ‏1% IGEPAL CA-630 ‏(Sigma-Aldrich) و 0٫5% سدیم دئوکسی‌کولات (Merck) لیز شدند. لیزات سلولی به‌مدت 2 × 10 s با تنظیم چرخه روی 1 و دامنه روی 80، با استفاده از پردازشگر فراصوتی UP50H (Hielscher، ‏Ultrasound Technology، ‏Teltow، آلمان) فراصوت‌دهی شد. سپس مواد به‌مدت 10 min با 14٬000 rpm سانتریفیوژ شدند و مایع رویی برای وسترن بلات استفاده شد. بیست‌وپنج μg پروتئین در بافر نمونه و عامل احیاکننده (Invitrogen) جوشانده شد و سپس با SDS-PAGE و با استفاده از ژل‌های پلی‌آکریل‌آمید 4–12% ‏(Invitrogen) جداسازی و به غشای نیتروسلولزی (GE health care) منتقل شد. غشا به‌مدت 1 h با TBS ‏(10 mM Tris-HCl؛ ‏pH 7٫6؛ ‏150 mM NaCl) حاوی 1% کازئین (Sigma-Aldrich) و 1% Tris ‏(1 M) مسدود شد. پس از مسدودسازی، غشا یک شب در 4°C با هم‌زدن ملایم همراه با آنتی‌بادی اولیه (آنتی‌بادی خرگوشی ضد CBS انسانی با رقت 1/500، تولیدشده در آزمایشگاه Prof. R. Banerjee، ‏Ann Arbor، ‏MI، ‏USA) انکوبه شد. انکوباسیون با آنتی‌بادی ثانویهٔ کونژوگه‌شده با پراکسیداز ترب کوهی (HPR) ‏(Dako) به‌مدت 1 h در دمای اتاق انجام شد. همهٔ بلات‌ها با شیمی‌لومینسانس تقویت‌شده (Perkin Elmer) آشکارسازی شدند.
 

برای مطالعهٔ بیشتر دربارهٔ بهترین شیوه‌های لیز و استخراج فراصوتی سلولی، تهیهٔ لیزات و توصیه‌های بهبود فرایند، اینجا کلیک کنید!
 
جدول زیر نمایی از ظرفیت تقریبی پردازش دستگاه‌های فراصوت آزمایشگاهی ما ارائه می‌دهد:

منابع علمی / مراجع

• Koch RJ, Barrette AM, Stern AD, et al. Validating Antibodies for Quantitative Western Blot Measurements with Microwestern Array. Sci Rep. 2018;8(1):11329. Published 2018 Jul 27. doi:10.1038/s41598-018-29436-0
• Carsten Kriebitzsch, Lieve Verlinden, Guy Eelen, Natasja M. van Schoor, Karin Swart, Paul Lips, Mark B. Meyer, J Wesley Pike, Steven Boonen, Carsten Carlberg, Victor Vitvitsky, Roger Bouillon, Ruma Banerjee, and Annemieke Verstuyf (2011): 1,25-dihydroxyvitamin D3 influences cellular homocysteine levels in murine pre-osteoblastic MC3T3-E1 cells by direct regulation of cystathionine β-synthase. J Bone Miner Res. 26(12), 2011. 2991–3000.
• Tahrin Mahmood, Ping-Chang Yang (2012): Western Blot: Technique, Theory, and Trouble Shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4(9), 2012. 429-434.