لیز اولتراسونیک برای وسترن بلات
- وسترن بلات یک روش تحلیلی برای تشخیص پروتئین های خاص در نمونه ای از بافت همگن یا عصاره سلولی است.
- برای اجرای یک لکه غربی یا اندازه گیری فعالیت آنزیم، بسیاری از سنجش ها نیاز به دسترسی به مواد (به عنوان مثال پروتئین ها، DNA، قطعات زیر سلولی) به دام افتاده در سلول دارند.
- فراصوت یک روش قابل اعتماد و آسان برای کنترل اختلال سلول و لیز است.
اختلال سلول اولتراسونیک
استخراج پروتئین از بافت ها و سلول های کشت شده اولین قدم برای بسیاری از تکنیک های بیولوژیکی، بیوشیمیایی و تحلیلی (PAGE، وسترن بلاتینگ، الایزا، طیف سنجی جرمی و غیره) یا تصفیه پروتئین است. برای به دست آوردن بازده پروتئین بالا، مواد و بافت سلول باید به طور موثر مختل/لیز شوند. چه سلول گیاهی و چه بافت حیوانی، فراصوت روشی برای آماده سازی لیز سلولی شما آسان و سریع است.
مزایای فراصوت
- سریع & کارآمد
- عملیات آسان
- بازده پروتئین بالا
- قابل تکرار/ تکرارپذیر
- دقیقا کنترل می شود
- Scalable
سونیکاتور VialTweeter برای آماده سازی نمونه اولتراسونیک مانند اختلال سلولی و جداسازی پروتئین
پروتکل رسوب ایمنی برای ایمونوبلات غربی
الف معرف ها
برای تهیه محلول ها از آب تصفیه شده مانند Milli-Q استفاده کنید.
- 1X نمک بافر فسفات (PBS)
- بافر لیز سلولی 1X: 20 میلی مولار تریس (pH 7.5) ، 150 میلی مولار NaCl ، 1 میلی مولار EDTA ، 1 میلی مولار EGTA ، 1٪ تریتون X-100 ، 2.5 میلی مولار پیروفسفات سدیم ، 1 میلی مولار β-گلیسروفسفات ، 1 میلی مولار Na3VO4 ، 1 میکروگرم در میلی لیتر لوپپتین
مهم: بلافاصله قبل از استفاده، 1 میلی مولار PMSF اضافه کنید. - 15 میکرولیتر پروتئین A+15 میکرولیتر پروتئین G برای IPکافی است، اما ممکن است به آنتی بادی اولیه و حجم نمونه شما بستگی داشته باشد. همچنین می توانید از پروتئین A/G آگارز از پیش مخلوط شده استفاده کنید (به عنوان مثال پروتئین A برای خرگوش IgG را پایین بکشید و پروتئین G برای موش IgG را پایین بکشید)
- بافر نمونه 3X SDS: 187.5 میلی مولار Tris-HCl (pH 6.8 در 25 درجه سانتیگراد) ، 6٪ وزن / حجم SDS ، 30٪ گلیسرول ، 150 میلی مولار DTT ، 0.03٪ وزن / حجم بروموفنول آبی
ب. تهیه لیزات سلولی
- سلول ها را برداشت کنید. برای برداشت سلول ها در شرایط غیر دناتوره ، محیط را بردارید و سلول ها را یک بار با PBS سرد یخ بشویید.
- PBS را بردارید و 0.5 میلی لیتر بافر لیز سلولی 1X یخ سرد را به هر صفحه (10 سانتی متر) اضافه کنید و صفحات را به مدت 5 دقیقه روی یخ جوجه کشی کنید.
- سلول ها را از صفحات خراش دهید و به لوله های میکروسانتریفیوژ منتقل کنید. روی یخ نگه دارید.
- دو بار به مدت 10 ثانیه در بافر رسوب ایمنی سرد (بافر IP: 50 میلی مولار Tris-HCl [pH 7.4]، 150 میلی مولار NaCl، 5 میلی مولار EDTA، 0.1٪ NP-40 و مخلوط مهارکننده پروتئاز). برای فراصوت ، VialTweeter(ویال گروهی) یا یک اولتراسونیک کاوشگر مانند UP100H یا تا 200 هرتز مناسب ترین هستند.
- سانتریفیوژ لیز در دمای 15000 گرم به مدت 10 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد.
- مایع رویی را به یک لوله جدید منتقل کنید. (در صورت لزوم، لیزات را می توان در دمای -80 درجه سانتیگراد ذخیره کرد.)
- آنتی بادی اولیه را به مایع رویی اضافه کنید. مایع رویی با آنتی بادی اولیه به مدت 1 ساعت در دمای 4 درجه سانتی گراد تحت هم زدن سبک انکوبه می شود. آنتی بادی اولیه معمولا به مقداری 10 برابر غلیظ تر از آنچه برای وسترن بلات استفاده می شود اضافه می شود. (می توانید با 1 میکروگرم در هر 100 میکرولیتر شروع کنید.)
- سپس مایع رویی با مخلوطی از مقادیر مساوی پروتئین A-آگارز (Invitrogen) و پروتئین G آگارز به مدت 1 ساعت دیگر انکوبه می شود.
- گلوله های آگارز را سه بار با بافر IP بشویید. سپس پروتئین های متصل شده را با بافر بارگذاری SDS-PAGE با حرارت دادن در دمای 95 درجه سانتی گراد به مدت 5 دقیقه استخراج کنید.
ج. رسوب ایمنی
- 200 میکرولیتر لیز سلولی مصرف کرده و آنتی بادی اولیه را اضافه کنید. یک شب با تکان دادن ملایم در دمای 4 درجه سانتیگراد جوجه کشی کنید.
- مهره های آگارز پروتئین A یا G (20 میکرولیتر دوغاب مهره 50٪) را اضافه کنید. با تکان دادن ملایم به مدت 1 تا 3 ساعت در دمای 4 درجه سانتیگراد جوجه کشی کنید.
- میکرو سانتریفیوژ به مدت 30 ثانیه در دمای 4 درجه سانتیگراد. گلوله را پنج بار با 500 میکرولیتر بافر لیز سلول 1X بشویید. در حین شستشو روی یخ نگه دارید.
- گلوله را با بافر نمونه 20 میکرولیتر 3X SDS به حالت تعلیق درآورید. گرداب ، سپس میکرو سانتریفیوژ به مدت 30 ثانیه.
- نمونه را به مدت 2-5 دقیقه تا 95-100 درجه سانتیگراد و میکروسانتریفیوژ را به مدت 1 دقیقه در دمای 14000 گرم گرم کنید.
- نمونه (15-30 میکرولیتر) را روی ژل SDS-PAGE (12-15٪) بارگذاری کنید.
- نمونه را با وسترن بلات تجزیه و تحلیل کنید.
تجزیه و تحلیل وسترن بلات با Sonicator UP50H
پروتکل زیر با استفاده از فراصوت پروب نوع UP50H در مطالعه Kriebisch و همکاران (2011) استفاده شد:
پروتئین کل از سلول های MC3T3-E1 تیمار شده با 1،25 (OH) جداسازی شدH2SD3 (10-8 M) یا وسیله نقلیه. سلول ها با یک بافر حاوی 50 میلی مولار Tris HCl، pH 8 (سیگما-آلدریچ) لیز شدند. 150 میلی مولار NaCl (فیشر علمی)؛ 0.1٪ سدیم دودسیل سولفات (SDS) (فیشر علمی)؛ 1٪ IGEPAL CA-630 (سیگما-آلدریچ) و 0.5٪ دئوکسی کولات سدیم (مرک). لیز سلولی به مدت 2 × 10 ثانیه در چرخه 1 و دامنه 80 با پردازنده اولتراسونیک UP50H (Hielscher ، فناوری اولتراسوند ، Teltow ، آلمان). پس از آن مواد به مدت 10 دقیقه در 14000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شد و مایع رویی برای وسترن بلات استفاده شد. 25 میکروگرم پروتئین در بافر نمونه و عامل احیا کننده (Invitrogen) جوشانده شد و سپس با استفاده از ژل های پلی آکریل آمید 4 تا 12 درصد (Invitrogen) توسط SDS-PAGE جدا شد و به غشای نیتروسلولز (GE health care) منتقل شد. غشا به مدت 1 ساعت با TBS (10 میلی مولار Tris-HCl؛ pH 7.6؛ 150 میلی مولار NaCl) حاوی 1٪ کازئین (سیگما-آلدریچ) و 1٪ تریس (1 مولار) مسدود شد. پس از مسدود شدن، غشا با تحریک جزئی در طول شب در دمای 4 درجه سانتیگراد با آنتی بادی اولیه انکوبه شد (خرگوش ضد انسانی CBS 1/500، توسعه یافته در آزمایشگاه پروفسور R. Banerjee، Ann Arbor، MI، ایالات متحده آمریکا). انکوباسیون با آنتی بادی ثانویه کونژوگه پراکسیداز ترب (HPR) (داکو) به مدت 1 ساعت در دمای اتاق انجام شد. همه لکه ها با استفاده از شیمی لومینسانس تقویت شده (Perkin Elmer) ایجاد شدند.
اینجا را کلیک کنید برای مطالعه بیشتر در مورد بهترین شیوه ها برای لیز سلول اولتراسونیک و استخراج، آماده سازی لیز و توصیه هایی برای بهبود فرآیند!
جدول زیر به شما نشانه ای از ظرفیت پردازش تقریبی مافوق صوت به اندازه آزمایشگاه ما می دهد:
| دستگاه های توصیه شده | حجم دسته ای | نرخ جریان |
|---|---|---|
| UIP400MTP سونیکاتور صفحه 96 چاه | صفحات چند چاه / میکروتیتر | ن.ا. |
| التراسونیک CupHorn | CupHorn برای ویال یا لیوان | ن.ا. |
| GDmini2 | راکتور میکرو جریان اولتراسونیک | ن.ا. |
| VialTweeter(ویال گروهی) | 0.5 تا 1.5 میلی لیتر | ن.ا. |
| UP100H | 1 تا 500 میلی لیتر | 10 تا 200 میلی لیتر در دقیقه |
| تا 200 هرتز، 200 خیابان | 10 تا 1000 میلی لیتر | 20 تا 200 میلی لیتر در دقیقه |
| UP400St | 10 تا 2000 میلی لیتر | 20 تا 400 میلی لیتر در دقیقه |
| التراسونیک غربال شاکر | ن.ا. | ن.ا. |
تماس با ما! / از ما بپرسید!
UIP400MTP صفحه صوتی برای فراصوت با توان بالا از صفحات 96 چاه
درباره وسترن بلات
لکه ها روش های تحلیلی هستند که در آن DNA، RNA و پروتئین ها به یک حامل منتقل می شوند تا بتوانند از هم جدا شوند.
لکه جنوبی برای تشخیص DNA، لکه شمالی برای RNA و لکه غربی برای پروتئین ها استفاده می شود.
وسترن بلات پروتئین ایمونوبلات نیز نامیده می شود زیرا از آنتی بادی برای تشخیص خاص آنتی ژن آن استفاده می شود. وسترن بلات یکی از مهم ترین روش های آنالیز برای تشخیص پروتئین های خاص در نمونه است. در وسترن بلات، پروتئین ها روی غشاها تثبیت می شوند تا با استفاده از آنتی بادی های مونوکلونال یا پلی کلونال تشخیص داده شوند.
با الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید SDS-PAGE، پروتئین های بومی توسط ساختار سه بعدی یا پروتئین های دناتوره شده با طول پلی پپتید از هم جدا می شوند. سپس پروتئین ها به غشایی (معمولا نیتروسلولز یا PVDF) منتقل می شوند، جایی که با آنتی بادی های خاص پروتئین هدف رنگ آمیزی می شوند. مرحله الکتروفورز ژل در تجزیه و تحلیل وسترن بلات برای حل مسئله واکنش متقابل آنتی بادی ها گنجانده شده است.
پس از آن، پروتئین های جدا شده بر روی یک ماتریکس (عمدتا روی غشای نیتروسلولز یا PVDF) پاک می شوند، جایی که با آنتی بادی ها رنگ آمیزی می شوند. آنتی بادی ها به عنوان یک پروب عمل می کنند و به طور خاص برای پروتئین هدف انتخاب می شوند. تجزیه و تحلیل مکان و شدت واکنش خاص، جزئیات بیان پروتئین های هدف را در نمونه داده شده نشان می دهد. وسترن بلات به دلیل وضوح بالای الکتروفورز ژل و ویژگی قوی و حساسیت بالای ایمونواسی می تواند پروتئین هدف را که به اندازه 1 نانوگرم است، تشخیص دهد. روش وسترن بلات در زیست شناسی مولکولی، بیوشیمی، ایمونوژنتیک و سایر زمینه های تحقیقاتی مولکولی استفاده می شود.
سایر تکنیک های مرتبط شامل تجزیه و تحلیل لکه نقطه، ایمونوهیستوشیمی و ایمونوسیتوشیمی است که در آن از آنتی بادی ها برای تشخیص پروتئین ها در بافت ها و سلول ها با رنگ آمیزی ایمنی استفاده می شود، و سنجش ایمونوسوربنت مرتبط با آنزیم (ELISA).
ادبیات / منابع
- Koch RJ, Barrette AM, Stern AD, et al. Validating Antibodies for Quantitative Western Blot Measurements with Microwestern Array. Sci Rep. 2018;8(1):11329. Published 2018 Jul 27. doi:10.1038/s41598-018-29436-0
- Carsten Kriebitzsch, Lieve Verlinden, Guy Eelen, Natasja M. van Schoor, Karin Swart, Paul Lips, Mark B. Meyer, J Wesley Pike, Steven Boonen, Carsten Carlberg, Victor Vitvitsky, Roger Bouillon, Ruma Banerjee, and Annemieke Verstuyf (2011): 1,25-dihydroxyvitamin D3 influences cellular homocysteine levels in murine pre-osteoblastic MC3T3-E1 cells by direct regulation of cystathionine β-synthase. J Bone Miner Res. 26(12), 2011. 2991–3000.
- Tahrin Mahmood, Ping-Chang Yang (2012): Western Blot: Technique, Theory, and Trouble Shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4(9), 2012. 429-434.
سونیکاتور VialTweeter برای آماده سازی همزمان نمونه ویال های متعدد
تماس با ما! / از ما بپرسید!
UP200St با میکرو نوک برای فراصوت نمونه