لیز آلتراسونیک برای وسترن بلات
- بلات غربی این روش تحلیلی برای تشخیص پروتئین های خاص در یک نمونه از هموژن بافت و یا عصاره سلولی است.
- برای اجرای یک وسترن بلات یا برای اندازه گیری فعالیت آنزیم، بسیاری از سنجش نیاز به دسترسی به مواد (به عنوان مثال پروتئین ها، DNA، قطعات جایگاه درون سلولی) محبوس در سلول است.
- روش فراصوت یک روش قابل اعتماد و آسان برای دسته برای اختلال سلول کنترل می شود و لیز است.
اختلال همراه التراسونیک
استخراج پروتئین از بافت ها و سلول های کشت شده، اولین قدم برای بسیاری از تکنیک های زیستی، بیوشیمیایی و تحلیلی (PAGE، وسترن بلات، ELISA، طیف سنجی جرمی، و غیره) و یا تصفیه پروتئین است. برای به دست آوردن عملکرد پروتئین بالا، مواد سلول ها و بافت باید موثر مختل / لیز. آیا سلول های گیاهی و یا بافت های حیوانی، فراصوت روش برای آماده سازی عصاره همراه خود را آسان و سریع است.
مزایای استفاده از روش فراصوت
- سریع & کارآمد
- عملیات آسان
- عملکرد پروتئین بالا
- تجدید / تکرار
- دقیقا کنترل
- مقیاس پذیر
VialTweeter sonicator (ویال گروهی) برای اماده سازی نمونه مافوق صوت مانند اختلال سلول و جداسازی پروتئین
پروتکل Immunoprecipitation برای وسترن بلات
A. معرف
برای تهیه راه حل، استفاده از آب تصفیه شده مانند ملی-Q.
- 1X بافر فسفات نمکی (PBS)
- 1X همراه لیز بافر: 20 میلی متر تریس (با pH 7.5)، 150 میلی مولار، 1 میلی متر EDTA، 1 میلی متر EGTA، 1٪ تریتون X-100، 2.5 پیرو فسفات میلی سدیم، 1 میلی متر β-گلیسروفسفات، 1 میلی متر Na3VO4، 1 میکروگرم / میلی لیتر Leupeptin
مهم: اضافه کردن 1 میلی متر PMSF بلافاصله قبل از استفاده. - 15 میکرولیتر پروتئین A + 15 میکرولیتر پروتئین G به صورت IP کافی است، اما ممکن است در آنتی بادی و نمونه حجم اولیه شما بستگی دارد. شما همچنین می توانید قبل از مخلوط پروتئین A / G آگارز استفاده (به عنوان مثال پروتئین A برای خرگوش های IgG جلو و پایین و پروتئین G ماوس IgG به جلو و پایین)
- 3X SDS بافر نمونه: 187.5 میلی تریس هیدروکلراید (با pH 6.8 در 25 درجه سانتی گراد)، 6٪ W / V SDS، 30٪ گلیسرول، 150 میلی DTT، 0.03٪ W / V bromophenol آبی
ب تهیه همراه lysate به
- برداشت سلول ها است. برای برداشت سلول های تحت شرایط nondenaturing، حذف رسانه و شستشو سلول های یک بار با PBS سرد.
- حذف و اضافه کردن PBS 0.5 میلی لیتر یخ سرد 1X بافر لیز سلولی به هر بشقاب (10 سانتی متر) و انکوباسیون صفحات بر روی یخ به مدت 5 دقیقه.
- خراش سلول کردن صفحات و انتقال به لوله میکروسنتریفیوژ. نگه دارید بر روی یخ.
- Sonicate دو بار به مدت 10 ثانیه در بافر immunoprecipitation سرد (IP بافر: 50 میلی متر تریس هیدروکلراید [pH برابر 7.4]، 150 میلی مولار، 5 میلی متر EDTA، 0.1٪ NP-40 و پروتئاز مخلوط مهار کننده). برای فراصوت از VialTweeter(ویال گروهی) و یا یک ultrasonicator پروب مانند UP100H یا UP200Ht مناسب ترین هستند.
- سانتریفیوژ lysate به در 15000 گرم به مدت 10 دقیقه در دمای 4 درجه.
- انتقال رویی به یک لوله جدید است. (در صورت لزوم، عصاره را می توان در -80 ° C ذخیره می شود.)
- اضافه کردن آنتی بادی اولیه به رویی. رویی با آنتی بادی اولیه است به مدت 1 ساعت در دمای 4 درجه تحت تکان نور انکوبه شدند. آنتی بادی اولیه معمولا در مقدار تا 10x غلیظ تر از برای وسترن بلات استفاده اضافه شده است. (شما ممکن است با 1μg در 100μL شروع می شود.)
- مایع رویی است پس از آن بیشتر با مخلوطی از مقدار مساوی از پروتئین A-آگارز (Invitrogen) می و پروتئین G آگارز برای یکی دیگر از 1 ساعت انکوبه.
- شستن گلوله آگارز سه مرتبه با بافر IP. پس از آن، استخراج پروتئین محدود با روش SDS-PAGE بافر بارگذاری با حرارت دادن در 95 ° C به مدت 5 دقیقه.
C. ايمن زدايي
- نگاهی 200 عصاره سلول در هر میکرولیتر و اضافه کردن آنتی بادی اولیه. جوجه کشی با ملایم تاب یک شب در 4 درجه سانتی گراد
- اضافه کردن یا پروتئین یا G مهره آگارز (20 میکرولیتر از 50٪ دوغاب مهره). جوجه کشی با تکان دادن ملایم برای 1/3 ساعت در 4 درجه سانتی گراد
- میکروسنتریفیوژ به مدت 30 ثانیه در دمای 4 درجه. شستشوی پنج بار با 500 میکرولیتر بافر لیز سلولی 1X پلت. نگه دارید بر روی یخ در طول شستشو.
- Resuspend گلوله با 20 میکرولیتر بافر نمونه 3X SDS. گرداب، سپس برای 30 ثانیه میکروسنتریفیوژ.
- حرارت نمونه به 95-100 درجه سانتی گراد برای 2-5 دقیقه و میکروسنتریفیوژ به مدت 1 دقیقه در 14000 X گرم.
- بار نمونه (15-30 میکرولیتر) در ژل SDS-PAGE (12-15٪).
- تجزیه و تحلیل نمونه های وسترن بلات.
تجزیه و تحلیل وسترن بلات با SONICATOR UP50H
پروتکل زیر با استفاده از پروب نوع SONICATOR UP50H در مطالعه Kriebisch و همکاران مورد استفاده قرار گرفت. (2011):
پروتئین ها از سلول های MC3T3-E1 تحت درمان با 1،25 جدا شد (OH)H2Sد3 (10-8 M) یا وسیله نقلیه. سلول با بافر حاوی 50 میلی متر تریس هیدروکلراید، pH برابر 8 (سیگما آلدریچ) آزاد شدند. 150 میلی مولار (فیشر علمی)؛ 0.1٪ سدیم دودسیل سولفات (SDS) (فیشر علمی)؛ 1٪ IGEPAL CA-630 (سیگما آلدریچ) و 0.5٪ deoxycholate سدیم (مرک). لیز سلولی سلول برای 2 × 10 ثانیه در چرخه 1 فراصوت داده شد و دامنه 80 با پردازنده UP50H التراسونیک (Hielscher، تکنولوژی سونوگرافی، Teltow، آلمان). پس از آن ماده به مدت 10 دقیقه در 14000 دور در دقیقه سانتریفوژ شد و مایکروویو برای غربالگری غربی استفاده شد. 25 میکروگرم پروتئین در بافر نمونه و عامل کاهش دهنده (Invitrogen) جوش داده شده و سپس با استفاده از SDS-PAGE با استفاده از ژل های 4-12٪ پلی آکریل آمید (Invitrogen) جدا شد و به غشای نیتروس سلولز (GE) منتقل شد. غشا به مدت 1 ساعت با TBS (10 میلی متری تریس-HCl، pH 7.6، 150 میلی متیل NaCl) حاوی 1 درصد کازئین (سیگما-الدریچ) و 1 درصد تریس (1 میلیمتر) مسدود شد. پس از مسدود کردن، غشاء با یک تحریک کمی در دمای 4 درجه سانتیگراد با آنتی بادی اولیه (CBS 1/500 خرگوش ضد انسانی، در آزمایشگاه پروفسور R. Banerjee، Ann Arbor، MI، USA) انکوباتور شد. انكوباسيون با آنتي بادي ثانويه Conjugated Peroxidase (HPR) (Dako) به مدت 1 ساعت در دماي اتاق انجام شد. تمام پلاکت ها با استفاده از شیمی درمانی (Perkin Elmer) توسعه یافته بودند.
جدول زیر به شما می دهد نشانه ای از ظرفیت پردازش تقریبی ultrasonicators ازمایشگاه اندازه ما:
| دستگاه های توصیه شده | دسته ای دوره | نرخ جریان |
|---|---|---|
| UIP400MTP 96-خوب صفحه Sonicator | چند چاه / صفحات میکروتیتر | خب |
| cuphorn التراسونیک | CupHorn برای ویال یا فنجان | خب |
| GDmini2 | راکتور میکرو جریان اولتراسونیک | خب |
| VialTweeter(ویال گروهی) | 00.5 به 1.5mL | خب |
| UP100H | 1 تا 500ML | 10 تا پوست 200ml / دقیقه |
| UP200Ht، UP200St | 10 تا 1000mL | 20 تا 200mL/min |
| UP400St | 10 به 2000mL | 20 تا 400ML / دقیقه |
| شاکر ماورای صوت | خب | خب |
تماس با ما! / از ما بپرسید!
UIP400MTP صفحه Sonicator برای فراصوت با توان بالا از صفحات 96-well
درباره وسترن بلات
نابودی روشهای تحلیلی که در آن DNA، RNA و پروتئین ها را بر روی یک حامل منتقل به طوری که آنها می توانند از هم جدا هستند.
بلات جنوبی برای تشخیص DNA استخراج شده، نورترن بلات برای RNA و وسترن بلات برای پروتئین استفاده می شود.
وسترن بلات نیز بلات پروتئینی به نام دلیل آنتی بادی استفاده می شود برای تشخیص آنتی ژن به طور خاص آن است. غربی بلات یکی از روش های تجزیه و تحلیل مهم ترین برای تشخیص پروتئین های خاص در نمونه است. در روش وسترن بلات، پروتئین در غشاء بی حرکت آنها را تشخیص با استفاده از آنتی بادی های مونوکلونال یا پلی کلونال.
با استفاده از الکتروفورز ژل SDS-polyacrylamide (SDS-PAGE) پروتئین های مادری با ساختار 3-D یا پروتئین های دندانی شده از طریق طول پلیپپتید جدا می شوند. سپس پروتئین ها به غشاء (معمولا نیترو سلولز یا PVDF) منتقل می شوند، جایی که آنها با آنتی بادی های اختصاصی پروتئین هدف رنگ می شوند. گام الكتروفورز ژل در تجزیه و تحلیل غلظت غربی گنجانده شده است تا مسئله پاسخ متقابل آنتی بادی ها حل شود.
پس از آن، پروتئین های جدا شده بر روی یک ماتریکس (عمدتا بر روی غشای نیترو سلولز یا PVDF) بلوک می شوند، جایی که با آنتی بادی رنگ می شوند. آنتیبادی ها به عنوان پروب عمل می کنند و به طور خاص به پروتئین هدف انتخاب می شوند. تجزیه و تحلیل موقعیت و شدت واکنش های خاص نشان می دهد جزئیات بیان پروتئین های هدف در نمونه داده شده است. غربالگری غربی می تواند پروتئین هدف را که به دلیل وضوح بالا الکتروفورز ژل و ویژگی های قوی و حساسیت بالا در آزمایش ایمنی تشخیص داده شده است، به اندازه 1 نانومتر تشخیص دهد. روش غربی بلاست در زیست شناسی مولکولی، بیوشیمی، ایمونوگنیک و دیگر زمینه های تحقیق مولکولی استفاده می شود.
دیگر تکنیک های مرتبط شامل تجزیه و تحلیل نقطه بلات، ایمونوهیستوشیمی و ایمونوسیتوشیمی که در آن آنتی بادی استفاده می شود برای تشخیص پروتئین در بافت ها و سلول های رنگ آمیزی ایمونوهیستوشیمی و متصل به آنزیم آزمون ایمونوسوربنت (ELISA).
ادبیات/منابع
- Koch RJ, Barrette AM, Stern AD, et al. Validating Antibodies for Quantitative Western Blot Measurements with Microwestern Array. Sci Rep. 2018;8(1):11329. Published 2018 Jul 27. doi:10.1038/s41598-018-29436-0
- Carsten Kriebitzsch, Lieve Verlinden, Guy Eelen, Natasja M. van Schoor, Karin Swart, Paul Lips, Mark B. Meyer, J Wesley Pike, Steven Boonen, Carsten Carlberg, Victor Vitvitsky, Roger Bouillon, Ruma Banerjee, and Annemieke Verstuyf (2011): 1,25-dihydroxyvitamin D3 influences cellular homocysteine levels in murine pre-osteoblastic MC3T3-E1 cells by direct regulation of cystathionine β-synthase. J Bone Miner Res. 26(12), 2011. 2991–3000.
- Tahrin Mahmood, Ping-Chang Yang (2012): Western Blot: Technique, Theory, and Trouble Shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4(9), 2012. 429-434.
VialTweeter sonicator (ویال گروهی) برای اماده سازی نمونه همزمان از ویال های متعدد
تماس با ما! / از ما بپرسید!
UP200St با میکرو نوک برای فراصوت نمونه