آماده‌سازی پلاسمید با استفاده از فراصوت‌دهی
فراصوت‌دهی روشی قابل‌اعتماد برای قطعه‌قطعه‌سازی DNA پلاسمیدی است. دامنهٔ قابل‌کنترل با دقت بالا، حالت پالسی و کنترل دما از مهم‌ترین ویژگی‌های یک سونیکاتور برای قطعه‌قطعه‌سازی پلاسمید بدون آسیب هستند. همچنین، استفاده از برخی عوامل به محافظت در برابر تخریب پلاسمید کمک می‌کند. Hielscher Ultrasonics راهکارهای گوناگونی برای قطعه‌قطعه‌سازی کنترل‌شدهٔ پلاسمید، از ویال‌های منفرد تا فراصوت‌دهی هم‌زمان تعداد زیادی نمونه و نیز پلیت‌های چندچاهکی، ارائه می‌دهد. دربارهٔ قطعه‌قطعه‌سازی موفق پلاسمید با فراصوت بیشتر بدانید!
دستگاه UIP400MTP فراصوت‌دهی پلیت‌های چندچاهکی را با کنترل دقیق امکان‌پذیر می‌کند. یکی از کاربردهای UIP400MTP قطعه‌قطعه‌سازی DNA پلاسمیدی برای دستیابی به قطعاتی با طول مشخص و هدف‌گذاری‌شده است.
برش پلاسمید با استفاده از فراصوت‌دهی
هنگامی که نمونه‌های DNA در معرض امواج فراصوت قرار می‌گیرند، ارتعاشات ایجادشده با فراصوت در مایع کاویتاسیون آکوستیکی ایجاد می‌کنند که از طریق نیروهای مکانیکی، مولکول‌های DNA با وزن مولکولی بالا را برش می‌دهد یا می‌شکند. فراصوت‌دهی پرکاربردترین روش در آزمایش‌های برش DNA در حجم زیاد است؛ از جمله در کاربردهایی مانند رسوب‌دهی ایمنی کروماتین (ChIP) که در آن‌ها اندازهٔ کوچک قطعات برای دستیابی به قدرت تفکیک بالا کاملاً ضروری است. (رجوع کنید به Tseng et al., 2012)
DNA پلاسمیدی (pDNA) شکل خاصی از DNA است که با ساختار حلقوی خود مشخص می‌شود و در باکتری‌ها و برخی یوکاریوت‌ها یافت می‌شود.
pDNA ابرمارپیچ شکل مطلوب DNA پلاسمیدی است، زیرا بهترین نتایج را در فرایندهای پایین‌دستی مانند توالی‌یابی خودکار و ترانسفکشن نشان می‌دهد. فراصوت‌دهی برای قطعه‌قطعه‌سازی موفق pDNA، از جمله pDNA ابرمارپیچ، مناسب است.
Thompson et al. (2008) نشان دادند که فراصوت‌دهی پلاسمید، که به‌عنوان روشی برای قطعه‌قطعه‌سازی DNA ابرمارپیچ شناخته می‌شود، راهی مؤثر برای افزایش طول خوانش‌های توالی با کیفیت phred20 است؛ به‌گونه‌ای که این طول‌ها دیگر تفاوت معناداری با طول خوانش‌های الگوی کنترل Beckman Coulter یا پلاسمیدهای خطی‌شده به روش آنزیمی ندارند.
- قابل‌کنترل با دقت بالا
- نتایج تکرارپذیر
- قابل‌تنظیم برای دستیابی به طول هدف قطعات DNA
- کنترل دما
- مقیاس‌پذیر برای هر اندازهٔ نمونه
استفاده از ناقل‌های پلاسمیدی
پلاسمیدها اغلب به‌عنوان ابزاری برای همسانه‌سازی، انتقال و دست‌کاری ژن‌ها استفاده می‌شوند. هنگامی که پلاسمیدها در آزمایش‌ها برای این اهداف به کار می‌روند، ناقل نامیده می‌شوند. می‌توان قطعات DNA یا ژن‌ها را در یک ناقل پلاسمیدی وارد کرد و به‌این‌ترتیب پلاسمیدی موسوم به پلاسمید نوترکیب ساخت. ناقل‌های پلاسمیدی به‌عنوان حامل برای وارد کردن DNA نوترکیب به سلول میزبان استفاده می‌شوند و یکی از اجزای کلیدی همسانه‌سازی مولکولی هستند.
«ناقل‌های غیرویروسی به‌طور گسترده برای کاربرد بالقوهٔ آن‌ها در ژن‌درمانی به‌منظور درمان بیماری‌های پیچیدهٔ گوناگون بررسی می‌شوند. ناقل‌های غیرویروسی از DNA پلاسمیدی در برابر تخریب فیزیکی، شیمیایی و آنزیمی محافظت می‌کنند و مولکول DNA را به محل هدف می‌رسانند. برای مثال، لیپوزوم‌های کاتیونی، کیتوسان و سایر نانوذرات با بار مثبت از طریق برهم‌کنش‌های الکترواستاتیکی با DNA پلاسمیدی کمپلکس تشکیل می‌دهند. بااین‌حال، کمپلکس‌های لیپوزوم کاتیونی/DNA پلاسمیدی که به‌آسانی تشکیل می‌شوند، نسبتاً بزرگ‌اند (یعنی 300–400 nm) و ماهیتی ناهمگن دارند؛ به همین دلیل، استفاده از آن‌ها در کاربردهای دارویی دشوار است. کمپلکس‌های بزرگ و ناهمگن DNA پلاسمیدی/لیپوزوم‌ها، DNA پلاسمیدی/آئروسل‌ها و DNA پلاسمیدی/پپتیدها را می‌توان با استفاده از فراصوت‌دهی به ذرات کوچک‌تر و همگن تبدیل کرد.» (Sarker et al., 2019)
نمونه‌ای شاخص از کاربرد ناقل‌های پلاسمیدی، CRISPR–Cas9 است. سامانهٔ CRISPR–Cas9 معمولاً به‌صورت یک پلاسمید بزرگ منفرد یا چند پلاسمید کوچک‌تر که یک توالی هدف، یک راهنمای CRISPR و Cas9 را کدگذاری می‌کنند، به سلول‌ها رسانده می‌شود.
آماده‌سازی فراصوتی نانوذرات PLGA بارگذاری‌شده با DNA به روش نانوترسیب
Jo et al. (2020) از پلی(لاکتیک-کو-گلیکولیک اسید) (PLGA) برای ساخت یک حامل نانوذره‌ای به‌منظور رساندن یک پلاسمید مدل CRISPR–Cas9 به ماکروفاژهای اولیهٔ مشتق از مغز استخوان استفاده کردند. برای نانوترسیب نانوذرات PLGA، از PLGA با دو گروه انتهایی متفاوت (گروه‌های استر و آمین) استفاده شد، با این هدف که گروه‌های انتهایی آمینی با بار مثبت، به‌واسطهٔ برهم‌کنش‌های بار الکتریکی میان آن‌ها و ستون فقرات DNA با بار منفی، بازده کپسوله‌سازی و بارگذاری را افزایش دهند. در یک لولهٔ سانتریفیوژ مخروطی پلی‌پروپیلنی 50 mL، مقدار 100 mg از Pluronic F127 در 20 mL آب دیونیزهٔ اتوکلاوشده با اختلاط ورتکسی حل شد و سپس به‌مدت 30 min با استفاده از حمام فراصوت، فراصوت‌دهی ملایم انجام گرفت (به CupHorn مراجعه کنید). یک میلهٔ همزن مغناطیسی اتوکلاوشده اضافه شد و هم‌زمان با تهیهٔ محلول‌های دیگر، محلول با سرعت 600 RPM به‌مدت 30 min هم زده شد. در تمام مراحل، برای به‌حداقل‌رساندن جذب سطحی غیراختصاصی DNA، به‌جای ظروف شیشه‌ای از ظروف آزمایشگاهی پلاستیکی استفاده شد. محلول‌های PLGA حل‌شده در DMF با غلظت (44٫48 mg/ ml) و پنتاسن TIPS حل‌شده در THF با غلظت (0٫667 mg/ml) به‌طور جداگانه تهیه شدند. PLGA پیش از فراصوت‌دهی به‌مدت 30 min، به‌مدت 30 min بدون حرکت در DMF قرار گرفت تا خیس بخورد. (برای پروتکل کامل به Jo et al., 2020 مراجعه کنید)
- استخراج DNA
- کپسوله‌سازی DNA
- پراکنش DNA پوشش‌داده‌شده با نانوذرات
- رساندن DNA پلاسمیدی به درون سلول‌ها
UP200St CupHorn برای فراصوت‌دهی غیرمستقیم نمونه‌ها، برای مثال برای استخراج و قطعه‌قطعه‌سازی DNA.
محافظت از DNA پلاسمیدی هنگام فراصوت‌دهی
DNA، از جمله پلاسمیدها و پلاسمیدهای ابرمارپیچ، به تخریب بسیار حساس است. همهٔ روش‌های موجود برای قطعه‌قطعه‌سازی، معایب مشخصی دارند. قطعه‌قطعه‌سازی فراصوتی DNA یکی از روش‌های ترجیحی است، زیرا فراصوت‌دهی کنترل‌شده همراه با اقدامات محافظتی، کاهش آسیب ناشی از برش و گرما به رشته‌های DNA را امکان‌پذیر می‌کند.
علاوه بر تنظیم دامنه در سطوح پایین، حالت پالسی و کنترل دما هنگام برش فراصوتی DNA، استفاده از برخی عوامل اثر محافظتی چشمگیری در برابر تخریب DNA نشان داده است. برای مثال، پلیمرها، پپتیدها و لیپیدهای گوناگون از DNA پلاسمیدی در طول فراصوت‌دهی محافظت می‌کنند.
پایداری DNA پلاسمیدی و نانوکمپلکس‌های DNA پلاسمیدی/IL در برابر تنش برشی فراصوتی با استفاده از آزمون الکتروفورز ژل آگارز بررسی شد. هم DNA پلاسمیدی و هم نانوکمپلکس‌های DNA پلاسمیدی/IL برای مدت‌زمان‌های متفاوت در معرض تنش برشی فراصوتی قرار گرفتند. DNA پلاسمیدی به‌مدت 0، 10، 20، 30 و 40 دقیقه در معرض تنش برشی فراصوتی قرار گرفت. در مقابل، نانوکمپلکس‌های DNA پلاسمیدی/IL به‌مدت 0، 10، 20، 30، 40، 60، 90 و 120 دقیقه در معرض تنش برشی فراصوتی قرار گرفتند.
(مطالعه و تصویر: ©Sarker et al., 2019)
Sarker et al. (2019) نشان دادند که وقتی نانوساختارهای DNA پلاسمیدی / مایع یونی (pDNA/IL) به‌مدت 0، 10، 20، 30، 40، 60، 90 و 120 min در معرض تنش برشی فراصوتی قرار گرفتند و با لیپوفکتامین، عامل کاتیونی انتقال ژنِ موجود در بازار، کمپلکس تشکیل دادند، درصد سلول‌های فلورسانس‌مثبت به‌ترتیب 80%، 98%، 97%، 85%، 78%، 65%، 65% و 50% بود (نمودار زیر را ببینید). درصد سلول‌های فلورسانس‌مثبت هنگامی که نانوساختارها به‌مدت 10 و 20 min در معرض تنش برشی فراصوتی قرار گرفتند افزایش یافت و پس از آن به‌آرامی کاهش پیدا کرد.
تأثیر مایع یونی [Bmim][PF6] بر رساندن DNA پلاسمیدی به سلول‌های COS7. نانوکمپلکس‌های DNA پلاسمیدی/IL (مایع یونی) تا 120 دقیقه در معرض تنش برشی فراصوتی قرار گرفتند و پیش از ورود به سلول‌های COS7، با LA کمپلکس تشکیل دادند. داده‌ها میانگین تعداد (%) سلول‌های HeLa مثبت برای GFP را نشان می‌دهند که در 10 میدان میکروسکوپی مختلف شمارش شدند؛ آزمایش چندین بار در سه روز مختلف انجام شد. (مطالعه و نمودار: ©Sarker et al., 2019)
می‌توان با افزودن یک عامل پیش از قطعه‌قطعه‌سازی فراصوتی، از DNA پلاسمیدی محافظت کرد: تخریب ناشی از فراصوت‌دهی در pDNA برهنه (A) و pDNA فرموله‌شده با 1٫5 mM از CaCl2 و 20 % (v/v) از t-butanol (B)
نمونه‌ها با یک پروب 20W تا 120s فراصوت‌دهی شدند، همان‌طور که در بالای هر مسیر مشخص شده است. مسیر H مربوط به نشانگر Hyperladder I ™️ است. باندهای پلاسمیدی OC و SC مشخص شده‌اند.
(مطالعه و تصاویر: ©Wu et al., 2009)
آماده‌سازی فراصوتی لیزات
پروتکل لیز فراصوتی سلول
با یک نمونهٔ غنی‌شده از سلول‌ها شروع کنید که با یک روش جداسازی سلولی تهیه شده است (برای مثال، جداسازی ایمونومغناطیسی سلول‌ها، جداسازی سلولی فعال‌شونده با فلورسانس (FACS)، سانتریفیوژ گرادیان چگالی، جداسازی سلولی مبتنی بر ایمنی و چگالی).
نمونه‌های سلولی باید حاوی حجمی از بافر لیز باشند که با هدف آزمایش و سونیکاتور پروبی تناسب داشته باشد.
بافرهای هیپوتونیک ترجیح داده می‌شوند، زیرا لیز فراصوتی سلول را تقویت می‌کنند. استفادهٔ مناسب از افزودنی‌ها و غلظت مناسب نمک اهمیت دارد.
دستگاه لیز فراصوتی خود را انتخاب کنید: برای فراصوت‌دهی غیرمستقیم ویال‌ها، VialTweeter یا CupHorn توصیه می‌شود. برای پلیت‌های چندچاهکی، UIP400MTP سونیکاتور ایدئال است. برای فراصوت‌دهی متداول با پروب نیز یک هموژنایزر فراصوتی مانند UP100H یا UP200Ht مجهز به میکروتیپ، مناسب‌ترین گزینه است.
پروتکل فراصوت‌دهی با پروب: پروب سونیکاتور را درون نمونه در یک لولهٔ میکروسانتریفیوژ قرار دهید و حدود 10 ثانیه فراصوت‌دهی کنید. بسته به نمونهٔ DNA، ممکن است فراصوت‌دهی یک یا دو بار دیگر تکرار شود. انرژی فراصوتی ورودی موردنیاز (Ws/mL) به گرانروی نمونه و نوع DNA بستگی دارد. خنک‌سازی با حمام یخ و استفاده از حالت پالسی سونیکاتور به جلوگیری از تخریب حرارتی نمونه کمک می‌کند.
پس از لیز فراصوتی، نمونه سانتریفیوژ می‌شود تا بقایای رسوبی (حاوی سلول‌های لیزنشده، هسته‌ها و اندامک‌های لیزنشده) جدا شوند.
اگر نمونه بلافاصله تحت مراحل بعدی پردازش قرار نمی‌گیرد، می‌توان آن را در دمای مناسب نگهداری کرد تا زیست‌پذیری آن حفظ شود.
سونیکاتورها برای قطعه‌قطعه‌سازی DNA
Hielscher Ultrasonics سامانه‌های گوناگون مبتنی بر فراصوت را برای قطعه‌قطعه‌سازی DNA، RNA و کروماتین ارائه می‌دهد. این سامانه‌های مختلف شامل پروب‌های فراصوتی (سونوتْرودها)، راهکارهای فراصوت‌دهی غیرمستقیم برای آماده‌سازی هم‌زمان نمونه‌ها در چندین لوله یا پلیت چندچاهکی (برای مثال، پلیت‌های 96 چاهکی و پلیت‌های میکروتیتر)، راکتورهای فراصوتی و کاپ‌هورن‌های فراصوتی هستند. همهٔ سامانه‌های برش DNA از پردازشگرهای فراصوتی با عملکرد بالا و فرکانس تنظیم‌شده نیرو می‌گیرند که با دقت قابل‌کنترل‌اند و نتایج تکرارپذیر ارائه می‌دهند.
پردازشگرهای فراصوتی برای هر تعداد و اندازهٔ نمونه
با سونیکاتورهای چندنمونه‌ای Hielscher، یعنی VialTweeter (برای حداکثر 10 لولهٔ آزمایش) و UIP400MTP (برای میکروپلیت‌ها/پلیت‌های چندچاهکی)، به‌لطف فراصوت‌دهی شدید و قابل‌کنترل با دقت بالا، کاهش زمان پردازش نمونه به‌آسانی امکان‌پذیر می‌شود و هم‌زمان توزیع اندازه و بازده مطلوب قطعات DNA به دست می‌آید. قطعه‌قطعه‌سازی فراصوتی DNA مراحل آماده‌سازی پلاسمید را کارآمد، قابل‌اعتماد و مقیاس‌پذیر می‌کند. با اعمال پارامترهای ثابت فراصوت، می‌توان پروتکل‌ها را به‌صورت خطی از یک نمونه به تعداد زیادی نمونه مقیاس داد.
سونیکاتورهای پروبی با یک تا پنج انگشتی برای آماده‌سازی تعداد کمتر نمونه‌ها ایدئال هستند. سونیکاتورهای آزمایشگاهی Hielscher با سطوح توان مختلف عرضه می‌شوند تا بتوانید دستگاه تخریب فراصوتی ایدئال را برای کاربرد مرتبط با DNA خود انتخاب کنید.
واحد فراصوتی آماده‌سازی چندنمونه‌ای VialTweeter فراصوت‌دهی هم‌زمان حداکثر 10 ویال را امکان‌پذیر می‌کند. با ابزار گیره‌ای VialPress می‌توان حداکثر 4 لولهٔ اضافی را به سطح جلویی فشرد تا فراصوت‌دهی شدید انجام شود.
کنترل دقیق فرایند
تنظیمات فراصوت‌دهی با قابلیت کنترل دقیق ضروری هستند، زیرا فراصوت‌دهی بیش‌ازحد می‌تواند DNA، RNA و کروماتین را تخریب کند، درحالی‌که برش فراصوتی ناکافی به تولید قطعات بیش‌ازحد بلند DNA و کروماتین می‌انجامد. سونیکاتورهای دیجیتال Hielscher را می‌توان به‌آسانی روی پارامترهای دقیق فراصوت‌دهی تنظیم کرد. تنظیمات مشخص فراصوت‌دهی را نیز می‌توان به‌صورت تنظیمات برنامه‌ریزی‌شده ذخیره کرد تا همان روش به‌سرعت تکرار شود.
همهٔ عملیات فراصوت‌دهی به‌طور خودکار ثبت و به‌صورت فایل CSV روی کارت SD داخلی ذخیره می‌شوند. این قابلیت، مستندسازی دقیق آزمایش‌های انجام‌شده را فراهم می‌کند و بازبینی آسان اجراهای فراصوت‌دهی را امکان‌پذیر می‌سازد.
از طریق کنترل از راه دور مبتنی بر مرورگر، می‌توان همهٔ سونیکاتورهای دیجیتال را با هر مرورگر استاندارد راه‌اندازی و پایش کرد. نصب نرم‌افزار اضافی لازم نیست، زیرا اتصال LAN راه‌اندازی بسیار ساده‌ای به‌صورت اتصال و استفاده دارد.
بالاترین سهولت استفاده هنگام آماده‌سازی فراصوتی DNA
همهٔ سونیکاتورهای Hielscher برای ارائهٔ فراصوت با عملکرد بالا طراحی شده‌اند و درعین‌حال همواره بسیار کاربرپسند و آسان برای کار هستند. همهٔ تنظیمات در منویی روشن و با ساختاری منظم قرار دارند که از طریق نمایشگر لمسی رنگی یا کنترل از راه دور مبتنی بر مرورگر به‌آسانی در دسترس است. نرم‌افزار هوشمند با تنظیمات قابل‌برنامه‌ریزی و ثبت خودکار داده‌ها، تنظیمات بهینهٔ فراصوت‌دهی را برای دستیابی به نتایج قابل‌اعتماد و تکرارپذیر تضمین می‌کند. رابط منوی ساده و آسان برای استفاده، سونیکاتورهای Hielscher را به دستگاه‌هایی کاربرپسند و کارآمد تبدیل می‌کند.
جدول زیر نمایی از ظرفیت تقریبی پردازش سونیکاتورهای آزمایشگاهی ما برای لیز سلولی و قطعه‌قطعه‌سازی DNA ارائه می‌دهد:
| حجم بچ | دبی | دستگاه‌های پیشنهادی |
|---|---|---|
| پلیت‌های چندچاهکی | قابل‌اعمال نیست | UIP400MTP |
| ویال‌ها، بشر کوچک | قابل‌اعمال نیست | CupHorn فراصوتی |
| حداکثر 10 ویال | قابل‌اعمال نیست | VialTweeter |
| 1 تا 500mL | 10 تا 200mL/min | UP100H |
| 10 تا 2000mL | 20 تا 400mL/min | UP200Ht, UP400St |
با ما تماس بگیرید! / از ما بپرسید!
منابع علمی / مراجع
- Mark D. Thompson, Kelly G. Aukema, Dana M. O’Bryan, Stephen D. Rader, Brent W. Murray (2008): Plasmid sonication improves sequencing efficiency and quality in the Beckman Coulter CEQ system. BioTechniques 2008, 45:3, 327-329
- Fykse, Else; Olsen, Jaran; Skogan, Gunnar (2003): Application of sonication to release DNA from Bacillus cereus for quantitative detection by real-time PCR. Journal of microbiological methods 55, 2003. 1-10.
- Ming L. Wu; Sindélia S. Freitas; Gabriel A. Monteiro; Duarte M. F. Prazeres; José A. L. Santos (2009). Stabilization of naked and condensed plasmid DNA against degradation induced by ultrasounds and high-shear vortices. Biotechnology Applied Biochemistry 53(4), 2009.
- Sarker, Satya Ranjan; Ball, Andrew S.; Bhargava, Suresh Kumar; Soni., Sarvesh K. (2019): Evaluation of plasmid DNA stability against ultrasonic shear stress and its in vitro delivery efficiency using ionic liquid [Bmim][PF6]. RSC Advances 9, 2019. 29225-29231.
- Miguel Larguinho, Hugo M. Santos, Gonçalo Doria, H. Scholz, Pedro V. Baptista, José L. Capelo (2010): Development of a fast and efficient ultrasonic-based strategy for DNA fragmentation. Talanta, Volume 81, Issue 3, 2010. 881-886.
- Julie Ann Wyber; Julie Andrews; Antony D’Emanuele (1997): The Use of Sonication for the Efficient Delivery of Plasmid DNA into Cells. Pharmaceutical Research 14(6), 1997. 750–756.
دانستنی‌های مفید
پلاسمیدها چیستند؟
پلاسمید یک مولکول کوچک و حلقوی DNA است که از نظر فیزیکی از DNA کروموزومی جداست و به‌طور مستقل همانندسازی می‌کند. پلاسمیدها اغلب با ژن‌هایی مرتبط‌اند که به بقای جاندار کمک می‌کنند و مزایای مشخصی مانند مقاومت به آنتی‌بیوتیک ایجاد می‌کنند. پلاسمیدها بیشتر به‌صورت مولکول‌های کوچک، حلقوی و دورشته‌ای DNA در باکتری‌ها یافت می‌شوند؛ بااین‌حال، گاهی در آرکی‌ها و جانداران یوکاریوتی نیز وجود دارند. پلاسمیدها ابزارهای مهمی در زیست‌شناسی مولکولی، ژنتیک، زیست‌شیمی و علوم زیستی هستند. پلاسمیدها که در مهندسی ژنتیک به‌عنوان ناقل شناخته می‌شوند، برای تکثیر یا بیان ژن‌های مشخص به کار می‌روند. تغییر هدفمند یک ناقل، طراحی ناقل نامیده می‌شود.
تحلیل GFP در پژوهش‌های سلولی
پروتئین فلورسنت سبز (GFP) یک نشانگر زیستی چندمنظوره برای پایش فرایندهای فیزیولوژیک، مشاهدهٔ جایگاه پروتئین و تشخیص بیان ترانس‌ژن درون جاندار زنده است. GFP را می‌توان با خط لیزری 488 nm برانگیخت و بهترین آشکارسازی آن در 510 nm انجام می‌شود.
Hielscher Ultrasonics هموژنایزرهای فراصوتی با عملکرد بالا را در مقیاس‌های آزمایشگاهی تا صنعتی تولید می‌کند.