پلاسمید آماده سازی با استفاده از فراصوت
امواج فراصوت یک تکنیک قابل اعتماد برای تکه تکه کردن DNA پلاسمید است. دامنه دقیقا قابل کنترل، حالت ضربان و کنترل دما مهم ترین ویژگی های یک مافوق صوت برای تکه تکه شدن پلاسمید غیر آسیب رسان است. علاوه بر این، استفاده از عوامل خاص کمک به محافظت در برابر تخریب پلاسمید. Hielscher Ultrasonics ارائه می دهد راه حل های مختلف برای تکه تکه شدن پلاسمید کنترل شده از ویال های تک, به طور همزمان فراصوت از نمونه های متعدد و همچنین صفحات چند چاه. اطلاعات بیشتر در مورد موفقیت آمیز قطعه قطعه پلاسمید مافوق صوت!
The UIP400MTP اجازه می دهد تا برای امواج فراصوت دقیقا کنترل شده از صفحات چند چاه. یکی از کاربردهای UIP400MTP، تکه تکه شدن DNA پلاسمید به منظور به دست آوردن تکه هایی از یک طول مشخص هدفمند است.
Shearing پلاسمید با استفاده از امواج فراصوت
هنگامی که نمونه های DNA در معرض امواج مافوق صوت قرار می گیرد، ارتعاشات تولید شده مافوق صوت حفره صوتی را در مایع ایجاد می کنند که مولکول های DNA با وزن مولکولی بالا را از طریق نیروهای مکانیکی می شکند یا می شکند. فراصوت به طور گسترده ترین روش مورد استفاده برای آزمایش های shearing DNA فله از جمله برنامه های کاربردی، مانند کروماتین Immunoprecipitation (ChIP) است، که برای آن اندازه قطعه کوچک کاملا بسیار مهم برای به دست آوردن وضوح بالا است. (cf. Tseng et al., 2012)
DNA پلاسمید (pDNA) شکل خاصی از DNA است که با شکل حلقه آن مشخص می شود و در باکتری ها و برخی یوکاریوت ها یافت می شود.
PDNA ابرسرد شکل مورد نظر DNA پلاسمید است چرا که بهترین نتایج را در فرایندهای پایین جریان مانند توالی خودکار و ترانسفشن نشان می دهد. امواج فراصوت مناسب برای تکه تکه pDNA، از جمله pDNA supercoiled، با موفقیت است.
تامپسون و همکارانش (۲۰۰۸) نشان دادند که فراصوت پلاسمید که به تکه تکه کردن DNA ابرسرطان شناخته شده است، راه مؤثری برای بهبود طول خواندن phred20 توالی است تا حدی که تفاوت قابل توجهی با قالب کنترل بکمن کولتر یا پلاسمیدهای خطی آنزیمی ندارد.
- دقیقا قابل کنترل
- نتایج قابل تکثیر
- قابل تنظیم برای هدف قرار دادن طول قطعه DNA
- کنترل دما
- مقیاس پذیر به هر اندازه نمونه
استفاده از بردارهای پلاسمید
پلاسمیدها اغلب به عنوان ابزاری برای کلون کردن، انتقال، و دستکاری ژن ها استفاده می شوند. هنگامی که پلاسمیدها به طور تجربی برای این اهداف استفاده می شوند، آن ها را بردار می نامند. قطعات یا ژن های DNA را می توان در یک بردار پلاسمید وارد کرد و به اصطلاح پلاسمید ترکیب مجدد ایجاد کرد. بردارهای پلاسمید به عنوان وسیله نقلیه برای راندن DNA ترکیب کننده به یک سلول میزبان استفاده می شوند و جزء کلیدی شبیه سازی مولکولی هستند.
“ناکتورهای غیر ویروسی به طور گسترده ای برای استفاده بالقوه خود در ژن درمانی برای درمان بیماری های مختلف پیچیده مورد مطالعه قرار می گیرد. ناکتورهای غیر ویروسی DNA پلاسمید را در برابر تخریب فیزیکی، شیمیایی، و آنزیمی محافظت می کنند و مولکول DNA را به محل هدف تحویل می دهند. به عنوان مثال لیپوزوم های کاتوتیک، کیتوسان و دیگر نانوذرات با بار مثبت، کمپلکت هایی را با DNA پلاسمید از طریق برهم کنش های الکترواستاتیک تشکیل می دهند. با این حال ، به آسانی تشکیل شده لیپوزوم ها / پلاسمید DNA کمپلکت نسبتا بزرگ (به عنوان نمونه ، 300 –400 nm) و هتروژن در طبیعت آنها را دشوار برای استفاده در کاربردهای دارویی. DNA/ لیپوزوم های پلاسمید بزرگ و نامتگن، DNA/آئروسل های پلاسمید، و کمپلکت های DNA/پپتیدهای پلاسمید را می توان به ذرات کوچکتر، و همگن با استفاده از فراصوت کاهش داد.” (سارکر و همکاران، ۱۳۹۸)
یک مثال برجسته برای استفاده از بردارهای پلاسمید CRISPR–Cas9 است. سیستم CRISPR–Cas9 به طور معمول به سلول ها به عنوان یک پلاسمید بزرگ یا چند پلاسمید کوچکتر که یک توالی هدف، یک راهنمای CRISPR، و Cas9 کدگذاری می کنند، تحویل داده می شود.
آماده سازی مافوق صوت نانوذرات PLGA بارگذاری شده توسط DNA توسط نانو
جو و همکاران (۲۰۲۰) از پلی (اسید لاکتیک-کو-گلیکولیک) (PLGA) به منظور تشکیل یک حامل نانوذرات برای تحویل پلاسمید مدل CRISPR–Cas9 به ماکروفاژهای مشتق شده از مغز استخوان اولیه استفاده کردند. برای نانواستثنای نانوذرات PLGA از PLGA با دو گروه انتهایی مختلف (گروه های استر و امین) با این هدف استفاده شد که کلاهک های انتهایی امین با بار مثبت، کارایی کپسوله سازی و بارگذاری را به دلیل برهم کنش های بار بین آن و ستون فقرات بار منفی DNA افزایش می دهند. در لوله 50 میلی تیل پلی پروپیلن مخروطی سنتریفیوژ، 100 میلی گرم پلورونیک F127 در 20 میلی ليتر اتوکلاو شده آب DI توسط مخلوط گرداب و به دنبال آن 30 دقیقه فراصوت ملایم با استفاده از حمام مافوق صوت حل شد (CupHorn را ببینید). یک نوار همزن مغناطیسی اتوکلاو شده اضافه شد و محلول در ۶۰۰ RPM به مدت ۳۰ دقیقه مخلوط شد در حالی که راه حل های دیگر ساخته شد. از آزمایشگاه های پلاستیکی به جای ظروف شیشه ای در سراسر برای به حداقل رساندن جذب غیرمشخص DNA استفاده شد. محلول های PLGA محلول در DMF (48/44 میلی گرم در میلی لیتر) و پنتاسن TIPS حل شده در THF (667/0 میلی گرم بر میلی لیتر) به طور جداگانه ساخته شدند. PLGA quiescently به مرطوب در DMF به مدت 30 دقیقه قبل از اینکه به مدت 30 دقیقه sonicated سمت چپ. (برای پروتکل کامل را ببینید جو و همکاران، 2020)
- استخراج DNA
- کپسوله سازی DNA
- پراکنده شدن DNA با پوشش نانوذرات
- تحویل DNA پلاسمید به سلول ها
UP200St CupHorn برای فراصوت غیر مستقیم نمونه ها، به عنوان نمونه برای استخراج DNA و تکه تکه شدن.
محافظت از DNA پلاسمید در زمان فراصوت
DNA شامل پلاسمیدها و پلاسمیدهای سوپرکد تخریب بسیار حساسی هستند. تمام روش های تکه تکه شدن موجود برای معایب خاصی شناخته شده اند. تکه تکه شدن DNA مافوق صوت یکی از روش های ترجیح داده شده از فراصوت کنترل شده در ترکیب با اقدامات حفاظتی اجازه می دهد تا برای کاهش آسیب رساندن به رشته های DNA ناشی از برشی و گرما است.
علاوه بر تنظیمات دامنه پایین، حالت ضربان و کنترل دما در طول shearing DNA مافوق صوت، استفاده از عوامل خاص اثر حفاظتی قابل توجهی در برابر تخریب DNA نشان داد. به عنوان مثال، پلیمرهای مختلف، پپتیدها، و لیپیدها از DNA پلاسمید در طول فراصوت محافظت می کنند.
ثبات DNA پلاسمید و نانوکاملکسی های DNA/IL پلاسمید در برابر استرس برشی مافوق صوت با استفاده از روش الکتروفورز ژل آگاروز مورد بررسی قرار گرفت. هر دو DNA پلاسمید و نانوکاملکسی DNA/IL پلاسمید برای نقاط زمانی مختلف تحت استرس براری مافوق صوت قرار گرفت. DNA پلاسمید به مدت ۰، ۱۰، ۲۰، ۳۰ و ۴۰ دقیقه در معرض استرس براری مافوق صوت قرار گرفت. با این حال، نانوکاملکسی های DNA/IL پلاسمید به مدت 0، 10، 20، 30، 40، 60، 90 و 120 دقیقه در معرض استرس براری مافوق صوت قرار گرفتند.
(مطالعه و تصویر: ©سارکر و همکاران، ۱۳۹۸)
سارکر و همکاران (2019) نشان داد که هنگامی که DNA پلاسمید / مایع یونی (pDNA / IL) نانوساختارها تحت استرس براری مافوق صوت برای 0، 10، 20، 30، 40، 60، 90، و 120 دقیقه و پیچیده با عامل تحویل ژن کاتونیک در دسترس تجاری لیپوفکتمین، درصد سلول های مثبت فلورسنت 80 درصد، 98 درصد، 97 درصد، 85 درصد، 78 درصد، 65 درصد، به ترتیب 65 درصد و 50 درصد (نمودار زیر را ببینید). درصد سلول های مثبت فلورسنت زمانی افزایش یافت که نانوساختارها به مدت ۱۰ و ۲۰ دقیقه تحت استرس براری مافوق صوت قرار گرفت و پس از آن به آرامی کاهش یافت.
تاثیر مایع یونی [Bmim][PF6] بر تحویل DNA پلاسمید به سلول های COS7. نانوکاملکسی های DNA/IL پلاسمید (مایع یونی) تا 120 دقیقه تحت استرس براری مافوق صوت قرار گرفت و قبل از تحویل به سلول های COS7 با LA پیچیده شد. داده ها میانگین تعداد (٪) سلول های HELa مثبت GFP را نشان می دهد که در 10 میدان میکروسکوپی مختلف شمارش شده اند و آزمایش در سه روز مختلف چندین بار انجام شد. (مطالعه و نمودار: ©سارکر و همکاران، ۱۳۹۸)
DNA پلاسمید را می توان محافظت اضافه کردن یک عامل قبل از تکه تکه شدن مافوق صوت: تخریب ناشی از فراصوت pDNA برهنه (A) و pDNA فرموله شده با 1.5 میلی متر از CaCl2 و 20 ٪ (v / v) t بوتانول (B)
نمونه ها با یک کاوشگر 20W تا 120s فراصوت شدند، همانطور که در بالای هر خط نشان داد. لین اچ با نشانگر هایپرلیدر اول مطابقت ™️ دارد. باندهای پلاسمید OC و SC نشان داده شده است.
(مطالعه و تصاویر: ©Wu et al., 2009)
آماده سازی Lysate مافوق صوت
پروتکل لیز سلول مافوق صوت
شروع با یک نمونه غنی شده از سلول ها که از طریق روش جداسازی سلول (به عنوان نمونه، جداسازی سلول های ایمونومغناطیسم، مرتب سازی سلول فعال فلورسانس (FACS)، سانتیریفوژ گرادیان چگالی، جداسازی سلول ایمنی) تهیه شده است.
نمونه های سلول باید حجمی از یک بافر لیز را نشان دهند که برای هدف تجربی و مافوق صوت نوع کاوشگر مناسب است.
بافر های هیپوتونیک ترجیح داده می شوند به عنوان آنها افزایش لیز سلول مافوق صوت. مهم این است که از مواد افزودنی و غلظت نمک به شیوه ای مناسب استفاده شود.
دستگاه لیز مافوق صوت خود را انتخاب کنید: برای فراصوت غیر مستقیم از ویال, VialTweeter یا CupHorn توصیه می شود. برای صفحات مولتی ول، UIP400MTP مافوق صوت ایده آل است. و کلاسیک پروب نوع فراصوت، هموژنیزر مافوق صوت به عنوان UP100H یا UP200Ht با نوک میکرو مناسب ترین.
پروتکل برای فراصوت از نوع کاوشگر: محل پروب مافوق صوت را به حجم نمونه در یک لوله microcentrifuge و sonicate برای تقریبا 10 ثانیه. بسته به نمونه DNA، فراصوت ممکن است یک یا دو بار دیگر تکرار شود. ورودی انرژی مافوق صوت مورد نیاز (Ws/mL) بستگی به ویسکوزیته نمونه و نوع DNA دارد. خنک کردن از طریق حمام یخ و حالت ضربان مافوق صوت کمک می کند تا برای جلوگیری از که نمونه به صورت حرارتی تخریب شده است.
پس از لیز مافوق صوت, نمونه centrifuged برای جدا کردن باقی مانده گلوله (حاوی سلول های unlysed, هسته ها, و اندامک های unlysed)
اگر نمونه بلافاصله بیشتر پردازش نشده باشد، می توان آن را در دمای مناسبی ذخیره کرد تا زنده ماندن آن حفظ شود.
امواج فراصوت برای تکه تکه شدن DNA
Hielscher سونوگرافی ارائه می دهد سیستم عامل های مختلف مبتنی بر سونوگرافی برای DNA, RNA, و تکه تکه شدن کروماتین. این سیستم عامل های مختلف عبارتند از پروب مافوق صوت (sonotrodes) ، راه حل های فراصوت غیر مستقیم برای آماده سازی نمونه همزمان از لوله های متعدد و یا صفحات چند چاه (به عنوان نمونه ، صفحات 96 چاه ، صفحات میکروتیتر) ، sonoreactors ، و cuphorns مافوق صوت. تمام سیستم عامل برای SHEARING DNA توسط فرکانس کوک شده، پردازنده های مافوق صوت با کارایی بالا، که دقیقا قابل کنترل و ارائه نتایج قابل تکثیر است.
پردازنده های مافوق صوت برای هر تعداد نمونه و اندازه
با Hielscher چند نمونه ultrasonicators VialTweeter (برای تا 10 لوله تست) و UIP400MTP (برای میکروپلات / صفحات مولتی ول) آن را به راحتی ممکن می شود برای کاهش زمان پردازش نمونه با توجه به امواج فراصوت شدید و دقیقا قابل کنترل در حالی که به دست آوردن توزیع اندازه قطعه DNA مورد نظر و عملکرد. تکه تکه شدن DNA مافوق صوت باعث می شود گام های آماده سازی پلاسمید کارآمد، قابل اعتماد و مقیاس پذیر است. پروتکل ها را می توان به صورت خطی از یک تا نمونه های متعدد با استفاده از پارامترهای سونوگرافی ثابت مقیاس بندی کرد.
پروب سونوگرافی با یک تا پنج انگشت ایده آل برای آماده سازی اعداد نمونه کوچکتر هستند. اولتراسونیک آزمایشگاه Hielscher در دسترس هستند با سطوح مختلف قدرت به طوری که شما می توانید مختل کننده مافوق صوت ایده آل برای برنامه مربوط به DNA خود را انتخاب کنید.
اولتراسونیک چند نمونه واحد آماده سازی VialTweeter اجازه می دهد تا برای فراصوت همزمان تا 10 ویال. با گیره در دستگاه VialPress، تا 4 لوله های اضافی را می توان به جلو برای فراصوت شدید فشرده شده است.
کنترل دقیق فرآیند
تنظیمات فراصوت دقیقا قابل کنترل بسیار مهم هستند از سونیفیکاسیون جامع می تواند DNA، RNA و کروماتین را از بین ببرند، اما نتایج شکننده مافوق صوت ناکافی در DNA بیش از حد طولانی و قطعات کروماتین. امواج فراصوت دیجیتال Hielscher را می توان به راحتی به پارامتر فراصوت دقیق تنظیم شده است. تنظیمات فراصوت خاص نیز می تواند به عنوان تنظیمات برنامه ریزی شده برای تکرار سریع از همان روش ذخیره می شود.
تمام فراصوت به طور خودکار پروتکل و ذخیره شده به عنوان فایل CSV بر روی کارت SD ساخته شده است. این اجازه می دهد تا برای مستند سازی دقیق از کارآزمایی های انجام شده و این امکان را به تجدید نظر در فراصوت اجرا می شود به راحتی.
از طریق کنترل از راه دور مرورگر، تمام سونوگرافی دیجیتال را می توان از طریق هر مرورگر استاندارد عمل و نظارت. نصب و راه اندازی نرم افزار اضافی مورد نیاز نیست ، از اتصال LAN بسیار ساده پلاگین n - بازی راه اندازی است.
بالاترین کاربر دوستی در طول آماده سازی DNA مافوق صوت
همه Hielscher ultrasonicators طراحی شده اند برای ارائه سونوگرافی با عملکرد بالا, در حالی که در همان زمان همیشه بسیار کاربر پسند و آسان به کار. تمام تنظیمات به خوبی در یک منوی روشن ساختار یافته اند، که به راحتی می تواند از طریق صفحه نمایش لمسی رنگی یا کنترل از راه دور مرورگر قابل دسترسی باشد. نرم افزار هوشمند با تنظیمات قابل برنامه ریزی و ضبط خودکار داده ها، تنظیمات فراصوت مطلوب را برای نتایج قابل اعتماد و قابل تکثیر تضمین می کند. تمیز و آسان برای استفاده از رابط منو به نوبه خود Ultrasonicators Hielscher را به دستگاه های کاربر پسند و کارآمد.
جدول زیر به شما می دهد نشانه ای از ظرفیت پردازش تقریبی از سونوگرافی آزمایشگاه ما برای لیز سلول و تکه تکه شدن DNA:
| دسته ای دوره | نرخ جریان | دستگاه های توصیه شده |
|---|---|---|
| صفحات چند چاهه | n/a | UIP400MTP |
| ویال، منقار کوچک | n/a | cuphorn التراسونیک |
| تا 10 ویال | n/a | VialTweeter(ویال گروهی) |
| 1 تا 500ML | 10 تا پوست 200ml / دقیقه | UP100H |
| 10 به 2000mL | 20 تا 400ML / دقیقه | UP200Ht، UP400St |
تماس با ما! / از ما بپرسید!
ادبیات/منابع
- Mark D. Thompson, Kelly G. Aukema, Dana M. O’Bryan, Stephen D. Rader, Brent W. Murray (2008): Plasmid sonication improves sequencing efficiency and quality in the Beckman Coulter CEQ system. BioTechniques 2008, 45:3, 327-329
- Fykse, Else; Olsen, Jaran; Skogan, Gunnar (2003): Application of sonication to release DNA from Bacillus cereus for quantitative detection by real-time PCR. Journal of microbiological methods 55, 2003. 1-10.
- Ming L. Wu; Sindélia S. Freitas; Gabriel A. Monteiro; Duarte M. F. Prazeres; José A. L. Santos (2009). Stabilization of naked and condensed plasmid DNA against degradation induced by ultrasounds and high-shear vortices. Biotechnology Applied Biochemistry 53(4), 2009.
- Sarker, Satya Ranjan; Ball, Andrew S.; Bhargava, Suresh Kumar; Soni., Sarvesh K. (2019): Evaluation of plasmid DNA stability against ultrasonic shear stress and its in vitro delivery efficiency using ionic liquid [Bmim][PF6]. RSC Advances 9, 2019. 29225-29231.
- Miguel Larguinho, Hugo M. Santos, Gonçalo Doria, H. Scholz, Pedro V. Baptista, José L. Capelo (2010): Development of a fast and efficient ultrasonic-based strategy for DNA fragmentation. Talanta, Volume 81, Issue 3, 2010. 881-886.
- Julie Ann Wyber; Julie Andrews; Antony D’Emanuele (1997): The Use of Sonication for the Efficient Delivery of Plasmid DNA into Cells. Pharmaceutical Research 14(6), 1997. 750–756.
آمار ارزشمند دانستن
پلاسمیدها چی هستن؟
پلاسمید یک مولکول DNA دایره ای کوچک است که از نظر فیزیکی از DNA کروموزومی جدا است و به طور مستقل تکثیر می شود. پلاسمیدها اغلب با ژن هایی همراه هستند که به بقای یک ارگانیسم کمک می کنند و مزایای خاصی را انتقال می دهند، مانند مقاومت آنتی بیوتیکی. پلاسمیدها بیشتر به عنوان مولکول های کوچک دایره ای، DNA دو رشته ای در باکتری ها یافت می شوند؛ با این حال، پلاسمیدها گاهی اوقات در آرکئا و موجودات یوکاریوتی وجود دارند. پلاسمیدها ابزارهای مهمی در زیست شناسی مولکولی، ژنتیک، بیوشیمی، و علم زندگی هستند. پلاسمیدها که در مهندسی ژنتیک به عنوان وکتور شناخته می شوند، برای تکثیر یا بیان ژن های خاصی استفاده می شوند. تغییر هدفمند یک بردار را طراحی برداری می نامند.
تجزیه و تحلیل GFP در تحقیقات سلول
پروتئین فلورسنت سبز (GFP) یک نشانگر بیولوژیکی همه کاره برای نظارت بر فرایندهای فیزیولوژیکی، تجسم بومی سازی پروتئین، و تشخیص بیان ترارژنیک در زنده است. GFP می تواند توسط خط لیزر 488 nm هیجان زده است و به طور بهینه در 510 nm تشخیص داده شده است.
Hielscher Ultrasonics تولید هموژنیزرهای مافوق صوت با کارایی بالا از ازمایشگاه ها تا اندازه صنعتی.