آماده سازی پلاسمید با استفاده از امواج فراصوت
سونتراسونیک یک تکنیک قابل اعتماد برای قطعه قطعه DNA پلاسمید است. دامنه دقیق قابل کنترل، حالت ضربان و کنترل دما مهم ترین ویژگی های یک مافوق صوت برای تکه تکه شدن پلاسمید غیر آسیب رسان است. علاوه بر این، استفاده از عوامل خاص به محافظت در برابر تخریب پلاسمید کمک می کند. Hielscher مافوق صوت ارائه می دهد راه حل های مختلف برای تکه تکه شدن پلاسمید کنترل شده از ویال های تک، به طور همزمان فراصوت از نمونه های متعدد و همچنین صفحات چند چاه. درباره تکه تکه شدن پلاسمید اولتراسونیک موفق بیشتر بدانید!
The UIP400MTP اجازه می دهد تا برای سونوگرافی دقیق کنترل شده از صفحات چند چاه. یکی از کاربردهای UIP400MTP ، تکه تکه شدن DNA پلاسمید به منظور بدست آوردن قطعاتی با طول خاص هدف است.
برش پلاسمید با استفاده از اولتراسونیک
هنگامی که نمونه های DNA در معرض امواج اولتراسونیک قرار می گیرند، ارتعاشات مافوق صوت ایجاد حفره صوتی در مایع است که برش و یا شکستن مولکول های DNA با وزن مولکولی بالا از طریق نیروهای مکانیکی. فراصوت پرکاربردترین روش برای آزمایش های برش DNA فله از جمله کاربردهایی مانند Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) است که برای آن اندازه قطعات کوچک برای به دست آوردن وضوح بالا کاملا مهم است. (رجوع کنید به تسنگ و همکاران، 2012)
DNA پلاسمید (pDNA) شکل خاصی از DNA است که با شکل حلقه آن مشخص می شود و در باکتری ها و برخی یوکاریوت ها یافت می شود.
pDNA ابرپیچ خورده شکل مطلوب DNA پلاسمید است زیرا بهترین نتایج را در فرآیندهای پایین دستی مانند توالی یابی خودکار و ترانسفکشن نشان می دهد. امواج فراصوت مناسب برای قطعه کردن pDNA، از جمله pDNA supercoiled، با موفقیت.
تامپسون و همکاران (2008) نشان دادند که فراصوت پلاسمید ، که به قطعه DNA supercoiled شناخته شده است ، یک راه موثر برای بهبود طول خواندن phred20 توالی است تا جایی که آنها به طور قابل توجهی متفاوت از الگوی کنترل بکمن کولتر یا پلاسمیدهای خطی آنزیمی نیستند.
- دقیقا قابل کنترل است
- نتایج قابل تکرار
- قابل تنظیم برای هدف قرار دادن طول قطعه DNA
- کنترل دما
- مقیاس پذیر برای هر اندازه نمونه
استفاده از بردارهای پلاسمیدی
پلاسمیدها اغلب به عنوان ابزاری برای شبیه سازی، انتقال و دستکاری ژن ها استفاده می شوند. هنگامی که پلاسمیدها به صورت تجربی برای این اهداف استفاده می شوند، به آنها بردار می گویند. قطعات یا ژن های DNA را می توان در یک بردار پلاسمید قرار داد و به اصطلاح پلاسمید نوترکیب ایجاد کرد. بردارهای پلاسمیدی به عنوان وسیله نقلیه ای برای هدایت DNA نوترکیب به داخل سلول میزبان استفاده می شوند و جزء کلیدی شبیه سازی مولکولی هستند.
“ناقلین غیر ویروسی به طور گسترده ای برای استفاده بالقوه از آنها در ژن درمانی برای درمان بیماری های پیچیده مختلف مورد مطالعه قرار می گیرند. بردارهای غیر ویروسی از DNA پلاسمیدی در برابر تخریب فیزیکی، شیمیایی و آنزیمی محافظت می کنند و مولکول DNA را به محل هدف می رسانند. به عنوان مثال، لیپوزوم های کاتیونی، کیتوزان و سایر نانوذرات با بار مثبت از طریق فعل و انفعالات الکترواستاتیک، کمپلکس هایی را با DNA پلاسمید تشکیل می دهند. با این حال، لیپوزوم های کاتیونی/کمپلکس های DNA پلاسمیدی که به راحتی تشکیل می شوند، نسبتا بزرگ هستند (یعنی 300-400 نانومتر) و ماهیت ناهمگنی دارند که استفاده از آنها را در کاربردهای دارویی دشوار می کند. DNA پلاسمید بزرگ و ناهمگن DNA / لیپوزوم، DNA پلاسمید / آئروسل ها، و مجتمع های پلاسمید DNA / پپتیدی را می توان به کوچکتر کاهش داد، و ذرات همگن با استفاده از امواج فراصوت کاهش می یابد.” (سارکر و همکاران، 2019)
یک مثال بارز برای استفاده از بردارهای پلاسمیدی CRISPR-Cas9 است. سیستم CRISPR-Cas9 معمولا به صورت یک پلاسمید بزرگ یا چندین پلاسمید کوچکتر که یک توالی هدف، یک راهنمای CRISPR و Cas9 را رمزگذاری می کند، به سلول ها تحویل داده می شود.
آماده سازی التراسونیک نانوذرات PLGA بارگذاری شده با DNA به روش نانورسوب
جو و همکاران (2020) از پلی (اسید لاکتیک-کوگلیکولیک اسید) (PLGA) به منظور تشکیل یک حامل نانوذرات برای تحویل پلاسمید مدل CRISPR-Cas9 به ماکروفاژهای اولیه مشتق شده از مغز استخوان استفاده کردند. برای رسوب نانوذرات PLGA از PLGA با دو گروه انتهایی مختلف (گروه استر و آمین) استفاده شد با این هدف که کلاهک های انتهایی آمین با بار مثبت به دلیل برهمکنش های بار بین آن و ستون فقرات بار منفی DNA، راندمان درون پوشانی و بارگذاری را افزایش دهند. در یک لوله سانتریفیوژ مخروطی پلی پروپیلن 50 میلی لیتر، 100 میلی گرم پلورونیک F127 در 20 میلی لیتر آب DI اتوکلاو شده با اختلاط گرداب و به دنبال آن 30 دقیقه فراصوت ملایم با استفاده از حمام اولتراسونیک حل شد.CupHorn را ببینید). یک میله همزن مغناطیسی اتوکلاو شده اضافه شد و محلول در سرعت 600 دور در دقیقه به مدت 30 دقیقه مخلوط شد در حالی که محلول های دیگر ساخته شدند. ظروف آزمایشگاهی پلاستیکی به جای ظروف شیشه ای برای به حداقل رساندن جذب غیر اختصاصی DNA استفاده شد. محلول های PLGA محلول در DMF (48/44 میلی گرم بر میلی لیتر) و پنتاسن محلول در THF (667/0 میلی گرم بر میلی لیتر) به طور جداگانه ساخته شدند. PLGA به مدت 30 دقیقه قبل از اینکه به مدت 30 دقیقه فراصوت شود ، به آرامی در DMF مرطوب شد (برای پروتکل کامل به جو و همکاران ، 2020 مراجعه کنید)
- استخراج DNA
- کپسوله سازی DNA
- پراکندگی DNA پوشش داده شده با نانوذرات
- تحویل DNA پلاسمید به سلول ها
UP200St CupHorn برای فراصوت غیر مستقیم نمونه ها، به عنوان مثال برای استخراج DNA و تکه تکه شدن.
حفاظت از DNA پلاسمید در طول فراصوت
DNA از جمله پلاسمیدها و پلاسمیدهای ابرپیچ خورده تخریب بسیار حساسی هستند. تمام روش های تکه تکه شدن موجود برای معایب خاصی شناخته شده اند. تکه تکه شدن DNA مافوق صوت یکی از روش های ارجح از فراصوت کنترل شده در ترکیب با اقدامات محافظتی اجازه می دهد تا برای کاهش برش- و گرما ناشی از آسیب رساندن رشته های DNA.
علاوه بر تنظیمات دامنه کم، حالت ضربان و کنترل دما در طول برش DNA اولتراسونیک، استفاده از برخی عوامل اثر محافظتی قابل توجهی در برابر تخریب DNA نشان داد. به عنوان مثال، پلیمرهای مختلف، پپتیدها و لیپیدها از DNA پلاسمید در طول امواج فراصوت محافظت می کنند.
پایداری DNA پلاسمیدی و نانوکمپلکس های پلاسمیدی DNA/IL در برابر تنش برشی فراصوت با استفاده از روش الکتروفورز ژل آگارز بررسی شد. هر دو نانوکمپلکس DNA پلاسمیدی و پلاسمید DNA/IL در نقاط زمانی مختلف تحت تنش برشی فراصوت قرار گرفتند. DNA پلاسمید به مدت 0، 10، 20، 30 و 40 دقیقه در معرض تنش برشی فراصوت قرار گرفت. با این حال، نانوکمپلکس های پلاسمیدی DNA/IL به مدت 0، 10، 20، 30، 40، 60، 90 و 120 دقیقه در معرض تنش برشی فراصوت قرار گرفتند.
(مطالعه و تصویر: ©سارکر و همکاران، 2019)
سارکر و همکاران (2019) نشان دادند که هنگامی که نانوساختارهای پلاسمیدی DNA / مایع یونی (pDNA/IL) به مدت 0، 10، 20، 30، 40، 60، 90 و 120 دقیقه تحت تنش برشی اولتراسونیک قرار گرفتند و با عامل تحویل ژن کاتیونی موجود در بازار لیپوفکتامین کمپلکس شدند، درصد سلول های مثبت فلورسنت 80٪، 98٪، 97٪، 85٪، 78٪، 65٪ بود. به ترتیب 65 و 50 درصد (نمودار زیر را ببینید). درصد سلول های مثبت فلورسنت زمانی که نانوساختارها به مدت 10 و 20 دقیقه تحت تنش برشی فراصوت قرار گرفتند افزایش یافت و پس از آن به آرامی کاهش یافت.
تأثیر مایع یونی [Bmim][PF6] بر تحویل DNA پلاسمید به سلول های COS7. نانوکمپلکس های پلاسمید DNA/IL (مایع یونی) به مدت 120 دقیقه تحت تنش برشی اولتراسونیک قرار گرفتند و قبل از تحویل به سلول های COS7 با LA کمپلکس شدند. داده ها نشان دهنده میانگین تعداد (درصد) سلول های HeLa مثبت GFP در 10 میدان میکروسکوپی مختلف است و آزمایش چندین بار در سه روز مختلف انجام شد. (مطالعه و نمودار: ©سارکر و همکاران، 2019)
DNA پلاسمید را می توان با افزودن یک عامل قبل از تکه تکه شدن اولتراسونیک محافظت کرد: تخریب ناشی از فراصوت pDNA برهنه (A) و pDNA فرموله شده با 1.5 میلی مولار CaCl2 و 20٪ (v/v) t-بوتانول (B)
نمونه ها با یک پروب 20W تا 120s فراصوت شدند، همانطور که در بالای هر خط نشان داده شده است. Lane H مربوط به نشانگر Hyperladder I ™️ است. باندهای پلاسمید OC و SC نشان داده شده اند.
(مطالعه و تصاویر: ©وو و همکاران، 2009)
آماده سازی لیزات التراسونیک
پروتکل لیز سلول اولتراسونیک
با یک نمونه غنی شده از سلول ها شروع کنید که از طریق روش جداسازی سلولی (به عنوان مثال، جداسازی سلول های ایمونومغناطیسی، مرتب سازی سلول فعال شده با فلورسانس (FACS)، سانتریفیوژ گرادیان چگالی، جداسازی سلول های چگالی ایمنی) تهیه شده است.
نمونه های سلولی باید حجمی از بافر لیز را نشان دهند که برای هدف تجربی و سونوگرافی نوع کاوشگر مناسب است.
بافرهای هیپوتونیک ترجیح داده می شوند زیرا لیز سلول اولتراسونیک را افزایش می دهند. مهم است که از مواد افزودنی و غلظت نمک به شیوه ای مناسب استفاده شود.
دستگاه لیز اولتراسونیک خود را انتخاب کنید: برای فراصوت غیر مستقیم ویال ها، VialTweeter یا CupHorn توصیه می شود. برای چند چاه صفحات، UIP400MTP اولتراسونیک ایده آل است. و کلاسیک پروب نوع فراصوت، یک هموژنایزر مافوق صوت به عنوان UP100H یا UP200Ht با یک میکرو نوک مناسب ترین هستند.
پروتکل برای فراصوت پروب نوع: پروب اولتراسونیک را در حجم نمونه در یک لوله میکرو سانتریفیوژ قرار دهید و حدود 10 ثانیه فراصوت کنید. بسته به نمونه DNA، فراصوت ممکن است یک یا دو بار دیگر تکرار شود. ورودی انرژی اولتراسونیک مورد نیاز (Ws / mL) بستگی به ویسکوزیته نمونه و نوع DNA. خنک کننده از طریق حمام یخ و حالت ضربان مافوق صوت کمک می کند تا برای جلوگیری از اینکه نمونه از نظر حرارتی تخریب می شود.
پس از لیز اولتراسونیک، نمونه سانتریفیوژ می شود تا بقایای پلت (حاوی سلول های لیز نشده، هسته ها و اندامک های لیز نشده) جدا شود.
اگر نمونه بلافاصله پردازش نشود، می توان آن را در دمای مناسب نگهداری کرد تا زنده ماندن آن حفظ شود.
مافوق صوت برای تکه تکه شدن DNA
Hielscher مافوق صوت ارائه می دهد سیستم عامل های مختلف مبتنی بر سونوگرافی برای DNA, RNA, و تکه تکه شدن کروماتین. این سیستم عامل های مختلف شامل پروب های مافوق صوت (sonotrodes)، راه حل های فراصوت غیر مستقیم برای آماده سازی نمونه همزمان از لوله های متعدد و یا صفحات چند چاه (به عنوان مثال، صفحات 96 چاه، صفحات microtiter)، sonoreactors، و cuphorns مافوق صوتی. تمام سیستم عامل های برش DNA توسط پردازنده های اولتراسونیک تنظیم شده با فرکانس و با کارایی بالا تغذیه می شوند که دقیقا قابل کنترل هستند و نتایج قابل تکرار را ارائه می دهند.
پردازنده های اولتراسونیک برای هر تعداد نمونه و اندازه
با مافوق صوت چند نمونه Hielscher ، VialTweeter (تا 10 test لوله) و UIP400MTP (برای microplates / صفحات چند چاه) آن را به راحتی ممکن می شود برای کاهش زمان پردازش نمونه با توجه به سونوگرافی شدید و دقیق قابل کنترل در حالی که به دست آوردن توزیع اندازه قطعه DNA مورد نظر و بازده. تکه تکه شدن DNA اولتراسونیک باعث می شود مراحل آماده سازی پلاسمید کارآمد، قابل اعتماد و مقیاس پذیر باشد. پروتکل ها را می توان به صورت خطی از یک نمونه به چند نمونه با استفاده از پارامترهای سونوگرافی ثابت مقیاس بندی کرد.
پروب اولتراسونیک با یک تا پنج انگشت ایده آل برای آماده سازی تعداد نمونه کوچکتر هستند. مافوق صوت آزمایشگاه Hielscher را با سطوح مختلف قدرت در دسترس هستند به طوری که شما می توانید مختل کننده اولتراسونیک ایده آل برای نرم افزار مربوط به DNA خود را انتخاب کنید.
واحد آماده سازی چند نمونه اولتراسونیک VialTweeter اجازه می دهد تا برای فراصوت همزمان تا 10 ویال. با دستگاه گیره دار VialPress، حداکثر 4 لوله اضافی را می توان به جلو برای فراصوت شدید فشار داد.
کنترل دقیق فرآیند
تنظیمات فراصوت دقیق قابل کنترل بسیار مهم است از فراصوت جامع می تواند DNA ، RNA و کروماتین را از بین ببرد ، اما نتایج برش اولتراسونیک ناکافی در قطعات DNA و کروماتین بیش از حد طولانی. اولتراسونیک های دیجیتال Hielscher را می توان به راحتی به پارامتر فراصوت دقیق تنظیم. تنظیمات فراصوت خاص نیز می تواند به عنوان تنظیمات برنامه ریزی شده برای تکرار سریع همان روش ذخیره شود.
تمام فراصوت به طور خودکار پروتکل شده و ذخیره شده به عنوان فایل CSV بر روی ساخته شده در کارت SD. این اجازه می دهد تا برای مستندات دقیق از آزمایش های انجام شده و باعث می شود آن را ممکن است برای تجدید نظر فراصوت اجرا می شود به راحتی.
از طریق کنترل از راه دور مرورگر، تمام مافوق صوت دیجیتال را می توان از طریق هر مرورگر استاندارد عمل و نظارت کرد. نصب نرم افزار اضافی مورد نیاز نیست، زیرا اتصال LAN یک راه اندازی بسیار ساده plug-n-play است.
بالاترین کاربر پسند در طول آماده سازی DNA اولتراسونیک
همه مافوق صوت Hielscher طراحی شده اند برای ارائه سونوگرافی با کارایی بالا، در حالی که در همان زمان همیشه بسیار کاربر پسند و آسان برای کار. همه تنظیمات به خوبی در یک منوی واضح ساختار یافته اند که به راحتی از طریق نمایشگر لمسی رنگی یا کنترل از راه دور مرورگر قابل دسترسی است. نرم افزار هوشمند با تنظیمات قابل برنامه ریزی و ضبط خودکار داده ها تنظیمات فراصوت بهینه را برای نتایج قابل اعتماد و قابل تکرار تضمین می کند. رابط منوی تمیز و آسان برای استفاده به نوبه خود مافوق صوت Hielscher را به دستگاه های کاربر پسند و کارآمد.
جدول زیر به شما نشانه ای از ظرفیت پردازش تقریبی مافوق صوت آزمایشگاه ما برای لیز سلول و تکه تکه شدن DNA می دهد:
| حجم دسته ای | نرخ جریان | دستگاه های توصیه شده |
|---|---|---|
| صفحات چند چاهی | N / A | UIP400MTP |
| ویال، لیوان کوچک | N / A | التراسونیک CupHorn |
| تا 10 ویال | N / A | VialTweeter(ویال گروهی) |
| 1 تا 500 میلی لیتر | 10 تا 200 میلی لیتر در دقیقه | UP100H |
| 10 تا 2000 میلی لیتر | 20 تا 400 میلی لیتر در دقیقه | تا 200 هرتز، UP400St |
تماس با ما! / از ما بپرسید!
ادبیات / منابع
- Mark D. Thompson, Kelly G. Aukema, Dana M. O’Bryan, Stephen D. Rader, Brent W. Murray (2008): Plasmid sonication improves sequencing efficiency and quality in the Beckman Coulter CEQ system. BioTechniques 2008, 45:3, 327-329
- Fykse, Else; Olsen, Jaran; Skogan, Gunnar (2003): Application of sonication to release DNA from Bacillus cereus for quantitative detection by real-time PCR. Journal of microbiological methods 55, 2003. 1-10.
- Ming L. Wu; Sindélia S. Freitas; Gabriel A. Monteiro; Duarte M. F. Prazeres; José A. L. Santos (2009). Stabilization of naked and condensed plasmid DNA against degradation induced by ultrasounds and high-shear vortices. Biotechnology Applied Biochemistry 53(4), 2009.
- Sarker, Satya Ranjan; Ball, Andrew S.; Bhargava, Suresh Kumar; Soni., Sarvesh K. (2019): Evaluation of plasmid DNA stability against ultrasonic shear stress and its in vitro delivery efficiency using ionic liquid [Bmim][PF6]. RSC Advances 9, 2019. 29225-29231.
- Miguel Larguinho, Hugo M. Santos, Gonçalo Doria, H. Scholz, Pedro V. Baptista, José L. Capelo (2010): Development of a fast and efficient ultrasonic-based strategy for DNA fragmentation. Talanta, Volume 81, Issue 3, 2010. 881-886.
- Julie Ann Wyber; Julie Andrews; Antony D’Emanuele (1997): The Use of Sonication for the Efficient Delivery of Plasmid DNA into Cells. Pharmaceutical Research 14(6), 1997. 750–756.
حقایقی که ارزش دانستن دارند
پلاسمیدها چیست؟
پلاسمید یک مولکول DNA دایره ای کوچک است که از نظر فیزیکی از DNA کروموزومی جدا است و به طور مستقل تکثیر می شود. پلاسمیدها اغلب با ژن هایی مرتبط هستند که به بقای یک ارگانیسم کمک می کنند و مزایای خاصی را به همراه دارند، به عنوان مثال مقاومت آنتی بیوتیکی. پلاسمیدها معمولا به صورت مولکول های DNA دایره ای کوچک و دو رشته ای در باکتری ها یافت می شوند. با این حال ، پلاسمیدها گاهی اوقات در ارگانیسم های باستان و یوکاریوتی وجود دارند. پلاسمیدها ابزارهای مهمی در زیست شناسی مولکولی، ژنتیک، بیوشیمی و علوم زیستی هستند. پلاسمیدها که در مهندسی ژنتیک به عنوان بردارها شناخته می شوند، برای تکثیر یا بیان ژن های خاص استفاده می شوند. تغییر هدفمند یک بردار، طراحی برداری نامیده می شود.
تجزیه و تحلیل GFP در تحقیقات سلولی
پروتئین فلورسنت سبز (GFP) یک نشانگر بیولوژیکی همه کاره برای نظارت بر فرآیندهای فیزیولوژیکی، تجسم محلی سازی پروتئین و تشخیص بیان تراریخته در داخل بدن است. GFP را می توان توسط خط لیزر 488 نانومتری برانگیخته کرد و در 510 نانومتر به طور بهینه تشخیص داده می شود.
Hielscher مافوق صوت تولید کننده هموژنایزرهای مافوق صوت با کارایی بالا از ازمایشگاه ها تا اندازه صنعتی.