لیز اولتراسونیک سلول های مهندسی زیستی در تولید صنعتی
گونه های باکتری های مهندسی شده زیستی مانند E. coli و همچنین انواع سلول های پستانداران و گیاهی اصلاح شده ژنتیکی به طور گسترده ای در بیوتکنولوژی برای بیان مولکول ها استفاده می شوند. به منظور آزاد کردن این مولکول های زیستی سنتز شده، یک تکنیک قابل اعتماد برای اختلال سلولی مورد نیاز است. سونوگرافی با کارایی بالا یک روش اثبات شده برای لیز سلول کارآمد و قابل اعتماد است – به راحتی به توان عملیاتی بزرگ مقیاس پذیر است. Hielscher مافوق صوت ارائه می دهد شما تجهیزات مافوق صوت با کارایی بالا برای لیز سلول موثر به منظور تولید حجم زیادی از مولکول های زیستی با کیفیت بالا.
استخراج مولکول ها از کارخانه های سلولی
برای تولید طیف گسترده ای از مولکول های زیستی ، می توان از میکروب ها و سلول های گیاهی مهندسی شده مختلف به عنوان کارخانه های سلول میکروبی استفاده کرد ، از جمله اشریشیا کلی ، باسیلوس سوبتیلیس ، سودوموناس پوتیدا ، استرپتومیسس ، کورینه باکتریوم گلوتامیکوم ، لاکتوکوکوس لاکسی ، سیانوباکتری ها ، ساکارومایسس سرویزیا ، Pichia pastoris ، یارویا لیپولیتیکا ، نیکوتیانا بنتیانا و جلبک ها و بسیاری دیگر. این کارخانه های سلولی می توانند پروتئین ها، لیپیدها، بیوشیمیاییها، پلیمرها، سوخت های زیستی و اولئوشیمیایی ها را تولید کنند که به عنوان مواد غذایی یا ماده اولیه برای کاربردهای صنعتی استفاده می شوند. سلول هایی که به عنوان کارخانه های سلولی استفاده می شوند در بیوراکتورهای بسته کشت می شوند، جایی که می توانند به راندمان بالا، ویژگی و نیاز به انرژی کم دست یابند.
برای جداسازی مولکول های هدف از کشت های سلولی مهندسی زیستی، سلول ها باید مختل شوند تا مواد داخل سلولی آزاد شوند. مختل کننده های سلول اولتراسونیک به خوبی به عنوان تکنیک بسیار قابل اعتماد و کارآمد برای تجزیه سلول و انتشار ترکیب تثبیت شده اند.
تجزیه کننده های سلول اولتراسونیک مانند UIP2000hdT برای جداسازی ترکیبات از کارخانه های سلول های میکروبی استفاده می شود.
کارخانه های سلول های میکروبی سلول های مهندسی متابولیکی هستند که برای سنتز ترکیبات ارزشمند مختلف استفاده می شوند. اختلال سلول اولتراسونیک یک روش کارآمد و قابل اعتماد برای انتشار ترکیبات ارزشمند از داخل سلول است.
مطالعه و گرافیک: ©Villaverde ، 2010.
مزایای استفاده از مختل کننده های سلول اولتراسونیک
به عنوان یک تکنولوژی غیر حرارتی، خفیف، و در عین حال بسیار کارآمد، مختل کننده های مافوق صوت در آزمایشگاه و صنعت برای لیز سلول ها و تولید عصاره های با کیفیت بالا استفاده می شود، به عنوان مثال برای جداسازی مولکول ها از کارخانه های سلولی استفاده می شود.
- کارآمد بالا
- غیر حرارتی، ایده آل برای مواد حساس به دما
- نتایج قابل اعتماد و تکرارپذیر
- کنترل دقیق پردازش
- خطی مقیاس پذیر تا توان عملیاتی بزرگتر
- برای ظرفیت های تولید صنعتی موجود است
قدرت سونوگرافی برای اختلال کارآمد کارخانه های سلول های میکروبی
مکانیسم و اثرات مختل کننده های سلول اولتراسونیک:
اختلال سلول اولتراسونیک از قدرت امواج اولتراسوند استفاده می کند. هموژنایزر اولتراسونیک / مختل کننده سلول مجهز به یک پروب (با نام مستعار سونوترود) ساخته شده از آلیاژ تیتانیوم است که در فرکانس بالا تقریبا نوسان می کند. این بدان معناست که کاوشگر اولتراسونیک زوج 20،000 ارتعاش در ثانیه به مایع فراصوت. امواج اولتراسوند همراه با مایع با چرخه های متناوب فشار بالا / فشار کم مشخص می شوند. در طول یک چرخه فشار کم، مایع منبسط می شود و حباب های خلاء دقیقه ای ایجاد می شوند. این حباب های بسیار کوچک در طی چندین چرخه فشار متناوب رشد می کنند تا زمانی که نتوانند انرژی بیشتری را جذب کنند. در این مرحله، حباب های کاویتاسیون به شدت منفجر می شوند و به صورت محلی یک محیط فوق العاده متراکم انرژی ایجاد می کنند. این پدیده به عنوان کاویتاسیون صوتی شناخته می شود و با دمای بسیار بالا موضعی، فشارهای بسیار بالا و نیروهای برشی مشخص می شود. این تنش های برشی به طور موثر دیواره های سلولی را می شکنند و انتقال جرم بین داخل سلول و حلال اطراف را افزایش می دهند. به عنوان یک تکنیک صرفا مکانیکی، نیروهای برشی مافوق صوت تولید شده به طور گسترده ای مورد استفاده قرار می گیرند و روش توصیه می شود برای اختلال سلول های باکتریایی، و همچنین برای جداسازی پروتئین. به عنوان یک روش ساده و سریع اختلال سلول، فراصوت ایده آل برای جداسازی حجم کوچک، متوسط و بزرگ است. مافوق صوت دیجیتال Hielscher را با یک منوی روشن از تنظیمات برای کنترل فراصوت دقیق مجهز. تمام داده های فراصوت به طور خودکار بر روی یک کارت SD ساخته شده ذخیره می شوند و به سادگی در دسترس هستند. گزینه های پیچیده از اتلاف گرما مانند خنک کننده خارجی، فراصوت در حالت پالس و غیره در طول فرایند تجزیه مافوق صوت، اطمینان از حفظ دمای فرآیند ایده آل و در نتیجه دست نخورده بودن ترکیبات حساس به حرارت استخراج.
تحقیقات تاکید نقاط قوت اختلال سلول مافوق صوت و استخراج
پروفسور Chemat و همکاران (2017) در مطالعه خود از سر می گیرند که "استخراج به کمک سونوگرافی یک جایگزین سبز و از نظر اقتصادی مناسب برای تکنیک های مرسوم برای مواد غذایی و محصولات طبیعی است. مزایای اصلی آن کاهش زمان استخراج و پردازش، میزان انرژی و حلال های مصرفی، عملیات واحد و CO استH2S انتشار گازهای گلخانه ای."
Gabig-Ciminska و همکاران (2014) در مطالعه خود از یک هموژنایزر با فشار بالا و یک DSINTEGRATOR سلول اولتراسونیک برای لیز هاگ به منظور آزاد کردن DNA استفاده کردند. با مقایسه هر دو روش اختلال سلولی، تیم تحقیقاتی نتیجه می گیرند که در مورد لیز سلولی برای DNA اسپور، "تجزیه و تحلیل با استفاده از لیزات سلولی از همگن سازی فشار بالا انجام شده است. پس از آن، متوجه شدیم که اختلال در سلول های اولتراسونیک مزایای برجسته ای برای این منظور دارد. نسبتا سریع است و می توان آن را برای حجم نمونه های کوچک پردازش کرد. (گابیگ-سیمینسکا و همکاران، 2014)
تجزیه کننده سلول اولتراسونیک صنعتی UIP4000hdT (4000 وات، 20 کیلوهرتز) برای جداسازی و خالص سازی مداوم درون خطی ترکیبات سنتز شده از کارخانه های سلول های میکروبی.
مولکول های زیستی از کارخانه های سلولی برای تولید مواد غذایی
کارخانه های سلول های میکروبی یک روش تولید مناسب و کارآمد با استفاده از ارگانیسم های میکروبی برای تولید بازده بالای متابولیت های بومی و غیر بومی با مهندسی زیستی متابولیک میکروارگانیسم های میکروبی مانند باکتری ها، مخمرها، قارچ ها و غیره هستند. آنزیم های فله به عنوان مثال با استفاده از میکروارگانیسم های auch به عنوان آسپرژیلوس oryzae، قارچ ها و باکتری ها تولید می شوند. این آنزیم های فله برای تولید مواد غذایی و آشامیدنی و همچنین در کشاورزی، انرژی زیستی و مراقبت های خانگی استفاده می شوند.
باکتری های خاصی مانند استوباکتر زایلینوم و گلوکوناستوباکتر زایلینوس در طی فرآیند تخمیر سلولز تولید می کنند که در آن نانوالیاف در یک فرآیند از پایین به بالا سنتز می شوند. سلولز باکتریایی (همچنین به عنوان سلولز میکروبی شناخته می شود) از نظر شیمیایی معادل سلولز گیاهی است، اما دارای درجه تبلور بالا و خلوص بالا (عاری از لیگنین، همی سلولز، پکتین و سایر اجزای بیوژنیک) و همچنین ساختار منحصر به فردی از شبکه سه بعدی (سه بعدی) بافته شده با نانوالیاف سلولز است. (رجوع کنید به ژونگ، 2020) سلولز باکتریایی در مقایسه با سلولز گیاهی پایدارتر است و سلولز تولید شده خالص است و نیازی به مراحل پیچیده خالص سازی ندارد. امواج فراصوت و استخراج حلال با استفاده از NaOH یا SDS (سدیم دودسیل سولفات) برای جداسازی سلولز باکتریایی از سلول های باکتریایی بسیار موثر است.
مولکول های زیستی از کارخانه های سلولی برای تولید دارو و واکسن
یکی از برجسته ترین محصولات دارویی مشتق شده از کارخانه های سلولی، انسولین انسانی است. برای تولید انسولین مهندسی شده زیستی، عمدتا از E. coli و Saccharomyces cerevisiae استفاده می شود. از آنجایی که مولکول های نانو سنتز شده زیستی سازگاری بالایی دارند، نانوذرات بیولوژیکی مانند فریتین برای کاربردهای متعدد تولید زیستی سودمند هستند. علاوه بر این، تولید در میکروب های مهندسی متابولیکی اغلب به طور قابل توجهی در بازده های به دست آمده موثرتر است. برای مثال, تولید اسید آرتمیسینیک است, رسوراترول و لیکوپن ده برابر به چند صد برابر افزایش یافته است, و در حال حاضر تاسیس شده است و یا در حال توسعه به تولید در مقیاس صنعتی. (رجوع کنید به لیو و همکاران؛ میکروب. واقعیت سلول. 2017)
به عنوان مثال، مولکول های زیستی نانو مبتنی بر پروتئین با خواص خود مونتاژی مانند فریتین و ذرات شبه ویروس به ویژه برای توسعه واکسن جالب هستند، زیرا هم اندازه و هم ساختار پاتوژن ها را تقلید می کنند و برای ترکیب سطحی آنتی ژن ها برای تقویت تعامل با سلول های ایمنی قابل استفاده هستند. چنین مولکول هایی در کارخانه های به اصطلاح سلولی (به عنوان مثال، سویه های E. coli مهندسی شده) بیان می شوند که یک مولکول هدف خاص تولید می کنند.
پروتکل لیز اولتراسونیک و E. coli BL21 برای انتشار فریتین
فریتین پروتئینی است که عملکرد اصلی آن ذخیره آهن است. فریتین قابلیت های امیدوارکننده ای را به عنوان نانوذرات خود مونتاژ در واکسن ها نشان می دهد، جایی که از آن به عنوان وسیله نقلیه تحویل واکسن استفاده می شود (به عنوان مثال پروتئین های اسپایک SARS-Cov-2). تحقیقات علمی سان و همکاران. al. (2016) نشان می دهد که فریتین نوترکیب می تواند به صورت محلول از اشریشیا کلی در غلظت های پایین NaCl (≤50 میلی مول در لیتر) آزاد شود. به منظور بیان فریتین در باکتری E. coli BL21 و رهاسازی فرتین، پروتکل زیر با موفقیت اعمال شد. پلاسمید نوترکیب pET-28a/فریتین به سویه E coli BL21 (DE3) تبدیل شد. سلول های فریتین E coli BL21 (DE3) در محیط کشت LB با 5/0 درصد کانامایسین در دمای 37 درجه سانتی گراد کشت داده شدند و در OD600 برابر با 4/0 درصد ایزوپروپیل-β-D-تیوگالاکتوپیرانوزید به مدت 3 ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد القا شدند. سپس کشت نهایی با سانتریفیوژ در دمای 8000 گرم به مدت 10 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی گراد برداشت و پلت جمع آوری شد. سپس پلت در محیط کشت LB (1 درصد کلرید سدیم، 1 درصد تایپون، 5/0 درصد عصاره مخمر) / بافر لیز (20 میلی مول در لیتر تریس، 50 میلی مول در لیتر کلرید سدیم، 1 میلی مول در لیتر EDTA، pH 6/7) و غلظت های مختلف محلول کلرید سدیم (صفر، 50، 100، 170 و 300 میلی مول در لیتر) مجددا معلق شد. برای لیز سلول های باکتریایی، فراصوت در حالت نبض اعمال شد: به عنوان مثال، با استفاده از Ultrasonicator UP400St در دامنه 100٪ با چرخه کاری 5 ثانیه روشن، 10 ثانیه خاموش، برای 40 چرخه) و سپس در 10 000 گرم به مدت 15 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ می شود. مایع رویی و رسوب با استفاده از الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید سدیم دودسیل سولفات (SDS-PAGE) مورد بررسی قرار گرفتند. تمام ژل های رنگ آمیزی شده با سدیم دودسیل سولفات با اسکنر با وضوح بالا اسکن شدند. تصاویر ژل با استفاده از نرم افزار Magic Chemi 1D مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. برای وضوح بهینه، باندهای پروتئینی با تنظیم پارامترها شناسایی شدند. داده های مربوط به باندها از سه تکرار فنی تولید شده است. (رجوع کنید به سان و همکاران، 2016)
مختل کننده های سلول التراسونیک برای لیز صنعتی کارخانه های سلولی
لیز و استخراج مافوق صوت یک روش قابل اعتماد و راحت برای انتشار متابولیت ها از کارخانه های سلولی است و در نتیجه به تولید موثر مولکول های هدف کمک می کند. مختل کننده های سلول اولتراسونیک از آزمایشگاه تا اندازه صنعتی در دسترس هستند و فرآیندها را می توان به طور کامل خطی مقیاس بندی کرد.
Hielscher اولتراسونیک شریک صالح خود را برای اختلال مافوق صوت با کارایی بالا است و دارای تجربه طولانی مدت در زمینه کاشت سیستم های مافوق صوت در نیمکت بالا و تنظیمات صنعتی است.
هنگامی که آن را به سخت افزار پیچیده و نرم افزار می آید, Hielscher مافوق صوت سیستم های اختلال سلول برآورده تمام الزامات برای کنترل فرآیند بهینه, بهره برداری آسان و کاربر پسند. مشتریان و کاربر از مافوق صوت Hielscher ارزش سود است که Hielscher مختل کننده سلول های مافوق صوت و استخراج اجازه می دهد تا برای نظارت دقیق بر روند و کنترل – از طریق صفحه نمایش لمسی دیجیتال و کنترل از راه دور مرورگر. تمام داده های مهم فراصوت (به عنوان مثال انرژی خالص، انرژی کل، دامنه، مدت زمان، دما، فشار) به طور خودکار به عنوان فایل CSV بر روی یک کارت SD یکپارچه ذخیره می شوند. این کمک می کند تا برای به دست آوردن نتایج تکرارپذیر و تکرارپذیر و تسهیل استاندارد فرآیند و همچنین تحقق شیوه های تولید خوب (cGMP).
البته، پردازنده های مافوق صوت Hielscher برای عملیات 24/7 تحت بار کامل ساخته شده و بنابراین می تواند قابل اعتماد در تنظیمات تولید صنعتی عمل. با توجه به استحکام بالا و نگهداری کم، خرابی تجهیزات اولتراسونیک واقعا کم است. ویژگی های CIP (تمیز کردن در محل) و SIP (استریل کردن در محل) تمیز کردن پر زحمت را به حداقل می رساند، به خصوص که تمام قسمت های مرطوب سطوح فلزی صاف هستند (بدون روزنه یا نازل پنهان).
جدول زیر به شما نشانه ای از ظرفیت پردازش تقریبی مافوق صوت ما می دهد:
| حجم دسته ای | نرخ جریان | دستگاه های توصیه شده |
|---|---|---|
| 1 تا 500 میلی لیتر | 10 تا 200 میلی لیتر در دقیقه | UP100H |
| 10 تا 2000 میلی لیتر | 20 تا 400 میلی لیتر در دقیقه | تا 200 هرتز، UP400St |
| 0.1 تا 20 لیتر | 0.2 تا 4 لیتر در دقیقه | UIP2000hdT |
| 10 تا 100 لیتر | 2 تا 10 لیتر در دقیقه | UIP4000hdT |
| ن.ا. | 10 تا 100 لیتر در دقیقه | UIP16000 |
| ن.ا. | بزرگتر | خوشه ای از UIP16000 |
تماس با ما! / از ما بپرسید!
Hielscher مافوق صوت تولید کننده هموژنایزرهای مافوق صوت با کارایی بالا برای مخلوط کردن برنامه های کاربردی، پراکندگی، امولسیون و استخراج در آزمایشگاه، خلبان و مقیاس صنعتی.
ادبیات / منابع
- Sun, W., Jiao, C., Xiao, Y., Wang, L., Yu, C., Liu, J., Yu, Y., Wang, L. (2016):Salt-Dependent Aggregation and Assembly of E Coli-Expressed Ferritin. Dose-Response, March 2016.
- Rodrigues, M.Q.; Alves, P.M.; Roldão, A. (2021): Functionalizing Ferritin Nanoparticles for Vaccine Development. Pharmaceutics 2021, 13, 1621.
- Farid Chemat, Natacha Rombaut, Anne-Gaëlle Sicaire, Alice Meullemiestre, Anne-Sylvie Fabiano-Tixier, Maryline Abert-Vian (2017): Ultrasound assisted extraction of food and natural products. Mechanisms, techniques, combinations, protocols and applications. A review. Ultrasonics Sonochemistry, Volume 34, 2017. 540-560.
- Villaverde, Antonio (2010): Nanotechnology, bionanotechnology and microbial cell factories. Microbial Cell Factories 2010 9:53.
حقایقی که ارزش دانستن دارند
سونو بیوراکتورها
سونوگرافی از یک طرف برای مختل کردن سلول ها به منظور انتشار ترکیبات داخل سلولی استفاده می شود، اما با دامنه خفیف تر و / یا به عنوان انفجار سونوگرافی ضربان دار اعمال می شود، فراصوت تا حد زیادی می تواند بهره وری متابولیک سلول های میکروبی، گیاهی و حیوانی در بیوراکتورها را افزایش دهد و در نتیجه فرآیندهای بیوتکنولوژی. پروب های اولتراسونیک را می توان به سادگی در بیوراکتورها (به اصطلاح سونو بیوراکتورها) به منظور تشدید بهره وری از بیوکاتالیست های زندگی می کنند یکپارچه. اولتراسونیک Hielscher اجازه می دهد تا برای شرایط سونوگرافی دقیقا کنترل شده، که می تواند بهینه تنظیم به تبدیل کاتالیزوری بالا از سلول های زنده. اطلاعات بیشتر در مورد پروب مافوق صوت Hielscher برای sonobioreactors و اثرات biocatalysis مافوق صوت افزایش یافته است!
کارخانه های سلولی و سنتز متابولیت ها
میکروارگانیسم های مختلف می توانند متابولیت های مشابهی را سنتز کنند ، به عنوان مثال ، برای تولید اسیدهای آمینه Corynebacterium ، Brevibacterium و Escherichia coli با موفقیت استفاده شده است. ویتامین ها با استفاده از Propionibacterium و Pseudomonas سنتز شده است; اسیدهای آلی از آسپرژیلوس مشتق شده, لاکتوباسیلوس, ریزوپوس; در حالی که آنزیم ها می توانند توسط آسپرژیلوس و باسیلوس ساخته شوند. آنتی بیوتیک ها را می توان توسط Streptomyces و Penicillium تولید کرد. در حالی که برای تولید بیوسورفکتانت ها معمولا تشکیل شده Pseudomonas، Bacillus و Lactobacillus به عنوان کارخانه های سلولی استفاده می شوند.
E. coli به عنوان کارخانه های سلول میکروبی
باکتری های E. coli و سویه های متعدد آن به طور گسترده ای مورد استفاده قرار می گیرند و به عنوان یکی از اولین مدل های سلولی کارآمد مورد استفاده در کارخانه های سلول میکروبی برای تولید پروتئین های نوترکیب، سوخت های زیستی و مواد شیمیایی مختلف دیگر قرار گرفته است. E. coli دارای توانایی طبیعی در تولید چندین ترکیب است که با مهندسی زیستی و تغییرات ژنتیکی بهبود یافته است. به عنوان مثال، با انتقال آنزیم های هترولوگ، توانایی E.coli برای تولید محصولات متعدد به منظور توسعه مسیرهای بیوسنتزی جدید اصلاح شده است.
(Antonio Valle, Jorge Bolívar: Chapter 8 – Escherichia coli, the workhorse cell factory for the production of chemicals. In: Editor(s): Vijai Singh, Microbial Cell Factories Engineering for Production of Biomolecules, Academic Press, 2021. 115-137.)
Streptomyces به عنوان کارخانه های سلول های میکروبی
استرپتومیسس بزرگترین گروه اکتینومیست ها است. گونه های Streptomyces در اکوسیستم های آبی و خشکی گسترده هستند. اعضای جنس Streptomyces به دلیل ظرفیت آنها در تولید تعداد زیادی از مولکول های زیستی و متابولیت های ثانویه فعال زیستی، مورد توجه تجاری هستند. آنتی بیوتیک های بالینی مفید مانند تتراسایکلین ها ، آمینوگلیکوزیدها ، ماکرولیدها ، کلرامفنیکل و ریفامایسین ها تولید می کند. علاوه بر آنتی بیوتیک ها، استرپتومیسس محصولات دارویی بسیار ارزشمند دیگری از جمله ضد سرطان، محرک سیستم ایمنی، سرکوب کننده سیستم ایمنی، عوامل آنتی اکسیدانی، حشره کش ها و داروهای ضد انگلی را نیز تولید می کند که کاربردهای پزشکی و کشاورزی گسترده ای دارند.
گونه های استرپتومیسس طیف وسیعی از آنزیم ها را تولید می کنند که از نظر پزشکی مهم هستند، از جمله ال-آسپاراژیناز، اوریکاز و کلسترول اکسیداز. بسیاری از اکتینومیست ها می توانند آنزیم های مهم صنعتی مانند سلولازها، کیتینازها، کیتوزانازها، α-آمیلازها، پروتئازها و لیپازها تولید کنند. بسیاری از اکتینومیست ها می توانند رنگدانه های مختلفی تولید کنند که به طور بالقوه جایگزین خوبی برای رنگ های مصنوعی هستند. گونه های استرپتومایسس ظرفیت بالایی برای تولید مولکول های زیستی فعال سطحی از جمله امولسیون کننده های زیستی و بیوسورفکتانت ها دارند. آکاربوز ضد دیابتی توسط سویه های استرپتومایسس از طریق تخمیر میکروبی تولید شد. گونه های Streptomyces توانایی سنتز مهارکننده های سنتز کلسترول مانند پراواستاتین را نشان داده اند. اخیرا گونه های استرپتومایسس می توانند به عنوان "نانوکارخانه" سازگار با محیط زیست برای سنتز نانوذرات مورد استفاده قرار گیرند. برخی از گونه های استرپتومایسس برای تولید ویتامین B12 امیدوار کننده هستند.
(Noura El-Ahmady El-Naggar: Chapter 11 – Streptomyces-based cell factories for production of biomolecules and bioactive metabolites, In: Editor(s): Vijai Singh, Microbial Cell Factories Engineering for Production of Biomolecules, Academic Press, 2021. 183-234.)
Hielscher مافوق صوت تولید کننده هموژنایزرهای مافوق صوت با کارایی بالا از ازمایشگاه ها تا اندازه صنعتی.