لیز فراصوتی سلولهای مهندسیشده زیستی در تولید صنعتی
گونههای باکتریایی مهندسیشده زیستی مانند E. coli و همچنین انواع سلولهای پستانداران و گیاهان که اصلاح ژنتیکی شدهاند، بهطور گسترده در زیستفناوری برای بیان مولکولها به کار میروند. برای آزادسازی این زیستمولکولهای سنتزشده، به یک روش قابلاعتماد برای تخریب سلولی نیاز است. فراصوتدهی با عملکرد بالا، روشی اثباتشده برای لیز کارآمد و قابلاعتماد سلولهاست – که بهراحتی میتوان مقیاس آن را برای ظرفیتهای پردازش بالا افزایش داد. Hielscher Ultrasonics تجهیزات فراصوتی با عملکرد بالا را برای لیز مؤثر سلولی در اختیار شما قرار میدهد تا حجم زیادی از زیستمولکولهای باکیفیت تولید کنید.
استخراج مولکولها از کارخانههای سلولی
برای تولید طیف گستردهای از زیستمولکولها، میتوان از میکروبهای مهندسیشده و سلولهای گیاهی گوناگون بهعنوان کارخانههای سلولی میکروبی استفاده کرد؛ از جمله Escherichia coli، Bacillus subtilis، Pseudomonas putida، Streptomyces، Corynebacterium glutamicum، Lactococcus lacti، Cyanobacteria، Saccharomyces cerevisiae، Pichia pastoris، Yarrowia lipolytica، Nicotiana benthamiana و جلبکها، در کنار بسیاری موارد دیگر. این کارخانههای سلولی میتوانند پروتئینها، لیپیدها، مواد زیستشیمیایی، پلیمرها، سوختهای زیستی و مواد شیمیایی مشتق از روغنها و چربیها را تولید کنند که بهعنوان غذا یا ماده اولیه در کاربردهای صنعتی استفاده میشوند. سلولهایی که بهعنوان کارخانه سلولی به کار میروند، در زیستراکتورهای بسته کشت میشوند؛ در این محیطها میتوانند به کارایی و اختصاصیت بالا و نیاز انرژی کم دست یابند.
برای جداسازی مولکولهای هدف از کشتهای سلولی مهندسیشده زیستی، باید سلولها تخریب شوند تا مواد درونسلولی آزاد شوند. استفاده از تخریبکنندههای سلولی فراصوتی، روشی کاملاً جاافتاده، بسیار قابلاعتماد و کارآمد برای متلاشیسازی سلولها و آزادسازی ترکیبات است.
متلاشیکنندههای سلولی فراصوتی مانند UIP2000hdT برای جداسازی ترکیبات از کارخانههای سلولی میکروبی به کار میروند.
کارخانههای سلولی میکروبی، سلولهایی با متابولیسم مهندسیشده هستند که برای سنتز ترکیبات ارزشمند گوناگون به کار میروند. تخریب سلولی فراصوتی، روشی کارآمد و قابلاعتماد برای آزادسازی ترکیبات ارزشمند از درون سلول است.
پژوهش و تصویر: ©Villaverde, 2010.
مزایای تخریبکنندههای سلولی فراصوتی
تخریبکنندههای فراصوتی، بهعنوان فناوری غیرحرارتی، ملایم و درعینحال بسیار کارآمد، در آزمایشگاه و صنعت برای لیز سلولها و تولید عصارههای باکیفیت به کار میروند؛ برای مثال، برای جداسازی مولکولها از کارخانههای سلولی استفاده میشوند.
- کارایی بالا
- غیرحرارتی، ایدئال برای مواد حساس به دما
- نتایج قابلاعتماد و تکرارپذیر
- کنترل دقیق پردازش
- قابلیت افزایش مقیاس خطی برای ظرفیتهای پردازش بالاتر
- قابلارائه برای ظرفیتهای تولید صنعتی
فراصوت پرتوان برای تخریب کارآمد کارخانههای سلولی میکروبی
سازوکار و اثرات تخریبکنندههای سلولی فراصوتی:
تخریب سلولی فراصوتی از توان امواج فراصوت استفاده میکند. هموژنایزر فراصوتی / تخریبکننده سلولی به پروبی از آلیاژ تیتانیوم مجهز است که سونوتْرود نیز نامیده میشود و با فرکانس بالای حدود 20 kHz نوسان میکند. این یعنی پروب فراصوتی در هر ثانیه 20٬000 ارتعاش را به مایع تحت فراصوتدهی منتقل میکند. امواج فراصوت منتقلشده به مایع، با چرخههای متناوب فشار بالا / فشار پایین مشخص میشوند. در طول چرخه فشار پایین، مایع منبسط میشود و حبابهای خلأ بسیار ریزی پدید میآیند. این حبابهای بسیار کوچک طی چندین چرخه فشار متناوب رشد میکنند تا دیگر نتوانند انرژی بیشتری جذب کنند. در این مرحله، حبابهای کاویتاسیون بهشدت به درون فرومیپاشند و بهصورت موضعی محیطی با چگالی انرژی فوقالعاده بالا ایجاد میکنند. این پدیده کاویتاسیون آکوستیکی نام دارد و با دماهای موضعی بسیار بالا، فشارهای بسیار بالا و نیروهای برشی مشخص میشود. این تنشهای برشی، دیوارههای سلولی را بهطور مؤثر میشکنند و انتقال جرم میان درون سلول و حلال پیرامون آن را افزایش میدهند. استفاده از نیروهای برشی ایجادشده با فراصوت، بهعنوان روشی کاملاً مکانیکی، رواج گستردهای دارد و روشی توصیهشده برای تخریب سلولهای باکتریایی و نیز جداسازی پروتئین است. فراصوتدهی بهعنوان روشی ساده و سریع برای تخریب سلولی، برای جداسازی در حجمهای کوچک، متوسط و بزرگ ایدئال است. دستگاههای فراصوت دیجیتال Hielscher به منوی تنظیمات روشن و قابلفهمی برای کنترل دقیق فراصوتدهی مجهز هستند. همه دادههای فراصوتدهی بهطور خودکار روی کارت SD داخلی ذخیره میشوند و بهسادگی در دسترس قرار میگیرند. گزینههای پیشرفته دفع گرما، مانند خنکسازی خارجی، فراصوتدهی در حالت پالسی و موارد دیگر، در طول فرایند متلاشیسازی فراصوتی، حفظ دمای ایدئال فرایند و در نتیجه سالمماندن ترکیبات استخراجشده حساس به گرما را تضمین میکنند.
پژوهشها بر نقاط قوت تخریب سلولی و استخراج فراصوتی تأکید میکنند
پروفسور Chemat et al. (2017) در مطالعه خود چنین جمعبندی میکنند: «استخراج به کمک فراصوت، جایگزینی سبز و از نظر اقتصادی مقرونبهصرفه برای روشهای متداول در زمینه مواد غذایی و محصولات طبیعی است. مزایای اصلی آن عبارتاند از کاهش زمان استخراج و پردازش، مقدار انرژی و حلالهای مصرفی، عملیات واحد و انتشار CO2 .»
Gabig-Ciminska et al. (2014) در مطالعه خود از یک هموژنایزر فشار بالا و یک متلاشیکننده سلولی فراصوتی برای لیز اسپورها بهمنظور آزادسازی DNA استفاده کردند. گروه پژوهشی با مقایسه این دو روش تخریب سلولی، درباره لیز سلولی برای دستیابی به DNA اسپورها چنین نتیجهگیری میکند: «تجزیهوتحلیل با استفاده از لیزاتهای سلولی حاصل از هموژنسازی فشار بالا انجام شده است. پس از آن دریافتیم که تخریب سلولی فراصوتی برای این منظور مزایای برجستهای دارد. این روش نسبتاً سریع است و میتوان آن را برای حجمهای کوچک نمونه به کار برد.» (Gabig-Ciminska et al., 2014)
متلاشیکننده سلولی فراصوتی صنعتی UIP4000hdT (4000W, 20kHz) برای جداسازی و خالصسازی پیوسته و درونخطی ترکیبات سنتزشده از کارخانههای سلولی میکروبی.
زیستمولکولهای حاصل از کارخانههای سلولی برای تولید مواد غذایی
کارخانههای سلولی میکروبی، روشی عملی و کارآمد برای تولید هستند که با استفاده از جانداران میکروبی و از طریق مهندسی زیستی متابولیسم میکروارگانیسمهایی مانند باکتریها، مخمرها، قارچها و غیره، متابولیتهای بومی و غیربومی را با بازده بالا تولید میکنند. برای مثال، آنزیمها در حجم انبوه با استفاده از میکروارگانیسمهایی مانند Aspergillus oryzae، قارچها و باکتریها تولید میشوند. این آنزیمهای تولیدشده در حجم انبوه، در تولید غذا و نوشیدنی و همچنین در کشاورزی، زیستانرژی و محصولات مراقبت و نظافت خانگی به کار میروند.
باکتریهای خاصی مانند Acetobacter xylinum و Gluconacetobacter xylinus طی فرایند تخمیر سلولز تولید میکنند؛ در این فرایند، نانوالیاف با رویکرد پایینبهبالا سنتز میشوند. سلولز باکتریایی که سلولز میکروبی نیز نامیده میشود، از نظر شیمیایی معادل سلولز گیاهی است، اما درجه بلورینگی و خلوص بالایی دارد و فاقد لیگنین، همیسلولز، پکتین و دیگر اجزای زیستزاد است. همچنین دارای ساختاری منحصربهفرد از یک شبکه مشبک سهبعدی (3D) بافتهشده از نانوالیاف سلولز است. (رجوع کنید به Zhong, 2020) در مقایسه با سلولز حاصل از گیاهان، سلولز باکتریایی از نظر پایداری زیستمحیطی مطلوبتر است و سلولز تولیدشده خالص است و به مراحل پیچیده خالصسازی نیاز ندارد. فراصوتدهی و استخراج با حلال با استفاده از NaOH یا SDS (سدیم دودسیل سولفات)، برای جداسازی سلولز باکتریایی از سلولهای باکتری بسیار مؤثر هستند.
زیستمولکولهای حاصل از کارخانههای سلولی برای تولید دارو و واکسن
یکی از برجستهترین محصولات دارویی حاصل از کارخانههای سلولی، انسولین انسانی است. برای تولید انسولین با مهندسی زیستی، عمدتاً از E. coli و Saccharomyces cerevisiae استفاده میشود. از آنجا که مولکولهای زیستسنتزشده در اندازه نانو، زیستسازگاری بالایی دارند، نانوذرات زیستی مانند فریتین برای کاربردهای متعدد تولید زیستی سودمند هستند. افزون بر این، تولید در میکروبهایی با متابولیسم مهندسیشده، اغلب از نظر بازده حاصل بهطور چشمگیری مؤثرتر است. برای مثال، تولید اسید آرتمیسینیک، رسوراترول و لیکوپن از ده برابر تا چند صد برابر افزایش یافته است و تولید آنها در مقیاس صنعتی هماکنون برقرار شده یا در دست توسعه است. (رجوع کنید به Liu et al.; Microb. Cell Fact. 2017)
برای مثال، زیستمولکولهای پروتئینی در اندازه نانو با ویژگی خودآرایی، مانند فریتین و ذرات شبهویروسی، برای توسعه واکسن بهویژه جالبتوجه هستند؛ زیرا هم اندازه و هم ساختار عوامل بیماریزا را تقلید میکنند و امکان اتصال آنتیژنها به سطح آنها وجود دارد تا برهمکنش با سلولهای ایمنی تقویت شود. چنین مولکولهایی در ساختارهایی موسوم به کارخانههای سلولی، مانند سویههای مهندسیشده E. coli، بیان میشوند که یک مولکول هدف مشخص را تولید میکنند.
پروتکل لیز فراصوتی E. coli BL21 برای آزادسازی فریتین
فریتین پروتئینی است که کارکرد اصلی آن ذخیرهسازی آهن است. فریتین در قالب نانوذرات خودآرا در واکسنها قابلیتهای امیدبخشی نشان میدهد و در آنها بهعنوان حامل رسانش واکسن، برای مثال پروتئینهای اسپایک SARS-Cov-2، به کار میرود. پژوهش علمی Sun et. al. (2016) نشان میدهد که فریتین نوترکیب را میتوان در غلظتهای پایین NaCl (≤50 mmol/L) بهشکل محلول از Escherichia coli آزاد کرد. برای بیان فریتین در E. coli BL21 و آزادسازی آن، پروتکل زیر با موفقیت اجرا شد. پلاسمید نوترکیب pET-28a/ferritin از طریق ترانسفورماسیون به سویه E coli BL21 (DE3) وارد شد. سلولهای E coli BL21 (DE3) حاوی فریتین، در محیط کشت رشد LB دارای 0٫5% کانامایسین در 37°C کشت داده شدند و در OD600 برابر با 0٫6، با 0٫4% ایزوپروپیل-β-D-تیوگالاکتوپیرانوزید بهمدت 3 ساعت در 37°C القا شدند. سپس کشت نهایی با سانتریفیوژ در 8000g بهمدت 10 دقیقه در 4°C برداشت و رسوب جمعآوری شد. پس از آن، رسوب بهترتیب در محیط LB (1% NaCl، 1% Typone، 0٫5% عصاره مخمر)/بافر لیز (20 mmol/L Tris، 50 mmol/L NaCl، 1 mmol/L EDTA، pH 7٫6) و محلول NaCl با غلظتهای مختلف (0، 50، 100، 170 و 300 mmol/L) دوباره معلق شد. برای لیز سلولهای باکتریایی، فراصوتدهی در حالت پالسی اعمال شد؛ برای مثال، با استفاده از دستگاه فراصوت UP400St با دامنه 100% و چرخه کاری 5 ثانیه روشن، 10 ثانیه خاموش، بهمدت 40 چرخه) و سپس سانتریفیوژ در 10 000g بهمدت 15 دقیقه در 4°C انجام شد. مایع رویی و رسوب با الکتروفورز ژل پلیآکریلآمید در حضور سدیم دودسیل سولفات (SDS-PAGE) تجزیهوتحلیل شدند. همه ژلهای رنگآمیزیشده با سدیم دودسیل سولفات، با اسکنر با وضوح بالا اسکن شدند. تصاویر ژل با نرمافزار Magic Chemi 1D تجزیهوتحلیل شدند. برای دستیابی به وضوح بهینه، باندهای پروتئینی با تنظیم پارامترها شناسایی شدند. دادههای مربوط به باندها از سه تکرار فنی به دست آمدند. (رجوع کنید به Sun et al., 2016)
تخریبکنندههای سلولی فراصوتی برای لیز صنعتی کارخانههای سلولی
لیز و استخراج فراصوتی، روشی قابلاعتماد و آسان برای آزادسازی متابولیتها از کارخانههای سلولی است و از این طریق به تولید مؤثر مولکولهای هدف کمک میکند. تخریبکنندههای سلولی فراصوتی در ابعاد آزمایشگاهی تا صنعتی عرضه میشوند و مقیاس فرایندها را میتوان بهصورت کاملاً خطی افزایش داد.
Hielscher Ultrasonics شریک توانمند شما در زمینه تخریبکنندههای فراصوتی با عملکرد بالاست و تجربهای طولانی در استقرار سامانههای فراصوتی در محیطهای رومیزی و صنعتی دارد.
از نظر سختافزار و نرمافزار پیشرفته، سامانههای تخریب سلولی Hielscher Ultrasonics همه الزامات مربوط به کنترل بهینه فرایند، کاربری آسان و کاربرپسندی را برآورده میکنند. مشتریان و کاربران دستگاههای فراصوت Hielscher برای این مزیت ارزش قائلاند که تخریبکنندهها و استخراجکنندههای سلولی فراصوتی Hielscher، پایش و کنترل دقیق فرایند را از طریق نمایشگر لمسی دیجیتال و کنترل از راه دور با مرورگر امکانپذیر میکنند. همه دادههای مهم فراصوتدهی، مانند انرژی خالص، انرژی کل، دامنه، مدت، دما و فشار، بهطور خودکار بهصورت فایل CSV روی کارت SD داخلی ذخیره میشوند. این امر به دستیابی به نتایج بازتولیدپذیر و تکرارپذیر کمک میکند و استانداردسازی فرایند و نیز رعایت اصول روشهای خوب تولید (cGMP) را تسهیل میسازد.
البته پردازشگرهای فراصوتی Hielscher برای کارکرد 24/7 تحت بار کامل ساخته شدهاند و بنابراین میتوان آنها را بهطور قابلاعتماد در محیطهای تولید صنعتی به کار گرفت. بهدلیل استحکام بالا و نیاز کم به نگهداری، زمان توقف تجهیزات فراصوتی بسیار کم است. قابلیتهای CIP (شستوشو در محل) و SIP (استریلسازی در محل) نیاز به تمیزکاری پرزحمت را به حداقل میرسانند، بهویژه به این دلیل که همه قطعات در تماس با مایع دارای سطوح فلزی صاف هستند و هیچ روزنه یا نازل پنهانی ندارند.
جدول زیر نمایی از ظرفیت تقریبی پردازش دستگاههای فراصوت ما را به شما نشان میدهد:
| حجم بچ | دبی | دستگاههای پیشنهادی |
|---|---|---|
| 1 تا 500mL | 10 تا 200mL/min | UP100H |
| 10 تا 2000mL | 20 تا 400mL/min | UP200Ht, UP400St |
| 0٫1 تا 20L | 0٫2 تا 4L/min | UIP2000hdT |
| 10 تا 100L | 2 تا 10L/min | UIP4000hdT |
| قابلاعمال نیست | 10 تا 100L/min | UIP16000 |
| قابلاعمال نیست | بیشتر | مجموعهای از دستگاههای UIP16000 |
با ما تماس بگیرید! / از ما بپرسید!
منابع علمی / مراجع
- Sun, W., Jiao, C., Xiao, Y., Wang, L., Yu, C., Liu, J., Yu, Y., Wang, L. (2016):Salt-Dependent Aggregation and Assembly of E Coli-Expressed Ferritin. Dose-Response, March 2016.
- Rodrigues, M.Q.; Alves, P.M.; Roldão, A. (2021): Functionalizing Ferritin Nanoparticles for Vaccine Development. Pharmaceutics 2021, 13, 1621.
- Farid Chemat, Natacha Rombaut, Anne-Gaëlle Sicaire, Alice Meullemiestre, Anne-Sylvie Fabiano-Tixier, Maryline Abert-Vian (2017): Ultrasound assisted extraction of food and natural products. Mechanisms, techniques, combinations, protocols and applications. A review. Ultrasonics Sonochemistry, Volume 34, 2017. 540-560.
- Villaverde, Antonio (2010): Nanotechnology, bionanotechnology and microbial cell factories. Microbial Cell Factories 2010 9:53.
دانستنیهای مفید
زیستراکتورهای فراصوتی
فراصوت از یک سو برای تخریب سلولها بهمنظور آزادسازی ترکیبات درونسلولی به کار میرود، اما اگر با دامنههای ملایمتر و / یا بهصورت قطارهای پالسی فراصوت اعمال شود، فراصوتدهی میتواند بهرهوری متابولیکی سلولهای میکروبی، گیاهی و جانوری را در زیستراکتورها بهطور چشمگیری افزایش دهد و در نتیجه فرایندهای زیستفناوری را تقویت کند. پروبهای فراصوتی را میتوان بهسادگی در زیستراکتورها، موسوم به زیستراکتورهای فراصوتی، یکپارچه کرد تا کارایی زیستکاتالیزورهای زنده افزایش یابد. دستگاههای فراصوت Hielscher امکان ایجاد شرایط فراصوتی با کنترل دقیق را فراهم میکنند؛ شرایطی که میتوان آنها را بهطور بهینه برای دستیابی به تبدیل کاتالیزوری بالای سلولهای زنده تنظیم کرد. درباره پروبهای فراصوتی Hielscher برای زیستراکتورهای فراصوتی و اثرات زیستکاتالیز تقویتشده با فراصوت بیشتر بدانید!
کارخانههای سلولی و سنتز متابولیتها
میکروارگانیسمهای گوناگون میتوانند متابولیتهای مشابهی سنتز کنند؛ برای مثال، برای تولید اسیدهای آمینه از Corynebacterium، Brevibacterium و Escherichia coli با موفقیت استفاده شده است؛ ویتامینها با استفاده از Propionibacterium و Pseudomonas سنتز شدهاند؛ اسیدهای آلی از Aspergillus، Lactobacillus و Rhizopus به دست میآیند؛ آنزیمها را میتوان با Aspergillus و Bacillus تولید کرد؛ آنتیبیوتیکها را میتوان با Streptomyces و Penicillium تولید کرد؛ و برای تولید زیستسورفکتانتها، معمولاً از Pseudomonas، Bacillus و Lactobacillus بهعنوان کارخانههای سلولی استفاده میشود.
E. Coli بهعنوان کارخانههای سلولی میکروبی
باکتری E. coli و سویههای متعدد آن بهطور گسترده در زیستشناسی مولکولی به کار میروند و این باکتری به یکی از نخستین مدلهای سلولی کارآمد تبدیل شده است که بهعنوان کارخانههای سلولی میکروبی برای تولید پروتئینهای نوترکیب، سوختهای زیستی و مواد شیمیایی گوناگون دیگر استفاده میشود. E. coli توانایی طبیعی تولید چندین ترکیب را دارد که با مهندسی زیستی و اصلاحات ژنتیکی بهبود یافته است. برای مثال، با انتقال آنزیمهای هترولوگ، قابلیت E.coli در تولید محصولات متعدد تغییر داده شده است تا مسیرهای زیستسنتزی جدید توسعه یابند.
(Antonio Valle, Jorge Bolívar: Chapter 8 – Escherichia coli, the workhorse cell factory for the production of chemicals. In: Editor(s): Vijai Singh, Microbial Cell Factories Engineering for Production of Biomolecules, Academic Press, 2021. 115-137.)
Streptomyces بهعنوان کارخانههای سلولی میکروبی
Streptomyces بزرگترین گروه اکتینومیستهاست؛ گونههای Streptomyces در زیستبومهای آبی و خشکی پراکندگی گستردهای دارند. اعضای سرده Streptomyces بهدلیل توانایی تولید تعداد بسیار زیادی از زیستمولکولها و متابولیتهای ثانویه زیستفعال، از نظر تجاری مورد توجه هستند. این سرده آنتیبیوتیکهای مفید در کاربردهای بالینی، مانند تتراسایکلینها، آمینوگلیکوزیدها، ماکرولیدها، کلرامفنیکل و ریفامایسینها را تولید میکند. افزون بر آنتیبیوتیکها، Streptomyces محصولات دارویی بسیار ارزشمند دیگری نیز تولید میکند، از جمله عوامل ضدسرطان، محرک ایمنی، سرکوبکننده ایمنی و آنتیاکسیدانی، حشرهکشها و داروهای ضدانگل که کاربردهای گستردهای در پزشکی و کشاورزی دارند.
گونههای Streptomyces طیفی از آنزیمهای مهم از نظر پزشکی، از جمله L-آسپاراژیناز، اوریکاز و کلسترول اکسیداز را تولید میکنند. بسیاری از اکتینومیستها میتوانند آنزیمهای مهم صنعتی، مانند سلولازها، کیتینازها، کیتوزانازها، α-آمیلاز، پروتئازها و لیپازها را تولید کنند. بسیاری از اکتینومیستها میتوانند رنگدانههای گوناگونی تولید کنند که بالقوه جایگزین مناسبی برای رنگهای سنتزی هستند. گونههای Streptomyces ظرفیت بالایی برای تولید زیستمولکولهای فعال سطحی، از جمله زیستامولسیونکنندهها و زیستسورفکتانتها دارند. آکاربوز ضددیابت با استفاده از سویههای Streptomyces و از طریق تخمیر میکروبی تولید شده است. گونههای Streptomyces توانایی سنتز مهارکنندههای سنتز کلسترول، مانند پراواستاتین، را نشان دادهاند. اخیراً امکان استفاده از گونههای Streptomyces بهعنوان «نانوکارخانههای» سازگار با محیطزیست برای سنتز نانوذرات فراهم شده است. برخی گونههای Streptomyces برای تولید ویتامین B12 امیدبخش هستند.
(Noura El-Ahmady El-Naggar: Chapter 11 – Streptomyces-based cell factories for production of biomolecules and bioactive metabolites, In: Editor(s): Vijai Singh, Microbial Cell Factories Engineering for Production of Biomolecules, Academic Press, 2021. 183-234.)
Hielscher Ultrasonics هموژنایزرهای فراصوتی با عملکرد بالا را در ابعاد آزمایشگاهی تا صنعتی تولید میکند.
