چگونه فراصوت‌دهی می‌تواند عملکرد لیزوزیم را برای لیز سلول‌های باکتریایی به‌شدت تقویت کند
، Kathrin Hielscher، منتشرشده در اخبار Hielscher
باز کردن سلول‌های باکتریایی مرحله‌ای حیاتی در زیست‌فناوری، پژوهش‌های دارویی و تولید پروتئین است. یکی از رایج‌ترین ابزارها برای این کار، لیزوزیم است؛ آنزیمی که دیوارهٔ سلولی باکتری‌ها را تضعیف می‌کند. بااین‌حال، لیزوزیم با وجود اثربخشی، اغلب به‌تنهایی سرعت یا قدرت کافی ندارد – به‌ویژه هنگام کار با کشت‌های متراکم یا باکتری‌هایی که برای بیش‌بیان پروتئین‌ها مهندسی شده‌اند.
اینجاست که فراصوت‌دهی وارد عمل می‌شود. پژوهشگران به‌طور فزاینده‌ای از پردازش فراصوتی برای بهبود چشمگیر لیز سلولی مبتنی بر لیزوزیم استفاده می‌کنند. لیزوزیم و فراصوت‌دهی در کنار هم سامانه‌ای مکمل و بسیار کارآمد تشکیل می‌دهند که نتایجی سریع‌تر، کامل‌تر و تکرارپذیرتر به دست می‌دهد.
چرا لیزوزیم به‌تنهایی اغلب کافی نیست
لیزوزیم با تجزیهٔ پپتیدوگلیکان، یکی از اجزای ساختاری اصلی دیوارهٔ سلولی باکتری‌ها، عمل می‌کند. این روش آنزیمی ملایم است و به‌ویژه برای E. coli کاربرد گسترده‌ای دارد. بااین‌حال، در شرایط واقعی آزمایشگاه، تیمار با لیزوزیم به‌تنهایی می‌تواند محدودیت‌هایی داشته باشد.
چالش‌های رایج عبارت‌اند از:
- تخریب سلولی ناقص در کشت‌های با تراکم بالا یا دارای تجمعات سلولی
- زمان‌های طولانی انکوباسیون
- کاهش اثربخشی در باکتری‌های دارای بیش‌بیان یا سازگاری‌یافته با تنش
- تغییرپذیری بین بچ‌ها
این محدودیت‌ها می‌توانند بر فرایندهای پایین‌دستی مانند استخراج پروتئین، شفاف‌سازی و خالص‌سازی اثر منفی بگذارند – و در نهایت بازده و یکنواختی نتایج را کاهش دهند.
مبانی علمی هم‌افزایی لیزوزیم و فراصوت‌دهی
فراصوت‌دهی امواج فراصوتی با شدت بالا را وارد نمونهٔ مایع می‌کند. این امواج حباب‌های میکروسکوپی ایجاد می‌کنند که در فرایندی موسوم به کاویتاسیون به‌سرعت فرومی‌پاشند. نیروهای برشی، تغییرات فشار و ریزجت‌های حاصل، ساختارهای سلولی را به‌صورت فیزیکی تخریب می‌کنند.
هنگامی که فراصوت‌دهی پس از تیمار با لیزوزیم – یا هم‌زمان با آن – انجام می‌شود، این دو روش از چند طریق مهم یکدیگر را تقویت می‌کنند:
- دسترسی آسان‌تر به دیوارهٔ سلولی
لیزوزیم دیوارهٔ سلولی باکتری را تضعیف می‌کند و آن را در برابر نیروهای مکانیکی ناشی از فراصوت بسیار آسیب‌پذیرتر می‌سازد. - لیز سلولی سریع‌تر
انرژی فراصوتی در مقایسه با تیمار آنزیمی به‌تنهایی، زمان لازم برای دستیابی به تخریب کامل سلولی را به‌شدت کاهش می‌دهد. - پردازش یکنواخت‌تر
فراصوت‌دهی اختلاط را بهبود می‌بخشد و تضمین می‌کند که همهٔ سلول‌ها به‌طور یکنواخت در معرض لیزوزیم و تنش مکانیکی قرار گیرند. - بازده بالاتر پروتئین
لیز کامل‌تر به معنای آزادسازی بیشتر پروتئین‌ها، آنزیم‌ها و متابولیت‌های درون‌سلولی است – که بازیابی کلی را بهبود می‌بخشد.
روند کاری معمول فراصوت‌دهی به کمک لیزوزیم
در آزمایشگاه‌هایی که با سویه‌های باکتریایی دارای بیش‌بیان کار می‌کنند، یک روند کاری تثبیت‌شده، لیز آنزیمی و فراصوتی را با هم ترکیب می‌کند:
- معلق‌سازی مجدد سلول‌ها
رسوب‌های باکتریایی جمع‌آوری‌شده در یک بافر لیز مناسب حاوی لیزوزیم، معمولاً با غلظت‌های 0٫1–1 mg/mL، مجدداً معلق می‌شوند. فراصوت‌دهی ملایم به معلق‌سازی مجدد سریع و یکنواخت سلول‌ها کمک می‌کند. - پیش‌تیمار آنزیمی
سوسپانسیون به مدت 10–30 دقیقه در دماهای کنترل‌شده (معمولاً بین 4 °C و 25 °C) انکوبه می‌شود تا لیزوزیم فرصت تضعیف دیوارهٔ سلولی را داشته باشد. - تخریب فراصوتی
سوسپانسیون پیش‌تیمارشده با استفاده از پردازشگر فراصوتی Hielscher و با دامنه، حالت پالسی و سرمایش بهینه‌شده تحت فراصوت‌دهی قرار می‌گیرد. - شفاف‌سازی
بقایای سلولی با سانتریفیوژ یا فیلتراسیون حذف می‌شوند و لیزاتی شفاف‌شده و غنی از پروتئین‌های هدف باقی می‌ماند.
چرا پژوهشگران سونیکاتورهای Hielscher را انتخاب می‌کنند
دستگاه‌های فراصوتی Hielscher به دلیل دقت و انعطاف‌پذیری، برای لیز سلولی به کمک لیزوزیم بسیار مناسب‌اند. مزایای اصلی عبارت‌اند از:
- دامنه و انرژی ورودی قابل تنظیم برای پردازش تکرارپذیر
- کارکرد در حالت پالسی برای کاهش تجمع گرما
- کاویتاسیون کارآمد در گسترهٔ وسیعی از حجم‌ها و گرانروی‌ها
- افزایش آسان مقیاس از نمونه‌های آزمایشگاهی میکرولیتری تا تولید صنعتی
این ترکیب، سامانه‌های Hielscher را به ابزارهایی ارزشمند هم در آزمایشگاه‌های پژوهشی و هم در محیط‌های تولید در مقیاس بزرگ تبدیل می‌کند.
سونیکاتور پلیت چندخانه‌ای UIP400MTP برای آماده‌سازی نمونه با ظرفیت پردازش بالا
عوامل کلیدی برای بهینه‌سازی نتایج
برای بهره‌گیری حداکثری از فراصوت‌دهی به کمک لیزوزیم، پژوهشگران چندین پارامتر را با دقت تنظیم می‌کنند:
- غلظت لیزوزیم: برای کنترل هزینه‌ها و به حداقل رساندن تداخل در مراحل پایین‌دستی، از کمترین دوز مؤثر استفاده کنید.
- انرژی فراصوتی: توان کافی اعمال کنید تا لیز کامل بدون آسیب رساندن به پروتئین‌های حساس تضمین شود.
- مدیریت دما: سامانه‌های سرمایش یا حمام‌های یخ به محافظت از مواد هدف حساس به گرما کمک می‌کنند.
- تنظیمات پالس: فراصوت‌دهی متناوب، کارایی کاویتاسیون و پایداری نمونه را بهبود می‌بخشد.
لیزوزیم‌ها را با فراصوت‌دهی تقویت کنید!
ترکیب لیزوزیم با تخریب فراصوتی، راهکاری قابل‌اعتماد و با عملکرد بالا برای لیز سلول‌های باکتریایی فراهم می‌کند. فراصوت‌دهی اثربخشی تیمار آنزیمی را افزایش می‌دهد و پردازش سریع‌تر، تخریب کامل‌تر و بازده بالاتر محصولات درون‌سلولی را به همراه دارد.
با سامانه‌های فراصوتی دارای قابلیت کنترل دقیق و افزایش مقیاس، مانند سامانه‌های Hielscher، پژوهشگران می‌توانند روندهای کاری خود را برای پاسخ‌گویی به نیازهای زیست‌فناوری مدرن به‌دقت تنظیم کنند – چه در یک آزمایشگاه کوچک و چه در یک خط تولید صنعتی.
لیز باکتری‌ها با ظرفیت پردازش بالا با سونیکاتور میکروپلیت UIP400MTP
منابع علمی / مراجع
- Ghosh, A., Bhar, K. & Siddhanta, A. (2019): Oxygen sequestration by Leghemoglobin is positively regulated via its interaction with another late nodulin, Nlj16 of Lotus japonicus. Journal of Plant Biochemistry and Biotechnology 28, 2019. 414–423.
- Hannah K. Lembke; Adeline Espinasse; Mckenna G. Hanson; Christian J. Grimme;Zhe Tan; Theresa M. Reineke; Erin E. Carlson (2023): Cationic Polymers Enable Internalization of Negatively Charged Chemical Probes into Bacteria. ACS Chem Biol . 2023 September 15; 18(9): 2063–2072.
- Müller MRA, Ehrmann MA, Vogel RF (2000): Multiplex PCR for the Detection ofLactobacillus pontis and Two Related Species in a Sourdough Fermentation. Applied Environmental Microbiology 66, 2000.
- Di Giosia, Matteo; Bomans, Paul; Bottoni, Andrea; Cantelli, Andrea; Falini, Giuseppe; Franchi, Paola; Guarracino, Giuseppe; Friedrich, Heiner; Lucarini, Marco; Paolucci, Francesco; Rapino, Stefania; Sommerdijk, Nico; Soldà, Alice; valle, Francesco ; Zerbetto, Francesco; Calvaresi, Matteo (2018): Proteins as Supramolecular Hosts for C60: A True Solution of C60 in Water. Nanoscale 10(21); 2018.
پرسش‌های متداول
لیزوزیم‌ها چه هستند؟
لیزوزیم‌ها آنزیم‌های ضدمیکروبی هستند که هیدرولیز پیوندهای گلیکوزیدی β(1→4) را در پپتیدوگلیکان، یکی از اجزای ساختاری اصلی دیوارهٔ سلولی باکتری‌ها، کاتالیز می‌کنند و موجب تضعیف دیوارهٔ سلولی و لیز می‌شوند؛ به‌ویژه در باکتری‌های گرم‌مثبت و سلول‌های گرم‌منفی که نفوذپذیر شده‌اند.
مزایا و محدودیت‌های لیز سلولی با استفاده از لیزوزوم‌ها چیست؟
لیز سلولی با استفاده از لیزوزیم‌ها مزایایی مانند شرایط واکنش ملایم، حفظ عملکرد پروتئین و تنش مکانیکی کم دارد، اما سینتیک کند، لیز ناقص در کشت‌های باکتریایی متراکم یا مقاوم، اثربخشی کمتر در برابر غشاهای خارجی دست‌نخوردهٔ باکتری‌های گرم‌منفی و تغییرپذیری وابسته به فیزیولوژی سلول و شرایط رشد، آن را محدود می‌کنند.
فراصوت‌دهی چگونه عملکرد لیزوزیم‌ها را تقویت می‌کند؟
فراصوت‌دهی با تخریب مکانیکی و نفوذپذیر کردن دیوارهٔ سلولی باکتری‌ها از طریق نیروهای برشی ناشی از کاویتاسیون، فعالیت لیزوزیم را تقویت می‌کند؛ این امر دسترسی آنزیم به پپتیدوگلیکان را افزایش می‌دهد، سینتیک لیز را تسریع می‌کند و به تخریب سلولی کامل‌تر و یکنواخت‌تر می‌انجامد.
مدل‌های سونیکاتور چندنمونه‌ای Hielscher شامل UIP400MTP برای میکروپلیت‌ها، VialTweeter و CupHorn: آماده‌سازی نمونه با سرعت و ظرفیت پردازش بالا