تولید زیست‌سنتزی الیگوساکاریدهای شیر انسان
زیست‌سنتز الیگوساکاریدهای شیر انسان (HMOs) از طریق تخمیر یا واکنش‌های آنزیمی، فرایندی پیچیده، زمان‌بر و اغلب با بازده پایین است. فراصوت‌دهی انتقال جرم بین سوبسترا و کارخانه‌های سلولی را افزایش می‌دهد و رشد و متابولیسم سلول را تحریک می‌کند. به‌این‌ترتیب، فراصوت‌دهی فرایندهای تخمیر و بیوشیمیایی را تشدید می‌کند و موجب تولید سریع‌تر و کارآمدتر HMOs می‌شود.
الیگوساکاریدهای شیر انسان
الیگوساکاریدهای شیر انسان (HMOs)، که با نام گلیکان‌های شیر انسان نیز شناخته می‌شوند، مولکول‌های قندی متعلق به گروه الیگوساکاریدها هستند. نمونه‌های شاخص HMOs عبارت‌اند از 2’-فوکوزیل‌لاکتوز (2′-FL)، لاکتو-N-نئوتتراوز (LNnT)، 3’-گالاکتوزیل‌لاکتوز (3′-GL) و دی‌فوکوزیل‌لاکتوز (DFL).
با اینکه شیر مادر حاوی بیش از 150 ساختار متفاوت HMO است، در حال حاضر فقط 2′-فوکوزیل‌لاکتوز (2′-FL) و لاکتو-N-نئوتتراوز (LNnT) در سطح تجاری تولید می‌شوند و به‌عنوان افزودنی‌های تغذیه‌ای در شیر خشک نوزاد به کار می‌روند.
الیگوساکاریدهای شیر انسان (HMOs) به‌دلیل اهمیتشان در تغذیه نوزاد شناخته شده‌اند. الیگوساکاریدهای شیر انسان نوعی منحصربه‌فرد از مواد مغذی هستند که در روده نوزاد به‌عنوان پری‌بیوتیک، عوامل ضدمیکروبیِ ضدچسبندگی و تعدیل‌کننده‌های ایمنی عمل می‌کنند و نقش چشمگیری در تکامل مغز دارند. HMOs منحصراً در شیر مادر انسان یافت می‌شوند؛ شیر سایر پستانداران (مانند گاو، بز، گوسفند، شتر و غیره) فاقد این شکل‌های خاص الیگوساکاریدهاست.
الیگوساکاریدهای شیر انسان سومین جزء جامد فراوان در شیر انسان هستند که می‌توانند به‌صورت حل‌شده، امولسیون‌شده یا معلق در آب وجود داشته باشند. لاکتوز و اسیدهای چرب فراوان‌ترین مواد جامد موجود در شیر انسان هستند. HMOs با غلظت 0٫35–0٫88 اونس (9٫9–24٫9 g)/ L وجود دارند. حدود 200 الیگوساکارید شیر انسان با ساختارهای متفاوت شناخته شده است. الیگوساکارید غالب در 80% از زنان، 2′-فوکوزیل‌لاکتوز است که با غلظتی حدود 2٫5 g/ L در شیر مادر وجود دارد.
ازآنجاکه HMOs هضم نمی‌شوند، سهمی در تأمین کالری تغذیه ندارند. این کربوهیدرات‌های هضم‌ناپذیر به‌عنوان پری‌بیوتیک عمل می‌کنند و به‌طور انتخابی به‌وسیله میکروفلور مطلوب روده، به‌ویژه بیفیدوباکتری‌ها، تخمیر می‌شوند.
- رشد و تکامل نوزادان را تقویت می‌کنند
- برای تکامل مغز اهمیت دارند
- دارای اثرات ضدالتهابی و
- ضدچسبندگی در دستگاه گوارش هستند
- از دستگاه ایمنی بزرگسالان پشتیبانی می‌کنند
این پردازشگر فراصوتی UIP2000hdT انتقال جرم را افزایش می‌دهد و کارخانه‌های سلولی را برای دستیابی به بازده بالاتر مولکول‌های زیستیِ تولیدشده از طریق زیست‌سنتز، مانند HMOs، فعال می‌کند
زیست‌سنتز الیگوساکاریدهای شیر انسان
کارخانه‌های سلولی و سامانه‌های آنزیمی / شیمیایی–آنزیمی، فناوری‌های کنونی مورد استفاده برای سنتز HMOs هستند. برای تولید HMO در مقیاس صنعتی، تخمیر با کارخانه‌های سلولی میکروبی، سنتز بیوشیمیایی و واکنش‌های آنزیمی مختلف، روش‌های عملی برای تولید زیستی HMO محسوب می‌شوند. به دلایل اقتصادی، زیست‌سنتز با استفاده از کارخانه‌های سلولی میکروبی در حال حاضر تنها روش مورد استفاده در تولید صنعتی HMOs است.
تخمیر HMOs با استفاده از کارخانه‌های سلولی میکروبی
E.coli، Saccharomyces cerevisiae و Lactococcus lactis کارخانه‌های سلولی رایجی هستند که برای تولید زیستی مولکول‌هایی مانند HMOs به کار می‌روند. تخمیر فرایندی بیوشیمیایی است که از میکروارگانیسم‌ها برای تبدیل سوبسترا به مولکول‌های زیستی هدف استفاده می‌کند. کارخانه‌های سلولی میکروبی، قندهای ساده را به‌عنوان سوبسترا مصرف و به HMOs تبدیل می‌کنند. ازآنجاکه قندهای ساده (مانند لاکتوز) سوبسترایی فراوان و ارزان هستند، استفاده از آن‌ها فرایند زیست‌سنتز را از نظر هزینه مقرون‌به‌صرفه نگه می‌دارد.
نرخ رشد و تبدیل زیستی عمدتاً تحت تأثیر انتقال جرم مواد مغذی (سوبسترا) به میکروارگانیسم‌ها قرار دارد. نرخ انتقال جرم یکی از عوامل اصلی مؤثر بر سنتز محصول در طول تخمیر است. فراصوت‌دهی به‌خوبی به‌عنوان روشی برای تقویت انتقال جرم شناخته شده است.
در طول تخمیر، شرایط زیست‌راکتور باید پیوسته پایش و تنظیم شود تا سلول‌ها بتوانند با بیشترین سرعت ممکن رشد کنند و سپس زیست‌مولکول‌های هدف را تولید کنند (مانند الیگوساکاریدهایی نظیر HMOs؛ انسولین؛ پروتئین‌های نوترکیب). از نظر نظری، تشکیل محصول به‌محض آغاز رشد کشت سلولی شروع می‌شود. بااین‌حال، به‌ویژه در سلول‌های اصلاح‌شده ژنتیکی مانند میکروارگانیسم‌های مهندسی‌شده، معمولاً این فرایند در مرحله‌ای دیرتر با افزودن ماده‌ای شیمیایی به سوبسترا القا می‌شود که بیان زیست‌مولکول هدف را افزایش می‌دهد. زیست‌راکتورهای فراصوتی (سونو-زیست‌راکتور) را می‌توان به‌دقت کنترل کرد و با آن‌ها میکروب‌ها را به‌صورت اختصاصی تحریک کرد. این امر به زیست‌سنتز سریع‌تر و بازده بالاتر منجر می‌شود.
لیز و استخراج فراصوتی: تخمیر HMOs پیچیده ممکن است به‌دلیل تیترهای پایین تخمیر و باقی ماندن محصولات درون سلول محدود شود. لیز و استخراج فراصوتی برای آزادسازی مواد درون‌سلولی پیش از خالص‌سازی و فرایندهای پایین‌دستی به کار می‌رود.
تقویت تخمیر با فراصوت
با اعمال فراصوت‌دهی کنترل‌شده با فرکانس پایین و افزایش نرخ انتقال جرم و نفوذپذیری دیواره سلولی، می‌توان نرخ رشد میکروب‌هایی مانند Escherichia coli، E.coli مهندسی‌شده، Saccharomyces cerevisiae و Lactococcus lactis را افزایش داد. فراصوت‌دهی، به‌عنوان روشی ملایم و غیرحرارتی برای پردازش، نیروهایی صرفاً مکانیکی به محیط مایع تخمیر وارد می‌کند.
کاویتاسیون آکوستیکی: اصل عملکرد فراصوت‌دهی بر کاویتاسیون آکوستیکی استوار است. پروب فراصوتی (سونوتْرود) امواج فراصوت با فرکانس پایین را به محیط کوپل می‌کند. امواج فراصوت در مایع حرکت می‌کنند و چرخه‌های متناوب پرفشار (تراکم) / کم‌فشار (انبساط) ایجاد می‌کنند. فشرده و کشیده شدن مایع در چرخه‌های متناوب، حباب‌های خلأ بسیار کوچکی ایجاد می‌کند. این حباب‌های کوچک خلأ طی چندین چرخه رشد می‌کنند تا به اندازه‌ای برسند که دیگر نتوانند انرژی بیشتری جذب کنند. در این نقطه از حداکثر رشد، حباب خلأ به‌شدت به درون فرو می‌پاشد و شرایط موضعی بسیار شدیدی ایجاد می‌کند که به پدیده کاویتاسیون معروف است. در «نقطه داغ» کاویتاسیون، اختلاف‌های زیاد فشار و دما و نیروهای برشی شدید همراه با جت‌های مایع با سرعت تا 280m/sec مشاهده می‌شود. این اثرات کاویتاسیونی، انتقال جرم کامل و سونوپوریشن (ایجاد منفذ در دیواره‌ها و غشاهای سلولی) را فراهم می‌کنند. مواد مغذی سوبسترا به‌سوی سلول‌های زنده و کامل و به درون آن‌ها جریان می‌یابند، در نتیجه کارخانه‌های سلولی به‌طور بهینه تغذیه می‌شوند و نرخ رشد و تبدیل افزایش می‌یابد. زیست‌راکتورهای فراصوتی راهکاری ساده و درعین‌حال بسیار مؤثر برای پردازش زیست‌توده در یک فرایند زیست‌سنتز تک‌ظرفی هستند.
فراصوت‌دهی ملایم و دقیقاً کنترل‌شده، روشی شناخته‌شده برای تشدید فرایندهای تخمیر است.
فراصوت‌دهی «بهره‌وری بسیاری از فرایندهای زیستیِ شامل سلول‌های زنده را از طریق افزایش جذب سوبسترا، افزایش تولید یا رشد با افزایش تخلخل سلول، و احتمالاً افزایش آزادسازی اجزای سلولی» بهبود می‌بخشد. (Naveena et al. 2015)
درباره تخمیر به کمک فراصوت بیشتر بخوانید!
- افزایش بازده
- تخمیر سریع‌تر
- تحریک اختصاصی سلول
- افزایش جذب سوبسترا
- افزایش تخلخل سلول
- کاربری آسان
- ایمن
- نصب و ادغام آسان در تجهیزات موجود
- افزایش مقیاس خطی
- پردازش ناپیوسته یا درون‌خطی
- بازگشت سریع سرمایه
Naveena et al. (2015) دریافتند که تشدید فراصوتی در طول پردازش زیستی مزایای متعددی دارد؛ از جمله هزینه‌های عملیاتی پایین در مقایسه با سایر روش‌های تقویت‌کننده فرایند، سادگی کاربری و نیاز به توان نسبتاً کم.
MultiSonoReactor MSR-4 یک هموژنایزر درون‌خطی صنعتی است که برای تقویت زیست‌سنتز الیگوساکاریدهای شیر انسان (HMO) مناسب است.
راکتورهای فراصوتی با عملکرد بالا برای تخمیر
فرایندهای تخمیر شامل میکروارگانیسم‌های زنده مانند باکتری‌ها یا مخمرها هستند که به‌عنوان کارخانه‌های سلولی عمل می‌کنند. هنگامی که فراصوت‌دهی برای تقویت انتقال جرم و افزایش نرخ رشد و تبدیل میکروارگانیسم به کار می‌رود، کنترل دقیق شدت فراصوت برای جلوگیری از تخریب کارخانه‌های سلولی ضروری است.
Hielscher Ultrasonics در طراحی، ساخت و توزیع دستگاه‌های فراصوت با عملکرد بالا تخصص دارد؛ دستگاه‌هایی که می‌توان آن‌ها را به‌دقت کنترل و پایش کرد تا بازده عالی تخمیر تضمین شود.
کنترل فرایند نه‌تنها برای دستیابی به بازده بالا و کیفیت عالی ضروری است، بلکه تکرار و بازتولید نتایج را نیز امکان‌پذیر می‌کند. به‌ویژه در تحریک کارخانه‌های سلولی، تنظیم پارامترهای فراصوت‌دهی متناسب با نوع سلول برای دستیابی به بازده بالا و جلوگیری از تخریب سلول ضروری است. ازاین‌رو، همه مدل‌های دیجیتال دستگاه‌های فراصوت Hielscher به نرم‌افزار هوشمندی مجهز هستند که امکان تنظیم، پایش و بازبینی پارامترهای فراصوت‌دهی را فراهم می‌کند. پارامترهای فرایند فراصوتی مانند دامنه، دما، فشار، مدت فراصوت‌دهی، چرخه‌های کاری و انرژی ورودی، برای تقویت تولید HMO از طریق تخمیر ضروری هستند.
نرم‌افزار هوشمند دستگاه‌های فراصوت Hielscher به‌طور خودکار همه پارامترهای مهم فرایند را روی کارت SD تعبیه‌شده در دستگاه ثبت می‌کند. ثبت خودکار داده‌های فرایند فراصوت‌دهی، مبنای استانداردسازی فرایند و بازتولیدپذیری / تکرارپذیری است که از الزامات شیوه‌های خوب تولید (GMP) به شمار می‌روند.
راکتورهای فراصوتی برای تخمیر
Hielscher پروب‌های فراصوتی را با اندازه‌ها، طول‌ها و هندسه‌های مختلف عرضه می‌کند که می‌توان از آن‌ها برای پردازش ناپیوسته و نیز پردازش با جریان عبوری پیوسته استفاده کرد. راکتورهای فراصوتی، که با نام سونو-زیست‌راکتورها نیز شناخته می‌شوند، برای هر حجمی در دسترس هستند و پردازش زیستی فراصوتی را از نمونه‌های کوچک آزمایشگاهی تا مقیاس پایلوت و تولید کاملاً تجاری پوشش می‌دهند.
به‌خوبی مشخص شده است که محل قرارگیری سونوتْرود فراصوتی در ظرف واکنش، بر توزیع کاویتاسیون و ریزجریان‌ها در محیط تأثیر می‌گذارد. سونوتْرود و راکتور فراصوتی باید متناسب با حجم محیط مایع کشت سلولیِ مورد پردازش انتخاب شوند. اگرچه فراصوت‌دهی را می‌توان به‌صورت ناپیوسته و پیوسته انجام داد، برای حجم‌های بالای تولید استفاده از تأسیسات جریان پیوسته توصیه می‌شود. هنگام عبور از یک سلول جریان فراصوتی، تمام محیط سلولی دقیقاً به یک میزان در معرض فراصوت‌دهی قرار می‌گیرد و در نتیجه مؤثرترین پردازش تضمین می‌شود. مجموعه گسترده پروب‌های فراصوتی و راکتورهای سلول جریان Hielscher Ultrasonics امکان مونتاژ سامانه‌ای ایدئال برای پردازش زیستی فراصوتی را فراهم می‌کند.
Hielscher Ultrasonics – از آزمایشگاه تا پایلوت و تولید
Hielscher Ultrasonics تمام طیف تجهیزات فراصوتی را پوشش می‌دهد؛ از هموژنایزرهای فراصوتی جمع‌وجورِ قابل نگه‌داشتن در دست برای آماده‌سازی نمونه تا سامانه‌های رومیزی و پایلوت و همچنین واحدهای فراصوتی صنعتی قدرتمند که به‌راحتی در هر ساعت حجمی معادل بار چند کامیون را پردازش می‌کنند. دستگاه‌های فراصوت Hielscher با برخورداری از گزینه‌های متنوع و انعطاف‌پذیر برای نصب و استقرار، به‌آسانی در انواع راکتورهای ناپیوسته، سامانه‌های ناپیوسته با تغذیه تدریجی یا سامانه‌های جریان عبوری پیوسته ادغام می‌شوند.
لوازم جانبی متنوع و قطعات سفارشی، انطباق ایدئال سامانه فراصوتی شما با الزامات فرایندتان را امکان‌پذیر می‌کنند.
پردازشگرهای فراصوتی Hielscher برای کارکرد 24/7 با بار کامل و کار سنگین در شرایط دشوار ساخته شده‌اند، قابل‌اعتماد هستند و تنها به نگهداری اندکی نیاز دارند.
جدول زیر نمایی از ظرفیت تقریبی پردازش دستگاه‌های فراصوت ما ارائه می‌دهد:
| حجم هر بچ | دبی | دستگاه‌های پیشنهادی |
|---|---|---|
| 1 تا 500mL | 10 تا 200mL/min | UP100H |
| 10 تا 2000mL | 20 تا 400mL/min | UP200Ht, UP400St |
| 0٫1 تا 20L | 0٫2 تا 4L/min | UIP2000hdT |
| 10 تا 100L | 2 تا 10L/min | UIP4000hdT |
| قابل اعمال نیست | 10 تا 100L/min | UIP16000 |
| قابل اعمال نیست | بیشتر | مجموعه‌ای از دستگاه‌های UIP16000 |
با ما تماس بگیرید! / از ما بپرسید!
هموژنایزرهای فراصوتی پرتوان از مقیاس آزمایشگاهی تا پایلوت و صنعتی .
منابع علمی / مراجع
- Muschiol, Jan; Meyer, Anne S. (2019): A chemo-enzymatic approach for the synthesis of human milk oligosaccharide backbone structures. Zeitschrift für Naturforschung C, Volume 74: Issue 3-4, 2019. 85-89.
- Birgitte Zeuner, David Teze, Jan Muschiol, Anne S. Meyer (2019): Synthesis of Human Milk Oligosaccharides: Protein Engineering Strategies for Improved Enzymatic Transglycosylation. Molecules 24, 2019.
- Yun Hee Choi, Bum Seok Park, Joo‐Hyun Seo, Byung‐Gee Ki (2019): Biosynthesis of the human milk oligosaccharide 3‐fucosyllactose in metabolically engineered Escherichia coli via the salvage pathway through increasing GTP synthesis and β‐galactosidase modification. Biotechnology and Bioengineering Volume 116, Issue 12. December 2019.
- Balakrishnan Naveena, Patricia Armshaw, J. Tony Pembroke (2015): Ultrasonic intensification as a tool for enhanced microbial biofuel yields. Biotechnology of Biofuels 8:140, 2015.
- Shweta Pawar, Virendra K. Rathod (2020): Role of ultrasound in assisted fermentation technologies for process enhancements. Preparative Biochemistry & Biotechnology 50(6), 2020. 1-8.
دانستنی‌های مفید
زیست‌سنتز با استفاده از کارخانه‌های سلولی
کارخانه سلولی میکروبی روشی در مهندسی زیستی است که از سلول‌های میکروبی به‌عنوان یک واحد تولیدی استفاده می‌کند. با مهندسی ژنتیکی میکروب‌ها، DNA میکروارگانیسم‌هایی مانند باکتری‌ها، مخمرها، قارچ‌ها، سلول‌های پستانداران یا جلبک‌ها تغییر می‌یابد و میکروب‌ها به کارخانه‌های سلولی تبدیل می‌شوند. کارخانه‌های سلولی برای تبدیل سوبستراها به مولکول‌های زیستی ارزشمند به کار می‌روند؛ مولکول‌هایی که برای مثال در صنایع غذایی، دارویی، شیمیایی و تولید سوخت استفاده می‌شوند. راهبردهای مختلف زیست‌سنتز مبتنی بر کارخانه سلولی، تولید متابولیت‌های بومی، بیان مسیرهای زیست‌سنتزی هترولوگ یا بیان پروتئین را هدف قرار می‌دهند.
از کارخانه‌های سلولی می‌توان برای سنتز متابولیت‌های بومی، بیان مسیرهای زیست‌سنتزی هترولوگ یا بیان پروتئین‌ها استفاده کرد.
زیست‌سنتز متابولیت‌های بومی
متابولیت‌های بومی به مولکول‌های زیستی‌ای گفته می‌شود که سلول‌های مورد استفاده به‌عنوان کارخانه سلولی، آن‌ها را به‌طور طبیعی تولید می‌کنند. کارخانه‌های سلولی این مولکول‌های زیستی را یا درون سلول یا به‌صورت ماده‌ای ترشح‌شده تولید می‌کنند. حالت دوم ترجیح داده می‌شود، زیرا جداسازی و خالص‌سازی ترکیبات هدف را تسهیل می‌کند. نمونه‌هایی از متابولیت‌های بومی عبارت‌اند از اسیدهای آمینه و نوکلئیک، آنتی‌بیوتیک‌ها، ویتامین‌ها، آنزیم‌ها، ترکیبات زیست‌فعال و پروتئین‌های تولیدشده از مسیرهای آنابولیک سلول.
مسیرهای زیست‌سنتزی هترولوگ
هنگام تلاش برای تولید یک ترکیب مورد توجه، یکی از مهم‌ترین تصمیم‌ها، انتخاب میان تولید در میزبان بومی و بهینه‌سازی این میزبان، یا انتقال مسیر به میزبان شناخته‌شده دیگری است. اگر بتوان میزبان اولیه را با یک فرایند تخمیر صنعتی سازگار کرد و انجام این کار هیچ خطر مرتبط با سلامتی نداشته باشد (برای مثال، تولید محصولات جانبی سمی)، این می‌تواند راهبرد ترجیحی باشد؛ همان‌طور که برای مثال در مورد پنی‌سیلین چنین بود. بااین‌حال، در بسیاری از موارد امروزی، مزیت بالقوه استفاده از یک کارخانه سلولی ترجیحی برای صنعت و فرایندهای پلتفرمی مرتبط با آن، بر دشواری انتقال مسیر می‌چربد.
بیان پروتئین
بیان پروتئین‌ها را می‌توان به روش‌های همولوگ و هترولوگ انجام داد. در بیان همولوگ، ژنی که به‌طور طبیعی در یک جاندار وجود دارد، بیش‌بیان می‌شود. از طریق این بیش‌بیانی، می‌توان یک مولکول زیستی مشخص را با بازده بالاتر تولید کرد. در بیان هترولوگ، یک ژن مشخص به سلول میزبانی منتقل می‌شود که آن ژن به‌طور طبیعی در آن وجود ندارد. با استفاده از مهندسی سلولی و فناوری DNA نوترکیب، ژن در DNA میزبان وارد می‌شود تا سلول میزبان مقادیر (زیادی) از پروتئینی را تولید کند که به‌طور طبیعی تولید نمی‌کرد. بیان پروتئین در میزبان‌های متنوعی انجام می‌شود: باکتری‌ها، مانند E. coli و Bacillis subtilis؛ مخمرها، مانند Klyuveromyces lactis، Pichia pastoris و S. cerevisiae؛ قارچ‌های رشته‌ای، مانند A. niger؛ و سلول‌های مشتق‌شده از جانداران چندسلولی مانند پستانداران و حشرات. پروتئین‌های بی‌شماری از نظر تجاری بسیار مورد توجه هستند؛ از آنزیم‌های تولیدشده در مقیاس انبوه و داروهای زیستی پیچیده تا مواد تشخیصی و معرف‌های پژوهشی. (رجوع کنید به A.M. Davy et al. 2017)