سنتز پپتید در فاز جامد – کارآمدتر با فراصوت‌دهی
سنتز پپتید در فاز جامد (SPPS) روش رایج سنتز پپتید است. فراصوت‌دهی ابزاری قابل‌اعتماد برای تشدید سنتز پپتید در فاز جامد است که به بازده بالاتر، خلوص بهتر، عدم راسمیزاسیون و افزایش چشمگیر سرعت واکنش می‌انجامد. Hielscher Ultrasonics راهکارهای فراصوتی متنوعی برای سنتز، جداسازی از طریق شکستن پیوند و حل‌کردن پپتیدها ارائه می‌دهد.
سنتز فراصوتی پپتید در فاز جامد
فراصوت‌دهی هم‌اکنون به‌طور گسترده به‌عنوان روشی برای تشدید سنتز آلی به کار می‌رود و به‌دلیل مزایایی مانند کاهش شدید زمان واکنش، بازده بالاتر، محصولات جانبی کمتر، آغاز مسیرهای واکنشی که با روش‌های دیگر دست‌یافتنی نیستند و/یا گزینش‌پذیری بهتر، شناخته شده است. اعمال فراصوت‌دهی به واکنش‌های سنتز پپتید نیز می‌تواند مزایای چشمگیری داشته باشد. نتایج پژوهش‌ها نشان داده‌اند که سنتز پپتید به کمک فراصوت، در زمان واکنش کوتاه، پپتیدهایی با بازده بهینه و خلوص بالا و بدون راسمیزاسیون تولید می‌کند.
- بازده بالای پپتید
- سنتز به‌مراتب سریع‌تر
- خلوص بالاتر پپتید
- بدون راسمیزاسیون
- سنتز موازی پپتیدهای مختلف
- قابل افزایش مقیاس برای هر حجم
کاپ‌هورن فراصوتی برای فراصوت‌دهی یکنواخت چندین ظرف راکتور به‌منظور بهبود سنتز پپتید.
تصویری از سنتز پپتید در فاز جامد به روش Merrifield. فراصوت‌دهی برای پیشبرد و تقویت واکنش سنتز و همچنین جداسازی پپتیدهای سنتزشده از رزین از طریق شکستن پیوند به کار می‌رود.
تصویر: ©Conejos-Sanchez et al., 2014)
| مطالعه | پپتیدهای بررسی‌شده | زمان واکنش (روش کلاسیک در مقایسه با US-SPPS) | خلوص محصول خام (روش کلاسیک در مقایسه با US-SPPS) | راسمیزاسیون و واکنش‌های جانبی | یافته‌های کلیدی |
|---|---|---|---|---|---|
| Wołczański et al. (2019) | Met-enkephalin, UB33-43-OCam, TAT48-60-NH2, B2m58-69-NH2, ACP65-74-NH2, β-endorphin | 600–1920 min → 48–284 min | 24٫2–71٫3% → 60٫6–89٫9% | برای Cys/His هیچ موردی مشاهده نشد، حتی در 70°C | سنتز ~7–12x سریع‌تر؛ بهبود چشمگیر خلوص، به‌ویژه برای توالی‌های مستعد تجمع مانند TAT. |
| Silva et al. (2021) | Pep1 (12-مر)، Pep2 (9-مر)، Pep3 (25-مر) | >3515/365 min → ~250/85 min (Pep1/Pep2)؛ Pep3: 347 min (فقط US) | 73–84% → 72–82% (Pep1/Pep2) | آزمایش نشد؛ افت اندک خلوص در Pep2 گزارش شد | کاهش 14x زمان برای Pep1؛ بازده محصول خام به‌طور چشمگیری افزایش یافت. |
| Merlino et al. (2019) | پنتاپپتیدهای مدل، پپتیدهای تا 44-مر، «توالی‌های دشوار» (Aβ 1-42، ACP 65-74) | 60 min → 30 min (مدل) | 84% → 93% (مدل)؛ به‌مراتب بالاتر از گرمایش حرارتی (~45°C) | بدون افزایش قابل‌توجه در انانتیومرهای Cys/His | بسیار مؤثر برای توالی‌های دشوار/مستعد تجمع؛ امکان کاهش مقدار مازاد واکنشگر را با حفظ خلوص بالا فراهم می‌کند. |
بهبود سنتز پپتید در فاز جامد با فراصوت
سنتز پپتید در فاز جامد (SPPS) واکنشی شیمیایی است که تشکیل زنجیرهٔ پپتیدی را از طریق واکنش‌های متوالی مشتقات اسیدهای آمینه روی یک بستر متخلخل نامحلول امکان‌پذیر می‌کند. بااین‌حال، سنتز سنتی پپتید در فاز جامد فرایندی نسبتاً کم‌بازده و کند است. ازاین‌رو، تشدید فراصوتی سنتز پپتید ابزاری بسیار مورد توجه برای سنتز مؤثرتر و سریع‌تر پپتیدهاست.
Silva et al. (2021) سنتز «کلاسیک» پپتید در فاز جامد (SPPS) مبتنی بر فلوئورنیل‌متوکسی‌کربونیل (Fmoc) را با SPPS به کمک فراصوت (US)، بر پایهٔ تهیهٔ سه پپتید مقایسه کردند: پپتید Pep1 (VSPPLTLGQLLS-NH2) اختصاصی گیرندهٔ 3 فاکتور رشد فیبروبلاست (FGFR3) و پپتیدهای جدید Pep2 (RQMATADEA-NH2) و Pep3 (AAVALLPAVLLALLAPRQMATADEA-NH2).
SPPS به کمک US در مقایسه با روش «کلاسیک»، زمان تشکیل پپتید را برای Pep1 به میزان 14 برابر و برای Pep2 به میزان 4 برابر کاهش داد. جالب آنکه SPPS به کمک فراصوت، Pep1 را با خلوص بالاتری (82%) نسبت به SPPS «کلاسیک» (73%) تولید کرد. کاهش چشمگیر زمان همراه با خلوص بالای پپتید خام به‌دست‌آمده، گروه پژوهشی را بر آن داشت تا SPPS به کمک US را برای پپتید بزرگ Pep3 به کار بگیرند که دارای تعداد زیادی اسید آمینهٔ آب‌گریز و توالی‌های هموالیگومری است. نکتهٔ قابل‌توجه آنکه سنتز این پپتید 25-مر در کمتر از 6 ساعت (347 min) با خلوص متوسط (حدود 49%) انجام شد.
سنتز سریع‌تر پپتید از طریق سنتز پپتید در فاز جامد با استفاده از هم‌زدن فراصوتی.
(مطالعه و تحلیل: Wołczański et al., 2019)
Merlino et al. (2019) نیز مطالعه‌ای جامع دربارهٔ اثرات فراصوت بر سنتز پپتید در فاز جامد مبتنی بر Fmoc انجام دادند که سنتز پپتیدهای مختلف دارای فعالیت زیستی (تا 44-مر) را با صرفه‌جویی چشمگیر در مواد و زمان واکنش امکان‌پذیر کرد. آن‌ها نشان دادند که فراصوت‌دهی واکنش‌های جانبی اصلی را تشدید نکرد و سنتز پپتیدهای دارای «توالی‌های دشوار» را بهبود بخشید؛ بدین‌ترتیب، سنتز پپتید در فاز جامد تقویت‌شده با فراصوت (US-SPPS) در میان راهبردهای کنونی سنتز پپتید با کارایی بالا قرار می‌گیرد.
دسترسی به سامانه‌های پربازده برای سنتز فراصوتی (صوتی) پپتیدها، افزایش چشمگیر سرعت سنتز و افزایش خلوص محصولات خام را امکان‌پذیر می‌کند. (رجوع کنید به Wołczański et al., 2019)
بررسی راسمیزاسیون. مقایسهٔ طیف‌های شاخص 1H NMR پپتیدهای مدل که به‌صورت دستی با روش کلاسیک در دمای اتاق و با روش فراصوتی در دمای بالا سنتز شده‌اند. جابه‌جایی‌های شیمیایی پروتون‌های α در His و Cys و گروه متیلن Acm (پنل‌های سمت چپ) و پروتون‌های متیل ɣ در Val (پنل‌های سمت راست) نشان می‌دهند که فراصوت‌دهی در 70°C موجب راسمیزاسیون نمی‌شود.
(مطالعه و تحلیل: Wołczański et al., 2019)
جداسازی فراصوتی پپتیدها از طریق شکستن پیوند
پس از سنتز پپتید در فاز جامد (SPPS)، پپتیدهای سنتزشده باید با شکستن پیوند از رزین‌های پلیمری جدا شوند. این مرحله با عنوان محافظت‌زدایی نیز شناخته می‌شود. در مقایسهٔ تکان‌دادن معمول و فراصوت‌دهی برای جداسازی پپتید از رزین، روش تکان‌دادن حدود 1 ساعت زمان نیاز دارد، درحالی‌که جداسازی فراصوتی را می‌توان در 15 تا 20 min انجام داد. جداسازی فراصوتی پپتید را می‌توان برای جداکردن اسیدهای آمینه و پپتیدهای محافظت‌شده‌ای به کار برد که از طریق پیوندهای استری بنزیلی به رزین‌های پلی‌استایرن متصل‌اند.
جداسازی فراصوتی پپتیدها از رزین پلی‌استایرن، طی فرایندی سریع، پپتیدهایی با بازده و خلوص بالا و بدون راسمیزاسیون به دست می‌دهد.
(مطالعه و تصویر: ©Anuradha and Ravindranath, 1995)
راکتور مجهز به هم‌زدن فراصوتی برای بهبود و تسریع سنتز پپتید. در تصویر، سونیکاتور UP200St در یک راکتور شیشه‌ای هم‌زن‌دار نشان داده شده است.
سونیکاتورهای پربازده برای سنتز پپتید
Hielscher Ultrasonics راهکارهای فراصوتی متنوعی برای فراصوت‌دهی مستقیم و غیرمستقیم ارائه می‌دهد. پردازشگرهای فراصوتی قدرتمند با قابلیت کنترل دقیق، انرژی فراصوتی را دقیقاً به مقدار مناسب به ظرف واکنش می‌رسانند. چه از سرنگ، لوله، پلیت چندخانه‌ای یا راکتور شیشه‌ای به‌عنوان ظرف سنتز استفاده کنید، Hielscher Ultrasonics مناسب‌ترین سونیکاتور را برای کاربرد پپتیدی شما ارائه می‌دهد.
- پپتیدهای سفارشی
- تولید پپتید در مقیاس بزرگ
- کتابخانه‌های پپتیدی
بسیاری از سنتزهای پپتید در سرنگ‌ها انجام می‌شوند (برای مثال، راکتورهای سرنگی دارای فریت). هم‌زن فراصوتی سرنگ Hielscher با انتقال امواج فراصوت از دیوارهٔ سرنگ به درون مایع، محلول پپتیدی را فراصوت‌دهی می‌کند. هم‌زن فراصوتی سرنگ یکی از محبوب‌ترین راهکارهای فراصوتی برای سنتز پپتیدها به کمک فراصوت است.
کاپ‌هورن فراصوتی ابزاری مناسب برای فراصوت‌دهی حداکثر 5 ظرف راکتور است، درحالی‌که VialTweeter می‌تواند تا ده لولهٔ واکنش و افزون بر آن، پنج ظرف بزرگ‌تر را از طریق متعلقات گیره‌ای در خود جای دهد.
برای انواع دیگر راکتورها، مانند راکتور فاز جامد Merrifield یا Kamysz و سایر ظروف و راکتورهای پلی‌پروپیلنی یا بوروسیلیکاتی، Hielscher سونیکاتورهایی برای فراصوت‌دهی غیرمستقیم و مستقیم با اتصال گیره‌ای سفارشی یا فلنج ارائه می‌دهد.
البته راکتورهای شیشه‌ای هم‌زن‌دار بزرگ‌تر، برای مثال برای سنتز در فاز محلول، را نیز می‌توان به‌آسانی به پروب‌های فراصوتی (که سونوتْرود یا هورن فراصوتی نیز نامیده می‌شوند) در هر اندازه‌ای مجهز کرد.
- انواع مختلف سونیکاتور
- فراصوت‌دهی مستقیم و غیرمستقیم
- کنترل دقیق شدت
- کنترل دقیق دما
- فراصوت پیوسته یا پالسی
- قابلیت‌های هوشمند، دستگاه‌های برنامه‌پذیر
- قابل‌ارائه برای هر حجم
- مقیاس‌پذیری خطی
برای سنتز پپتید در فاز جامد در پلیت‌های چندخانه‌ای/میکروتیتر، UIP400MTP دستگاهی ایدئال است. کاویتاسیون فراصوتی به‌صورت غیرمستقیم و یکنواخت به خانه‌های متعدد نمونه منتقل می‌شود تا انتقال جرم و واکنش سنتز بهتری حاصل شود. ویدئوی زیر را تماشا کنید تا سونیکاتور میکروپلیت UIP400MTP را در حال کار ببینید!
با ما تماس بگیرید! / از ما بپرسید!
Hielscher Ultrasonics هموژنایزرهای فراصوتی پربازده برای کاربردهای اختلاط، پراکنده‌سازی، امولسیون‌سازی و استخراج در مقیاس آزمایشگاهی، پایلوت و صنعتی تولید می‌کند.
نکات دانستنی دربارهٔ سنتز فراصوتی پپتید
پپتیدها چه هستند؟
پپتیدها ترکیباتی هستند که در آن‌ها چندین اسید آمینه از طریق پیوندهای آمیدی، موسوم به پیوندهای پپتیدی، به یکدیگر متصل شده‌اند. هنگامی که این ساختارهای پپتیدی بزرگ به‌شکل ساختارهای پیچیده به هم متصل می‌شوند – معمولاً متشکل از 50 اسید آمینه یا بیشتر – پروتئین نام می‌گیرند. پپتیدها از واحدهای سازندهٔ اساسی حیات هستند و کارکردهای متعددی در بدن دارند.
سنتز پپتید چگونه انجام می‌شود؟
در شیمی آلی، زیست‌شناسی مولکولی و علوم زیستی، سنتز پپتید فرایند تولید پپتیدهاست. پپتیدها از طریق واکنش تراکمی گروه کربوکسیل یک اسید آمینه با گروه آمین اسید آمینه‌ای دیگر به‌صورت شیمیایی سنتز می‌شوند. برای جلوگیری از واکنش‌های جانبی ناخواسته با زنجیره‌های جانبی مختلف اسیدهای آمینه، معمولاً از راهبردهای مبتنی بر گروه‌های محافظ (یا گروه‌های محافظت‌کننده) استفاده می‌شود.
سنتز شیمیایی پپتید در شرایط برون‌تنی اغلب با اتصال گروه کربوکسیل اسید آمینهٔ ورودی (انتهای C) به انتهای N زنجیرهٔ پپتیدی در حال رشد آغاز می‌شود. برخلاف این سنتز در جهت C به N، زیست‌سنتز طبیعی پروتئین از پپتیدهای بلند در موجودات زنده در جهت عکس انجام می‌شود. به این معنا که در زیست‌سنتز، انتهای N اسید آمینهٔ ورودی به انتهای C زنجیرهٔ پروتئینی متصل می‌شود (N به C).
بیشتر پروتکل‌های تحقیق و توسعه برای سنتز پپتید بر روش‌های فاز جامد استوارند، درحالی‌که روش‌های سنتز در فاز محلول در تولید صنعتی پپتیدها در مقیاس بزرگ به کار می‌روند.
پیشرفته‌ترین روش‌های کنونی سنتز پپتید کدام‌اند؟
SUS-SPPS (سنتز پایدار پپتید در فاز جامد به کمک فراصوت) چنان‌که نشان داده شده است، فرایند را به تنها دو مرحله در هر چرخه کاهش می‌دهد (اتصال/مسدودسازی انتهایی/محافظت‌زدایی به‌صورت ترکیبی + یک بار شست‌وشو) و بدین‌ترتیب مصرف حلال و زمان را به‌طور چشمگیری کاهش می‌دهد. (رجوع کنید به Mottola et al., 2025)
TAPS به کمک فراصوت ترکیبی نوظهور است که موفقیت آن در سنتزهای کامل (برای مثال، lipobactin) نشان داده شده و سازمان‌های توسعه و تولید قراردادی (CDMOs) در حال بررسی آن برای تولید مادهٔ مؤثرهٔ دارویی (API) هستند.
با مزایای سنتز پپتید با برچسب‌گذاری (TAGGING) به کمک فراصوت آشنا شوید!
پردازش پیوسته به‌عنوان راهی برای بهبود بیشتر در حال بررسی است – بسترهای سنتز پیوستهٔ تک‌ظرفی به کمک برچسب سیلیله‌شده توصیف شده‌اند.
این حوزه به‌سوی اصول شیمی سبز حرکت می‌کند و فراصوت و TAPS هر دو به کاهش مصرف حلال، کاهش مقدار واکنشگر مصرفی و بهبود پایداری کمک می‌کنند.
منابع علمی / مراجع
- Merlino, F., Tomassi, S., Yousif, A. M., Messere, A., Marinelli, L., Grieco, P., Novellino, E., Cosconati, S., Di Maro, S. (2019): Boosting Fmoc Solid-Phase Peptide Synthesis by Ultrasonication. Organic Letters, 21(16), 2019. 6378–6382.
- Andrew M. Bray; Liana M. Lagniton; Robert M. Valerio; N.Joe Maeji (1994): Sonication-assisted cleavage of hydrophobic peptides. Application in multipin peptide synthesis. Tetrahedron Letters 35(48), 1994. 9079–9082.
- Silva, R., Franco Machado, J., Gonçalves, K., Lucas, F. M., Batista, S., Melo, R., Morais, T. S., & Correia, J. (2021): Ultrasonication Improves Solid Phase Synthesis of Peptides Specific for Fibroblast Growth Factor Receptor and for the Protein-Protein Interface RANK-TRAF6. Molecules (Basel, Switzerland), 26(23), 7349.
- Conejos-Sanchez, Inmaculada; Duro Castaño, Aroa; Vicent, María (2014): Peptide-Based Polymer Therapeutics. Polymers. 6. 515-551.
- Raheem, Shvan J; Schmidt, Benjamin W; Solomon, Viswas Raja; Salih, Akam K; Price, Eric W (2020): Ultrasonic-Assisted Solid-Phase Peptide Synthesis of DOTA-TATE and DOTA-linker-TATE Derivatives as a Simple and Low-Cost Method for the Facile Synthesis of Chelator-Peptide Conjugates. ACS Bioconjugate Chemistry, 2020.
- Salvatore Mottola, Alessandra Del Bene, Vincenzo Mazzarella, Roberto Cutolo, Ida Boccino, Francesco Merlino, Sandro Cosconati, Salvatore Di Maro, Anna Messere (2015): Sustainable Ultrasound-Assisted Solid-Phase peptide synthesis (SUS-SPPS): Less Waste, more efficiency. Ultrasonics Sonochemistry, Volume 114, 2025.
- M.V. Anuradha, B. Ravindranath (1995): Ultrasound in peptide synthesis. 4: Rapid cleavage of polymer-bound protected peptides by alkali and alkanolamines. Tetrahedron Volume 51, Issue 19, 1995. 5675-5680.
- Wołczański, G., Płóciennik, H., Lisowski, M., Stefanowicz, P. (2019): The faster peptide synthesis on the solid phase using ultrasonic agitation. Tetrahedron Letters, 2019.
Hielscher Ultrasonics هموژنایزرهای فراصوتی پربازده را از مقیاس آزمایشگاهی تا صنعتی تولید می‌کند.