گردش‌کارهای پروتئومیکس با هضم پروتئین با ظرفیت پردازش بالا
پروتئومیکس حوزه‌ای اساسی برای درک فرایندها و سامانه‌های زیستی است و هضم پروتئین مرحله‌ای حیاتی در گردش‌کارهای آن به شمار می‌رود. به‌طور سنتی، هضم پروتئین در محلول و با استفاده از آنزیم‌های پروتئولیتیک مانند تریپسین انجام می‌شود که پیوندهای پپتیدی را به‌طور اختصاصی در محل باقی‌مانده‌های لیزین و آرژینین هیدرولیز می‌کند. این فرایند پپتیدهایی تولید می‌کند که برای یونش و قطعه‌قطعه‌شدن در کاربردهای طیف‌سنجی جرمی (MS) بسیار مناسب‌اند. بااین‌حال، روش‌های متداول هضم برای تکمیل به 12–24 ساعت زمان نیاز دارند و گلوگاه‌های قابل‌توجهی در گردش‌کارهای پروتئومیکس ایجاد می‌کنند.
فراصوت‌دهی جایگزینی قدرتمند است که زمان هضم را به‌شدت، از چند ساعت به تنها چند دقیقه، کاهش می‌دهد. ترکیب فراصوت‌دهی با سونیکاتورهای پیشرفته چندنمونه‌ای مانند CupHorn و VialTweeter از Hielscher و سونیکاتور پلیت 96 خانه‌ای UIP400MTP، پروتئومیکس سریع با ظرفیت پردازش بالا را امکان‌پذیر می‌کند. این فناوری‌ها گردش‌کارها را تسهیل می‌کنند و ضمن کاهش زمان آماده‌سازی نمونه و افزایش کارایی، تکرارپذیری یا کیفیت داده‌ها را تحت تأثیر منفی قرار نمی‌دهند.
نقش انرژی فراصوتی در هضم پروتئین
فراصوت‌دهی از امواج فراصوت متمرکز برای ایجاد کاویتاسیون استفاده می‌کند – ریزحباب‌های موضعی که با فروپاشی خود نیروهای برشی شدیدی ایجاد می‌کنند. این پدیده انتقال جرم را افزایش می‌دهد، اختلاط آنزیم‌ها با سوبستراها را بهبود می‌بخشد و ساختارهای پروتئینی را باز می‌کند تا جایگاه‌های برش در دسترس آنزیم‌های پروتئولیتیک مانند تریپسین قرار گیرند.
نتیجه چیست؟ کاهش قابل‌توجه زمان هضم، بدون افت کارایی یا تکرارپذیری.
هضم پروتئولیتیک تقویت‌شده با فراصوت: روش‌شناسی و نتایج
پروتکل هضم تسریع‌شده
هضم به کمک فراصوت، آنزیم‌های پروتئولیتیک و انرژی فراصوتی را برای تسریع گردش‌کارها ترکیب می‌کند. برای مثال، با استفاده از Hielscher UP200St-CupHorn (200 W, 26 kHz)، گردش‌کار هضم به شرح زیر پیش می‌رود:
- احیا: نمونه‌های پروتئینی (0٫5 mg/mL, 20 µL) با DTT (2 µL, 110 mM) در بافر بی‌کربنات آمونیوم (12٫5 mM) تیمار می‌شوند. فراصوت‌دهی با دامنه 50% به مدت 5 دقیقه اعمال می‌شود.
- آلکیلاسیون: پس از افزودن IAA (2 µL, 400 mM)، فراصوت‌دهی در همان شرایط تکرار می‌شود.
- هضم: نمونه‌ها رقیق شده و با نانوذرات دارای تریپسین تثبیت‌شده انکوبه می‌شوند. یک دور نهایی فراصوت‌دهی (5 دقیقه) هضم را تکمیل می‌کند. پپتیدها جداسازی، خشک و برای آنالیز MS نگهداری می‌شوند.
این روش فراصوتی زمان کل آماده‌سازی را از 12 ساعت به کمتر از 30 دقیقه کاهش می‌دهد. با وجود تسریع فرایند، بازده و کیفیت پپتیدها با روش‌های سنتی هضم شبانه همخوان باقی می‌ماند.
کارایی هضم فراصوتی پروتئین
در مطالعات مقایسه‌ای با استفاده از پروتئوم‌های E. coli:
- شناسایی پروتئین: در نمونه‌های هضم‌شده با فراصوت، 777 پروتئین در 5 دقیقه شناسایی شد، در مقایسه با 817 پروتئین در 12 ساعت. پروتئین‌های شناسایی‌شده مشترک بیش از 70% بودند.
- تکرارپذیری: آنالیزهای تکراری در هر روش مقادیر همبستگی بالاتر از 98% نشان دادند که بیانگر قابلیت اعتماد است.
- گزینش‌پذیری: هر روش برخی پروتئین‌ها را ترجیحاً هضم کرد؛ هضم فراصوتی برای 65 پروتئین و هضم شبانه برای 54 پروتئین ترجیح نشان داد. چنین تفاوت‌های ظریفی بر قابلیت منحصربه‌فرد فراصوت‌دهی برای کاربردهای خاص تأکید می‌کنند.
نتایج اندازه‌گیری کمی بدون نشان‌گذاریِ هفت پروتئین افزوده‌شده به یک نمونه E. coli
نشان داده شده‌اند. پروتئین‌های زیر در دو سطح متفاوت افزوده شدند که در ستونی
با عنوان «Theo Ratio» مشخص شده‌اند. Theo Ratio نسبت نظری بین دو سطح استفاده‌شده در این
آزمایش است. آلبومین سرم گاوی (ALBU)، β-لاکتوگلوبولین (LACB)، کازئین α-S1 (CASA1)،
کازئین α-S2 (CASA2)، سیتوکروم c (CYC)، اووالبومین (OVAL) و کربنیک انهیدراز 2
(CAH2). نسبت‌ها با استفاده از شدت سیگنال‌های پروتئینی LFQ حاصل از آنالیز MaxQuant
محاسبه شدند. برای مقایسه مقادیر به‌دست‌آمده با هر روش، آزمون t استیودنت به کار رفت (p>0٫01, n=3, t-theoretical=4٫6).
مطالعه و نمودار: © Martins et al., 2019)
تریپسین تثبیت‌شده روی نانوذرات
ترکیب نانوذرات دارای تریپسین تثبیت‌شده (مانند T-FMNPs) با فراصوت‌دهی، گردش‌کارهای پروتئومیکس را بیش‌ازپیش بهبود می‌بخشد. این نانوذرات مساحت سطح بالایی برای برهم‌کنش‌های آنزیم–سوبسترا فراهم می‌کنند و کارایی را افزایش می‌دهند. هنگام استفاده برای پروتئوم‌های پیچیده مانند E. coli، روش ترکیبی به نتایج زیر دست می‌یابد:
- سرعت: هضم کامل ظرف 5 دقیقه.
- صحت: اندازه‌گیری کمی پروتئین قابل‌مقایسه با روش‌های سنتی (p > 0٫01, n=3).
- مقیاس‌پذیری: سازگارکردن روش با پلتفرم‌های چندخانه‌ای مانند UIP400MTP، پردازش با ظرفیت بالا را امکان‌پذیر می‌کند.
برای مشاهده پروتکل تفصیلی همراه با دستورالعمل‌های گام‌به‌گام، اینجا کلیک کنید!
(رجوع کنید به Martins et al., 2019)
هضم پروتئولیتیک با سرعت و ظرفیت پردازش بالا با سونیکاتورهای Hielscher
بهترین مدل‌های سونیکاتور برای پروتئومیکس
Hielscher Ultrasonics مدل‌های گوناگون سونیکاتور را برای آماده‌سازی هم‌زمان چندین نمونه ارائه می‌دهد که گردش‌کارهای با ظرفیت پردازش بالا را تسهیل می‌کنند. چه با ویال‌ها، لوله‌های آزمایش، پلیت‌های چندخانه‌ای (مانند پلیت‌های 6، 24 و 96 خانه‌ای) و چه با پتری‌دیش‌ها کار کنید – ما سونیکاتورهای ایدئال را برای آزمایش‌های شما ارائه می‌دهیم.
سونیکاتور پلیت چندخانه‌ای UIP400MTP
برای دستیابی به بیشترین ظرفیت پردازش، UIP400MTP امکان پردازش فراصوتی پلیت‌های 96 خانه‌ای را فراهم می‌کند. UIP400MTP با هر میکروپلیت استانداردی سازگار است، به اقلام مصرفی یک‌بارمصرف اختصاصی و گران‌قیمت نیاز ندارد و به شما آزادی می‌دهد بهترین پلیت چندخانه‌ای را برای پژوهش خود انتخاب کنید. این دستگاه با توزیع یکنواخت انرژی در سراسر پلیت، احیا، آلکیلاسیون و هضم سریع حداکثر 200 پروتئوم پیچیده را تنها در 1 ساعت امکان‌پذیر می‌کند. این سطح از خودکارسازی و کارایی برای پروتئومیکس با ظرفیت پردازش بالا و کاربردهای بالینی حیاتی است. درباره سونیکاتور پلیت چندخانه‌ای بیشتر بدانید!
VialTweeter
VialTweeter برای آزمایشگاه‌هایی طراحی شده است که به فراصوت‌دهی هم‌زمان حداکثر 10 ویال یا لوله آزمایش نیاز دارند. رویکرد غیرتهاجمی آن، ضمن تضمین هضم تکرارپذیر پروتئین، خطرات آلودگی متقاطع را حذف می‌کند. این دستگاه برای پژوهشگرانی که با حجم‌های محدود نمونه یا انواع متنوع نمونه کار می‌کنند، ایدئال است.
درباره سونیکاتور چندلوله‌ای VialTweeter بیشتر بدانید!
Hielscher UP200St-CupHorn
سونیکاتور CupHorn دستگاهی قدرتمند است که برای پردازش هم‌زمان چندین نمونه در ظروف دربسته طراحی شده است. این دستگاه توزیع یکنواخت انرژی فراصوتی و کنترل دقیق دما را تضمین می‌کند. توانایی پردازش هم‌زمان حداکثر پنج نمونه، همراه با سازگاری با گردش‌کارهای شامل احیا، آلکیلاسیون و هضم، CupHorn را به ابزاری قابل‌اعتماد برای پروتئومیکس مبتنی بر MS تبدیل می‌کند.
درباره CupHorn SonoReactor بیشتر بدانید!
پروتکل گام‌به‌گام هضم پروتئولیتیک به کمک فراصوت‌دهی با استفاده از تریپسین تثبیت‌شده روی نانوذرات
این پروتکل از Martins et al. (2019) برای هضم سریع پروتئین با استفاده از انرژی فراصوتی و تریپسین تثبیت‌شده روی نانوذرات (T-FMNPs) بهینه‌سازی شده است. مراحل تشریح‌شده، احیا، آلکیلاسیون و پروتئولیز کارآمد و مناسب برای کاربردهای طیف‌سنجی جرمی (MS) را تضمین می‌کنند.
مراحل پروتکل
- احیای پیوندهای دی‌سولفیدی
- به نمونه پروتئینی 20 µL (0٫5 mg/mL) در بافر AmBic، مقدار 2 µL محلول DTT (110 mM) اضافه کنید.
- لوله نمونه را در سونورآکتور UP200St-CupHorn قرار دهید.
- نمونه را به مدت 2٫5 دقیقه با دامنه 50% فراصوت‌دهی کنید (200 W, 26 kHz).
- برای خنک‌شدن، وقفه‌ای کوتاه ایجاد کنید؛ سپس در همان شرایط، 2٫5 دقیقه دیگر فراصوت‌دهی کنید.
- آلکیلاسیون باقی‌مانده‌های سیستئین احیاشده
- به نمونه پروتئینی احیاشده، مقدار 2 µL محلول IAA (400 mM) اضافه کنید.
- برای تسهیل آلکیلاسیون، به مدت 2٫5 دقیقه با دامنه 50% فراصوت‌دهی کنید.
- برای خنک‌شدن مکث کنید؛ سپس 2٫5 دقیقه دیگر فراصوت‌دهی کنید.
توجه: برای جلوگیری از تجزیه IAA، قرارگیری نمونه آلکیله‌شده در معرض نور را به حداقل برسانید.
- رقیق‌سازی نمونه
- نمونه پروتئینی آلکیله‌شده را با استفاده از بافر AmBic با غلظت 25 mM حاوی 4% استونیتریل (v/v)، تا حجم نهایی 100 µL رقیق کنید.
- با پیپتاژ ملایم، کاملاً مخلوط کنید.
- هضم پروتئولیتیک با تریپسین تثبیت‌شده روی نانوذرات
- به نمونه پروتئینی رقیق‌شده، مقدار 20 µL محلول T-FMNP (3 mg/mL) اضافه کنید.
- مخلوط را در سونورآکتور به مدت 2٫5 دقیقه با دامنه 50% فراصوت‌دهی کنید.
- برای خنک‌شدن مکث کنید؛ سپس در همان شرایط، 2٫5 دقیقه دیگر فراصوت‌دهی کنید.
- جداسازی نانوذرات تریپسین
- با استفاده از آهنربا، T-FMNPs را از مایع رویی حاوی پپتیدهای حاصل از هضم جدا کنید.
- مایع رویی را به یک لوله میکروسانتریفیوژ جدید منتقل کنید.
- آماده‌سازی پپتیدها برای آنالیز MS
- مایع رویی حاوی پپتیدها را در سانتریفیوژ خلأ خشک کنید.
- پپتیدهای خشک‌شده را تا آنالیز بعدی با طیف‌سنجی جرمی، در دمای -20°C نگهداری کنید.
منابع علمی / مراجع
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP550MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet VialTweeter Multi-Tube Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- Gonçalo Martins, Javier Fernández-Lodeiro, Jamila Djafari, Carlos Lodeiro, J.L. Capelo, Hugo M. Santos (2019): Label-free protein quantification after ultrafast digestion of complex proteomes using ultrasonic energy and immobilized-trypsin magnetic nanoparticles. Talanta, Volume 196, 2019. 262-270.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.
پرسش‌های متداول
5 مرحله آنالیز پروتئوم کدام‌اند؟
پنج مرحله آنالیز پروتئوم عبارت‌اند از: (1) استخراج پروتئین، که در آن پروتئین‌ها با استفاده از بافرهای لیز از نمونه‌های زیستی جدا می‌شوند؛ (2) جداسازی پروتئین، که معمولاً با روش‌هایی مانند الکتروفورز ژل یا کروماتوگرافی مایع برای تفکیک مخلوط‌های پیچیده انجام می‌شود؛ (3) هضم پروتئین، که در آن پروتئین‌ها به‌صورت آنزیمی و اغلب با استفاده از تریپسین به پپتیدها شکسته می‌شوند؛ (4) آنالیز طیف‌سنجی جرمی، که در آن پپتیدها یونیده و قطعه‌قطعه می‌شوند و برای تعیین جرم و توالی خود مورد آنالیز قرار می‌گیرند؛ و (5) تحلیل داده‌ها، که در آن ابزارهای بیوانفورماتیک بر اساس داده‌های طیف‌سنجی جرمی، پروتئین‌ها را شناسایی و اندازه‌گیری کمی می‌کنند و اطلاعاتی درباره پروتئوم به دست می‌دهند.
هضم پروتئولیتیک چیست؟
هضم پروتئولیتیک فرایندی آنزیمی است که طی آن پروتئین‌ها با شکستن پیوندهای پپتیدی به پپتیدهای کوچک‌تر یا اسیدهای آمینه هیدرولیز می‌شوند؛ این فرایند معمولاً به‌وسیله آنزیم‌های پروتئولیتیک تسهیل می‌شود.
3 آنزیم پروتئولیتیک کدام‌اند؟
سه آنزیم اصلی پروتئولیتیک عبارت‌اند از تریپسین، کیموتریپسین و پپسین که هرکدام اختصاصیت سوبسترایی و شرایط بهینه فعالیت ویژه خود را دارند.
روش‌های پروتئولیز کدام‌اند؟
روش‌های پروتئولیز شامل هضم آنزیمی (برای مثال، با استفاده از تریپسین یا سایر پروتئازها)، برش شیمیایی (برای مثال، سیانوژن برومید برای باقی‌مانده‌های متیونین) و روش‌های فیزیکی مانند فراصوت‌دهی برای افزایش فعالیت آنزیمی هستند.
چه عواملی پروتئولیز را مهار می‌کنند؟
پروتئولیز می‌تواند به‌وسیله مهارکننده‌های پروتئاز، مانند فنیل‌متیل‌سولفونیل فلوراید (PMSF) یا اتیلن‌دی‌آمین‌تترااستیک اسید (EDTA)، عوامل محیطی مانند pH یا دمای بسیار بالا یا پایین، یا نبود کوفاکتورهای ضروری برای فعالیت پروتئاز مهار شود.
Hielscher Ultrasonics هموژنایزرهای فراصوتی با عملکرد بالا را در اندازه‌های آزمایشگاهی تا صنعتی تولید می‌کند.