گردش کار پروتئومیک با هضم پروتئین با توان عملیاتی بالا
پروتئومیکس یک زمینه ضروری برای درک فرآیندها و سیستم های بیولوژیکی است که هضم پروتئین یک مرحله حیاتی در گردش کار آن است. به طور سنتی، هضم پروتئین در محلول با استفاده از آنزیم های پروتئولیتیک مانند تریپسین انجام می شود که به طور خاص پیوندهای پپتیدی را در بقایای لیزین و آرژنین هیدرولیز می کند. این فرآیند پپتیدهایی را تولید می کند که برای یونیزاسیون و تکه تکه شدن در کاربردهای طیف سنجی جرمی (MS) مناسب هستند. با این حال، روش های هضم معمولی به 12 تا 24 ساعت زمان نیاز دارد تا به پایان برسد و گلوگاه های قابل توجهی در گردش کار پروتئومیک ایجاد می کند.
اولتراسونیک ارائه می دهد یک جایگزین قدرتمند, به طور چشمگیری کوتاه کردن زمان هضم از ساعت به تنها چند دقیقه. هنگامی که با فراصوت های چند نمونه پیشرفته مانند Hielscher CupHorn ، VialTweeter و UIP400MTP سونیکاتور صفحه 96 چاه ترکیب می شود ، مافوق صوت را قادر می سازد شتاب ، پروتئومیکس با توان بالا. این فناوری ها گردش کار را ساده می کنند، زمان آماده سازی نمونه را کاهش می دهند و کارایی را بدون به خطر انداختن تکرارپذیری یا کیفیت داده ها افزایش می دهند.
نقش انرژی اولتراسونیک در هضم پروتئین
امواج فراصوت از امواج اولتراسوند متمرکز برای ایجاد حفره استفاده می کند - میکرو حباب های موضعی که فرو می ریزند تا نیروهای برشی شدید ایجاد کنند. این پدیده انتقال جرم را افزایش می دهد، اختلاط آنزیم ها با بسترها را تقویت می کند و ساختارهای پروتئینی را آشکار می کند و مکان های شکاف را در معرض آنزیم های پروتئولیتیک مانند تریپسین قرار می دهد.
نتیجه؟ کاهش قابل توجه زمان هضم بدون به خطر انداختن کارایی یا تکرارپذیری.
هضم پروتئولیتیک تقویت شده با اولتراسونیک: روش شناسی و نتایج
پروتکل هضم تسریع شده
هضم به کمک اولتراسونیک ترکیبی از آنزیم های پروتئولیتیک و انرژی اولتراسونیک برای تسریع گردش کار است. به عنوان مثال، با استفاده از Hielscher UP200St-CupHorn (200 وات، 26 کیلوهرتز)، گردش کار هضم به شرح زیر پیش می رود:
- کاهش: نمونه های پروتئینی (0.5 میلی گرم بر میلی لیتر، 20 میکرولیتر) با DTT (2 میکرولیتر، 110 میلی مولار) در بافر بی کربنات آمونیوم (12.5 میلی مولار) تیمار می شوند. فراصوت در دامنه 50٪ به مدت 5 دقیقه اعمال می شود.
- آلکیلاسیون: پس از اضافه کردن IAA (2 میکرولیتر، 400 میلی مولار)، فراصوت تحت همان شرایط تکرار می شود.
- هضم: نمونه ها رقیق شده و با نانوذرات تریپسین تثبیت شده انکوبه می شوند. دور نهایی فراصوت (5 دقیقه) هضم را کامل می کند. پپتیدها جدا شده، خشک شده و برای تجزیه و تحلیل MS ذخیره می شوند.
این روش اولتراسونیک زمان آماده سازی کل را از 12 ساعت به کمتر از 30 دقیقه کاهش می دهد. با وجود روند تسریع شده، بازده و کیفیت پپتیدی با روش های سنتی یک شبه سازگار است.
بهره وری هضم پروتئین اولتراسونیک
در مطالعات مقایسه ای با استفاده از پروتئوم های E. coli:
- شناسایی پروتئین: نمونه های هضم شده اولتراسونیک 777 پروتئین را در 5 دقیقه شناسایی کردند، در مقایسه با 817 پروتئین در 12 ساعت. شناسایی پروتئین مشترک بیش از 70 درصد بود.
- تکرارپذیری: تجزیه و تحلیل های تکراری مقادیر همبستگی بالای 98 درصد را در هر روش نشان داد که پایایی را نشان می دهد.
- گزینش پذیری: پروتئین های خاصی ترجیحا توسط هر روش هضم شدند، با هضم اولتراسونیک به نفع 65 پروتئین و هضم شبانه 54 پروتئین. چنین تفاوت های ظریف تاکید پتانسیل منحصر به فرد از ultrasonication برای برنامه های کاربردی خاص.
نتایج کمی سازی پروتئین بدون برچسب هفت پروتئین میخ دار در E. coli
نمونه. پروتئین های زیر در دو سطح مختلف همانطور که در ستون ذکر شد اضافه شدند
به عنوان "نسبت تئو" نامگذاری شده است. نسبت تئو نسبت نظری بین دو سطح مورد استفاده در این است
آزمایش. آلبومین سرم گاو (ALBU)، β-لاکتوگلوبولین (LACB)، α-S1 کازئین (CASA1)،
α-S2 کازئین (CASA2)، سیتوکروم c (CYC)، اووالبومین (OVAL) و کربنیک انیدراز 2
(CAH2). نسبت ها با استفاده از شدت پروتئین LFQ به دست آمده از MaxQuant محاسبه شدند
analysis. The student’s t test was applied to compare the values obtained with each method (p>0.01, n=3, t-theoretical=4.6).
مطالعه و گرافیک: © مارتینز و همکاران ، 2019)
تریپسین تثبیت شده با نانوذرات
ادغام نانوذرات تریپسین تثبیت شده (به عنوان مثال، T-FMNPs) با امواج فراصوت بیشتر افزایش گردش کار پروتئومیکس. این نانوذرات سطح بالایی را برای برهمکنش های آنزیم-سوبسترا فراهم می کنند و کارایی را افزایش می دهند. هنگامی که برای پروتئوم های پیچیده مانند E. coli اعمال می شود، روش ترکیبی به موارد زیر دست می یابد:
- سرعت: هضم کامل در عرض 5 دقیقه.
- دقت: Comparable protein quantification to traditional methods (p > 0.01, n=3).
- مقیاس پذیری: انطباق با پلتفرم های چند چاهی مانند UIP400MTP پردازش با توان بالا را امکان پذیر می کند.
برای پروتکل دقیق با دستورالعمل های گام به گام اینجا را کلیک کنید!
(رجوع کنید به مارتینز و همکاران، 2019)
هضم پروتئولیتیک در سرعت بالا و توان عملیاتی بالا با فراصوت Hielscher
بهترین مدل های Sonicator برای پروتئومیکس
Hielscher مافوق صوت ارائه می دهد مدل های مختلف فراصوت برای آماده سازی چند نمونه به طور همزمان تسهیل گردش کار با توان عملیاتی بالا. چه با ویال ها، لوله های آزمایش، صفحات چند چاهی (به عنوان مثال صفحات 6، 24، 96 چاهی) یا ظروف پتری کار کنید. – ما به شما ماسونیک ایده آل برای آزمایش های خود را ارائه می دهیم.
UIP400MTP چند چاه صفحه فراصوت
برای توان عملیاتی نهایی، UIP400MTP قابلیت پردازش صفحات 96 چاه را به صورت اولتراسونیک فراهم می کند. سازگار با هر میکروپلیت استاندارد، UIP400MTP به یکبار مصرف اختصاصی گران قیمت نیاز ندارد و به شما این آزادی را می دهد که بهترین صفحه چند چاهی را برای تحقیقات خود انتخاب کنید. با ارائه انرژی یکنواخت در سراسر صفحه، کاهش سریع، آلکیلاسیون و هضم تا 200 پروتئوم پیچیده را تنها در 1 ساعت امکان پذیر می کند. این سطح از اتوماسیون و کارایی برای پروتئومیکس با توان عملیاتی بالا و کاربردهای بالینی بسیار مهم است. درباره فراصوت صفحه چند چاه بیشتر بدانید!
VialTweeter(ویال گروهی)
VialTweeter برای آزمایشگاه هایی طراحی شده است که نیاز به فراصوت همزمان تا 10 ویال یا لوله های آزمایش دارند. رویکرد غیر تهاجمی آن خطرات آلودگی متقابل را از بین می برد و در عین حال هضم پروتئین قابل تکرار را تضمین می کند. این دستگاه برای محققانی که با حجم نمونه محدود یا انواع نمونه های مختلف کار می کنند ایده آل است.
درباره ماسونیک چند لوله VialTweeter بیشتر بدانید!
Hielscher UP200St-CupHorn
سونیکاتور CupHorn یک دستگاه قدرتمند است که برای پردازش همزمان چندین نمونه در ظروف مهر و موم شده طراحی شده است. توزیع یکنواخت انرژی اولتراسونیک و کنترل دقیق دما را تضمین می کند. توانایی پردازش حداکثر پنج نمونه به طور همزمان، همراه با سازگاری آن با گردش کار کاهش یافته، آلکیله شده و هضم شده، CupHorn را به ابزاری قابل اعتماد برای پروتئومیکس مبتنی بر MS تبدیل می کند.
درباره CupHorn SonoReactor بیشتر بدانید!
UIP400MTP یک حمام اولتراسونیک نیست. این یک شاخ فنجان با شدت بالا برای فراصوت متمرکز است. این فراصوت قدرتمند بدون تماس ارائه فراصوت یکنواخت در سراسر تمام چاه های استاندارد خود را به خوبی بشقاب. شما کنترل دقیقی بر دامنه، توان و ضربان دارید. یک تایمر داخلی و پروب دما نتایج ثابتی را تضمین می کند. سونیکاتور صفحه UIP400MTP نمونه ها را با حمام آب خنک می کند (چیلر خارجی اختیاری).
پروتکل گام به گام برای هضم پروتئولیتیک به کمک اولتراسونیک با استفاده از تریپسین تثبیت شده با نانوذرات
این پروتکل توسط مارتینز و همکاران (2019) برای هضم سریع پروتئین با استفاده از انرژی اولتراسونیک و تریپسین تثبیت شده با نانوذرات (T-FMNPs) بهینه شده است. مراحل ذکر شده کاهش کارآمد، آلکیلاسیون و پروتئولیز مناسب برای کاربردهای طیف سنجی جرمی (MS) را تضمین می کند.
مراحل پروتکل
- کاهش پیوندهای دی سولفید
- 2 میکرولیتر محلول DTT (110 میلی مولار) را به نمونه پروتئین 20 میکرولیتری (0.5 میلی گرم در میلی لیتر) در بافر AmBic اضافه کنید.
- لوله نمونه را در سونوره عامل UP200St-CupHorn قرار دهید.
- نمونه را به مدت 2.5 دقیقه با دامنه 50٪ (200 وات ، 26 کیلوهرتز) فراصوت کنید.
- مکث برای یک فاصله کوتاه اجازه می دهد خنک کننده، سپس برای دیگر 2.5 دقیقه تحت همان شرایط.
- آلکیلاسیون بقایای سیستئین کاهش یافته
- 2 میکرولیتر محلول IAA (400 میلی مولار) را به نمونه پروتئین کاهش یافته اضافه کنید.
- به مدت 2.5 دقیقه با دامنه 50 درصد برای تسهیل آلکیلاسیون فراصوت کنید.
- برای خنک شدن مکث کنید، سپس برای 2.5 دقیقه اضافی فراصوت کنید.
توجه داشته باشید: قرار گرفتن نمونه آلکیله شده در معرض نور را به حداقل برسانید تا از تخریب IAA جلوگیری شود.
- رقت نمونه
- نمونه پروتئین آلکیله شده را با استفاده از بافر 25 میلی مولار AmBic حاوی 4 درصد استونیتریل (v/v) تا حجم نهایی 100 میکرولیتر رقیق کنید.
- با پیپت ملایم کاملا مخلوط کنید.
- هضم پروتئولیتیک با تریپسین تثبیت شده با نانوذرات
- 20 میکرولیتر محلول T-FMNP (3 میلی گرم در میلی لیتر) را به نمونه پروتئین رقیق شده اضافه کنید.
- مخلوط را به مدت 2.5 دقیقه در دامنه 50 درصد در سونراکتور فراصوت کنید.
- برای خنک شدن مکث کنید، سپس برای 2.5 دقیقه دیگر تحت همان شرایط فراصوت کنید.
- جداسازی نانوذرات تریپسین
- از آهنربا برای جدا کردن T-FMNP ها از مایع رویی حاوی پپتیدهای هضم شده استفاده کنید.
- مایع رویی را به یک لوله میکرو سانتریفیوژ جدید منتقل کنید.
- آماده سازی پپتید برای تجزیه و تحلیل MS
- مایع رویی حاوی پپتیدها را در سانتریفیوژ خلاء خشک کنید.
- پپتیدهای خشک شده را در دمای 20- درجه سانتیگراد نگهداری کنید تا تجزیه و تحلیل بیشتر توسط طیف سنجی جرمی انجام شود.
ادبیات / منابع
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet VialTweeter Multi-Tube Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- Gonçalo Martins, Javier Fernández-Lodeiro, Jamila Djafari, Carlos Lodeiro, J.L. Capelo, Hugo M. Santos (2019): Label-free protein quantification after ultrafast digestion of complex proteomes using ultrasonic energy and immobilized-trypsin magnetic nanoparticles. Talanta, Volume 196, 2019. 262-270.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.
پرسش و پاسخهای متداول
5 مرحله تجزیه و تحلیل پروتئوم چیست؟
پنج مرحله تجزیه و تحلیل پروتئوم عبارتند از: (1) استخراج پروتئین، که در آن پروتئین ها با استفاده از بافرهای لیز از نمونه های بیولوژیکی جدا می شوند. (2) جداسازی پروتئین، که معمولا از طریق تکنیک هایی مانند الکتروفورز ژل یا کروماتوگرافی مایع برای حل مخلوط های پیچیده به دست می آید. (3) هضم پروتئین، که در آن پروتئین ها به صورت آنزیمی به پپتیدها تقسیم می شوند، اغلب با استفاده از تریپسین استفاده می کنند. (4) تجزیه و تحلیل طیف سنجی جرمی، که در آن پپتیدها یونیزه می شوند، تکه تکه می شوند و برای تعیین جرم و توالی آنها تجزیه و تحلیل می شوند. و (5) تجزیه و تحلیل داده ها، که در آن ابزارهای بیوانفورماتیک پروتئین ها را بر اساس داده های طیف سنجی جرمی شناسایی و تعیین می کنند و بینش هایی را در مورد پروتئوم ارائه می دهند.
هضم پروتئولیتیک چیست؟
هضم پروتئولیتیک فرآیند آنزیمی است که طی آن پروتئین ها از طریق شکاف پیوندهای پپتیدی به پپتیدهای کوچکتر یا اسیدهای آمینه هیدرولیز می شوند که معمولا توسط آنزیم های پروتئولیتیک تسهیل می شوند.
3 آنزیم پروتئولیتیک کدامند؟
سه آنزیم اصلی پروتئولیتیک تریپسین ، کیموتریپسین و پپسین هستند که هر کدام دارای ویژگی های خاص بستر و شرایط فعالیت مطلوب هستند.
روش های پروتئولیز چیست؟
روش های پروتئولیز شامل هضم آنزیمی (به عنوان مثال، با استفاده از تریپسین یا سایر پروتئازها)، شکاف شیمیایی (به عنوان مثال، سیانوژن بروماید برای باقیمانده متیونین)، و روش های فیزیکی مانند امواج فراصوت برای افزایش فعالیت آنزیمی.
چه چیزی پروتئولیز را مهار می کند؟
پروتئولیز را می توان توسط مهارکننده های پروتئاز مانند فنیل متیل سولفونیل فلوراید (PMSF) یا اتیلن دی آمین تترا استیک اسید (EDTA) ، توسط عوامل محیطی مانند pH یا دما شدید یا عدم وجود کوفاکتورهای مورد نیاز برای فعالیت پروتئاز مهار کرد.
Hielscher مافوق صوت تولید کننده هموژنایزرهای مافوق صوت با کارایی بالا از ازمایشگاه ها تا اندازه صنعتی.