آماده سازی نمونه با کمک فیلتر اولتراسونیک (FASP): بهبود جریان های کاری پروتئومیکس با سونیکاسیون پیشرفته

آماده سازی نمونه با کمک فیلتر اولتراسونیک (FASP) به عنوان روشی بسیار کارآمد و قابل تکرار در پروتئومیک مدرن در حال ظهور است. با ادغام سونیک کنترل شده در جریان های کاری تثبیت شده FASP، پژوهشگران می توانند استخراج پروتئین، کارایی هضم و کیفیت کلی داده ها را به طور قابل توجهی بهبود بخشند. با افزایش تقاضا برای آماده سازی نمونه با توان بالا و قابل تکرار، سونیکاتورهای متمرکز مانند سونیکاتور میکروپلیت UIP400MTP اهمیت علمی و عملی پیدا می کنند.

زمینه علمی: چرا FASP در پروتئومیک اهمیت دارد

آماده سازی نمونه با کمک فیلتر (FASP) به دلیل توانایی حذف شوینده ها، نمک ها و سایر آلاینده ها و تسهیل هضم آنزیمی کارآمد، به استاندارد طلایی در پروتئومیکس پایین به بالا تبدیل شده است. با این حال، پروتکل های کلاسیک FASP اغلب با محدودیت هایی مانند لیز ناقص، هضم ناسازگار و تنوع نمونه مواجه هستند – به ویژه هنگام سروکار با سلول ها یا بافت های زیستی پیچیده یا مقاوم.
اینجاست که انرژی متمرکز فراصوت (سونیکاشن) مزیت قاطعی ایجاد می کند. با وارد کردن نیروهای برشی مکانیکی و کاویتاسیون، سونیک چندین مرحله حیاتی در جریان کاری FASP را بدون به خطر انداختن یکپارچگی پروتئین بهبود می بخشد.

اثرات مثبت سونیکاسیون در FASP اولتراسونیک

سونیکاسیون کاویتاسیون آکوستیک کنترل شده را معرفی می کند – تشکیل و فروپاشی حباب های میکروسکوپی – که نیروهای برشی موضعی و میکرواستریمینگ تولید می کند.
سونیکاسیون هم مراحل آلکیلاسیون و هم هضم را در FASP اولتراسونیک با بهبود انتقال جرم و تسریع سینتیک واکنش بهبود می بخشد. کاربرد انرژی فراصوت باعث ایجاد کاویتاسیون می شود که منجر به میکروجریان موضعی و نیروهای برشی گذرا می گردد که باعث اختلاط سریع و نفوذ مؤثر معرف ها به ماتریس پروتئین یا محیط فیلتر می شود. در طول آلکیلاسیون، این امر منجر به تغییر یکنواخت تر و سریع تر باقی مانده های سیستئین توسط یدواستامید می شود. در مرحله هضم، سونیکاسیون دسترسی به محل های برش پروتئولیتیک را افزایش داده و تعاملات آنزیم-سوبسترا را بهبود می بخشد و بدین ترتیب فعالیت تریپسین را تسریع کرده و کارایی هضم را افزایش می دهد. در مجموع، درمان اولتراسونیک زمان پردازش را کاهش می دهد و در عین حال کامل بودن واکنش و قابلیت تکرارپذیری را حفظ یا بهبود می بخشد.

در آماده سازی نمونه پروتئومیک، FASP فراصوت به صورت زیر ترجمه می شود:

• اختلال سلولی و استخراج پروتئین کارآمدتر، حتی در بافت های سخت یا نمونه های میکروبی
• حل شدن تقویت شده پروتئین ها
• بهبود دسترسی به آنزیم ها در طول هضم
• کاهش زمان پردازش و افزایش قابلیت تکرارپذیری

برخلاف روش های مکانیکی یا شیمیایی متداول، پردازش اولتراسونیک بسیار قابل کنترل و مقیاس پذیر است که آن را به ویژه برای جریان های کاری استاندارد پروتئومیکس مناسب می کند.

مزایای FASP فراصوت نسبت به روش های متداول

ادغام سونیکاسیون در پروتکل های FASP مزایای قابل اندازه گیری ای فراهم می کند که مستقیما بر نتایج طیف سنجی جرمی پایین دستی تأثیر می گذارد.
FASP اولتراسونیک امکان بازیابی کامل تر پروتئین را فراهم می کند، به ویژه از نمونه های چالش برانگیز مانند بافت های فیبری یا بیوفیلم ها. توزیع یکنواخت انرژی تضمین می کند که در سراسر تکرارها یکنواخت رفتار یکنواخت انجام می شود و تغییرپذیری را کاهش می دهد – یک نیاز اساسی برای پروتئومیکس کمی.
علاوه بر این، سونیکاسیون با بهبود تعامل آنزیم و سوبسترا باعث تسریع سینتیک هضم می شود. این اغلب منجر به زمان هضم کوتاه تر و افزایش بازده پپتیدی می شود، در حالی که پوشش توالی حفظ می شود.
از منظر جریان کار، سیستم های اولتراسونیک مداخله دستی را کاهش داده و نیاز به درمان های شیمیایی تهاجمی را از بین می برند، که باعث حفظ یکپارچگی نمونه و ساده سازی استانداردسازی پروتکل ها می شود.

نمودار ون که افزایش تعداد پروتئین های شناسایی شده توسط FASP اولتراسونیک را نسبت به FASP شبانه نشان می دهد
تصویر و مطالعه: ©کاروالیو و همکاران، ۲۰۲۰

پروتکل: FASP اولتراسونیک با توان بالا و UIP400MTP

برای آزمایشگاه هایی که نمونه های بزرگ را پردازش می کنند، سونیکاتور میکروپلیت UIP400MTP امکان سونیک همزمان صفحات چندچاهکی استاندارد (مثلا صفحات ۹۶ چاه) را فراهم می کند که به طور قابل توجهی توان عملیاتی و تکرارپذیری را افزایش می دهد.
در این قالب، نمونه ها (معمولا ۵۰ تا ۲۰۰ میکرولیتر در هر چاه) مستقیما در میکروپلیت هایی که با اولترافیلتراسیون یا پردازش پایین دستی سازگار هستند، آماده می شوند. بافرهای لیز مشابه بافرهای استفاده شده در پروتکل های استاندارد FASP هستند.

UIP400MTP انرژی اولتراسونیک یکنواخت را در تمام چاه ها اعمال می کند. سونیکاسیون معمولا در دامنه ۶۰ تا ۸۰ درصد به مدت ۲ تا ۴ دقیقه، بسته به نوع نمونه، انجام می شود. دمای بدن را با استفاده از سنسور دمای قابل اتصال کنترل کنید. با استفاده از پالس سونیک و حتی به صورت اختیاری به یک چیلر آزمایشگاهی.

پروتکل نمونه:

1. برای مرحله آلکیلاسیون، نمونه ها با استفاده از سونیکاتور میکروپلیت (UIP400MTP) با دامنه ۴۰٪ به مدت ۷ چرخه (۳۰ ثانیه روشن، ۱۵ ثانیه خاموش؛ کل زمان سونیکاون: ۵ دقیقه و ۴۵ ثانیه) سونیک می شوند.
2. پس از سونیکاسیون، محلول یدواستامید (IAA) با سانتریفیوژ حذف می شود. قبل از هضم تریپسین، نمونه ها باید شسته شوند تا اوره باقی مانده که یک عامل آتوتروپیک قوی است و فعالیت آنزیمی را مهار می کند، حذف شود. بنابراین، نمونه ها دو بار با ۲۰۰ میکرولیتر بی کربنات آمونیوم ۲۵ میلی مولار (AmBic) شسته می شوند.
3. سپس ۱۰۰ میکرولیتر محلول تریپسین (نسبت آنزیم به پروتئین ۱:۳۰) تهیه شده در ۱۲.۵ میلی مولار بی کربنات آمونیوم اضافه می شود. سپس هضم پروتئین با استفاده از UIP400MTP و تحت همان شرایط صوتی (۴۰٪ دامنه، ۷ چرخه، ۳۰ ثانیه روشن / ۱۵ ثانیه خاموش؛ زمان کل: ۵ دقیقه و ۴۵ ثانیه) انجام می شود.
4. پس از سونیکاسیون، نمونه ها به صفحات فیلتر منتقل می شوند یا با استفاده از سیستم های FASP مبتنی بر صفحه پردازش می شوند. مراحل کاهش و آلکیلاسیون درون صفحه انجام می شود و روند کاری روان حفظ می گردد.
5. هضم تریپسین تحت شرایط کنترل شده (مثلا ۳۷ درجه سانتی گراد، ۴ تا ۱۶ ساعت) انجام می شود، با گزینه تحریک فراصوتی کوتاه مدت برای تسریع فعالیت آنزیمی و افزایش بازده پپتید.
6. پپتیدها با سانتریفیوژ بازیابی شده و آماده تحلیل LC-MS/MS هستند.

مزیت کلیدی این سیستم در توانایی ارائه شرایط پردازش یکسان در تمام چاه ها، به حداقل رساندن اثرات دسته ای و امکان مقایسه های کمی قوی در مطالعات پروتئومیکس بزرگ مقیاس است.

طراحی، ساخت و مشاوره – کیفیت ساخت آلمان

مافوق صوت Hielscher به خوبی برای بالاترین کیفیت و استانداردهای طراحی خود را شناخته شده. استحکام و بهره برداری آسان اجازه می دهد تا ادغام صاف از ultrasonicators ما به امکانات صنعتی. شرایط خشن و محیط های خواستار به راحتی توسط مافوق صوت Hielscher رسیده.

Hielscher اولتراسونیک یک شرکت دارای گواهینامه ISO است و تاکید ویژه ای بر مافوق صوت با کارایی بالا با ویژگی های دولت از هنر فن آوری و کاربر پسند قرار داده است. البته، مافوق صوت Hielscher مطابق با CE و دیدار با الزامات UL، CSA و RoHs.

ادبیات / منابع