استخراج پروتئین به کمک فراصوت‌دهی برای فسفوپروتئومیکس
در علوم زیستی نوین، فسفوپروتئومیکس به فناوری بنیادینی برای رمزگشایی مسیرهای پیام‌رسانی سلولی و درک سازوکارهای بیماری در سطح سامانه‌ای تبدیل شده است. از آنجا که فسفریلاسیون عملکردهای حیاتی زیستی – از فعالیت آنزیمی تا برهم‌کنش‌های پروتئین–پروتئین – را تنظیم می‌کند، اندازه‌گیری دقیق آن هم برای پژوهش‌های بنیادی و هم برای پزشکی ترجمانی ضروری است. پیشرفت‌های اخیر در طیف‌سنجی جرمی، شناسایی ده‌ها هزار رویداد فسفریلاسیون را در یک آزمایش امکان‌پذیر کرده‌اند و بر نیاز به گردش‌کارهای آماده‌سازی نمونه که قابل‌اتکا، مقیاس‌پذیر و تکرارپذیر باشند تأکید می‌کنند.
یکی از تأثیرگذارترین تحولات این حوزه، به‌کارگیری استخراج پروتئین به کمک فراصوت‌دهی است که کیفیت نمونه، ظرفیت پردازش نمونه‌ها و تکرارپذیری را به‌طور چشمگیری افزایش می‌دهد. فناوری‌های فراصوتی مانند VialTweeter و UIP400MTP اکنون در حال بازتعریف شیوه پردازش مجموعه‌های بزرگ نمونه در آزمایشگاه‌ها هستند، به‌ویژه در فسفوپروتئومیکس با ظرفیت پردازش بالا.
اهمیت علمی آماده‌سازی کارآمد نمونه در فسفوپروتئومیکس
فسفریلاسیون پروتئین یک تغییر پساترجمۀ بسیار پویا و برگشت‌پذیر است که بر بیشتر پروتئین‌های سلول‌های انسانی تأثیر می‌گذارد. این فرایند ساختار، جایگیری و شبکه‌های برهم‌کنش پروتئین‌ها را تنظیم می‌کند و اختلال در تنظیم آن در بیماری‌هایی مانند سرطان و تخریب عصبی نقش دارد.
بااین‌حال، تجزیه‌وتحلیل فسفوپروتئومی چالش‌های فنی ویژه‌ای دارد. پپتیدهای فسفریله اغلب فراوانی کمی دارند و به غنی‌سازی دقیق و آماده‌سازی بسیار کارآمد نمونه در مراحل بالادستی نیاز دارند. هرگونه ناکارآمدی در استخراج یا هضم پروتئین می‌تواند به از دست رفتن سیگنال، تکرارپذیری ضعیف و پوشش ناقص جایگاه‌های فسفریلاسیون منجر شود.
در اینجاست که فراصوت‌دهی نقشی حیاتی پیدا می‌کند.
فراصوت‌دهی 40 ویال اتوسمپلر با UIP400MTP برای استخراج پروتئین
چرا فراصوت‌دهی در حال متحول کردن استخراج پروتئین است
فراصوت‌دهی از امواج فراصوت با شدت بالا برای تخریب مکانیکی سلول‌ها و بافت‌ها استفاده می‌کند و آزادسازی کارآمد پروتئین از سلول‌ها، بافت‌ها، مایعات زیستی و وزیکول‌های خارج‌سلولی را امکان‌پذیر می‌سازد. در مقایسه با روش‌های متداول لیز، فراصوت‌دهی چندین مزیت متمایز دارد:
- نخست، تخریب سریع و یکنواخت سلولی را تضمین می‌کند که برای حفظ وضعیت‌های گذرای فسفریلاسیون اهمیت ویژه‌ای دارد. در فسفوپروتئومیکس، حتی تأخیرهای جزئی یا لیز ناقص می‌توانند الگوهای پیام‌رسانی را تغییر دهند؛ بنابراین استخراج سریع و تکرارپذیر ضروری است.
- دوم، فراصوت‌دهی بازده استخراج و محلول‌سازی پروتئین را بهبود می‌دهد، به‌ویژه برای نمونه‌هایی که لیز آن‌ها دشوار است، مانند بافت‌های متراکم یا سلول‌های غنی از غشا. این امر مستقیماً به هضم بهتر در مراحل پایین‌دستی و بازیابی بیشتر فسفوپپتیدها منجر می‌شود.
- سوم، پردازش فراصوتی ذاتاً مقیاس‌پذیر است. دستگاه‌هایی مانند VialTweeter فراصوت‌دهی هم‌زمان چندین لوله دربسته را امکان‌پذیر می‌کنند و شرایط پردازش یکسانی را برای همه نمونه‌ها تضمین می‌کنند. این کار تغییرپذیری ناشی از کار دستی را حذف می‌کند.
- برای نیاز به ظرفیت پردازش حتی بالاتر، UIP400MTP جهشی بزرگ در فناوری به‌شمار می‌رود. این دستگاه فراصوت‌دهی مستقیم کل میکروپلیت‌ها یا رک‌های لوله، از جمله ویال‌های اتوسمپلر، را امکان‌پذیر می‌کند و ازاین‌رو برای پردازش موازی صدها نمونه ایدئال است. این قابلیت به‌ویژه در زیست‌شناسی سامانه‌ها و پژوهش‌های بالینی ارزشمند است؛ حوزه‌هایی که مجموعه‌های بزرگ نمونه در آن‌ها متداول هستند.
VialTweeter: فراصوت‌دهی هم‌زمان چندین نمونه با پارامترهای کنترل‌شده فرایند
فراصوت‌دهی با ظرفیت پردازش بالا: نگاهی به VialTweeter و UIP400MTP
ادغام دستگاه‌های پیشرفته فراصوتی در گردش‌کارهای فسفوپروتئومی صرفاً برای سهولت کار نیست – بلکه بهبودی در روش‌شناسی است.
VialTweeter برای تیمار فراصوتی هم‌زمان چندین ویال دربسته طراحی شده است و ضمن تضمین تکرارپذیری، آلودگی متقاطع را به حداقل می‌رساند. این دستگاه به‌ویژه برای کاربردهایی با ظرفیت پردازش متوسط و گردش‌کارهای استانداردشده مناسب است.
در مقابل، UIP400MTP برای محیط‌هایی با ظرفیت پردازش بالا بهینه شده است و امکانات زیر را فراهم می‌کند:
- فراصوت‌دهی یکنواخت در سراسر میکروپلیت‌های استاندارد، برای مثال پلیت‌های 96 خانه‌ای یا 384 خانه‌ای
- پردازش مستقیم رک‌های لوله و ویال‌های اتوسمپلر
- کاهش چشمگیر زمان کار مستقیم کاربر
- افزایش تکرارپذیری در مجموعه‌داده‌های بزرگ
این مقیاس‌پذیری کاملاً با رویکردهای نوین فسفوپروتئومیکس هم‌راستا است؛ رویکردهایی که در آن‌ها گردش‌کارها به‌طور معمول ده‌ها تا صدها نمونه را به‌صورت موازی پردازش می‌کنند.
پروتکل عمومی آماده‌سازی نمونه برای فسفوپروتئومیکس به کمک فراصوت‌دهی
یک گردش‌کار قابل‌اتکای فسفوپروتئومی، استخراج کارآمد پروتئین، هضم آنزیمی و غنی‌سازی فسفوپپتیدها را یکپارچه می‌کند. طرح کلی زیر بازتاب‌دهنده بهترین رویه‌های تثبیت‌شده‌ای است که برای آماده‌سازی مبتنی بر فراصوت‌دهی سازگار شده‌اند:
- توقف سریع واکنش‌های نمونه و جمع‌آوری آن
واکنش‌های سلول‌ها یا بافت‌ها به‌سرعت – معمولاً با انجماد آنی – متوقف می‌شوند تا وضعیت‌های فسفریلاسیون حفظ شوند. این مرحله به دلیل ماهیت گذرای رویدادهای فسفریلاسیون حیاتی است. - لیز فراصوتی سلول و استخراج پروتئین
نمونه‌ها یخ‌زدایی می‌شوند و معمولاً در چرخه‌های کوتاه تحت فراصوت‌دهی قرار می‌گیرند. انرژی فراصوتی غشاهای سلولی را تخریب می‌کند و پروتئین‌ها را به‌طور کارآمد آزاد می‌سازد. در گردش‌کارهای اعتبارسنجی‌شده، فراصوت‌دهی در چندین چرخه انجام می‌شود تا لیز کامل تضمین شود.
مثال: پس از یخ‌زدایی نمونه‌ها روی یخ، لیز سلولی با فراصوت‌دهی انجام شد؛ برای مثال، با دستگاه Vialtweeter طی 2 چرخه، هر چرخه به مدت 1 min. - شفاف‌سازی و تعیین مقدار پروتئین
پس از لیز، نمونه‌ها سانتریفیوژ می‌شوند تا بقایا حذف شوند. مایع رویی حاوی پروتئین‌های محلول جمع‌آوری و مقدار پروتئین آن تعیین می‌شود تا مقدار ورودی در همه نمونه‌ها یکسان باشد. - احیا و آلکیلاسیون
پیوندهای دی‌سولفیدی احیا می‌شوند (برای مثال، با استفاده از DTT) و آلکیله می‌شوند (برای مثال، با استفاده از IAA) تا پروتئین‌ها پایدار شوند و کارایی هضم افزایش یابد. - هضم پروتئولیتیک
پروتئین‌ها به‌صورت آنزیمی، معمولاً با تریپسین، هضم می‌شوند و پپتیدهایی مناسب برای تجزیه‌وتحلیل با طیف‌سنجی جرمی تولید می‌کنند. درباره هضم پروتئین تسریع‌شده با فراصوت بیشتر بخوانید! - خالص‌سازی و نمک‌زدایی پپتیدها
پپتیدها با روش‌های مبتنی بر C18 خالص‌سازی می‌شوند تا آلاینده‌هایی که ممکن است در تجزیه‌وتحلیل LC-MS اختلال ایجاد کنند، حذف شوند. - غنی‌سازی فسفوپپتیدها
با توجه به فراوانی کم پپتیدهای فسفریله، از روش‌های غنی‌سازی مانند روش‌های تمایلی Fe-NTA یا TiO₂ برای جداسازی انتخابی فسفوپپتیدها استفاده می‌شود. - تجزیه‌وتحلیل LC-MS/MS و پردازش داده‌ها
نمونه‌های غنی‌شده با طیف‌سنجی جرمی با قدرت تفکیک بالا تجزیه‌وتحلیل می‌شوند و اغلب برای بهبود تعیین مقدار و تکرارپذیری، از اکتساب مستقل از داده (DIA) استفاده می‌شود.
شایان توجه است که گردش‌کارهای مقیاس بزرگ را می‌توان با قالب پلیت‌های 96 خانه‌ای سازگار کرد تا پردازش موازی تا صدها نمونه امکان‌پذیر شود – رویکردی که کاملاً با فراصوت‌دهی مبتنی بر UIP400MTP سازگار است.
پروتکل بهینه‌شده برای توقف سریع واکنش‌های فسفوپروتئوم، غنی‌سازی فسفوپپتیدها و Phos-DIA-MS.
پروتکل و تصویر: ©Die et al. 2023
رک لوله تحت فراصوت‌دهی در UIP400MTP برای استخراج و هضم پروتئین
افزایش تکرارپذیری و کیفیت داده‌ها با فراصوت‌دهی
یکی از چالش‌های اصلی فسفوپروتئومیکس، دستیابی به تعیین مقدار یکسان و سازگار در مجموعه‌داده‌های بزرگ است. تغییرپذیری ایجادشده هنگام آماده‌سازی نمونه می‌تواند تفاوت‌های معنادار زیستی را پنهان کند.
فراصوت‌دهی با فراهم کردن موارد زیر این چالش را برطرف می‌کند:
- ورودی انرژی استانداردشده برای همه نمونه‌ها
- کاهش تغییرپذیری ناشی از کار دستی
- بهبود تکرارپذیری در استخراج و هضم پروتئین
با ترکیب فراصوت‌دهی و سامانه‌هایی با ظرفیت پردازش بالا مانند UIP400MTP، آزمایشگاه‌ها می‌توانند به سطحی از یکسانی و سازگاری نتایج دست یابند که برای مطالعات زیست‌شناسی سامانه‌ها و کشف نشانگرهای زیستی بالینی ضروری است.
آینده فسفوپروتئومیکس: خودکارسازی و مقیاس‌پذیری
با گسترش روزافزون فسفوپروتئومیکس در کاربردهای مقیاس بزرگ و بالینی، تقاضا برای خودکارسازی و ظرفیت پردازش نیز پیوسته افزایش خواهد یافت. آماده‌سازی نمونه مبتنی بر فراصوت‌دهی، به‌ویژه هنگامی که با سامانه‌های سازگار با میکروپلیت یکپارچه شود، فناوری کلیدی برای فراهم کردن این قابلیت‌ها است.
دستگاه‌هایی مانند VialTweeter و UIP400MTP با ترکیب لیز فراصوتی کارآمد، پردازش موازی و سازگاری با گردش‌کارهای خودکار، استانداردهای تازه‌ای در آماده‌سازی نمونه برای پروتئومیکس تعیین می‌کنند.
درباره ادغام UIP400MTP در گردش‌کارهای خودکار آزمایشگاهی بیشتر بخوانید!
از مزایای آماده‌سازی نمونه به کمک فراصوت‌دهی در فسفوپروتئومیکس بهره‌مند شوید!
استخراج پروتئین به کمک فراصوت‌دهی به بخشی حیاتی از فسفوپروتئومیکس نوین تبدیل شده است و کارایی، مقیاس‌پذیری و تکرارپذیری بی‌نظیری ارائه می‌دهد. با افزایش نیاز به تجزیه‌وتحلیل سامانه‌های زیستی پیچیده در مجموعه‌های بزرگ نمونه، فناوری‌های فراصوتی صرفاً مزیت‌آفرین نیستند – بلکه ضروری‌اند.
راهکارهایی مانند VialTweeter و UIP400MTP با فراهم کردن گردش‌کارهای استانداردشده با ظرفیت پردازش بالا، کشفیات در زمینه پیام‌رسانی سلولی، سازوکارهای بیماری و پزشکی دقیق را تسریع می‌کنند.
طراحی، ساخت و مشاوره – کیفیت ساخت آلمان
دستگاه‌های فراصوت Hielscher به برخورداری از بالاترین استانداردهای کیفیت و طراحی شهرت دارند. استحکام و سهولت کاربری، ادغام بی‌دردسر دستگاه‌های فراصوت ما را در تأسیسات صنعتی امکان‌پذیر می‌کند. دستگاه‌های فراصوت Hielscher به‌آسانی از عهده شرایط سخت و محیط‌های پرچالش برمی‌آیند.
Hielscher Ultrasonics شرکتی دارای گواهینامه ISO است و بر دستگاه‌های فراصوت با عملکرد بالا که از پیشرفته‌ترین فناوری و کاربری آسان برخوردارند، تأکید ویژه‌ای دارد. البته دستگاه‌های فراصوت Hielscher با CE انطباق دارند و الزامات UL، CSA و RoHs را برآورده می‌کنند.
مدل‌های سونیکاتور چندنمونه‌ای Hielscher شامل UIP400MTP برای میکروپلیت‌ها، VialTweeter و CupHorn: آماده‌سازی نمونه با سرعت و ظرفیت پردازش بالا
پرسش‌های متداول
فسفوپروتئومیکس چیست؟
فسفوپروتئومیکس شاخه‌ای تخصصی از پروتئومیکس است که بر شناسایی، تعیین موقعیت و تعیین مقدار جایگاه‌های فسفریلاسیون پروتئین در مقیاس بزرگ تمرکز دارد. این حوزه پروتئین‌ها و پپتیدهای فسفریله را تجزیه‌وتحلیل می‌کند تا مسیرهای پیام‌رسانی سلولی، سازوکارهای تنظیمی و تغییرات پویای پساترجمۀ کنترل‌کننده عملکرد پروتئین را روشن کند.
چرا تشخیص فسفریلاسیون چالش‌برانگیز است؟
تشخیص فسفریلاسیون چالش‌برانگیز است، زیرا رویدادهای فسفریلاسیون اغلب گذرا و کم‌فراوان‌اند و با استوکیومتری پایین رخ می‌دهند. علاوه بر این، شناسایی پپتیدهای فسفریله ممکن است به دلیل ناپایداری شیمیایی آن‌ها، تغییرپذیری یونش در طیف‌سنجی جرمی و پیچیدگی تعیین دقیق جایگاه‌های فسفریلاسیون در توالی‌های پپتیدی دشوار باشد.
فسفوپروتئین‌ها چه هستند؟
فسفوپروتئین‌ها پروتئین‌هایی هستند که فسفریله شده‌اند؛ به این معنی که یک یا چند گروه فسفات به‌صورت کووالانسی به باقی‌مانده‌های اسیدآمینه‌ای مشخص، معمولاً سرین، ترئونین یا تیروزین، متصل شده‌اند. این تغییر می‌تواند فعالیت، ساختار، جایگیری یا برهم‌کنش‌های پروتئین با مولکول‌های دیگر را تغییر دهد.
تفاوت پروتئومیکس و فسفوپروتئومیکس چیست؟
پروتئومیکس مطالعه جامع همه پروتئین‌های بیان‌شده در یک سامانه زیستی، از جمله فراوانی، ساختار و برهم‌کنش‌های آن‌ها است. در مقابل، فسفوپروتئومیکس به‌طور ویژه بر زیرمجموعه پروتئین‌های فسفریله تمرکز دارد و بر تجزیه‌وتحلیل جایگاه‌های فسفریلاسیون و نقش‌های تنظیمی آن‌ها در فرایندهای سلولی تأکید می‌کند.
منابع علمی / مراجع
- FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
- FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator für die High-Throughput Probenvorbereitung in 96-Well-Platten – deutsch – Hielscher Ultrasonics
- Di Y, Li W, Salovska B, Ba Q, Hu Z, Wang S, Liu Y. (2023): A basic phosphoproteomic-DIA workflow integrating precise quantification of phosphosites in systems biology. Biophysics Reports. 2023 Apr 30;9(2):82-98.
- Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.
- Gao, Erli; Li, Wenxue; Wu, Chongde; Shao, Wenguang; di, Yi; Liu, Yansheng (2021): Data-independent Acquisition-based Proteome and Phosphoproteome Profiling across Six Melanoma Cell Lines Reveals Determinants of Proteotypes. Molecular Omics. 2021
Hielscher Ultrasonics هموژنایزرهای فراصوتی با عملکرد بالا تولید می‌کند، در مقیاس‌هایی از آزمایشگاهی تا صنعتی.