پارافین‌زدایی و استخراج پروتئین از FFPE

استخراج پروتئین از برش‌های بافت تثبیت‌شده با فرمالین و قالب‌گیری‌شده در پارافین (FFPE) را با استفاده از ترکیبی بهینه از پارافین‌زدایی، محلول‌سازی و فراصوت‌دهی با دستگاه فراصوتی چندلوله‌ای VialTweeter تسهیل کنید. این پروتکل از پروتئومیکس مبتنی بر طیف‌سنجی جرمی در مراحل بعدی پشتیبانی می‌کند و با روندهای کاری پاک‌سازی SP3 و هضم آنزیمی سازگار است.

این دستورالعمل اجرایی استاندارد (SOP) برای کارکنان آزمایشگاهی تدوین شده است که با استفاده از فراصوت‌دهی با عملکرد بالا، نمونه‌های بافتی FFPE را از نظر پروتئومی تحلیل می‌کنند. این دستورالعمل برای پردازش موازی حداکثر ده نمونه FFPE با سونیکاتور چندلوله‌ای VialTweeter بهینه شده است.

پروتکل: استخراج پروتئین از نمونه‌های FFPE با استفاده از VialTweeter

مواد و معرف‌ها

معرف‌ها

• زایلن (گرید بافت‌شناسی)
• اتانول (مطلق 96%)
• بافر لیز:

گوانیدین هیدروکلراید 6 M
Tris-HCl با غلظت 50 mM، با pH 8٫5
TCEP (تریس(2-کربوکسی‌اتیل)فسفین) با غلظت 10 mM
CAA (2-کلرواستامید) با غلظت 40 mM

• مهارکننده پروتئاز (اختیاری؛ برای مثال cOmplete™ mini EDTA-free)

تجهیزات

• دستگاه فراصوتی چندلوله‌ای VialTweeter
• لوله‌های میکروسانتریفیوژ 1٫5 mL یا 2٫0 mL با اتصال سطحی کم
• بلوک حرارتی یا انکوباتور (با تنظیمات 95°C و 80°C)
• میکروسانتریفیوژ
• ترمومیکسر (اختیاری، اما توصیه می‌شود)

مقدار نمونه ورودی

• 1–2 برش از بافت FFPE با ضخامت 10 µm برای هر نمونه (یعنی هر ویال)

یا

• در مجموع ~100 µg بافت برای هر نمونه (یعنی هر ویال)

نکته: برای به حداقل رساندن آلودگی ناشی از خرده‌های پارافین، در میکروتومی از تیغه‌های نو استفاده کنید.

روش اجرا

1. پارافین‌زدایی
   1. برش‌های FFPE را به لوله‌های میکروسانتریفیوژ با اتصال سطحی کم منتقل کنید.
   2. 1 mL زایلن اضافه کنید و مدت کوتاهی ورتکس کنید.
   3. به‌مدت 10 دقیقه در دمای اتاق انکوبه کنید.
   4. به‌مدت 2 دقیقه در 14٬000 × g سانتریفیوژ کنید؛ مایع رویی را دور بریزید.
   5. شست‌وشو با زایلن را یک بار دیگر تکرار کنید (مراحل 2–4).
   6. رسوب را با 1 mL اتانول 96% بشویید، ورتکس کنید و سپس به‌مدت 2 دقیقه در 14٬000 × g سانتریفیوژ کنید. مایع رویی را دور بریزید.
   7. شست‌وشو با اتانول را یک بار دیگر تکرار کنید (در مجموع 2 بار شست‌وشو با اتانول).
   8. رسوب را به‌مدت 10 دقیقه در دمای اتاق، با درپوش‌های باز، در معرض هوا خشک کنید تا اتانول باقی‌مانده تبخیر شود.
2. استخراج پروتئین و فراصوت‌دهی
   1. به هر رسوب خشک، 200 µL بافر لیز اضافه کنید.

      نکته: اگرچه سونیکاتور تا 1 mL را می‌پذیرد، حجم 200 µL برای پردازش‌های بعدی بهینه است.

   2. با ورتکس کردن یا پیپتاژ ملایم مخلوط کنید.
3. انکوباسیون حرارتی اول
   1. لوله‌ها را با استفاده از ترمومیکسر یا بلوک حرارتی، به‌مدت 30 min در 95 °C و همراه با هم‌زدن در 400 rpm انکوبه کنید.
   2. اجازه دهید نمونه‌ها به‌مدت 5 min در دمای اتاق خنک شوند.
4. فراصوت‌دهی اول با VialTweeter
   1. لوله‌ها را در VialTweeter قرار دهید.
   2. VialTweeter UP200St را روی مقادیر زیر تنظیم کنید و فراصوت‌دهی را انجام دهید.
تنظیمات سونیکاتور
• دامنه (A) را روی 100% تنظیم کنید.
• حالت پالسی (C) را روی 100% تنظیم کنید.
• زمان‌سنج دوره: روشن
• زمان روشن بودن: 60s
• زمان خاموش بودن: 30s
• مقدار حدی: 15 min (معادل 10 چرخه)
(نکته محاسباتی: (60 s روشن + 30 s خاموش) × 10 چرخه = 900 s = 15 min)
5. انکوباسیون حرارتی دوم
   لوله‌ها را خارج کنید و دوباره به‌مدت 15 min در 95 °C و 400 rpm انکوبه کنید.
6. فراصوت‌دهی دوم
   فراصوت‌دهی با VialTweeter را با همان تنظیمات بالا برای 10 چرخه دیگر (در مجموع 15 min) تکرار کنید.
7. شفاف‌سازی لیزات
   1. نمونه‌ها را به‌مدت 10 min در 13٬000 × g و دمای 23°C (دمای اتاق) سانتریفیوژ کنید.
   2. مایع رویی را با احتیاط به یک لوله جدید 2٫0 mL از نوع Safe-lock Eppendorf منتقل کنید. از برهم‌زدن رسوب خودداری کنید.
8. پردازش‌های بعدی
   لیزات اکنون برای پاک‌سازی SP3 و هضم آنزیمی آماده است.

نکات و روش‌های توصیه‌شده

1. خطر گرم‌شدن بیش‌ازحد حین فراصوت‌دهی با چرخه‌های برنامه‌ریزی‌شده روشن/خاموش کاهش می‌یابد.
2. برای جلوگیری از تجمع پروتئین‌ها، پس از فراصوت‌دهی از ورتکس کردن خودداری کنید.

دفع پسماند و ایمنی

جدول زیر نمایی از ظرفیت تقریبی پردازش دستگاه‌های فراصوتی آزمایشگاهی ما ارائه می‌دهد: