دپارافینیزاسیون و استخراج پروتئین از FFPE

تسهیل استخراج پروتئین از فرمالین ثابت پارافین تعبیه شده (FFPE) بخش های بافت با استفاده از ترکیب بهینه شده از deparaffinization, حلال, و فراصوت با یک VialTweeter چند لوله ultrasonicator. این پروتکل از پروتئومیکس مبتنی بر طیف سنجی جرمی پایین دست پشتیبانی می کند و با پاکسازی SP3 و گردش کار هضم آنزیمی سازگار است.

این SOP برای پرسنل آزمایشگاهی درگیر در تجزیه و تحلیل پروتئومیک نمونه های بافت FFPE با استفاده از فراصوت با کارایی بالا در نظر گرفته شده است. برای حداکثر ده نمونه FFPE که به طور موازی با استفاده از VialTweeter Multi-Tube Sonicator پردازش می شوند، بهینه شده است.

پروتکل: استخراج پروتئین از نمونه های FFPE با استفاده از VialTweeter

مواد و معرف ها

رجنتس

• زایلن (درجه بافت شناسی)
• اتانول (مطلق 96٪)
• بافر لیز:

6 M گوانیدین هیدروکلراید
50 میلی مولار Tris-HCl ، pH 8.5
10 میلی مولار TCEP (تریس (2-کربوکسی اتیل) فسفین)
40 میلی مولار CAA (2-کلرواستامید)

• مهارکننده پروتئاز (اختیاری؛ به عنوان مثال، cOmplete™ mini EDTA-free)

تجهیزات

• VialTweeter چند لوله Ultrasonicator
• لوله های میکروسانتریفیوژ 1.5 میلی لیتر یا 2.0 میلی لیتر
• بلوک حرارتی یا انکوباتور (تنظیمات 95 و 80 درجه سانتیگراد)
• میکرو سانتریفیوژ
• ترمومیکسر (اختیاری اما توصیه می شود)

ورودی نمونه

• 1-2 بخش بافت FFPE به ضخامت 10 میکرومتر در هر نمونه (یعنی در هر ویال)

یا

• در مجموع ~ 100 میکروگرم بافت در هر نمونه (یعنی در هر ویال)

توجه: برای به حداقل رساندن آلودگی بقایای پارافین از تیغه های تازه برای میکروتومی استفاده کنید.

روش

1. دپارافینیزاسیون
   1. بخش های FFPE را به لوله های میکروسانتریفیوژ با اتصال کم منتقل کنید.
   2. 1 میلی لیتر زایلن ، گرداب را به طور خلاصه اضافه کنید.
   3. 10 دقیقه در دمای اتاق جوجه کشی کنید.
   4. سانتریفیوژ در 14000 × گرم به مدت 2 دقیقه؛ مایع رویی را دور بیندازید.
   5. شستشوی زایلن را یک بار دیگر تکرار کنید (مراحل 2-4).
   6. گلوله را با 1 میلی لیتر اتانول 96٪ ، گرداب بشویید ، سپس سانتریفیوژ را در 14000 × گرم به مدت 2 دقیقه بشویید. مایع رویی را دور بریزید.
   7. شستشوی اتانول را یک بار دیگر تکرار کنید (در مجموع 2 شستشوی اتانول).
   8. گلوله را به مدت 10 دقیقه در دمای اتاق با درب های باز خشک کنید تا اتانول باقیمانده تبخیر شود.
2. استخراج پروتئین و فراصوت
   1. 200 میکرولیتر بافر لیز را به هر گلوله خشک اضافه کنید.
      توجه داشته باشید: اگرچه فراصوت تا 1 میلی لیتر را در خود جای می دهد، اما 200 میکرولیتر برای پردازش پایین دست بهینه است.

   2. با گرداب یا پیپت ملایم مخلوط کنید.
3. اولین جوجه کشی حرارتی
   1. لوله ها را در دمای 95 درجه سانتیگراد به مدت 30 دقیقه با هم زدن در 400 دور در دقیقه با استفاده از ترمومیکسر یا بلوک حرارتی انکوبه کنید.
   2. اجازه دهید نمونه ها به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق خنک شوند.
4. اولین فراصوت با VialTweeter
   1. لوله ها را در VialTweeter قرار دهید.
   2. VialTweeter UP200St را روی مقادیر زیر تنظیم کنید و فراصوت کنید.
تنظیمات Sonicator
• دامنه (A) را روی 100٪ تنظیم کنید
• حالت ضربان (C) را روی 100٪ تنظیم کنید
• ساعت دوره: روشن
• به موقع: دهه 60
• زمان خاموش: 30 ثانیه
• مقدار حد: 15 دقیقه (مربوط به 10 چرخه)
(یادداشت محاسبه: (60 ثانیه روشن + 30 ثانیه خاموش) × 10 چرخه = 900 ثانیه = 15 دقیقه)
5. جوجه کشی حرارتی دوم
   لوله ها را بردارید و دوباره در دمای 95 درجه سانتیگراد به مدت 15 دقیقه، 400 دور در دقیقه جوجه کشی کنید.
6. فراصوت دوم
   فراصوت را در VialTweeter با استفاده از همان تنظیمات (مانند بالا) برای 10 چرخه اضافی (در مجموع 15 دقیقه) تکرار کنید.
7. شفاف سازی Lysate
   1. نمونه ها را در دمای 13000 × گرم به مدت 10 دقیقه در دمای 23 درجه سانتیگراد (دمای اتاق) سانتریفیوژ کنید.
   2. مایع رویی را با دقت در یک لوله جدید 2.0 میلی لیتری Eppendorf با قفل ایمن جمع آوری کنید. از مزاحمت گلوله خودداری کنید.
8. پردازش پایین دستی
   لیزات اکنون برای پاکسازی SP3 و هضم آنزیمی آماده است.

یادداشت ها و بهترین شیوه ها

1. خطر گرمای بیش از حد در طول فراصوت با دوچرخه سواری برنامه ریزی شده ON / OFF کاهش می یابد.
2. اجتناب از گرداب پس از فراصوت برای جلوگیری از تجمع پروتئین.

دفع زباله و ایمنی

جدول زیر به شما نشانه ای از ظرفیت پردازش تقریبی مافوق صوت به اندازه آزمایشگاه ما می دهد: