پروتکل استفاده از سونیکاتورهای چندنمونه‌ای Hielscher در تحلیل بیوفیلم و پروتئومیکس
استفاده از سونیکاتورهای چندنمونه‌ای، مانند سونیکاتور چندلوله‌ای VialTweeter و سونیکاتور میکروپلیت UIP400MTP، گردش‌کارهای آزمایشگاهی را برای کاربردهایی با ظرفیت پردازش بالا تسهیل می‌کند. هر دو دستگاه امکان پردازش فراصوتی دقیق و یکنواخت چندین نمونه را فراهم می‌کنند، تغییرپذیری را به حداقل می‌رسانند و تکرارپذیری را افزایش می‌دهند. این ویژگی به‌ویژه در آزمایش‌هایی سودمند است که به لیز یکنواخت نمونه‌ها، جداسازی بیوفیلم از سطح، استخراج پروتئین یا هضم پروتئولیتیک نیاز دارند؛ در چنین آزمایش‌هایی، روش‌های دستی یا تک‌نمونه‌ای کارایی کمتری دارند و مستعد ناهماهنگی در نتایج هستند.
تسهیل گردش‌کارها با سونیکاتورهای چندنمونه‌ای
برای مثال، UIP400MTP امکان تیمار فراصوتی هم‌زمان چاهک‌های میکروپلیت را فراهم می‌کند و جداسازی یکنواخت بیوفیلم‌ها یا مواد سلولی از سطح را تضمین می‌کند. در همین حال، VialTweeter لیز و همگن‌سازی دقیق چندین نمونه در لوله‌ها را بدون آلودگی متقاطع فراهم می‌کند. این سونیکاتورها زمان پردازش را به‌طور چشمگیری کاهش می‌دهند، تکرارپذیری آزمایش‌ها را بهبود می‌بخشند و یکپارچگی نمونه‌ها را در سطح بالایی حفظ می‌کنند؛ ازاین‌رو ابزارهایی ضروری در پژوهش‌های میکروبیولوژی، پروتئومیکس و زیست‌شناسی مولکولی هستند.
در ادامه، پروتکلی تفصیلی ارائه شده است که نمونه‌ای از کاربرد مدل‌های سونیکاتور چندنمونه‌ای Hielscher، یعنی سونیکاتور چندلوله‌ای VialTweeter و سونیکاتور میکروپلیت UIP400MTP، در مطالعه‌ای درباره تشکیل بیوفیلم E. coli و تحلیل پروتئومیکس پس از آن را نشان می‌دهد.
سونیکاتور پلیت چندچاهکی UIP400MTP – آماده‌سازی مطمئن نمونه با ظرفیت پردازش بالا
پروتکل: تشکیل بیوفیلم، جداسازی آن از سطح و تحلیل پروتئومیکس با استفاده از سونیکاتورهای چندنمونه‌ای Hielscher
1. آماده‌سازی کشت باکتری
- باکتری E. coli (سویه W3110) را در دمای 30°C، که برای تشکیل بیوفیلم E. coli مناسب است، در محیط تریپتون براث (TB) با ترکیبات زیر کشت دهید:
– 10 g/L تریپتون
– 5 g/L NaCl - در صورت نیاز، برای اطمینان از حفظ پلاسمید، آنتی‌بیوتیک اضافه کنید.
- برای مطالعات میکروسکوپی و فعالیت پروموتر، از سویه W3110 باکتری E. coli دارای گزارشگر ژنومی GFP تقویت‌شده (eGFP) تحت کنترل پروموتر rplL استفاده کنید.
- برای اندازه‌گیری فعالیت پروموترها، از پلاسمیدهای گزارشگر GFP برای پروموترهای مختلف (برای مثال، csgA, csgD, fliA, fliC, flhD ) استفاده کنید.
2. کشت بیوفیلم و جداسازی آن از سطح
- در هر چاهک از یک پلیت 12 چاهکی، 1٫5 mL کشت باکتری رقیق‌شده تلقیح کنید (پلیت‌های 12 چاهکی CellStar، شرکت Greiner Bio-One).
- برای فراهم شدن امکان تشکیل بیوفیلم، انکوبه کنید.
- کشت پلانکتونیک (غیرچسبیده) را با احتیاط خارج کنید.
– هر چاهک را با 500 µL محلول PBS بشویید.
– با فراصوت‌دهی پلیت 12 چاهکی در سونیکاتور میکروپلیت UIP400MTP، سلول‌های چسبیده را از سطح جدا کنید. UIP400MTP با رساندن انرژی فراصوتی یکسان به همه چاهک‌ها، جداسازی یکنواخت را تضمین می‌کند.
– تنظیمات فراصوت‌دهی: دامنه 60%، حالت چرخه‌ای: 60 sec روشن / 30 sec خاموش.
3. جمع‌آوری و لیز سلول‌ها
- سلول‌های بیوفیلم جداشده از سطح را به‌مدت 5 دقیقه در 4٬500 g سانتریفیوژ کنید.
- سلول‌های رسوب‌کرده را با PBS بشویید.
- سلول‌ها را در 100 µL محلول سدیم لائورویل سارکوزینات (SLS) با غلظت 2% مجدداً معلق کنید و به‌مدت 15 دقیقه در 95°C انکوبه کنید.
- برای اطمینان از لیز کامل سلولی، با استفاده از سونیکاتور چندلوله‌ای VialTweeter فراصوت‌دهی کنید.
– تنظیمات فراصوت‌دهی: دامنه 100%، 50 s روشن / 10 s خاموش، با زمان اجرای کل 10 min؛ نمونه‌ها را روی یخ نگه دارید.
4. احیا و آلکیلاسیون
- برای احیای پیوندهای دی‌سولفیدی، 5 mM تریس(2-کربوکسی‌اتیل)فسفین (TCEP) اضافه کنید و به‌مدت 15 دقیقه در 95°C انکوبه کنید.
- پروتئین‌ها را با 10 mM یدو‌استامید به‌مدت 30 دقیقه در 25°C آلکیله کنید.
5. اندازه‌گیری مقدار پروتئین و هضم آن
- لیزات‌ها را برای حذف بقایا سانتریفیوژ کنید.
- مقدار کل پروتئین را با استفاده از کیت سنجش پروتئین Pierce BCA اندازه‌گیری کنید.
- 50 µg پروتئین کل را با 1 µg تریپسین در محلولی حاوی 2% SLS و 100 mM بی‌کربنات آمونیوم هضم کنید.
- مخلوط واکنش هضم را یک شب در 30°C انکوبه کنید.
6. خالص‌سازی پپتیدها
- با افزودن اسید تری‌فلوئورواستیک (TFA) با غلظت 1٫5%، SLS را رسوب دهید و سپس سانتریفیوژ کنید.
- پپتیدها را با استفاده از ستون‌های میکرواسپین C18 خالص‌سازی کنید.
- پپتیدهای خالص‌شده را خشک کنید و در TFA با غلظت 0٫1% مجدداً معلق کنید.
7. کروماتوگرافی مایع–طیف‌سنجی جرمی (LC-MS/MS)
- پپتیدها را با طیف‌سنج جرمی Q-Exactive Plus متصل به سامانه Ultimate 3000 RSLC nano تحلیل کنید.
- پپتیدها را با استفاده از ستون HPLC فاز معکوس (75 µm × 42 cm) پرشده با رزین C18 با اندازه ذرات 2٫4 µm جداسازی کنید.
- طی 140 دقیقه، گرادیانی از 2% تا 35% حلال B (استونیتریل حاوی 0٫15% اسید فرمیک) اعمال کنید.
- داده‌ها را با اسکن‌های MS با قدرت تفکیک بالا و سپس اسکن‌های متوالی MS/MS از 10 یون دارای بیشترین شدت ثبت کنید.
8. تحلیل داده‌ها
- داده‌های خام LC-MS را با نرم‌افزار Progenesis پردازش کنید.
- فایل‌های .mgf را خروجی بگیرید و با MASCOT تحلیل کنید.
- اندازه‌گیری کمی پپتیدها را با استفاده از SafeQuant، برای کنترل کیفیت و تعدیل کشف کاذب، انجام دهید.
- برای اطمینان از تکرارپذیری، همه آزمایش‌ها را در دو یا سه تکرار انجام دهید.
سونیکاتورهای چندنمونه‌ای برای آماده‌سازی نمونه با ظرفیت پردازش بالا
مدل‌های سونیکاتور چندنمونه‌ای VialTweeter و UIP400MTP دقت و کارایی گردش‌کارهای آزمایشی را، به‌ویژه در پژوهش‌های بیوفیلم و پروتئومیکس، به‌طور چشمگیری افزایش می‌دهند. توانایی آن‌ها در پردازش یکنواخت چندین نمونه، ظرفیت پردازش بالا را بدون افت کیفیت داده‌ها تضمین می‌کند. این مزایا، همراه با گردش‌کارهای تسهیل‌شده شرح‌داده‌شده در بالا، سونیکاتورهای چندنمونه‌ای Hielscher را به ابزارهایی ضروری برای پژوهش‌های زیستی مدرن تبدیل می‌کنند.
- کارایی بالا
- فناوری پیشرفته روز
- قابلیت اطمینان و استحکام
- کنترل دقیق و قابل‌تنظیم فرایند
- ناپیوسته و درون‌خطی
- برای هر حجمی
- نرم‌افزار هوشمند
- قابلیت‌های هوشمند (برای مثال، برنامه‌پذیری، ثبت داده‌ها، کنترل از راه دور)
- کاربری آسان و ایمن
- نیاز اندک به نگهداری
- CIP (شست‌وشو در محل)
طراحی، ساخت و مشاوره – کیفیت ساخت آلمان
دستگاه‌های فراصوت Hielscher به بالاترین استانداردهای کیفیت و طراحی شهرت دارند. استحکام و کاربری آسان، ادغام بی‌دردسر دستگاه‌های فراصوت ما در تأسیسات صنعتی را ممکن می‌سازد. دستگاه‌های فراصوت Hielscher به‌راحتی از عهده شرایط سخت و محیط‌های پرچالش برمی‌آیند.
Hielscher Ultrasonics شرکتی دارای گواهینامه ISO است و بر دستگاه‌های فراصوت با عملکرد بالا، مجهز به فناوری پیشرفته روز و با کاربری آسان، تأکید ویژه‌ای دارد. بدیهی است که دستگاه‌های فراصوت Hielscher با CE انطباق دارند و الزامات UL، CSA و RoHs را برآورده می‌کنند.
منابع علمی / مراجع / برگه‌های اطلاعات فنی
- Download PDF “Protocol using Hielscher Multi-Sample Sonicators in Biofilm and Proteomic Analysis” – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP400MTP – High-throughput Sonicator for Multiwell-Plates
- FactSheet VialTweeter – Simultaneous sonication of closed vials
- Shirley J.D., Nauta K.M., Carlson E.E. (2022): Live-Cell Profiling of Penicillin-Binding Protein Inhibitors in Escherichia coli MG1655. ACS Infectious Diseases Jul 8;8(7); 2022. 1241-1252.
- Teteneva N.A., Mart’yanov S.V., Esteban-López M., Kahnt J., Glatter T,. Netrusov A.I., Plakunov V.K., Sourjik V. (2020): Multiple drug-induced stress responses inhibit formation of Escherichia coli biofilms. Applied Environmental Microbiology 2020: 86:e01113-20.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
پرسش‌های متداول
بیوفیلم چیست؟
بیوفیلم اجتماعی سازمان‌یافته از میکروارگانیسم‌هاست که در ماتریس خارج‌سلولی (ECM) تولیدشده توسط خودشان جای گرفته‌اند و به سطوح می‌چسبند. بیوفیلم در برابر تنش‌های محیطی، آنتی‌بیوتیک‌ها و سیستم ایمنی محافظت ایجاد می‌کند و در بروز عفونت‌های پایدار و رسوب‌گرفتگی زیستی نقش دارد.
جداسازی بیوفیلم چیست؟
جداسازی بیوفیلم فرایندی است که طی آن سلول‌ها یا خوشه‌های میکروبی از ساختار بیوفیلم جدا می‌شوند؛ این فرایند می‌تواند فعالانه (از طریق تجزیه آنزیمی یا حسگری حد نصاب) یا غیرفعالانه (بر اثر نیروهای برشی، کمبود مواد مغذی یا تخریب مکانیکی) رخ دهد. این فرایند پراکنش بیوفیلم و کلونیزاسیون سطوح جدید را تسهیل می‌کند.
پروتئین‌های مرتبط با بیوفیلم چه هستند؟
پروتئین‌های مرتبط با بیوفیلم (BAPs)، پروتئین‌های سطحی یا ترشحی میکروبی هستند که در تشکیل، پایداری و چسبندگی بیوفیلم نقش‌های کلیدی دارند. این پروتئین‌ها شامل ادهزین‌ها، آنزیم‌های خارج‌سلولی و پروتئین‌های ساختاری مانند الیاف کورلی در E. coli یا BapA در Staphylococcus aureus هستند.
ECM در بیوفیلم‌ها چیست؟
ماتریس خارج‌سلولی (ECM) در بیوفیلم‌ها شبکه‌ای پیچیده از پلی‌ساکاریدها، پروتئین‌ها، DNA خارج‌سلولی (eDNA) و لیپیدهاست که سلول‌های میکروبی را در بر می‌گیرد. این ماتریس یکپارچگی ساختاری را تأمین می‌کند، واسطه چسبندگی می‌شود، رطوبت را حفظ می‌کند و مقاومت بیوفیلم را در برابر عوامل ضدمیکروبی و دفاع‌های میزبان افزایش می‌دهد.
الیاف کورلی چه عملکردی دارند؟
الیاف کورلی، فیبریل‌های آمیلوئیدی خارج‌سلولی تولیدشده توسط Escherichia coli و باکتری‌های مرتبط هستند که در تشکیل بیوفیلم، چسبندگی به سطح و کلونیزاسیون میزبان نقش حیاتی دارند. آن‌ها به یکپارچگی بیوفیلم کمک می‌کنند، مقاومت در برابر تنش‌های محیطی را افزایش می‌دهند و تعامل با بافت‌های میزبان را هنگام عفونت تسهیل می‌کنند. همچنین، الیاف کورلی در تقویت فعال‌سازی سیستم ایمنی نقش دارند و با ماندگاری و بیماری‌زایی باکتری‌ها مرتبط دانسته شده‌اند.
Hielscher Ultrasonics هموژنایزرهای فراصوتی با عملکرد بالا را در مقیاس‌های آزمایشگاهی تا صنعتی تولید می‌کند.