پروتکل با استفاده از سونیکاتورهای چند نمونه Hielscher در تجزیه و تحلیل بیوفیلم و پروتئومیک
استفاده از فراصوت های چند نمونه ای مانند VialTweeter Multi-Tube Sonicator و UIP400MTP Microplate Sonicator، گردش کار آزمایشگاهی را برای برنامه های کاربردی با توان بالا ساده می کند. هر دو دستگاه امکان پردازش اولتراسونیک دقیق و یکنواخت را در چندین نمونه فراهم می کنند ، تنوع را به حداقل می رسانند و تکرارپذیری را افزایش می دهند. این امر به ویژه در آزمایش هایی که نیاز به لیز نمونه ثابت، جداسازی بیوفیلم، استخراج پروتئین یا هضم پروتئولیتیک دارند، که در آن روش های دستی یا تک نمونه ای کارایی کمتری دارند و مستعد ناسازگاری هستند، سودمند است.
ساده سازی گردش کار با Multi-Sample Sonicators
به عنوان مثال، این UIP400MTP امکان درمان همزمان اولتراسونیک چاه های میکروپلیت را فراهم می کند و از جداسازی یکنواخت بیوفیلم یا مواد سلولی اطمینان حاصل می کند. در همین حال، VialTweeter لیز و همگن سازی دقیق نمونه های لوله های متعدد را بدون آلودگی متقابل ارائه می دهد. این فراصوت ها به طور قابل توجهی زمان پردازش را کاهش می دهند، تکرارپذیری تجربی را بهبود می بخشند و یکپارچگی نمونه بالا را حفظ می کنند و آنها را به ابزارهای ضروری در میکروبیولوژی، پروتئومیکس و تحقیقات زیست شناسی مولکولی تبدیل می کنند.
در زیر یک پروتکل دقیق نمونه استفاده از مدل های فراصوت چند نمونه Hielscher ، VialTweeter چند لوله Sonicator و Microplate Sonicator UIP400MTP ، در یک مطالعه شامل تشکیل بیوفیلم E. coli و تجزیه و تحلیل پروتئومیک متعاقب آن است.
چند چاه صفحه ماسونیکاتور UIP400MTP – آماده سازی نمونه قابل اعتماد با توان عملیاتی بالا
پروتکل: تشکیل بیوفیلم، جداشدگی و تجزیه و تحلیل پروتئومیک با استفاده از سونیکاتورهای چند نمونه ای Hielscher
1. آماده سازی فرهنگ باکتریایی
- کشت باکتری E. coli (سویه W3110) در دمای 30 درجه سانتیگراد ، دمای مطلوب برای تشکیل بیوفیلم E. coli ، در محیط براث تریپتون (TB) حاوی موارد زیر است:
– 10 گرم در لیتر تریپتون
– 5 گرم در لیتر NaCl - مکمل با آنتی بیوتیک در صورت نیاز برای اطمینان از احتباس پلاسمید.
- برای مطالعات میکروسکوپی و فعالیت پروموتر، از سویه W3110 E. coli با گزارشگر GFP تقویت شده ژنومی (eGFP) تحت کنترل پروموتر rplL استفاده کنید.
- از پلاسمیدهای گزارشگر GFP برای پروموترهای مختلف استفاده کنید (به عنوان مثال، csgA, csgD, fliA, fliC, flhD ) برای اندازه گیری فعالیت های مروج.
2. کشت بیوفیلم و جداسازی
- بذر 1.5 میلی لیتر کشت باکتریایی رقیق شده در هر چاه در یک صفحه 12 چاهی (صفحات 12 چاهی CellStar ، Greiner Bio-One).
- جوجه کشی کنید تا امکان تشکیل بیوفیلم فراهم شود.
- کشت پلانکتونیک (غیر چسبنده) را با دقت حذف کنید.
– هر کدام را با 500 میکرولیتر PBS خوب بشویید.
– جدا کردن سلول های متصل با فراصوت صفحه 12 به خوبی در UIP400MTP ماسونیک microplate. این UIP400MTP با ارائه انرژی اولتراسونیک سازگار در تمام چاه ها، جدایی یکنواخت را تضمین می کند.
– تنظیمات فراصوت: دامنه 60٪ ، حالت چرخه: 60 ثانیه روشن / 30 ثانیه خاموش.
3. برداشت و لیز سلول
- سانتریفیوژ سلول های بیوفیلم را در دمای 4500 گرم به مدت 5 دقیقه جدا کرد.
- سلول های پلت شده را با PBS بشویید.
- سلول ها را در 100 میکرولیتر سدیم 2 درصد سدیم لوروئیل سارکوزینات (SLS) معلق کرده و به مدت 15 دقیقه در دمای 95 درجه سانتیگراد انکوبه کنید.
- با استفاده از VialTweeter Multi-Tube Sonicator برای اطمینان از لیز کامل سلول، Sonicate کنید.
– تنظیمات فراصوت: دامنه 100٪ ، 50 ثانیه روشن / 10 ثانیه خاموش برای 10 دقیقه زمان کل اجرا. نمونه ها را روی یخ نگه دارید.
4. کاهش و آلکیلاسیون
- 5 میلی مولار تریس (2-کربوکسی اتیل) فسفین (TCEP) اضافه کنید تا پیوندهای دی سولفید کاهش یابد و به مدت 15 دقیقه در دمای 95 درجه سانتیگراد انکوبه کنید.
- پروتئین های آلکیلات با 10 میلی مولار یدواستامید به مدت 30 دقیقه در دمای 25 درجه سانتی گراد.
5. کمی سازی و هضم پروتئین
- سانتریفیوژ برای پاک کردن زباله ها لیز می شود.
- مقدار پروتئین کل را با استفاده از کیت سنجش پروتئین Pierce BCA تعیین کنید.
- 50 میکروگرم پروتئین کل را با 1 میکروگرم تریپسین در محلول حاوی 2٪ SLS و 100 میلی مولار بی کربنات آمونیوم هضم کنید.
- واکنش هضم را یک شبه در دمای 30 درجه سانتیگراد جوجه کشی کنید.
6. تصفیه پپتید
- SLS را با افزودن 1.5٪ تری فلوئورواستیک اسید (TFA) و سپس سانتریفیوژ رسوب دهید.
- پپتیدها را با استفاده از ستون های میکرواسپین C18 خالص کنید.
- پپتیدهای خالص شده خشک شده و در 0.1٪ TFA معلق می شوند.
7. کروماتوگرافی مایع-طیف سنجی جرمی (LC-MS/MS)
- تجزیه و تحلیل پپتیدها بر روی طیف سنج جرمی Q-Exactive Plus همراه با یک سیستم نانو Ultimate 3000 RSLC.
- پپتیدها را با استفاده از ستون HPLC فاز معکوس (75 میکرومتر × 42 سانتی متر) بسته بندی شده با رزین C18 (2.4 میکرومتر) جدا کنید.
- یک شیب از 2٪ تا 35٪ حلال B (استونیتریل با 0.15٪ اسید فرمیک) را در مدت 140 دقیقه اعمال کنید.
- داده ها را با استفاده از اسکن های MS با وضوح بالا و به دنبال آن اسکن های پشت سر هم MS/MS از 10 یون شدید به دست آورید.
8. تجزیه و تحلیل داده ها
- داده های خام LC-MS را با استفاده از نرم افزار Progenesis پردازش کنید.
- فایل های mgf را صادر کرده و آنها را با MASCOT تجزیه و تحلیل کنید.
- انجام کمی سازی پپتید با استفاده از SafeQuant برای کنترل کیفیت و تنظیم کشف کاذب
- تمام آزمایشات را به صورت تکراری یا سه تکرار انجام دهید تا از تکرارپذیری اطمینان حاصل کنید.
فراصوت های چند نمونه ای برای آماده سازی نمونه با توان عملیاتی بالا
مدل های فراصوت چند نمونه VialTweeter و UIP400MTP به طور قابل توجهی دقت و کارایی گردش کار تجربی را افزایش می دهد، به ویژه در تحقیقات بیوفیلم و پروتئومیکس. توانایی آنها در پردازش چندین نمونه به طور یکنواخت، ظرفیت توان عملیاتی بالا را بدون به خطر انداختن کیفیت داده ها تضمین می کند. این مزایای, همراه با گردش کار ساده ذکر شده در بالا, را Hielscher چند نمونه فراصوت ابزار ضروری برای تحقیقات بیولوژیکی مدرن.
- راندمان بالا
- تکنولوژی روز
- قابلیت اطمینان & نیرومندی
- کنترل فرآیند قابل تنظیم و دقیق
- دسته & درون خطی
- برای هر حجمی
- نرم افزار هوشمند
- ویژگی های هوشمند (به عنوان مثال، قابل برنامه ریزی، پروتکل داده ها، کنترل از راه دور)
- آسان و ایمن برای کار
- تعمیر و نگهداری کم
- CIP (تمیز کردن در محل)
طراحی، ساخت و مشاوره – کیفیت ساخت آلمان
مافوق صوت Hielscher به خوبی برای بالاترین کیفیت و استانداردهای طراحی خود را شناخته شده. استحکام و بهره برداری آسان اجازه می دهد تا ادغام صاف از ultrasonicators ما به امکانات صنعتی. شرایط خشن و محیط های خواستار به راحتی توسط مافوق صوت Hielscher رسیده.
Hielscher اولتراسونیک یک شرکت دارای گواهینامه ISO است و تاکید ویژه ای بر مافوق صوت با کارایی بالا با ویژگی های دولت از هنر فن آوری و کاربر پسند قرار داده است. البته، مافوق صوت Hielscher مطابق با CE و دیدار با الزامات UL، CSA و RoHs.
ادبیات / منابع / برگه های اطلاعات
- Download PDF “Protocol using Hielscher Multi-Sample Sonicators in Biofilm and Proteomic Analysis” – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP400MTP – High-throughput Sonicator for Multiwell-Plates
- FactSheet VialTweeter – Simultaneous sonication of closed vials
- Shirley J.D., Nauta K.M., Carlson E.E. (2022): Live-Cell Profiling of Penicillin-Binding Protein Inhibitors in Escherichia coli MG1655. ACS Infectious Diseases Jul 8;8(7); 2022. 1241-1252.
- Teteneva N.A., Mart’yanov S.V., Esteban-López M., Kahnt J., Glatter T,. Netrusov A.I., Plakunov V.K., Sourjik V. (2020): Multiple drug-induced stress responses inhibit formation of Escherichia coli biofilms. Applied Environmental Microbiology 2020: 86:e01113-20.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
پرسش و پاسخهای متداول
بیوفیلم چیست؟
بیوفیلم یک جامعه ساختاریافته از میکروارگانیسم ها است که در یک ماتریس خارج سلولی (ECM) خود تولید شده تعبیه شده و به سطوح چسبیده است. این ماده در برابر استرس های محیطی، آنتی بیوتیک ها و سیستم ایمنی بدن محافظت می کند و به عفونت های مداوم و رسوب زیستی کمک می کند.
جداشدگی بیوفیلم چیست؟
جداشدگی بیوفیلم فرآیندی است که طی آن سلول ها یا خوشه های میکروبی از ساختار بیوفیلم جدا می شوند، یا به طور فعال (از طریق تخریب آنزیمی یا سنجش حد نصاب ) یا به صورت غیرفعال (به دلیل نیروهای برشی، کاهش مواد مغذی یا اختلال مکانیکی). این امر پراکندگی بیوفیلم و استعمار سطوح جدید را تسهیل می کند.
پروتئین های مرتبط با بیوفیلم چیست؟
پروتئین های مرتبط با بیوفیلم (BAPs) پروتئین های سطحی میکروبی یا ترشحی هستند که نقش کلیدی در تشکیل، پایداری و چسبندگی بیوفیلم دارند. اینها شامل چسبندگی، آنزیم های خارج سلولی و پروتئین های ساختاری مانند الیاف کرلی در E. coli یا BapA در استافیلوکوکوس اورئوس است.
ECM در بیوفیلم چیست؟
ماتریکس خارج سلولی (ECM) در بیوفیلم ها شبکه پیچیده ای از پلی ساکاریدها، پروتئین ها، DNA خارج سلولی (eDNA) و لیپیدها است که سلول های میکروبی را در بر می گیرد. یکپارچگی ساختاری را فراهم می کند، واسطه چسبندگی است، رطوبت را حفظ می کند و مقاومت بیوفیلم را در برابر ضد میکروبی ها و دفاع میزبان افزایش می دهد.
چه عملکردی الیاف فرفری را برآورده می کند؟
الیاف فرفری فیبریل های آمیلوئید خارج سلولی هستند که توسط اشریشیا کلی و باکتری های مرتبط با آن تولید می شوند و نقش مهمی در تشکیل بیوفیلم، چسبندگی سطحی و کلونیزاسیون میزبان دارند. آنها به یکپارچگی بیوفیلم کمک می کنند، مقاومت در برابر تنش های محیطی را افزایش می دهند و تعامل با بافت های میزبان را در طول عفونت تسهیل می کنند. علاوه بر این، فیبرهای کرلی در تقویت فعال شدن سیستم ایمنی نقش دارند و در ماندگاری و بیماری زایی باکتری ها نقش دارند.
Hielscher مافوق صوت تولید کننده هموژنایزرهای مافوق صوت با کارایی بالا از ازمایشگاه ها تا اندازه صنعتی.