پروتکل کشت و جداسازی بیوفیلم Staphylococcus
روش‌های استانداردشده برای دستیابی به نتایج پژوهشی قابل‌اعتماد ضروری هستند. در اینجا پروتکلی برای کشت و جداسازی بیوفیلم‌های استافیلوکوکی ارائه شده است. این پروتکل بر تسهیل آماده‌سازی نمونه‌ها با ظرفیت پردازش بالا با استفاده از سونیکاتور پلیت چندچاهکی UIP400MTP تمرکز دارد تا جداسازی بیوفیلم در پلیت‌های 96 چاهکی به‌طور کارآمد و با ظرفیت پردازش بالا انجام شود. این پروتکل همچنین شامل مراحل کلیدی کشت، شست‌وشو و مشاهدهٔ بیوفیلم است و بر به‌حداقل‌رساندن تغییرپذیری و تضمین تکرارپذیری تأکید دارد.
بیوفیلم Staphylococcus و پژوهش دربارهٔ آنتی‌بیوتیک‌ها
بیوفیلم‌های Staphylococcus به‌دلیل مقاومت در برابر آنتی‌بیوتیک‌ها و پاسخ‌های ایمنی، نقشی حیاتی در عفونت‌های پایدار دارند. تشکیل بیوفیلم محیطی محافظ برای باکتری‌ها فراهم می‌کند که درمان عفونت‌ها را دشوار می‌سازد. پژوهش دربارهٔ بیوفیلم‌ها اغلب بر شناخت نحوهٔ تشکیل، رفتار و حساسیت آن‌ها به عوامل ضدمیکروبی تمرکز دارد و برای تسهیل روند انجام آزمایش‌ها، بر روش‌های دارای ظرفیت پردازش بالا تأکید می‌کند.
سونیکاتور پلیت چندچاهکی UIP400MTP با فراهم‌کردن امکان جداسازی سریع و کارآمد بیوفیلم‌ها از پلیت‌های 96 چاهکی، مزیت قابل‌توجهی در پژوهش بیوفیلم ارائه می‌دهد. این دستگاه انرژی فراصوتی یکنواختی به همهٔ چاهک‌ها می‌رساند و ضمن به‌حداقل‌رساندن تغییرپذیری، نتایج یکسانی را تضمین می‌کند.
پروتکل کشت و جداسازی بیوفیلم Staphylococcus
در ادامه، با دستورالعملی گام‌به‌گام شما را در فرایند کشت و جداسازی بیوفیلم Staphylococcus راهنمایی می‌کنیم. به‌عنوان نمونه‌ای از یک مرحلهٔ تحلیلی، نشان می‌دهیم که چگونه زیست‌تودهٔ کشت‌شده را با رنگ‌آمیزی کریستال ویوله و به روش اسپکتروفتومتری اندازه‌گیری کمّی کنید.
کشت بیوفیلم Staphylococcus
مواد و تجهیزات موردنیاز:
- پلیت‌های میکروتیتر پلی‌استایرنی استریل 96 چاهکی کف‌تخت، دارای سطح تیمارشده برای کشت بافت و مجهز به درپوش
- محیط کشت تریپتیک سوی براث (TSB) حاوی 0٫25% گلوکز
- کابینت ایمنی زیستی
مراحل:
- برای به‌حداقل‌رساندن آلودگی، محیط کاری استریل در کابینت ایمنی زیستی آماده کنید.
- TSB حاوی 0٫25% گلوکز را به چاهک‌های پلیت میکروتیتر اضافه کنید. TSB فاقد گلوکز عموماً از تشکیل بیوفیلم پشتیبانی نمی‌کند و فقط در صورت نیاز باید به‌عنوان شاهد استفاده شود.
- چاهک‌ها را با سویه‌های باکتریایی که به روش زیر آماده شده‌اند، تلقیح کنید:
- سوسپانسیون‌های باکتریایی را آماده کنید و با همگن‌سازی آن‌ها از طریق فراصوت‌دهی یا با بازکردن تجمعات به کمک سوزن گیج 23 و ورتکس‌کردن کوتاه‌مدت، اطمینان حاصل کنید که تجمعات سلولی ازپیش‌موجود باقی نمانده‌اند.
- پلیت را با درپوش آن ببندید و در شرایط بهینه برای تشکیل بیوفیلم انکوبه کنید (برای مثال، در 37°C به‌مدت 24 ساعت).
- برای اطمینان از قابل‌اعتمادبودن نتایج، آزمایش را برای هر سویهٔ باکتریایی در سه تکرار انجام دهید (سه چاهک برای هر سویه).
- در هر پلیت، شش چاهک را به شاهدهای منفی اختصاص دهید. در هر پلیت 96 چاهکی می‌توان حداکثر 30 سویه را آزمایش کرد.
مشاهده و شست‌وشوی بیوفیلم
- پس از انکوباسیون، محیط کشت را با احتیاط دور بریزید تا بیوفیلم دچار اختلال نشود.
- هر چاهک را چهار بار با سرم فیزیولوژی بشویید تا باکتری‌های پلانکتونیک حذف شوند.
- کف چاهک‌ها را از نظر وجود لکه‌های سفید نشان‌دهندهٔ حضور بیوفیلم بررسی کنید.
جداسازی بیوفیلم با استفاده از سونیکاتور پلیت چندچاهکی UIP400MTP
راه‌اندازی دستگاه و پارامترها:
- سونیکاتور پلیت چندچاهکی UIP400MTP
- تنظیمات عملکرد: دامنهٔ 60%، حالت چرخه‌ای با 60 ثانیه روشن / 30 ثانیه خاموش
مراحل:
- پلیت میکروتیتر شسته‌شده را روی سکوی UIP400MTP قرار دهید.
- نمونه‌ها را با تنظیمات توصیه‌شده فراصوت‌دهی کنید (دامنهٔ 60%، 60 ثانیه روشن، 30 ثانیه خاموش). تنظیمات را متناسب با سویهٔ باکتری تنظیم کنید.
- فرایند فراصوت‌دهی را برای جداسازی بیوفیلم آغاز کنید. امواج فراصوت ماتریکس بیوفیلم را تخریب می‌کنند و باکتری‌های چسبیده را آزاد می‌سازند.
- UIP400MTP قرارگیری یکنواخت همهٔ چاهک‌ها در معرض فراصوت را تضمین می‌کند تا نتایج جداسازی یکسان باشند.
باکتری‌های Staphylococcus
مرحلهٔ تحلیلی: اندازه‌گیری کمّی زیست‌تودهٔ بیوفیلم جداشدهٔ Staphylococcus با استفاده از کریستال ویوله (CV)
مواد و تجهیزات موردنیاز:
- محلول 0٫1% کریستال ویوله (CV)
- اتانول 95% یا اسید استیک 30% (برای حل‌کردن)
- دستگاه میکروپلیت‌خوان با قابلیت خوانش در 570 nm
- پلیت‌های میکروتیتر استریل برای رنگ‌آمیزی
مراحل:
- آماده‌سازی پلیت رنگ‌آمیزی: مقدار 100 µL از سوسپانسیون بیوفیلم جداشده را از هر چاهک پلیت فراصوت‌دهی‌شده به چاهک متناظر در یک پلیت میکروتیتر 96 چاهکی تمیز و استریل منتقل کنید. این کار محیطی تمیز و یکنواخت برای رنگ‌آمیزی فراهم می‌کند.
- رنگ‌آمیزی بیوفیلم جداشده: به هر چاهک حاوی سوسپانسیون بیوفیلم جداشده، 150 µL محلول 0٫1% کریستال ویوله اضافه کنید. با پیپتاژ آرام، از اختلاط یکنواخت سوسپانسیون بیوفیلم و کریستال ویوله اطمینان حاصل کنید.
- انکوباسیون: پلیت را به‌مدت 15 دقیقه در دمای اتاق انکوبه کنید تا کریستال ویوله زیست‌توده را به‌طور مؤثر رنگ‌آمیزی کند.
- شست‌وشو: پس از انکوباسیون، محلول کریستال ویوله را با احتیاط و بدون برهم‌زدن زیست‌توده از چاهک‌ها دور بریزید. هر چاهک را سه بار با سرم فیزیولوژی استریل بشویید تا رنگ متصل‌نشده حذف شود.
- خشک‌کردن: اجازه دهید پلیت در معرض هوا در دمای اتاق یا زیر هود با جریان هوای استریل خشک شود. از گرم‌کردن خودداری کنید، زیرا ممکن است نتایج را تغییر دهد.
- حل‌کردن: به هر چاهک، 200 µL اتانول 95% (یا اسید استیک 30%، بسته به رویه‌های استاندارد آزمایشگاه) اضافه کنید تا کریستال ویولهٔ متصل‌شده حل شود. با پیپتاژ یا تکان‌دادن پلیت به‌مدت 10 دقیقه در دمای اتاق، به‌آرامی مخلوط کنید.
- اندازه‌گیری: چگالی نوری (OD) محلول حاصل از حل‌کردن کریستال ویوله را در 570 nm با استفاده از دستگاه میکروپلیت‌خوان اندازه‌گیری کنید.
- تحلیل داده‌ها: برای تصحیح اثر رنگ‌آمیزی زمینه، میانگین مقدار OD570 شاهدهای منفی (چاهک‌های حاوی TSB بدون مایهٔ تلقیح باکتریایی) را از مقادیر چاهک‌های آزمایشی کم کنید. داده‌ها را ثبت و تحلیل کنید.
نکته: برای تضمین تکرارپذیری، آزمایش را برای هر شرایط در سه تکرار انجام دهید. هنگام کار با کریستال ویوله و اتانول، از رعایت شیوهٔ صحیح کار و پروتکل‌های ایمنی و دفع پسماند اطمینان حاصل کنید.
مزایای کلیدی UIP400MTP در یک نگاه:
- پردازش با ظرفیت بالا: به‌طور ویژه برای پلیت‌های چندچاهکی طراحی شده است و به شما امکان می‌دهد چندین نمونه را هم‌زمان پردازش کنید.
- توزیع یکنواخت فراصوت: شدت فراصوت یکسان در همهٔ چاهک‌ها را تضمین می‌کند و نتایج یکسانی برای تمام نمونه‌ها فراهم می‌سازد.
- از هر پلیت استانداردی استفاده کنید: UIP400MTP می‌تواند هر نوع پلیت چندچاهکی استاندارد، پتری‌دیش و رک لوله را پردازش کند. نیازی به پلیت‌های اختصاصی گران‌قیمت نیست!
- رابط کاربرپسند: راه‌اندازی و کنترل آن آسان است و همین ویژگی آن را به ابزاری عالی برای افزایش بهره‌وری آزمایشگاه تبدیل می‌کند. تنظیمات قابل‌برنامه‌ریزی و خودکارسازی، استانداردسازی فرایند را تسهیل می‌کنند!
جداسازی بیوفیلم با ظرفیت پردازش بالا با سونیکاتور پلیت 96 چاهکی UIP400MTP
منابع علمی / مراجع
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
- Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
- Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.
پرسش‌های متداول
مواد پلیمری خارج‌سلولی (EPS) چیستند؟
مواد پلیمری خارج‌سلولی (EPS) مخلوط پیچیده‌ای از زیست‌پلیمرها هستند که عمدتاً از پلی‌ساکاریدها، پروتئین‌ها، اسیدهای نوکلئیک و لیپیدها تشکیل شده‌اند و توسط میکروارگانیسم‌های موجود در بیوفیلم‌ها ترشح می‌شوند. EPS ماتریکسی محافظ تشکیل می‌دهد که جامعهٔ میکروبی را دربر می‌گیرد، یکپارچگی ساختاری را فراهم می‌کند، واسطهٔ چسبیدن به سطوح می‌شود و سلول‌ها را در برابر تنش‌های محیطی، از جمله آنتی‌بیوتیک‌ها و پاسخ‌های ایمنی، محافظت می‌کند.
منظور از باکتری‌های پلانکتونیک چیست؟
باکتری‌های پلانکتونیک میکروارگانیسم‌های تک‌سلولی و آزادشناوری هستند که به‌صورت معلق، مثلاً در محیط کشت مایع یا مایعات بدن، وجود دارند و به سطوح متصل نیستند یا اجتماعات سازمان‌یافته‌ای مانند بیوفیلم‌ها تشکیل نمی‌دهند.
تفاوت بیوفیلم با باکتری‌های پلانکتونیک چیست؟
تفاوت اصلی بیوفیلم با باکتری‌های پلانکتونیک در سازمان‌یافتگی آن‌ها است. بیوفیلم‌ها اجتماعات سازمان‌یافته‌ای از باکتری‌ها هستند که به سطح متصل‌اند و در ماتریکسی از مواد پلیمری خارج‌سلولی (EPS) جای گرفته‌اند، درحالی‌که باکتری‌های پلانکتونیک آزادشناورند و چنین سازمان‌یافتگی ساختاری ندارند.
آیا درمان باکتری‌های موجود در بیوفیلم‌ها با آنتی‌بیوتیک دشوارتر از باکتری‌های پلانکتونیک است؟
درمان باکتری‌های موجود در بیوفیلم‌ها با آنتی‌بیوتیک در مقایسه با باکتری‌های پلانکتونیک به‌مراتب دشوارتر است. ماتریکس بیوفیلم به‌صورت یک سد فیزیکی عمل می‌کند و باکتری‌های درون آن وضعیت‌های متابولیکی تغییریافته و مقاومت بیشتر در برابر تنش نشان می‌دهند که به کاهش اثربخشی آنتی‌بیوتیک منجر می‌شود.
آیا آنتی‌بیوتیک‌ها می‌توانند بیوفیلم‌ها را از بین ببرند؟
گاهی می‌توان بیوفیلم‌ها را با آنتی‌بیوتیک ریشه‌کن کرد، اما این کار چالش‌برانگیز است. درمان مؤثر اغلب به غلظت‌های بالای آنتی‌بیوتیک، ترکیب‌های مشخص یا درمان‌های کمکی نیاز دارد، زیرا ماتریکس EPS و سازوکارهای مقاومت باکتریایی از بیوفیلم محافظت می‌کنند.
آیا Staphylococcus باکتری‌هایی با قابلیت چسبیدن هستند؟
باکتری‌های Staphylococcus به توانایی چسبیدن خود شناخته شده‌اند. آن‌ها به‌راحتی به سطوح متصل می‌شوند و به‌ویژه روی تجهیزات پزشکی یا بافت‌های میزبان، بیوفیلم تشکیل می‌دهند؛ به همین دلیل از عوامل اصلی دخیل در عفونت‌های پایدار هستند.
چه انواعی از باکتری‌های Staphylococcus وجود دارند؟
باکتری‌های Staphylococcus شامل چندین نوع هستند که شاخص‌ترین آن‌ها Staphylococcus aureus و Staphylococcus epidermidis هستند. S. aureus بیماری‌زا است و می‌تواند عفونت‌های شدید ایجاد کند، درحالی‌که S. epidermidis معمولاً با عفونت‌های مرتبط با بیوفیلم روی تجهیزات پزشکی ارتباط دارد.
کریستال ویوله چیست؟
کریستال ویوله یک رنگ بازی است که معمولاً برای رنگ‌آمیزی مواد زیستی استفاده می‌شود. در میکروبیولوژی، از آن برای ارزیابی تشکیل بیوفیلم از طریق رنگ‌آمیزی زیست‌توده استفاده می‌کنند و سپس می‌توان زیست‌توده را به روش اسپکتروفتومتری اندازه‌گیری کمّی کرد.
Hielscher Ultrasonics هموژنایزرهای فراصوتی با عملکرد بالا را در مقیاس‌هایی از آزمایشگاهی تا صنعتی تولید می‌کند.