پروتکل کشت و جداسازی بیوفیلم استافیلوکوک
روش های استاندارد شده برای نتایج قابل اعتماد پژوهش ضروری هستند. در اینجا می توانید پروتکل کشت و جداسازی بیوفیلم های استافیلوکوک را پیدا کنید. این پروتکل بر روی آماده سازی نمونه با توان بالا با استفاده از UIP400MTP فراصوت صفحه چند چاهی برای جداسازی بیوفیلم کارآمد و با توان بالا در صفحات 96 چاهی تمرکز دارد. این پروتکل همچنین شامل مراحل کلیدی برای کشت، شستشو و تجسم بیوفیلم، با تمرکز بر به حداقل رساندن تنوع و اطمینان از تکرارپذیری است.
تحقیقات بیوفیلم و آنتی بیوتیک استافیلوکوک
بیوفیلم های استافیلوکوک به دلیل مقاومت به آنتی بیوتیک ها و پاسخ های ایمنی، نقش مهمی در عفونت های پایدار ایفا می کنند. تشکیل بیوفیلم یک محیط محافظ برای باکتری ها فراهم می کند و درمان عفونت ها را دشوار می کند. تحقیقات در مورد بیوفیلم ها اغلب بر درک تشکیل، رفتار و حساسیت آنها به داروهای ضد میکروبی، با تأکید بر روش های با توان بالا برای ساده سازی گردش کار تجربی متمرکز است.
سونیکاتور صفحه چند چاهی UIP400MTP با امکان جداسازی سریع و کارآمد بیوفیلم از صفحات 96 چاه، مزیت قابل توجهی در تحقیقات بیوفیلم ارائه می دهد. این دستگاه انرژی اولتراسونیک یکنواخت را برای همه چاه ها فراهم می کند و ضمن به حداقل رساندن تغییرات، نتایج ثابت را تضمین می کند.
پروتکل کشت و جداسازی بیوفیلم استافیلوکوک
در زیر، ما شما را با یک دستورالعمل گام به گام از طریق فرآیند کشت و جدا کردن بیوفیلم استافیلوکوک راهنمایی می کنیم. به عنوان یک مرحله تحلیلی مثالزدنی ، ما به شما نشان می دهیم که چگونه می توانید زیست توده کشت شده را با رنگ آمیزی بنفش کریستالی به صورت اسپکتروفتومتری کمی کنید.
کشت بیوفیلم استافیلوکوک
مواد مورد نیاز:
- صفحات میکروتیتر تیمار شده با کشت بافت پلی استایرن 96 چاهکی با کف صاف استریل با درب
- آبگوشت سویا تریپتیک (TSB) با 0.25٪ گلوکز
- کابینت ایمنی بیولوژیکی
مراحل:
- یک محیط کار استریل را در کابینت ایمنی بیولوژیکی آماده کنید تا آلودگی به حداقل برسد.
- TSB حاوی 0.25 درصد گلوکز را به چاه های صفحه میکروتیتر اضافه کنید. TSB بدون گلوکز به طور کلی از تشکیل بیوفیلم پشتیبانی نمی کند و در صورت لزوم فقط باید به عنوان کنترل استفاده شود.
- چاه ها را با سویه های باکتریایی تهیه شده به شرح زیر تلقیح کنید:
- آماده سازی سوسپانسیون باکتریایی، اطمینان از هیچ خوشه سلولی از قبل موجود با همگن کردن سوسپانسیون با استفاده از فراصوت و یا با شکستن خوشه ها با یک سوزن 23 سنج و گرداب مختصر.
- صفحه را با درب آن ببندید و در شرایط مطلوب برای تشکیل بیوفیلم (به عنوان مثال، 37 درجه سانتیگراد به مدت 24 ساعت) جوجه کشی کنید.
- آزمایش را به صورت سه تکرار برای هر سویه باکتریایی (سه چاه در هر کرنش) انجام دهید تا از قابلیت اطمینان اطمینان حاصل شود.
- شش چاه در هر صفحه برای کنترل های منفی اختصاص دهید. حداکثر 30 سویه را می توان در هر صفحه 96 چاهی آزمایش کرد.
تجسم و شستشوی بیوفیلم
- پس از جوجه کشی، محیط را با دقت دور بریزید تا از ایجاد مزاحمت در بیوفیلم جلوگیری شود.
- هر کدام را چهار بار با سالین فیزیولوژیکی بشویید تا باکتری های پلانکتونی از بین بروند.
- کف چاه ها را برای لکه های سفید نشان دهنده حضور بیوفیلم بررسی کنید.
جداسازی بیوفیلم با استفاده از سونیکاتور صفحه چند چاهی UIP400MTP
راه اندازی دستگاه و پارامترها:
- UIP400MTP چند چاه صفحه فراصوت
- تنظیمات عملیاتی: دامنه 60٪ ، حالت چرخه با 60 ثانیه روشن / 30 ثانیه خاموش
مراحل:
- صفحه میکروتیتر شسته شده را روی سکوی UIP400MTP قرار دهید.
- نمونه ها را در تنظیمات توصیه شده (دامنه 60٪، 60 ثانیه روشن، 30 ثانیه خاموش) فراصوت کنید. تنظیمات را با فشار باکتری ها تنظیم کنید.
- شروع فرایند فراصوت برای جدا کردن بیوفیلم. امواج اولتراسونیک ماتریس بیوفیلم را مختل می کنند و باکتری های چسبنده را آزاد می کنند.
- این UIP400MTP قرار گرفتن در معرض یکنواخت را در تمام چاه ها برای نتایج جداسازی ثابت تضمین می کند.
باکتری استافیلوکوک
مرحله تحلیلی: کمی سازی زیست توده بیوفیلم استافیلوکوکوس جدا شده با استفاده از بنفش کریستالی (CV)
مواد مورد نیاز:
- 00.1٪ محلول بنفش کریستالی (CV).
- 95٪ اتانول یا 30٪ اسید استیک (برای حلالیت)
- خواننده میکروپلیت با قابلیت خواندن در 570 نانومتر
- صفحات میکروتیتر استریل برای رنگ آمیزی
مراحل:
- آماده سازی صفحه رنگ آمیزی: انتقال 100 میکرولیتر از سوسپانسیون بیوفیلم جدا شده از هر چاه از صفحه فراصوت به چاه های مربوطه از تمیز, استریل 96 به خوبی صفحه میکروتیتر. این یک محیط شفاف و یکنواخت برای رنگ آمیزی را تضمین می کند.
- رنگ آمیزی بیوفیلم جدا شده: 150 میکرولیتر محلول بنفش کریستالی 0.1٪ را به هر چاه حاوی سوسپانسیون بیوفیلم جدا شده اضافه کنید. پیپت را به آرامی بکشید تا از اختلاط یکنواخت سوسپانسیون بیوفیلم و بنفش کریستالی اطمینان حاصل شود.
- جوجه کشی: اجازه دهید صفحه به مدت 15 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شود تا بنفش کریستالی بتواند زیست توده را به طور موثر لکه دار کند.
- شستشو: پس از جوجه کشی، محلول بنفشه کریستالی را با دقت از چاه ها دور بریزید بدون اینکه مزاحمت زیست توده ایجاد شود. هر چاه را سه بار با سالین فیزیولوژیکی استریل بشویید تا لکه های نامحدود از بین برود.
- خشک کردن: اجازه دهید صفحه در دمای اتاق یا زیر هود جریان هوای استریل خشک شود. از گرم شدن خودداری کنید، زیرا ممکن است نتایج را تغییر دهد.
- حلالیت: 200 میکرولیتر اتانول 95٪ (یا 30٪ اسید استیک، بسته به شیوه های استاندارد آزمایشگاهی) را به هر چاه اضافه کنید تا بنفشه کریستال متصل حل شود. با پیپت کردن یا تکان دادن بشقاب به مدت 10 دقیقه در دمای اتاق به آرامی مخلوط کنید.
- اندازه گیری: چگالی نوری (OD) محلول بنفش کریستالی محلول در 570 نانومتر با استفاده از میکروپلیت خوان اندازه گیری کنید.
- تجزیه و تحلیل داده ها: میانگین مقدار OD570 کنترل منفی (چاه های دارای TSB اما بدون تلقیح باکتریایی) را از چاه های آزمایشی کم کنید تا رنگ آمیزی زمینه در نظر گرفته شود. ثبت و تجزیه و تحلیل داده ها.
توجه: آزمایش را برای هر شرایط سه تکرار انجام دهید تا از تکرارپذیری اطمینان حاصل شود. اطمینان از استفاده مناسب از کریستال بنفش و اتانول، پایبندی به پروتکل های ایمنی و دفع.
UIP400MTP یک حمام اولتراسونیک نیست. این یک شاخ فنجان با شدت بالا برای فراصوت متمرکز است. این فراصوت قدرتمند بدون تماس ارائه فراصوت یکنواخت در سراسر تمام چاه های استاندارد خود را به خوبی بشقاب. شما کنترل دقیقی بر دامنه، توان و ضربان دارید. یک تایمر داخلی و پروب دما نتایج ثابتی را تضمین می کند. سونیکاتور صفحه UIP400MTP نمونه ها را با حمام آب خنک می کند (چیلر خارجی اختیاری).
مزایای کلیدی UIP400MTP در یک نگاه:
- پردازش با توان عملیاتی بالا: به طور خاص برای صفحات چند چاهی طراحی شده است و به شما امکان می دهد چندین نمونه را به طور همزمان پردازش کنید.
- توزیع اولتراسونیک یکنواخت: شدت اولتراسونیک برابر را در چاه ها تضمین می کند و نتایج ثابتی را در تمام نمونه ها ارائه می دهد.
- از هر صفحه استاندارد استفاده کنید: این UIP400MTP می تواند هر صفحه چند چاهی استاندارد، ظروف پتری و قفسه های لوله را اداره کند. بدون نیاز به صفحات اختصاصی گران قیمت!
- رابط کاربر پسند: راه اندازی و کنترل آسان، آن را به ابزاری عالی برای افزایش بهره وری آزمایشگاه تبدیل می کند. تنظیمات قابل برنامه ریزی و اتوماسیون استانداردسازی فرآیند را تسهیل می کند!
جداسازی بیوفیلم با توان عملیاتی بالا با سونیکاتور صفحه 96 چاه UIP400MTP
ادبیات / منابع
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
- Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
- Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.
پرسش و پاسخهای متداول
مواد پلیمری خارج سلولی (EPS) چیست؟
مواد پلیمری خارج سلولی (EPS) مخلوط پیچیده ای از بیوپلیمرها هستند که عمدتا از پلی ساکاریدها، پروتئین ها، اسیدهای نوکلئیک و لیپیدها تشکیل شده اند که توسط میکروارگانیسم ها در بیوفیلم ها ترشح می شوند. EPS یک ماتریس محافظتی را تشکیل می دهد که جامعه میکروبی را در بر می گیرد، یکپارچگی ساختاری را فراهم می کند، واسطه چسبندگی به سطوح و محافظت از سلول ها در برابر تنش های محیطی، از جمله آنتی بیوتیک ها و پاسخ های ایمنی است.
منظور از باکتری های پلانکتونیک چیست؟
باکتری های پلانکتونیک میکروارگانیسم های تک سلولی شناور آزاد هستند که به جای اینکه به سطوح متصل شوند یا جوامع ساختاری مانند بیوفیلم ها را تشکیل دهند، در حالت تعلیق وجود دارند، مانند کشت مایع یا مایعات بدن.
تفاوت بین بیوفیلم و باکتری های پلانکتونیک چیست؟
تفاوت اصلی بین بیوفیلم و باکتری های پلانکتونیک در سازمان آنها نهفته است. بیوفیلم ها جوامع ساختاری و متصل به سطح باکتری ها هستند که در یک ماتریس ماده پلیمری خارج سلولی (EPS) تعبیه شده اند، در حالی که باکتری های پلانکتونی شناور هستند و فاقد چنین سازمان ساختاری هستند.
آیا درمان باکتری های موجود در بیوفیلم ها با آنتی بیوتیک ها دشوارتر از باکتری های پلانکتونیک است؟
درمان باکتری های موجود در بیوفیلم ها با آنتی بیوتیک ها در مقایسه با باکتری های پلانکتونیک به طور قابل توجهی دشوارتر است. ماتریکس بیوفیلم به عنوان یک مانع فیزیکی عمل می کند و باکتری های موجود در آن حالت های متابولیکی تغییر یافته و مقاومت در برابر استرس را افزایش می دهند و به کاهش اثر آنتی بیوتیکی کمک می کنند.
آیا بیوفیلم ها را می توان با آنتی بیوتیک ها از بین برد؟
بیوفیلم ها گاهی اوقات می توانند با آنتی بیوتیک ها ریشه کن شوند، اما این چالش برانگیز است. درمان موثر اغلب به غلظت های بالای آنتی بیوتیکی، ترکیبات خاص یا درمان های کمکی نیاز دارد، زیرا ماتریس EPS و مکانیسم های مقاومت باکتریایی از بیوفیلم محافظت می کنند.
آیا استافیلوکوک باکتری های چسبنده هستند؟
باکتری های استافیلوکوک به دلیل قابلیت های پایبندی خود به خوبی شناخته شده اند. آنها به راحتی به سطوح متصل می شوند و بیوفیلم ها را تشکیل می دهند، به ویژه در دستگاه های پزشکی یا بافت های میزبان، و آنها را به یک عامل اصلی در عفونت های مداوم تبدیل می کند.
چه نوع باکتری های استافیلوکوک وجود دارد؟
باکتری های استافیلوکوک شامل انواع مختلفی هستند که قابل توجه ترین آنها استافیلوکوکوس اورئوس و استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس هستند. استافیلوکوکوس اورئوس بیماری زا است و می تواند باعث عفونت های شدید شود، در حالی که استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس معمولا با عفونت های دستگاه مرتبط با بیوفیلم همراه است.
کریستال بنفش چیست؟
کریستال بنفش یک رنگ اساسی است که معمولا برای رنگ آمیزی مواد بیولوژیکی استفاده می شود. در میکروبیولوژی، برای ارزیابی تشکیل بیوفیلم با رنگ آمیزی زیست توده استفاده می شود، که سپس می توان آن را به صورت اسپکتروفتومتری اندازه گیری کرد.
Hielscher مافوق صوت تولید کننده هموژنایزرهای مافوق صوت با کارایی بالا از ازمایشگاه ها تا اندازه صنعتی.