پروتکل ASTM E2799-22 برای ارزیابی ضد میکروبی
Hielscher UIP400MTP یک فراصوت چند چاه صفحه قدرتمند و کارآمد طراحی شده برای ساده کردن مرحله فراصوت در پروتکل ASTM E2799-22 است. با ارائه انرژی اولتراسونیک یکنواخت در کل صفحه میکروتیتر، UIP400MTP جداسازی مداوم و قابل اعتماد بیوفیلم ها از درب های گیره را بدون آسیب رساندن به سلول ها یا به خطر انداختن یکپارچگی نمونه تضمین می کند. قابلیت توان بالا و عملکرد کاربر پسند آن به طور قابل توجهی زمان پردازش را کاهش می دهد و در عین حال تکرارپذیری را افزایش می دهد و آن را به یک راه حل ایده آل برای آزمایشگاه هایی تبدیل می کند که سنجش زنده ماندن بیوفیلم و آزمایش اثربخشی ضد میکروبی را انجام می دهند.
ASTM E2799
ASTM E2799 یک روش تست استاندارد است که برای ارزیابی اثربخشی عوامل ضد میکروبی در برابر بیوفیلم ها طراحی شده است و به طور خاص بر سودوموناس آئروژینوزا تمرکز دارد. بیوفیلم ها جوامع میکروبی پیچیده ای هستند که به سطوح می چسبند و مقاومت بیشتری در برابر درمان های ضد میکروبی از خود نشان می دهند و آنها را به یک چالش مهم در زمینه های مراقبت های بهداشتی، صنعتی و زیست محیطی تبدیل می کند. این روش از سنجش حداقل غلظت ریشه کنی بیوفیلم (MBEC) استفاده می کند تا چارچوبی قابل اعتماد و تکرارپذیر برای آزمایش ضدعفونی کننده ها در شرایط واقعی بیوفیلم ارائه دهد.
سونیکاتور صفحه 96 به خوبی UIP400MTP برای غربالگری با توان عملیاتی بالا
چگونه فراصوت به ASTM E2799 کمک?
فراصوت با تسهیل جداسازی بیوفیلم ها از سطوح آزمایش، نقش مهمی در پروتکل ASTM E2799 ایفا می کند و از ارزیابی دقیق زنده ماندن میکروبی پس از درمان اطمینان حاصل می کند. با استفاده از انرژی اولتراسونیک کنترل شده، این پروتکل بدون آسیب رساندن به سلول ها، اختلال بیوفیلم کارآمد و سازگار را به دست می آورد و نتایج دقیق و قابل تکرار را امکان پذیر می کند. این امر ASTM E2799 را به ابزاری ضروری برای پیشبرد تحقیقات بیوفیلم و توسعه استراتژی های ضد میکروبی موثر تبدیل می کند.
نحوه اجرای سنجش MBEC مطابق با ASTM E2799-22
پروتکل ASTM E2799-22 مراحل ارزیابی اثربخشی عوامل ضد میکروبی در برابر بیوفیلم ها را تشریح می کند. هنگام استفاده از Hielscher UIP400MTP میکروتیتر صفحه فراصوت، پروتکل را می توان اقتباس به ترکیب این روش فراصوت پیشرفته برای جداشدگی بیوفیلم. در زیر توضیحاتی از مراحل متناسب با استفاده از UIP400MTP ماسونیک میکروپلیت آورده شده است:
- تهیه بیوفیلم ها
یک صفحه میکروتیتر 96 چاهی استریل با درب های گیره قابل جدا شدن آماده کنید.
چاه ها را با سوسپانسیون باکتریایی استاندارد شده در یک محیط رشد مناسب تلقیح کنید.
درب گیره را روی صفحه قرار دهید و مطمئن شوید که گیره ها به طور کامل در سوسپانسیون باکتریایی غوطه ور شده اند.
صفحه را تحت شرایط کنترل شده (به عنوان مثال، دما و زمان) جوجه کشی کنید تا امکان تشکیل بیوفیلم روی گیره ها فراهم شود. - درمان با عوامل ضد میکروبی
پس از تشکیل بیوفیلم، محیط کشت را با محیط تازه حاوی عوامل ضد میکروبی آزمایش در غلظت های مختلف جایگزین کنید.
درب گیره را دوباره وصل کنید و تحت شرایط مشخص شده در طرح آزمایش جوجه کشی کنید. - آماده سازی برای جداشدگی بیوفیلم
پس از درمان، درب گیره را با غوطه ور کردن آن در محلول شستشوی استریل بشویید تا عوامل ضد میکروبی باقیمانده و سلول های پلانکتونی شل چسبیده از بین بروند. - جداسازی بیوفیلم با استفاده از UIP400MTP Sonicator
یک صفحه میکروتیتر 96 چاهی تازه حاوی یک محیط بازیابی (به عنوان مثال، آبگوشت خنثی کننده) آماده کنید.
بیوفیلم ها را با قرار دادن درب گیره در چاه های صفحه محیط بازیابی جدا کنید.
صفحه را در UIP400MTP سونیکاتور قرار دهید و مطمئن شوید که درب و صفحه به درستی تراز شده اند.
تنظیم سونیکاتور به 70٪ -80٪ دامنه و فراصوت برای 3-4 دقیقه در حالت چرخه، برای اطمینان از جدایی بیوفیلم سازگار بدون لیز سلول. - ارزیابی زنده مانی بیوفیلم
پس از فراصوت، محیط بازیابی حاوی سلول های بیوفیلم جدا شده را با استفاده از تکنیک های استاندارد میکروبیولوژیکی یا تحلیلی پردازش کنید، مانند:- شمارش واحد تشکیل کلنی (CFU): رقت های سریال و صفحه را روی آگار برای شمارش سلول های زنده انجام دهید.
- اندازه گیری چگالی نوری (OD): از تجزیه و تحلیل اسپکتروفتومتری برای ارزیابی تراکم سلول استفاده کنید.
- سنجش های زنده ماندن مبتنی بر فلورسانس: سلول های زنده و مرده را با استفاده از رنگ های فلورسنت تعیین کنید.
- تجزیه و تحلیل داده ها
داده های زنده ماندن بیوفیلم های تیمار شده و درمان نشده را برای تعیین اثربخشی عوامل ضد میکروبی مقایسه کنید.
حداقل غلظت ریشه کنی بیوفیلم (MBEC) را بر اساس غلظت مورد نیاز برای از بین بردن سلول های بیوفیلم زنده محاسبه کنید. - کنترل کیفیت
اطمینان از شرایط فراصوت سازگار با کالیبره کردن UIP400MTP به طور منظم و تأیید اینکه فرایند جداسازی بیوفیلم در لیز قابل توجهی سلول یا تخریب منجر نمی شود.
برای اعتبارسنجی نتایج، کنترل های مناسب، مانند بیوفیلم های درمان نشده و جاهای خالی فقط متوسط، را وارد کنید.
سلول های بیوفیلم تشکیل شده بر روی پین ها توسط فراصوت (Hielscher Ultrasound Technology، Teltow، آلمان، UIP250MTP) به مدت 5 دقیقه در صفحات 96 چاهی حاوی محیط کشت تازه برای بازیابی سلول ها جابجا شدند.
(تصویر و مطالعه: ©دی اولیویرا و همکاران، 2016)
با ادغام UIP400MTP در گردش کار ASTM E2799-22، فرآیند جداسازی بیوفیلم برای کاربردهای سازگاری، کارایی و توان عملیاتی بالا بهینه می شود.
ادبیات / منابع
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- ASTM E2799-22 Standard Test Method for Testing Disinfectant Efficacy against Pseudomonas aeruginosa Biofilm using the MBEC Assay
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
پرسش و پاسخهای متداول
ASTM E2799 چیست؟
ASTM E2799 یک روش تست استاندارد است که توسط ASTM International برای آزمایش اثربخشی ضد عفونی کننده در برابر بیوفیلم سودوموناس آئروژینوزا با استفاده از سنجش MBEC ایجاد شده است. این روش به طور گسترده ای برای ارزیابی تشکیل بیوفیلم، اثر ضد میکروبی و فعل و انفعالات سطح مواد استفاده می شود و امکان مقایسه های استاندارد در تحقیقات مرتبط با بیوفیلم را فراهم می کند.
تفاوت بین ASTM E2799-22 و ASTM E2799-11 ، ASTM E2799-12 و ASTM E2799-17 چیست؟
ASTM E2799 یک روش تست استاندارد است که اثربخشی ضد عفونی کننده ها را در برابر بیوفیلم سودوموناس آئروژینوزا با استفاده از آزمایش MBEC (حداقل غلظت ریشه کنی بیوفیلم) ارزیابی می کند. این روش برای افزایش دقت و کاربرد آن دستخوش بازنگری های متعددی شده است.
- ASTM E2799-11: این انتشار اولیه استاندارد بود که روش های اساسی را برای ارزیابی اثربخشی ضد عفونی کننده در برابر بیوفیلم P. aeruginosa با استفاده از روش MBEC ایجاد کرد.
- ASTM E2799-12: این بازنگری شامل به روز رسانی های فنی جزئی برای بهبود وضوح و رفع ابهامات شناسایی شده در نسخه 2011 است.
- ASTM E2799-17: در این به روز رسانی، تغییرات قابل توجه تری در پروتکل ایجاد شد، از جمله تنظیمات در فرآیند کشت بیوفیلم، کاربرد درمان و روش های خنثی سازی، با هدف افزایش تکرارپذیری و همسویی با پیشرفت های تحقیقات بیوفیلم.
- ASTM E2799-22: جدیدترین بازنگری نشان دهنده آخرین درک علمی و پیشرفت های تکنولوژیکی در مطالعات بیوفیلم است. این شامل روش های اصلاح شده برای رشد، درمان و تجزیه و تحلیل بیوفیلم است که اطمینان حاصل می کند که روش آزمایش برای ارزیابی های فعلی اثربخشی ضد عفونی کننده مرتبط و موثر باقی می ماند.
هر بازنگری ASTM E2799 برای بهبود قابلیت اطمینان، تکرارپذیری و ارتباط روش انجام شده است و اطمینان حاصل می کند که با پیشرفت علمی و فناوری در زمینه تحقیقات بیوفیلم به روز می ماند.
تفاوت بین سنجش های MBEC و MBIC چیست؟
تفاوت اصلی بین سنجش های MBEC (حداقل غلظت ریشه کنی بیوفیلم) و MBIC (حداقل غلظت مهاری بیوفیلم) در تمرکز آنها نهفته است:
سنجش MBEC اندازه گیری کمترین غلظت یک عامل ضد میکروبی مورد نیاز برای ریشه کن کردن کامل بیوفیلم های از پیش ساخته شده، ارزیابی توانایی یک ماده در از بین بردن میکروارگانیسم های تعبیه شده در بیوفیلم.
سنجش های MBIC کمترین غلظت یک عامل ضد میکروبی را که از تشکیل اولیه بیوفیلم ها جلوگیری می کند، تعیین کنید و توانایی آن را در مهار توسعه بیوفیلم ارزیابی کنید.
هر دو سنجش برای درک اثربخشی ضد میکروبی ها در برابر بیوفیلم ها بسیار مهم هستند، اما مراحل مختلف چرخه عمر بیوفیلم را هدف قرار می دهند.
بیاموزید که چگونه از سونیکاتور میکروپلیت UIP400MTP برای جابجایی بیوفیلم در سنجش های MBIC استفاده می شود!
میکروپلیت سونیکاتورهای جدید برای شکستن بیوفیلم های سرسخت
Hielscher مافوق صوت تولید کننده هموژنایزرهای مافوق صوت با کارایی بالا از ازمایشگاه ها تا اندازه صنعتی.