پروتکل ASTM E2799-22 برای ارزیابی ضدمیکروبی
Hielscher UIP400MTP یک سونیکاتور قدرتمند و کارآمد برای پلیت‌های چندچاهکی است که برای تسهیل مرحلهٔ فراصوت‌دهی در پروتکل ASTM E2799-22 طراحی شده است. UIP400MTP با رساندن یکنواخت انرژی فراصوتی به سراسر پلیت میکروتیتر، جداسازی یکنواخت و قابل‌اعتماد بیوفیلم‌ها از درپوش‌های میخک‌دار را بدون آسیب رساندن به سلول‌ها یا به خطر انداختن یکپارچگی نمونه تضمین می‌کند. ظرفیت بالای پردازش نمونه‌ها و کاربری آسان این دستگاه، زمان پردازش را به‌طور چشمگیری کاهش می‌دهد و هم‌زمان تکرارپذیری را افزایش می‌دهد؛ ازاین‌رو، راهکاری ایدئال برای آزمایشگاه‌هایی است که سنجش زنده‌مانی بیوفیلم و آزمون اثربخشی ضدمیکروبی انجام می‌دهند.
ASTM E2799
ASTM E2799 یک روش آزمون استانداردشده است که برای ارزیابی اثربخشی عوامل ضدمیکروبی علیه بیوفیلم‌ها، با تمرکز ویژه بر Pseudomonas aeruginosa، طراحی شده است. بیوفیلم‌ها اجتماعات پیچیدهٔ میکروبی هستند که به سطوح می‌چسبند و مقاومت بیشتری در برابر تیمارهای ضدمیکروبی نشان می‌دهند؛ به همین دلیل، در حوزه‌های بهداشت و درمان، صنعت و محیط‌زیست چالشی مهم به شمار می‌روند. این روش از سنجش حداقل غلظت ریشه‌کنی بیوفیلم (MBEC) استفاده می‌کند تا چارچوبی قابل‌اعتماد و تکرارپذیر برای آزمودن مواد ضدعفونی‌کننده در شرایط واقع‌گرایانهٔ بیوفیلم فراهم کند.
سونیکاتور پلیت 96 چاهکی UIP400MTP برای غربالگری با ظرفیت پردازش بالا
فراصوت‌دهی چگونه به اجرای ASTM E2799 کمک می‌کند؟
فراصوت‌دهی با تسهیل جداسازی بیوفیلم‌ها از سطوح آزمون، نقشی حیاتی در پروتکل ASTM E2799 ایفا می‌کند و ارزیابی دقیق زنده‌مانی میکروبی پس از تیمار را تضمین می‌کند. این پروتکل با استفاده از انرژی فراصوتی کنترل‌شده، بیوفیلم را به‌صورت کارآمد و یکنواخت، بدون آسیب رساندن به سلول‌ها، از هم می‌گسلد و دستیابی به نتایج دقیق و تکرارپذیر را ممکن می‌سازد. این ویژگی، ASTM E2799 را به ابزاری ضروری برای پیشبرد پژوهش‌های بیوفیلم و توسعهٔ راهبردهای ضدمیکروبی مؤثر تبدیل می‌کند.
نحوهٔ اجرای سنجش MBEC مطابق با ASTM E2799-22
پروتکل ASTM E2799-22 مراحل ارزیابی اثربخشی عوامل ضدمیکروبی علیه بیوفیلم‌ها را تشریح می‌کند. هنگام استفاده از سونیکاتور پلیت میکروتیتر Hielscher UIP400MTP، می‌توان پروتکل را برای به‌کارگیری این روش پیشرفتهٔ فراصوت‌دهی در جداسازی بیوفیلم تطبیق داد. در ادامه، مراحل متناسب با استفاده از سونیکاتور میکروپلیت UIP400MTP شرح داده شده است:
- آماده‌سازی بیوفیلم‌ها
یک پلیت میکروتیتر استریل 96 چاهکی با درپوش‌های میخک‌دار جداشدنی آماده کنید.
چاهک‌ها را با سوسپانسیون باکتریایی استانداردشده در یک محیط رشد مناسب تلقیح کنید.
درپوش میخک‌دار را روی پلیت قرار دهید و مطمئن شوید که میخک‌ها کاملاً در سوسپانسیون باکتریایی غوطه‌ور هستند.
پلیت را در شرایط کنترل‌شده (برای مثال، دما و زمان) انکوبه کنید تا بیوفیلم روی میخک‌ها تشکیل شود. - تیمار با عوامل ضدمیکروبی
پس از تشکیل بیوفیلم، محیط را با محیط تازهٔ حاوی عوامل ضدمیکروبی مورد آزمون در غلظت‌های مختلف جایگزین کنید.
درپوش میخک‌دار را دوباره روی پلیت قرار دهید و در شرایط تعیین‌شده در طرح آزمون انکوبه کنید. - آماده‌سازی برای جداسازی بیوفیلم
پس از تیمار، درپوش میخک‌دار را با غوطه‌ور کردن در یک محلول شست‌وشوی استریل آبکشی کنید تا عوامل ضدمیکروبی باقی‌مانده و سلول‌های پلانکتونیک با اتصال سست حذف شوند. - جداسازی بیوفیلم با استفاده از سونیکاتور UIP400MTP
یک پلیت میکروتیتر تازهٔ 96 چاهکی حاوی محیط بازیابی (برای مثال، براث خنثی‌کننده) آماده کنید.
با قرار دادن درپوش میخک‌دار در چاهک‌های پلیت حاوی محیط بازیابی، بیوفیلم‌ها را جدا کنید.
پلیت را داخل سونیکاتور UIP400MTP قرار دهید و مطمئن شوید که درپوش و پلیت به‌درستی هم‌راستا هستند.
دامنهٔ سونیکاتور را روی 70%–80% تنظیم کنید و به‌مدت 3–4 دقیقه در حالت چرخه‌ای فراصوت‌دهی کنید تا جداسازی یکنواخت بیوفیلم بدون لیز سلولی تضمین شود. - ارزیابی زنده‌مانی بیوفیلم
پس از فراصوت‌دهی، محیط بازیابی حاوی سلول‌های جداشدهٔ بیوفیلم را با استفاده از روش‌های استاندارد میکروب‌شناختی یا تحلیلی، مانند موارد زیر، بررسی کنید:- شمارش واحدهای تشکیل‌دهندهٔ کلنی (CFU): رقت‌های متوالی تهیه کنید و برای شمارش سلول‌های زنده، روی آگار کشت دهید.
- اندازه‌گیری چگالی نوری (OD): برای ارزیابی تراکم سلولی از تحلیل اسپکتروفتومتری استفاده کنید.
- سنجش‌های زنده‌مانی مبتنی بر فلورسانس: با استفاده از رنگ‌های فلورسنت، سلول‌های زنده و مرده را کمّی‌سازی کنید.
- تحلیل داده‌ها
داده‌های زنده‌مانی بیوفیلم‌های تیمارشده و تیمارنشده را مقایسه کنید تا اثربخشی عوامل ضدمیکروبی مشخص شود.
حداقل غلظت ریشه‌کنی بیوفیلم (MBEC) را بر اساس غلظت موردنیاز برای حذف سلول‌های زندهٔ بیوفیلم محاسبه کنید. - کنترل کیفیت
با کالیبراسیون منظم UIP400MTP و تأیید اینکه فرایند جداسازی بیوفیلم به لیز یا نابودی قابل‌توجه سلول‌ها منجر نمی‌شود، از یکنواختی شرایط فراصوت‌دهی اطمینان حاصل کنید.
برای اعتبارسنجی نتایج، کنترل‌های مناسب، مانند بیوفیلم‌های تیمارنشده و بلانک‌های حاوی فقط محیط، در نظر بگیرید.
سلول‌های بیوفیلم تشکیل‌شده روی میخک‌ها با فراصوت‌دهی (Hielscher Ultrasound Technology, Teltow, Germany, UIP250MTP) به‌مدت 5 min در پلیت‌های 96 چاهکی حاوی محیط کشت تازه برای بازیابی سلول‌ها جدا شدند.
(تصویر و مطالعه: ©de Oliveira et al., 2016)
با ادغام UIP400MTP در روند کاری ASTM E2799-22، فرایند جداسازی بیوفیلم از نظر یکنواختی، کارایی و کاربردهای نیازمند ظرفیت پردازش بالا بهینه می‌شود.
منابع / مراجع
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- ASTM E2799-22 Standard Test Method for Testing Disinfectant Efficacy against Pseudomonas aeruginosa Biofilm using the MBEC Assay
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
پرسش‌های متداول
ASTM E2799 چیست؟
ASTM E2799 یک روش آزمون استاندارد است که ASTM International برای آزمون اثربخشی مواد ضدعفونی‌کننده علیه بیوفیلم Pseudomonas aeruginosa با استفاده از سنجش MBEC تدوین کرده است. این روش به‌طور گسترده برای ارزیابی تشکیل بیوفیلم، اثربخشی ضدمیکروبی و برهم‌کنش‌های سطح مواد به کار می‌رود و امکان مقایسه‌های استانداردشده را در پژوهش‌های مرتبط با بیوفیلم فراهم می‌کند.
تفاوت ASTM E2799-22 با ASTM E2799-11، ASTM E2799-12 و ASTM E2799-17 چیست؟
ASTM E2799 یک روش آزمون استانداردشده است که اثربخشی مواد ضدعفونی‌کننده علیه بیوفیلم‌های Pseudomonas aeruginosa را با استفاده از سنجش MBEC (حداقل غلظت ریشه‌کنی بیوفیلم) ارزیابی می‌کند. این روش برای افزایش دقت و قابلیت کاربرد، چندین بار بازنگری شده است.
- ASTM E2799-11: این نسخه، نخستین انتشار استاندارد بود که رویه‌های پایه را برای ارزیابی اثربخشی مواد ضدعفونی‌کننده علیه بیوفیلم‌های P. aeruginosa با استفاده از سنجش MBEC تعیین کرد.
- ASTM E2799-12: این بازنگری شامل به‌روزرسانی‌های فنی جزئی برای افزایش وضوح و رفع ابهام‌های شناسایی‌شده در نسخهٔ 2011 بود.
- ASTM E2799-17: در این به‌روزرسانی، تغییرات مهم‌تری در پروتکل ایجاد شد؛ از جمله اصلاح فرایند کشت بیوفیلم، اعمال تیمار و رویه‌های خنثی‌سازی، با هدف افزایش تکرارپذیری و هماهنگی با پیشرفت‌های پژوهش بیوفیلم.
- ASTM E2799-22: جدیدترین بازنگری بازتاب‌دهندهٔ تازه‌ترین شناخت علمی و پیشرفت‌های فناوری در مطالعات بیوفیلم است. این نسخه شامل روش‌شناسی‌های بهبودیافته برای رشد، تیمار و تحلیل بیوفیلم است و تضمین می‌کند که روش آزمون برای ارزیابی‌های کنونی اثربخشی مواد ضدعفونی‌کننده همچنان مرتبط و مؤثر باقی بماند.
هر بازنگری ASTM E2799 با هدف بهبود قابلیت اعتماد، تکرارپذیری و تناسب این روش انجام شده است تا همگامی آن با پیشرفت‌های علمی و فناوری در حوزهٔ پژوهش بیوفیلم تضمین شود.
تفاوت سنجش‌های MBEC و MBIC چیست؟
تفاوت اصلی سنجش‌های MBEC (حداقل غلظت ریشه‌کنی بیوفیلم) و MBIC (حداقل غلظت مهارکنندهٔ بیوفیلم) در موضوع تمرکز آن‌هاست:
سنجش‌های MBEC کمترین غلظت یک عامل ضدمیکروبی موردنیاز برای ریشه‌کنی کامل بیوفیلم‌های ازپیش‌تشکیل‌شده را اندازه‌گیری می‌کنند و توانایی یک ماده را در کشتن میکروارگانیسم‌های جای‌گرفته در بیوفیلم می‌سنجند.
سنجش‌های MBIC کمترین غلظت یک عامل ضدمیکروبی را که از تشکیل اولیهٔ بیوفیلم‌ها جلوگیری می‌کند تعیین می‌کنند و توانایی آن را در مهار توسعهٔ بیوفیلم می‌سنجند.
هر دو سنجش برای درک اثربخشی عوامل ضدمیکروبی علیه بیوفیلم‌ها ضروری هستند، اما مراحل متفاوتی از چرخهٔ زندگی بیوفیلم را هدف قرار می‌دهند.
با نحوهٔ استفاده از سونیکاتور میکروپلیت UIP400MTP برای جداسازی بیوفیلم در سنجش‌های MBIC آشنا شوید!
سونیکاتورهای جدید میکروپلیت برای از هم گسیختن بیوفیلم‌های سرسخت
Hielscher Ultrasonics هموژنایزرهای فراصوتی با عملکرد بالا را در ابعادی از آزمایشگاهی تا صنعتی تولید می‌کند.