استخراج ماتریکس خارج سلولی با UIP400MTP سونیکاتور 96 چاه
روش های سنتی استخراج ماتریکس خارج سلولی (EM) اغلب شامل مراحل متعددی برای مختل کردن ماتریکس بیوفیلم است. با این حال، این تکنیک ها می توانند زمان بر و متناقض باشند و منجر به تنوع در نتایج شوند. با UIP400MTP سونیکاتور صفحه 96 چاه، فرآیند استخراج EM به طور قابل توجهی تسهیل می شود و اختلال بیوفیلم بسیار کارآمد، دقیق و یکنواخت را در قالب های با توان بالا فراهم می کند. این UIP400MTP از سونوگرافی متمرکز برای تولید کاویتاسیون کنترل شده استفاده می کند و به طور موثر ماتریس بیوفیلم را تجزیه می کند و در عین حال زنده ماندن و یکپارچگی سلول های تعبیه شده در بیوفیلم را حفظ می کند. استفاده از UIP400MTP تکرارپذیری و دقت سنجش های پایین دست، مانند تجزیه و تحلیل های متابولومیک و پروتئومی، تست های زنده ماندن و مطالعات حساسیت ضد میکروبی را افزایش می دهد. با ساده سازی استخراج EM، این UIP400MTP محققان را قادر می سازد تا به نتایج سازگار و با کیفیت دست یابند و بینش عمیق تری در مورد پویایی بیوفیلم و تعاملات با عوامل خارجی ارائه دهند.
استخراج ماتریکس خارج سلولی
ماتریکس خارج سلولی (EM) یک جزء حیاتی بیوفیلم است که توسط میکروارگانیسم هایی مانند کاندیدا آلبیکنس تشکیل شده است. EM که از پلی ساکاریدها، پروتئین ها، لیپیدها و DNA خارج سلولی تشکیل شده است، یکپارچگی ساختاری را فراهم می کند، چسبندگی به سطوح را واسطه می کند و به طور قابل توجهی به مقاومت ضد میکروبی کمک می کند. استخراج و تجزیه و تحلیل EM برای درک زیست شناسی بیوفیلم، روشن کردن مکانیسم های مقاومت دارویی و شناسایی اهداف درمانی جدید ضروری است.
پروتکل استخراج ماتریکس خارج سلولی (EM) از بیوفیلم کاندیدا آلبیکنس با استفاده از UIP400MTP
این پروتکل بر استخراج ماتریکس خارج سلولی (EM) بیوفیلم های استاتیک کاندیدا آلبیکنس تمرکز دارد. ادغام UIP400MTP فراصوت برای جایگزینی خراش دادن سنتی و یا مراحل مبتنی بر آنزیم برای بهبود بهره وری و تکرارپذیری.
مواد مورد نیاز
دستورالعمل های گام به گام برای استخراج EM
- تشکیل بیوفیلم استاتیک
برای بیوفیلم های استاتیک، تلقیح C. albicans در چاه های یک صفحه 96 چاهکی با استفاده از محیط RPMI-1640. هر چاه باید حاوی حجم ثابتی از تلقیح باشد (به عنوان مثال، 200 میکرولیتر در هر چاه).
صفحه را در دمای 37 درجه سانتیگراد در شرایط استاتیک به مدت 24 ساعت انکوبه کنید تا امکان تشکیل بیوفیلم در سطوح چاه فراهم شود. - آماده سازی بیوفیلم برای استخراج
پس از جوجه کشی، به آرامی آسپیراسیون کنید و محیط مصرف شده را از هر چاه بدون ایجاد مزاحمت در بیوفیلم دور بریزید.
هر چاه را با دقت با PBS استریل (به عنوان مثال، 200 میکرولیتر) بشویید تا سلول های شل و بقایای پلانکتونیک از بین برود. این مرحله را دو بار تکرار کنید.
اضافه کردن PBS تازه و یا بافر استخراج (به عنوان مثال، 200 میکرولیتر) به هر چاه برای آماده شدن برای فراصوت. - فراصوت با UIP400MTP
صفحه 96 چاهی حاوی PBS یا بافر استخراج را در سینی UIP400MTP صوتی قرار دهید. برای قرار دادن صحیح صفحه چند چاه، دستورالعمل های دفترچه راهنما را دنبال کنید.
به مدت 5-6 دقیقه در یک محیط ملایم (دامنه 60٪ ، حالت پالس) ، از اختلال یکنواخت ساختار بیوفیلم و آزاد شدن اجزای EM اطمینان حاصل کنید.
برای جلوگیری از گرمایش بیش از حد یا آسیب نمونه ، از کنترل دما UIP400MTP (سنسور دما و تنظیمات) استفاده کنید. - درمان رزین تبادل کاتیونی (CER).
انتقال مایع فراصوت از هر چاه به یک صفحه جدید 96 چاه.
به هر چاه یک حجم دو برابر سوسپانسیون CER (تهیه شده در PBS یا بافر) اضافه کنید (به عنوان مثال، 400 میکرولیتر حجم کل در هر چاه).
صفحه را ببندید و آن را روی یک شیکر صفحه یا روتاتور در 400 دور در دقیقه به مدت 3 ساعت جوجه کشی کنید تا امکان اتصال و جداسازی اجزای EM فراهم شود. - جداسازی و فیلتراسیون
صفحه را در دمای 2000 × گرم به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ کنید تا رزین و سلول ها از مایع رویی جدا شود.
مایع رویی حاوی EM را با دقت از هر چاه به یک صفحه 96 چاهی جدید منتقل کنید.
مایع رویی را از طریق یک فیلتر 0.22 میکرومتری با استفاده از یک سیستم منیفولد خلاء مبتنی بر صفحه یا معادل آن فیلتر کنید تا یک عصاره EM تمیز بدست آورید. - تجزیه و تحلیل EM
از تکنیک هایی مانند UPLC-Q-TOF-MS برای پروفایل متابولیت های غیرهدفمند استفاده کنید یا از سنجش های خاص (به عنوان مثال، BCA برای پروتئین ها، تری گلیسیرید و کیت های کمی سازی کربوهیدرات) برای توصیف اجزای EM استفاده کنید.
این UIP400MTP آماده سازی نمونه قابل اعتماد و ادغام آسان با گردش کار آزمایشگاه موجود را تضمین می کند
UIP400MTP یک حمام اولتراسونیک نیست. این یک شاخ فنجان با شدت بالا برای فراصوت متمرکز است. این فراصوت قدرتمند بدون تماس ارائه فراصوت یکنواخت در سراسر تمام چاه های استاندارد خود را به خوبی بشقاب. شما کنترل دقیقی بر دامنه، توان و ضربان دارید. یک تایمر داخلی و پروب دما نتایج ثابتی را تضمین می کند. سونیکاتور صفحه UIP400MTP نمونه ها را با حمام آب خنک می کند (چیلر خارجی اختیاری).
استخراج ماتریکس خارج سلولی با توان بالا
راندمان بالای استخراج ماتریکس خارج سلولی (EM) با سونیکاتور UIP400MTP انقلابی در آماده سازی نمونه برای سنجش ها ایجاد کرده است که نیاز به تجزیه و تحلیل دقیق خواص بیوفیلم دارد. این UIP400MTP از امواج اولتراسونیک برای مختل کردن دقیق و یکنواخت ماتریس بیوفیلم استفاده می کند و در عین حال زنده ماندن و یکپارچگی سلول را امکان انتشار موثر اجزای EM فراهم می کند. این رویکرد به طور قابل توجهی قابلیت اطمینان سنجش هایی مانند آزمایش های زنده مانی بیوفیلم، مطالعات پروتئومیک و متابولومیک و ارزیابی حساسیت آنتی بیوتیکی را افزایش می دهد.
برای سنجش های بازیابی بیوفیلم، مانند شمارش واحد تشکیل دهنده کلنی (CFU)، استخراج EM با UIP400MTP دسترسی بدون مانع معرف ها به سلول های تعبیه شده در بیوفیلم را تضمین می کند. به طور مشابه، تجزیه و تحلیل های پروتئومیک و متابولومی، مانند UPLC-Q-TOF-MS، از جداسازی پروتئین ها، لیپیدها و متابولیت ها با بازده بالا بهره می برند. این UIP400MTP همچنین از آزمایش دقیق حساسیت ضد میکروبی پشتیبانی می کند و امکان تعیین دقیق مقادیر بیوفیلم MIC و MBEC را فراهم می کند. علاوه بر این، استخراج کارآمد تسهیل شده توسط UIP400MTP به سنجش فعالیت آنزیم، کمی سازی اجزا و مطالعات ساختاری کمک می کند و بینش های ارزشمندی را در مورد نقش ماتریس های خارج سلولی در معماری بیوفیلم، چسبندگی و مکانیسم های مقاومت ارائه می دهد.
این روش استخراج با توان بالا و تکرارپذیر، آماده سازی EM را بهینه می کند و نتایج برتر را در طیف وسیعی از سنجش های مرتبط با بیوفیلم تضمین می کند.
استخراج EM با توان بالا با سونیکاتور صفحه 96 چاه UIP400MTP
ادبیات / منابع
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
- Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
- Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
پرسش و پاسخهای متداول
هدف از ماتریکس خارج سلولی چیست؟
ماتریکس خارج سلولی (EM یا ECM) پشتیبانی ساختاری از سلول ها را فراهم می کند، ارتباطات بین سلولی را تنظیم می کند و بر رفتار سلول تأثیر می گذارد.
ماتریکس خارج سلولی برای بافت ها چه می کند؟
برای بافت ها، EM به عنوان داربستی عمل می کند که یکپارچگی ساختاری را حفظ می کند، انعطاف پذیری مکانیکی را تسهیل می کند و سیگنالینگ بیوشیمیایی را برای تنظیم فرآیندهایی مانند رشد، تمایز و ترمیم واسطه می کند.
چسبندگی ماتریکس خارج سلولی چیست؟
چسبندگی ماتریکس خارج سلولی به تعامل بین سلول ها و EM اشاره دارد که در درجه اول توسط مولکول های چسبندگی سطح سلول مانند اینتگرین ها انجام می شود و امکان لنگر انداختن سلولی، انتقال سیگنال و مهاجرت را فراهم می کند.
چرا ماتریکس خارج سلولی برای سنجش استخراج می شود؟
EM برای سنجش برای مطالعه ترکیب آن، درک نقش آن در فرآیندهای سلولی و بررسی تأثیر آن بر پیشرفت بیماری، از جمله تشکیل بیوفیلم و مقاومت ضد میکروبی استخراج می شود.
روش های استخراج رایج برای ماتریکس خارج سلولی چیست؟
روش های استخراج رایج شامل روش های فیزیکی مانند اولتراسونیکاسیون، درمان های شیمیایی با مواد شوینده یا نمک و هضم آنزیمی برای جداسازی اجزای EM در حالی که حفظ یکپارچگی آنها است.
ماتریکس خارج سلولی سلولی (dECM) چیست؟
ماتریکس خارج سلولی سلولی (dECM) با حذف مواد سلولی از بافت ها با حفظ خواص ساختاری و بیوشیمیایی EM به دست می آید. در پزشکی احیا کننده به عنوان داربست برای مهندسی بافت و کشت سلولی استفاده می شود.
بیشتر درباره جداسازی ماتریکس خارج سلولی با کمک فراصوت بخوانید!
Hielscher مافوق صوت تولید کننده هموژنایزرهای مافوق صوت با کارایی بالا از ازمایشگاه ها تا اندازه صنعتی.