استخراج ماتریکس خارج‌سلولی با سونیکاتور 96 خانه‌ای UIP400MTP
روش‌های سنتی استخراج ماتریکس خارج‌سلولی (EM) اغلب شامل چندین مرحله برای تخریب ماتریکس بیوفیلم هستند. بااین‌حال، این روش‌ها می‌توانند زمان‌بر باشند و عملکرد یکنواختی نداشته باشند و در نتیجه به تغییرپذیری نتایج منجر شوند. با سونیکاتور پلیت 96 خانه‌ای UIP400MTP، فرایند استخراج EM به‌طور چشمگیری تسهیل می‌شود و تخریب بسیار کارآمد، دقیق و یکنواخت بیوفیلم در قالب‌های دارای ظرفیت پردازش بالا امکان‌پذیر می‌گردد. UIP400MTP از فراصوت متمرکز برای ایجاد کاویتاسیون کنترل‌شده استفاده می‌کند و ضمن حفظ زنده‌مانی و یکپارچگی سلول‌های محصور در بیوفیلم، ماتریکس بیوفیلم را به‌طور مؤثر تجزیه می‌کند. استفاده از UIP400MTP تکرارپذیری و دقت سنجش‌های پایین‌دستی، مانند تحلیل‌های متابولومیک و پروتئومیک، آزمون‌های زنده‌مانی و مطالعات حساسیت به عوامل ضدمیکروبی را افزایش می‌دهد. UIP400MTP با ساده‌سازی استخراج EM، پژوهشگران را قادر می‌سازد به نتایجی یکنواخت و باکیفیت دست یابند و شناخت عمیق‌تری از پویایی بیوفیلم و برهم‌کنش‌های آن با عوامل خارجی به دست آورند.
استخراج ماتریکس خارج‌سلولی
ماتریکس خارج‌سلولی (EM) یکی از اجزای حیاتی بیوفیلم‌هایی است که میکروارگانیسم‌هایی مانند Candida albicans تشکیل می‌دهند. EM از پلی‌ساکاریدها، پروتئین‌ها، لیپیدها و DNA خارج‌سلولی تشکیل شده است، یکپارچگی ساختاری را تأمین می‌کند، واسطهٔ چسبندگی به سطوح است و نقش چشمگیری در مقاومت ضدمیکروبی دارد. استخراج و تحلیل EM برای درک زیست‌شناسی بیوفیلم، روشن‌کردن سازوکارهای مقاومت دارویی و شناسایی اهداف درمانی جدید ضروری است.
پروتکل استخراج ماتریکس خارج‌سلولی (EM) از بیوفیلم‌های Candida albicans با استفاده از UIP400MTP
این پروتکل بر استخراج ماتریکس خارج‌سلولی (EM) از بیوفیلم‌های Candida albicans تشکیل‌شده در شرایط ساکن تمرکز دارد. در این روش، سونیکاتور UIP400MTP برای افزایش کارایی و تکرارپذیری، جایگزین مراحل سنتی خراشیدن یا مراحل مبتنی بر آنزیم می‌شود.
مواد و تجهیزات موردنیاز
دستورالعمل گام‌به‌گام استخراج EM
- تشکیل بیوفیلم در شرایط ساکن
برای تشکیل بیوفیلم در شرایط ساکن، C. albicans را با استفاده از محیط کشت RPMI-1640 به خانه‌های یک پلیت 96 خانه‌ای تلقیح کنید. هر خانه باید حاوی حجم یکسانی از مایهٔ تلقیح باشد (برای مثال، 200 µL در هر خانه).
پلیت را در دمای 37°C و در شرایط ساکن به‌مدت 24 ساعت انکوبه کنید تا بیوفیلم روی سطوح خانه‌ها تشکیل شود. - آماده‌سازی بیوفیلم برای استخراج
پس از انکوباسیون، محیط کشت مصرف‌شدهٔ هر خانه را به‌آرامی و بدون برهم‌زدن بیوفیلم با مکش خارج کرده و دور بریزید.
هر خانه را با دقت با PBS استریل (برای مثال، 200 µL) بشویید تا سلول‌های دارای اتصال سست و بقایای پلانکتونیک حذف شوند. این مرحله را دو بار تکرار کنید.
برای آماده‌سازی جهت فراصوت‌دهی، به هر خانه PBS تازه یا بافر استخراج (برای مثال، 200 µL) اضافه کنید. - فراصوت‌دهی با UIP400MTP
پلیت 96 خانه‌ای حاوی PBS یا بافر استخراج را در سینی سونیکاتور UIP400MTP قرار دهید. برای قراردادن صحیح پلیت چندخانه‌ای، دستورالعمل‌های دفترچهٔ راهنما را دنبال کنید.
به‌مدت 5–6 دقیقه با تنظیمات ملایم (دامنهٔ 60%، حالت پالسی) فراصوت‌دهی کنید و از تخریب یکنواخت ساختار بیوفیلم و آزادسازی اجزای EM اطمینان حاصل کنید.
برای جلوگیری از گرم‌شدن بیش‌ازحد یا آسیب به نمونه، از کنترل دمای سونیکاتور UIP400MTP (حسگر دما و تنظیمات) استفاده کنید. - تیمار با رزین تبادل کاتیونی (CER)
مایع فراصوت‌دهی‌شدهٔ هر خانه را به یک پلیت 96 خانه‌ای جدید منتقل کنید.
به هر خانه، حجمی معادل دو برابر از سوسپانسیون CER (تهیه‌شده در PBS یا بافر) اضافه کنید (برای مثال، حجم کل 400 µL در هر خانه).
پلیت را درزبندی کنید و روی شیکر پلیت یا دستگاه چرخاننده با سرعت 400 rpm به‌مدت 3 ساعت انکوبه کنید تا اتصال و جداسازی اجزای EM انجام شود. - جداسازی و فیلتراسیون
پلیت را با نیروی 2٬000 × g به‌مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ کنید تا رزین و سلول‌ها از مایع رویی جدا شوند.
مایع رویی حاوی EM را از هر خانه با دقت به یک پلیت 96 خانه‌ای جدید منتقل کنید.
مایع رویی را با استفاده از سامانهٔ منیفولد خلأ مخصوص پلیت یا سامانه‌ای معادل، از فیلتر 0٫22 µm عبور دهید تا عصارهٔ خالص EM به دست آید. - تحلیل EM
برای تعیین پروفایل غیرهدفمند متابولیت‌ها از روش‌هایی مانند UPLC-Q-TOF-MS استفاده کنید، یا برای مشخصه‌یابی اجزای EM، سنجش‌های اختصاصی (برای مثال، BCA برای پروتئین‌ها و کیت‌های اندازه‌گیری کمّی تری‌گلیسرید و کربوهیدرات) را به کار بگیرید.
UIP400MTP آماده‌سازی قابل‌اعتماد نمونه و ادغام آسان در روندهای کاری موجود آزمایشگاه را تضمین می‌کند
استخراج ماتریکس خارج‌سلولی با ظرفیت پردازش بالا
کارایی بالای استخراج ماتریکس خارج‌سلولی (EM) با سونیکاتور UIP400MTP، آماده‌سازی نمونه برای سنجش‌هایی را که به تحلیل دقیق ویژگی‌های بیوفیلم نیاز دارند متحول کرده است. UIP400MTP از امواج فراصوت برای تخریب دقیق و یکنواخت ماتریکس بیوفیلم استفاده می‌کند و ضمن حفظ زنده‌مانی و یکپارچگی سلول‌ها، آزادسازی مؤثر اجزای EM را امکان‌پذیر می‌سازد. این رویکرد قابلیت اعتماد سنجش‌هایی مانند آزمون‌های زنده‌مانی بیوفیلم، مطالعات پروتئومیک و متابولومیک و ارزیابی‌های حساسیت به عوامل ضدمیکروبی را به‌طور چشمگیری افزایش می‌دهد.
در سنجش‌های بازیابی بیوفیلم، مانند شمارش واحدهای تشکیل‌دهندهٔ کلنی (CFU)، استخراج EM با UIP400MTP دسترسی بدون مانع معرف‌ها به سلول‌های محصور در بیوفیلم را تضمین می‌کند. به همین ترتیب، تحلیل‌های پروتئومیک و متابولومیک، مانند UPLC-Q-TOF-MS، از جداسازی پروتئین‌ها، لیپیدها و متابولیت‌ها با بازده بالا بهره می‌برند. UIP400MTP همچنین از آزمون دقیق حساسیت به عوامل ضدمیکروبی پشتیبانی می‌کند و امکان تعیین دقیق مقادیر MIC و MBEC بیوفیلم را فراهم می‌سازد. افزون بر این، استخراج کارآمدی که UIP400MTP تسهیل می‌کند، به سنجش‌های فعالیت آنزیمی، اندازه‌گیری کمّی اجزا و مطالعات ساختاری کمک می‌کند و شناخت ارزشمندی از نقش ماتریکس‌های خارج‌سلولی در معماری بیوفیلم، چسبندگی و سازوکارهای مقاومت به دست می‌دهد.
این روش استخراج تکرارپذیر با ظرفیت پردازش بالا، آماده‌سازی EM را بهینه می‌کند و دستیابی به نتایج برتر را در طیفی از سنجش‌های مرتبط با بیوفیلم تضمین می‌کند.
استخراج EM با ظرفیت پردازش بالا با سونیکاتور پلیت 96 خانه‌ای UIP400MTP
منابع علمی / مراجع
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
- Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
- Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
پرسش‌های متداول
ماتریکس خارج‌سلولی چه نقشی دارد؟
ماتریکس خارج‌سلولی (EM یا ECM) پشتیبانی ساختاری از سلول‌ها را فراهم می‌کند، ارتباطات بین‌سلولی را تنظیم می‌کند و بر رفتار سلول تأثیر می‌گذارد.
ماتریکس خارج‌سلولی برای بافت‌ها چه کاری انجام می‌دهد؟
در بافت‌ها، EM به‌عنوان داربستی عمل می‌کند که یکپارچگی ساختاری را حفظ می‌کند، تاب‌آوری مکانیکی را تسهیل می‌کند و واسطهٔ پیام‌رسانی بیوشیمیایی برای تنظیم فرایندهایی مانند رشد، تمایز و ترمیم است.
چسبندگی به ماتریکس خارج‌سلولی چیست؟
چسبندگی به ماتریکس خارج‌سلولی به برهم‌کنش میان سلول‌ها و EM اشاره دارد که عمدتاً با واسطهٔ مولکول‌های چسبندگی سطح سلول، مانند اینتگرین‌ها، انجام می‌شود و اتصال پایدار سلول، انتقال پیام و مهاجرت را امکان‌پذیر می‌سازد.
چرا ماتریکس خارج‌سلولی برای سنجش‌ها استخراج می‌شود؟
EM برای سنجش‌ها استخراج می‌شود تا ترکیب آن مطالعه شود، نقش آن در فرایندهای سلولی درک شود و تأثیر آن بر پیشرفت بیماری، از جمله تشکیل بیوفیلم و مقاومت ضدمیکروبی، بررسی شود.
روش‌های رایج استخراج ماتریکس خارج‌سلولی کدام‌اند؟
روش‌های رایج استخراج شامل روش‌های فیزیکی مانند فراصوت‌دهی، تیمارهای شیمیایی با شوینده‌ها یا نمک‌ها و هضم آنزیمی هستند که برای جداسازی اجزای EM همراه با حفظ یکپارچگی آن‌ها به کار می‌روند.
ماتریکس خارج‌سلولی سلول‌زدایی‌شده (dECM) چیست؟
ماتریکس خارج‌سلولی سلول‌زدایی‌شده (dECM) با حذف مواد سلولی از بافت‌ها، ضمن حفظ ویژگی‌های ساختاری و بیوشیمیایی EM، به دست می‌آید. این ماتریکس در پزشکی بازساختی به‌عنوان داربستی برای مهندسی بافت و کشت سلول استفاده می‌شود.
دربارهٔ سلول‌زدایی ماتریکس خارج‌سلولی به کمک فراصوت بیشتر بخوانید!
Hielscher Ultrasonics هموژنایزرهای فراصوتی با عملکرد بالا را در مقیاس‌های آزمایشگاهی تا صنعتی تولید می‌کند.