لیز سلول‌های مخمر در میکروپلیت‌ها با استفاده از فراصوت‌دهی با شدت بالا

میکروبیولوژیست‌ها و پژوهشگران علوم زیستی که با Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris / Komagataella phaffii و سایر سامانه‌های مخمری کار می‌کنند، این چالش را می‌شناسند: سلول‌های مخمر مقاوم‌اند، دستیابی به لیز تکرارپذیر می‌تواند دشوار باشد و هنگامی که لازم است تعداد زیادی سویه، کلون، شرایط کشت یا سازهٔ بیانی غربالگری شوند، تخریب دستی نمونه‌ها به‌سرعت به گلوگاه فرایند تبدیل می‌شود.

لیز مخمر با ظرفیت پردازش بالا برای میکروبیولوژی، زیست‌شناسی مولکولی و آنالیز پروتئین

سونیکاتورهای میکروپلیت Hielscher، مانند UIP400MTP (400 W) و UIP550MTP (550 W)، راهکاری با ظرفیت پردازش بالا برای لیز مکانیکی سلول‌های مخمر مستقیماً در میکروپلیت‌ها فراهم می‌کنند. به‌جای پردازش تک‌تک نمونه‌ها با پروب، می‌توان کل میکروپلیت‌ها را در شرایط یکنواخت فراصوت‌دهی کرد. این کار لیز فراصوتی مخمر را سریع‌تر و تکرارپذیرتر می‌کند و ادغام آن را در گردش‌کارهای نوین میکروبیولوژی، بیان پروتئین، غربالگری آنزیم و اُمیکس آسان‌تر می‌سازد.
چه هدف شما آزادسازی پروتئین‌های نوترکیب از P. pastoris باشد، چه تهیهٔ لیزات مخمر برای سنجش‌های آنزیمی، تخریب S. cerevisiae برای آنالیز پروتئین یا غربالگری موازی ده‌ها کلون مخمر، سونیکاتورهای میکروپلیت Hielscher تخریب سلولی قدرتمند مبتنی بر کاویتاسیون را با کنترل دقیق فرایند فراهم می‌کنند.

چرا سلول‌های مخمر به لیز مکانیکی کارآمد نیاز دارند

لیز سلول‌های مخمر از بسیاری از سلول‌های باکتریایی یا پستانداران دشوارتر است، زیرا دیوارهٔ سلولی سختی که عمدتاً از پلی‌ساکاریدها، گلوکان‌ها، مانوپروتئین‌ها و کیتین تشکیل شده است، از آن‌ها محافظت می‌کند. این دیوارهٔ سلولی پایداری مکانیکی ایجاد می‌کند، اما آزادسازی پروتئین‌ها، اسیدهای نوکلئیک، متابولیت‌ها و آنزیم‌های درون‌سلولی را نیز محدود می‌سازد.
روش‌های متداول لیز مخمر شامل تخریب با ضربات مهره، هضم آنزیمی، چرخه‌های انجماد و ذوب، لیز شیمیایی و فراصوت‌دهی با پروب هستند. این روش‌ها می‌توانند مؤثر باشند، اما محدودیت‌هایی نیز دارند. تخریب با ضربات مهره می‌تواند خرده‌مواد و گرما ایجاد کند، هضم آنزیمی می‌تواند هزینه و تغییرپذیری را افزایش دهد و فراصوت‌دهی تک‌نمونه‌ای با پروب، هنگامی که تعداد زیادی نمونه باید پردازش شوند، زمان‌بر است.
کاویتاسیون فراصوتی متمرکز با شدت بالا، با اعمال نیروهای برشی مکانیکی شدید، نوسان‌های فشار و ریزجریان‌ها به سوسپانسیون مخمر، بر این محدودیت‌ها غلبه می‌کند. نتیجه، تخریب سریع دیواره‌ها و غشاهای سلولی، بهبود آزادسازی محتویات درون‌سلولی و آماده‌سازی نمونه با تکرارپذیری بسیار بالا در قالب پلیت است.

فراصوت‌دهی میکروپلیت برای آماده‌سازی موازی نمونه‌های مخمر

دستگاه‌های UIP400MTP و UIP550MTP ساخت Hielscher برای فراصوت‌دهی یکنواخت میکروپلیت‌ها، پلیت‌های چندچاهکی، پلیت‌های PCR و رک‌های مناسب نمونه طراحی شده‌اند. برخلاف فراصوت‌دهی با پروب، نیازی نیست نمونه‌ها به‌صورت جداگانه پردازش شوند. کل پلیت در معرض انرژی فراصوتی کنترل‌شده قرار می‌گیرد و همین امر این گردش‌کار را برای پردازش موازی نمونه‌ها بسیار مناسب می‌کند.

این قابلیت به‌ویژه برای موارد زیر مفید است:

• غربالگری S. cerevisiae (جهش‌یافته‌ها یا سویه‌های بیانی)
• لیز کلون‌های P. pastoris / K. phaffii پس از بیان پروتئین نوترکیب
• تهیهٔ لیزات مخمر برای سنجش‌های آنزیمی
• استخراج پروتئین برای SDS-PAGE، وسترن بلات، ELISA، LC-MS/MS یا آزمون فعالیت
• آزادسازی متابولیت‌های درون‌سلولی برای متابولومیکس
• آماده‌سازی نمونه‌های DNA و RNA پس از خالص‌سازی مناسب در مراحل پایین‌دستی
• بهینه‌سازی بافرهای لیز، افزودنی‌ها و شرایط استخراج با ظرفیت پردازش بالا

کاویتاسیون فراصوتی چگونه سلول‌های مخمر را تخریب می‌کند

در طول فراصوت‌دهی، امواج فراصوت متمرکز با توان بالا چرخه‌های متناوب تراکم و انبساط را در نمونهٔ مایع ایجاد می‌کنند. در شدت کافی، این نوسان‌های فشار کاویتاسیون آکوستیکی ایجاد می‌کنند. حباب‌های کاویتاسیون تشکیل می‌شوند، نوسان می‌کنند و فرو می‌پاشند و در نتیجه نیروهای برشی موضعی، ریزجت‌ها، آشفتگی و گرادیان‌های فشار شدید پدید می‌آورند.
در سوسپانسیون‌های مخمر، این اثرات مکانیکی دیواره و غشای سلولی را تضعیف و پاره می‌کنند. پروتئین‌ها، آنزیم‌ها، اسیدهای نوکلئیک و متابولیت‌های درون‌سلولی در بافر لیز آزاد می‌شوند. از آنجا که این فرایند مکانیکی است، می‌توان آن را با بسیاری از سامانه‌های بافری مختلف به کار برد و با مهارکننده‌های پروتئاز، عوامل کاهنده، شوینده‌ها، نمک‌ها یا پیش‌تیمار آنزیمی ملایم ترکیب کرد.

پروتکل عمومی: لیز سلول‌های مخمر در میکروپلیت‌ها

پروتکل زیر نقطهٔ شروعی عملی برای لیز مخمر با استفاده از سونیکاتور میکروپلیت UIP400MTP یا UIP550MTP ساخت Hielscher ارائه می‌دهد. پارامترها باید بر اساس سویهٔ مخمر، تراکم سلولی، مولکول هدف، ترکیب بافر، نوع پلیت و سنجش پایین‌دستی بهینه شوند.

1. سلول‌های مخمر را برداشت کنید و بشویید

Saccharomyces، Pichia، Hansenula، Debaryomyces یا سویهٔ مخمر دیگری را در شرایط کشت موردنظر رشد دهید. سلول‌ها را با سانتریفیوژ برداشت کنید و محیط کشت را بردارید. رسوب را با آب مقطر سرد، PBS یا بافر لیز انتخاب‌شده بشویید تا اجزای باقی‌ماندهٔ محیط کشت که ممکن است در آنالیز پایین‌دستی اختلال ایجاد کنند، حذف شوند.
برای استخراج پروتئین، نمونه‌ها را سرد نگه دارید و سریع کار کنید. اگر فعالیت پروتئازها نگران‌کننده است، همهٔ بافرها و اقلام مصرفی را از پیش سرد کنید.

2. رسوب سلولی را مجدداً معلق کنید

رسوب مخمر را در یک بافر لیز سرد و مناسب مجدداً معلق کنید. برای آزادسازی کارآمد پروتئین، تراکم سلولی بالا اغلب مزیت دارد. به‌عنوان نقطهٔ شروع، از حدود 10–20% w/v رسوب سلولی مرطوب یا سوسپانسیونی متراکم با OD₆₀₀ > 10 استفاده کنید؛ انتخاب به نوع سنجش بستگی دارد.

یک بافر لیز معمول برای استخراج پروتئین مخمر ممکن است حاوی موارد زیر باشد:

• سامانهٔ بافری مانند Tris-HCl، بافر فسفات یا HEPES
• نمکی مانند NaCl یا KCl
• مخلوط مهارکننده‌های پروتئاز
• عامل کاهندهٔ اختیاری مانند DTT یا β-مرکاپتواتانول
• شویندهٔ اختیاری مانند Triton X-100، NP-40، SDS یا CHAPS، بسته به سازگاری با مراحل پایین‌دستی
• مهارکننده‌های اختیاری فسفاتاز برای مطالعات فسفریلاسیون

برای سویه‌های مخمری که لیز آن‌ها دشوار است یا برای استخراج بسیار ملایم پروتئین، می‌توان پیش از فراصوت‌دهی از پیش‌تیماری کوتاه با Zymolyase، Lyticase یا آنزیم دیگری که دیوارهٔ سلولی را هضم می‌کند، استفاده کرد. این پیش‌تیمار آنزیمی اختیاری است، اما ممکن است کارایی لیز را بهبود دهد یا شدت فراصوتی موردنیاز را کاهش دهد.

3. نمونه‌ها را به میکروپلیت مناسب منتقل کنید

سوسپانسیون مخمر را در یک میکروپلیت سازگار با فراصوت‌دهی توزیع کنید. پلیت‌های ته‌گرد اغلب ترجیح داده می‌شوند، زیرا جمع‌آوری نمونه را بهبود می‌دهند و نواحی مرده را کاهش می‌دهند. برای بهبود تکرارپذیری، حجم نمونه را در همهٔ چاهک‌ها یکسان نگه دارید.
پلیت را با پد یا فیلم آب‌بندی مناسب ببندید تا از تبخیر، تشکیل آئروسل و آلودگی متقاطع جلوگیری شود. مطمئن شوید که پوشش آب‌بندی با دما و شرایط فراصوت‌دهی انتخاب‌شده سازگار است.
حجم‌های کاری معمول به قالب پلیت و کاربرد بستگی دارند. قالب‌های رایج شامل پلیت‌های 96 چاهکی، پلیت‌های چاهک‌عمیق، پلیت‌های PCR یا رک‌های مناسب لوله هستند.

4. سامانهٔ خنک‌کاری را آماده کنید

لیز مخمر به شدت فراصوتی بالا نیاز دارد و تخریب مکانیکی گرما تولید می‌کند. بنابراین کنترل دما، به‌ویژه برای آنالیز پروتئین، آنزیم، RNA یا فسفریلاسیون، حیاتی است.

از راهکار خنک‌کاری مناسبی استفاده کنید، مانند:

• بافر لیز از پیش سردشده
• میکروپلیت‌های از پیش سردشده
• وقفه‌های خنک‌کاری بین دوره‌های فراصوت‌دهی
• خنک‌کاری خارجی سکوی فراصوت‌دهی، در صورت امکان

هدف این است که نمونه به‌اندازهٔ کافی سرد بماند تا از دناتوره‌شدن پروتئین، غیرفعال‌شدن آنزیم، تخریب RNA و تغییرپذیری نمونه ناشی از گرما جلوگیری شود.

5. سوسپانسیون مخمر را فراصوت‌دهی کنید

پلیت آب‌بندی‌شده را در سونیکاتور میکروپلیت UIP400MTP یا UIP550MTP ساخت Hielscher قرار دهید و یک برنامهٔ فراصوت‌دهی پالسی انتخاب کنید. استفاده از پالس توصیه می‌شود، زیرا تخریب مکانیکی را در مراحل روشن و دفع گرما را در مراحل خاموش امکان‌پذیر می‌کند.
به‌عنوان نقطهٔ شروع برای لیز سلول‌های مخمر:

برای سوسپانسیون‌های مخمر بسیار مقاوم، زیست‌تودهٔ متراکم P. pastoris یا استخراج دشوار پروتئین نوترکیب، زمان تجمعی روشن‌بودن را به‌صورت مرحله‌ای افزایش دهید. برای پروتئین‌های حساس به گرما یا سنجش‌های آنزیمی، از پالس‌های کوتاه‌تر، وقفه‌های خنک‌کاری طولانی‌تر و دامنهٔ اولیهٔ کمتر استفاده کنید.

لیز مخمر با ظرفیت پردازش بالا در پلیت‌های چندچاهکی با UIP400MTP

6. لیزات را شفاف‌سازی کنید

پس از فراصوت‌دهی، میکروپلیت را سانتریفیوژ کنید یا نمونه‌ها را برای سانتریفیوژ به لوله منتقل کنید. بقایای سلولی را با سانتریفیوژ در سرعت و دمای مناسب جدا کنید. مایع رویی را برای آنالیز پایین‌دستی جمع‌آوری کنید.

بسته به کاربرد، می‌توان از لیزات برای موارد زیر استفاده کرد:

• اندازه‌گیری کمی پروتئین
• سنجش‌های فعالیت آنزیمی
• SDS-PAGE و وسترن بلات
• ELISA و سنجش‌های ایمنی
• پروتئومیکس با LC-MS/MS
• آنالیز متابولیت‌ها
• خالص‌سازی DNA یا RNA

7. روش را بهینه و مستند کنید

برای لیز تکرارپذیر مخمر، همهٔ پارامترهای مرتبط را مستند کنید، از جمله سویه، شرایط کشت، OD₆₀₀، جرم سلولی مرطوب، ترکیب بافر، نوع پلیت، حجم نمونه، دامنه، چرخهٔ پالس، زمان تجمعی روشن‌بودن، روش خنک‌کاری و دمای نهایی نمونه.
اگر سونیکاتور Hielscher به ثبت خودکار داده‌ها مجهز باشد، می‌توان از داده‌های فرایند برای مستندسازی، توسعهٔ روش، افزایش مقیاس و کنترل کیفیت استفاده کرد.

نکات بهینه‌سازی لیز مخمر

برای بیشترین آزادسازی پروتئین، از سوسپانسیون‌های متراکم مخمر، شدت فراصوتی بالا و زمان تجمعی کافی برای روشن‌بودن استفاده کنید. برای پروتئین‌های حساس، دامنه را کاهش دهید، وقفه‌های خنک‌کاری را طولانی‌تر کنید و پلیت را در تمام مدت اجرا سرد نگه دارید.
اگر لیز ناقص است، زمان فراصوت‌دهی را به‌صورت مرحله‌ای افزایش دهید، پیش‌تیمار آنزیمی را آزمایش کنید، گرانروی نمونه را کاهش دهید یا بافر را بهینه کنید. اگر پروتئین‌ها تخریب می‌شوند یا فعالیت خود را از دست می‌دهند، خنک‌کاری را بهبود دهید، دوره‌های روشن‌بودن را کوتاه‌تر کنید، مهارکننده اضافه کنید و از سازگاری سامانهٔ شوینده با پروتئین هدف مطمئن شوید.
از آنجا که سویه‌های مخمر از نظر ساختار دیوارهٔ سلولی، مرحلهٔ رشد، سامانهٔ بیان و تراکم زیست‌توده تفاوت‌های چشمگیری دارند، یک ماتریس بهینه‌سازی مختصر توصیه می‌شود. برای مثال، سه دامنه، دو چرخهٔ پالس و دو زمان کل روشن‌بودن را آزمایش کنید و سپس کارایی لیز و یکپارچگی پروتئین را ارزیابی کنید.

مزایای سونیکاتورهای میکروپلیت Hielscher برای لیز مخمر

سونیکاتورهای میکروپلیت Hielscher برای آزمایشگاه‌هایی ایدئال هستند که به لیز تکرارپذیر تعداد زیادی نمونه نیاز دارند. این دستگاه‌ها فرایند کند کار با نمونه‌ها به‌صورت تک‌به‌تک در فراصوت‌دهی با پروب را حذف می‌کنند و تغییرپذیری ناشی از جای‌گذاری دستی پروب، عمق غوطه‌وری و تفاوت در نحوهٔ کار با هر نمونه را کاهش می‌دهند.

مزایای اصلی عبارت‌اند از:

• پردازش با ظرفیت بالا: تعداد زیادی نمونهٔ مخمر را به‌صورت موازی در میکروپلیت‌ها یا رک‌های سازگار نمونه فراصوت‌دهی کنید.
• شرایط تکرارپذیر: شرایط فراصوت‌دهی یکسان در همهٔ چاهک‌ها برای دستیابی به نتایج لیز یکنواخت و قابل‌مقایسه.
• بدون آلودگی متقاطع ناشی از پروب: نمونه‌ها در طول فراصوت‌دهی آب‌بندی‌شده باقی می‌مانند و در نتیجه انتقال ناخواستهٔ مواد بین نمونه‌ها و مراحل تمیزکاری کاهش می‌یابد.
• مناسب برای سلول‌های مقاوم: فراصوت با شدت بالا به تخریب دیوارهٔ سلول‌های مخمر کمک می‌کند.
• گردش‌کار کارآمد: ایدئال برای غربالگری سویه‌ها، کلون‌ها، شرایط بیان و بافرهای لیز.
• گردش‌کار کارآمد: تنظیمات قابل‌برنامه‌ریزی، ثبت خودکار داده‌ها و مناسب برای اتوماسیون آزمایشگاهی.

کاربردها در زیست‌فناوری مخمر و پژوهش‌های علوم زیستی

لیز فراصوتی مخمر در میکروپلیت‌ها از بسیاری از گردش‌کارهای پژوهشی و غربالگری پشتیبانی می‌کند. در بیان پروتئین نوترکیب، می‌توان کلون‌های P. pastoris و S. cerevisiae را به‌صورت موازی لیز کرد تا سطوح بیان یا فعالیت آنزیمی مقایسه شوند. در زیست‌شناسی سامانه‌ای و اُمیکس، لیز استانداردشده قابلیت مقایسه میان شرایط مختلف را بهبود می‌دهد. در میکروبیولوژی، فراصوت‌دهی به تهیهٔ سریع لیزات از سویه‌های متعدد، شرایط مختلف محیط کشت یا تیمارهای تنشی کمک می‌کند.
حوزه‌های کاربرد رایج عبارت‌اند از:

• استخراج پروتئین مخمر
• غربالگری پروتئین نوترکیب
• غربالگری فعالیت آنزیمی
• انتخاب کلون پس از ترانسفورماسیون
• بهینه‌سازی تخمیر
• آماده‌سازی نمونه برای پروتئومیکس
• آماده‌سازی نمونه برای متابولومیکس
• مطالعات تخریب دیوارهٔ سلولی
• سنجش‌های میکروبیولوژی با ظرفیت پردازش بالا

لیز قابل‌اعتماد مخمر با فراصوت‌دهی کنترل‌شده آغاز می‌شود

لیز مخمر با افزایش تعداد نمونه‌ها می‌تواند دشوار شود، اما سونیکاتورهای میکروپلیت Hielscher این فرایند را سریع‌تر، پاکیزه‌تر و تکرارپذیرتر می‌کنند. UIP400MTP و UIP550MTP به پژوهشگران امکان می‌دهند کل پلیت‌ها را در شرایط فراصوتی تعریف‌شده پردازش کنند و ضمن کاهش کار دستی، ظرفیت پردازش را افزایش دهند.
برای میکروبیولوژیست‌ها، زیست‌شناسان مولکولی، پژوهشگران پروتئین و آزمایشگاه‌های زیست‌فناوری، فراصوت‌دهی میکروپلیت ابزاری قدرتمند برای آزادسازی کارآمد و تکرارپذیر اجزای درون‌سلولی مخمر است.

منابع علمی / مراجع

• FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
• FactSheet UIP550MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
• Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
• Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics 2024.