فراصوت‌دهی میکروپلیت در پروتئومیکس شاتگان – یادداشت کاربردی
پروتئومیکس شاتگان برای تبدیل مواد زیستی پیچیده به پپتیدهای آماده برای LC-MS/MS، به آماده‌سازی کارآمد و تکرارپذیر نمونه وابسته است. سونیکاتور میکروپلیت UIP400MTP با فراهم‌کردن فراصوت‌دهی استاندارد و موازی نمونه‌های کم‌حجم، از این فرایند پشتیبانی می‌کند و به آزمایشگاه‌ها کمک می‌کند تخریب، استخراج و حل‌سازی مجدد را در گردش‌کارهای مبتنی بر میکروپلیت بهبود دهند. این یادداشت کاربردی نحوه ادغام UIP400MTP در آماده‌سازی نمونه‌های پروتئومیکس را شرح می‌دهد و از یک گردش‌کار منتشرشده برای وزیکول‌های خارج‌سلولی در مطالعات PLA2G12A/Th17، به‌عنوان نمونه‌ای آزموده‌شده در آزمایشگاه استفاده می‌کند.
فراصوت‌دهی میکروپلیت برای پروتئومیکس شاتگان تکرارپذیرتر
برای پژوهشگران پروتئومیکس، آماده‌سازی تکرارپذیر نمونه برای دستیابی به داده‌های باکیفیت LC-MS/MS حیاتی است. سونیکاتور میکروپلیت UIP400MTP از فراصوت‌دهی استاندارد و موازی در گردش‌کارهای مبتنی بر پلیت و گردش‌کارهای کم‌حجم با ظرفیت پردازش بالا پشتیبانی می‌کند.
این دستگاه به‌ویژه برای آزمایشگاه‌هایی مفید است که با موارد زیر کار می‌کنند:
- مجموعه‌های بزرگ نمونه که به پردازش یکسان در تعداد زیادی چاهک نیاز دارند
- مواد با مقدار ورودی محدود که در آن‌ها اتلاف نمونه و تغییرپذیری باید به حداقل برسد
- نمونه‌های غنی از لیپید، مانند وزیکول‌های خارج‌سلولی
- فرآورده‌های زیستی پیچیده که به تخریب، استخراج یا حل‌سازی مجدد کارآمد نیاز دارند
- پروتئومیکس شاتگان مقایسه‌ای که در آن تکرارپذیری در شرایط و تکرارهای مختلف ضروری است
پژوهشگران با ادغام فراصوت‌دهی میکروپلیت پیش از هضم، می‌توانند آمادگی نمونه را برای موارد زیر بهبود دهند:
- استخراج و حل‌سازی مجدد پروتئین
- هضم با تریپسین/Lys-C
- داده‌برداری Nano-LC/MS/MS
- تحلیل کمّی پروتئومیکس در مراحل پایین‌دستی
بیاموزید که فراصوت‌دهی میکروپلیت چگونه به کاهش تغییرپذیری ناشی از کار دستی، بهبود تخریب نمونه و آماده‌سازی نمونه‌های زیستی پیچیده برای تحلیل قابل‌اعتماد LC-MS/MS کمک می‌کند.
فراصوت‌دهی میکروپلیت می‌تواند برای گروه‌های زیر سودمند باشد:
- مراکز خدمات مشترک پروتئومیکس
- آزمایشگاه‌های پژوهشی EV
- آزمایشگاه‌های ایمنی‌شناسی و زیست‌شناسی سلولی
- گروه‌های پژوهش ترجمانی
- تیم‌های علوم زیستی که از آماده‌سازی تک‌نمونه‌ای به گردش‌کارهایی با ظرفیت پردازش بالاتر گذار می‌کنند
آماده‌سازی نمونه با ظرفیت پردازش بالا برای تحلیل پروتئوم وزیکول‌های خارج‌سلولی
پروتئومیکس شاتگان چیست؟
پروتئومیکس شاتگان به یک راهبرد تحلیلی محوری برای مشخصه‌یابی نمونه‌های زیستی پیچیده تبدیل شده است؛ از لیزات‌های کل سلول و عصاره‌های بافتی گرفته تا اندامک‌های خالص‌شده، وزیکول‌های خارج‌سلولی و نمونه‌های بالینی با مقدار ورودی کم. نقطه قوت اصلی آن در پیوند هضم پروتئین، کروماتوگرافی مایع–طیف‌سنجی جرمی پشت‌سرهم با تفکیک‌پذیری بالا و استنباط محاسباتی پروتئین‌ها از پپتیدها نهفته است. بااین‌حال، کیفیت مجموعه‌داده نهایی پروتئوم مدت‌ها پیش از رسیدن نمونه به طیف‌سنج جرمی تعیین می‌شود. تخریب کارآمد نمونه، حل‌سازی پروتئین، حذف مواد مداخله‌گر، هضم آنزیمی تکرارپذیر و بازیابی قابل‌اتکای پپتید همگی در عمق پوشش و قابلیت اعتماد کمّی تعیین‌کننده‌اند.
برای پژوهشگران پروتئومیکس و آزمایشگاه‌های علوم زیستی که با نمونه‌های محدود یا ارزشمند کار می‌کنند، آماده‌سازی نمونه اغلب گلوگاه فرایند است.
UIP400MTP آماده‌سازی قابل‌اعتماد نمونه و ادغام آسان با گردش‌کارهای موجود آزمایشگاه را تضمین می‌کند
چالش وزیکول‌های خارج‌سلولی در پروتئومیکس
برای مثال، وزیکول‌های خارج‌سلولی (EVs) گروهی از نمونه‌ها با الزامات پردازشی به‌ویژه دشوار هستند. آن‌ها ذراتی در مقیاس نانو، محصور در غشا و غنی از لیپید هستند که بازده پروتئینی نسبتاً پایینی دارند و احتمال انتقال همراه لیپیدها، نمک‌ها، شوینده‌ها، پروتئین‌های سرم و سایر اجزای ماتریس در آن‌ها بالاست. این ویژگی‌ها می‌توانند در کارایی هضم، عملکرد کروماتوگرافی، پایداری الکترواسپری و شناسایی پپتیدها اختلال ایجاد کنند. بنابراین، گردش‌کار آماده‌سازی برای پروتئومیکس EV باید به‌اندازه کافی مؤثر باشد تا ساختار وزیکول‌ها را تخریب و محموله پروتئینی را حل کند، و درعین‌حال با هضم آنزیمی پایین‌دستی و تحلیل LC-MS/MS سازگار بماند.
در این زمینه، فراصوت‌دهی سازگار با میکروپلیت رویکردی عملی برای پردازش تکرارپذیر و موازی نمونه‌ها ارائه می‌دهد. مدل‌های سونیکاتور میکروپلیت Hielscher، یعنی UIP400MTP (400 W) و UIP550MTP (550 W)، برای فراصوت‌دهی نمونه‌ها در پلیت‌های چندچاهکی و ظروف کم‌حجم طراحی شده‌اند و از گردش‌کارهایی با ظرفیت پردازش بالاتر نسبت به سونیکاتورهای متداول تک‌پروبی پشتیبانی می‌کنند. این قالب برای آزمایشگاه‌های پروتئومیکس جذاب است، زیرا می‌تواند تغییرپذیری ناشی از مداخله دستی را کاهش دهد، تیمار موازی چندین نمونه را بهبود بخشد و به‌صورت طبیعی‌تری در زنجیره‌های آماده‌سازی نمونه مبتنی بر پلیت ادغام شود.
نمونه‌ای از گردش‌کار
یک گردش‌کار جدید پروتئومیکس وزیکول‌های خارج‌سلولی در زیست‌شناسی سلول‌های Th17 تحت تأثیر PLA2G12A، نمونه‌ای مفید و آزموده‌شده در آزمایشگاه از نحوه به‌کارگیری سونیکاتور میکروپلیت UIP400MTP در آماده‌سازی نمونه برای پروتئومیکس شاتگان ارائه می‌دهد. در آن مجموعه مطالعات، نمونه‌های EV برای تحلیل پروتئوم با استفاده از تیمار با متانول، فراصوت‌دهی با UIP400MTP، سانتریفیوژ، خشک‌کردن، هضم با تریپسین/Lys-C و LC با جریان نانو متصل به MS پشت‌سرهم با تفکیک‌پذیری بالا پردازش شدند. این پژوهش زیستی در 2026 توسط Mochizuki-Ono و همکاران گزارش شد و تحلیل پروتئومیکس در آن به مشخصه‌یابی نحوه تغییر پروتئین‌های محموله EV توسط PLA2G12A در زمینه پاسخ‌های بیماری‌زای سلول T کمک کرد.
سونیکاتور پلیت 96 چاهکی UIP400MTP برای استخراج پروتئین با ظرفیت پردازش بالا
سونیکاتور: سونیکاتور میکروپلیت UIP400MTP
ورودی: مقدار EV معادل 5 µg پروتئین
هضم: تریپسین/Lys-C
خروجی اندازه‌گیری: Nano-LC-MS/MS / پروتئومیکس DIA
دستورالعمل گام‌به‌گام: آماده‌سازی نمونه EV برای پروتئومیکس شاتگان به کمک UIP400MTP
این گردش‌کار، روش آماده‌سازی نمونه برای پروتئومیکس شاتگان وزیکول‌های خارج‌سلولی (EV) با مقدار ورودی کم را با استفاده از سونیکاتور میکروپلیت UIP400MTP شرح می‌دهد. مبنای آن یک گردش‌کار منتشرشده پروتئومیکس EV است که در آن نمونه‌های EV نرمال‌سازی و خشک شدند، با متانول تیمار و فراصوت‌دهی شدند، با تریپسین/Lys-C هضم و اسیدی شدند و با nano-LC-MS/MS تحلیل شدند.
این روش برای پژوهشگران پروتئومیکس و آزمایشگاه‌های علوم زیستی در نظر گرفته شده است که EVها یا سایر نمونه‌های زیستی کم‌حجم و غنی از لیپید را برای پروتئومیکس شاتگان پایین‌به‌بالا آماده می‌کنند.
مروری بر گردش‌کار
| مرحله | هدف | خروجی اصلی |
|---|---|---|
| آماده‌سازی EV | جداسازی، شست‌وشو و اندازه‌گیری کمّی نمونه‌های EV | ورودی نرمال‌سازی‌شده EV |
| خشک‌کردن نمونه | حذف مایع پیش از پردازش به کمک حلال | ماده EV خشک‌شده |
| تیمار با متانول | کمک به تخریب ماده EV غنی از لیپید | نمونه خیس‌شده با متانول |
| فراصوت‌دهی با UIP400MTP | تقویت تخریب، استخراج و همگن‌سازی | نمونه EV پردازش‌شده |
| هضم | تولید پپتید از پروتئین‌های EV | محصول پپتیدی هضم با تریپسین/Lys-C |
| تحلیل LC-MS/MS | جداسازی، آشکارسازی و اندازه‌گیری کمّی پپتیدها | مجموعه‌داده پروتئومیکس |
| تحلیل داده‌ها | شناسایی و اندازه‌گیری کمّی پپتیدها و پروتئین‌ها | نتایج در سطح پروتئین |
پروتکل گام‌به‌گام
| گام | دستورالعمل | پارامترهای حیاتی |
|---|---|---|
| 1 | نمونه‌های EV خالص‌شده را با استفاده از گردش‌کار تثبیت‌شده جداسازی در آزمایشگاه آماده کنید. | پیش از آماده‌سازی برای پروتئومیکس، سلول‌ها، بقایا و آلاینده‌های عمده را حذف کنید. |
| 2 | محتوای پروتئینی EV را، برای مثال با آزمون BCA، به‌صورت کمّی اندازه‌گیری کنید. | همه نمونه‌ها را به مقدار ورودی یکسان برحسب معادل پروتئین نرمال‌سازی کنید. |
| 3 | مقدار EV معادل 5 µg پروتئین را به لوله‌های PCR تمیز یا لوله‌های کم‌حجم سازگار منتقل کنید. | در مواردی که اتلاف نمونه نگران‌کننده است، از لوله‌های با اتصال سطحی کم استفاده کنید. |
| 4 | نمونه‌های EV را کاملاً خشک کنید. | از گرم‌شدن بیش‌ازحد جلوگیری کنید؛ تأیید کنید که هیچ مایع قابل‌مشاهده‌ای باقی نمانده است. |
| 5 | به هر نمونه EV خشک‌شده، 25 µL متانول اضافه کنید. | مطمئن شوید که ماده خشک‌شده کاملاً خیس شده است. |
| 6 | نمونه‌ها را به مدت 3 دقیقه با استفاده از سونیکاتور میکروپلیت UIP400MTP فراصوت‌دهی کنید. | برای همه نمونه‌ها از تنظیمات یکسان فراصوت‌دهی و منطق یکسان چیدمان استفاده کنید. |
| 7 | نمونه‌های فراصوت‌دهی‌شده را با 19٬000 × g به مدت 20 دقیقه در 4°C سانتریفیوژ کنید. | پس از سانتریفیوژ، از برهم‌زدن هرگونه رسوب یا ماده نامحلول خودداری کنید. |
| 8 | با دقت 20 µL از مایع رویی را بردارید. | برای همه نمونه‌ها از روش یکسان پیپت‌کردن استفاده کنید. |
| 9 | ماده باقی‌مانده نمونه را کاملاً خشک کنید. | مستقیماً به مرحله هضم بروید یا نمونه را فقط در شرایط اعتبارسنجی‌شده نگهداری کنید. |
| 10 | مقدار 4 µL محلول تریپسین/Lys-C با غلظت 100 ng/µL در بی‌کربنات آمونیوم 50 mM اضافه کنید. | محلول آنزیم را تازه تهیه کنید یا از بخش‌های تقسیم‌شده‌ای استفاده کنید که به‌درستی نگهداری شده‌اند. |
| 11 | برای حل‌کردن ماده پروتئینی خشک‌شده در محلول هضم، فراصوت‌دهی کوتاهی انجام دهید. | پس از فراصوت‌دهی، تمام مایع را در ته لوله جمع کنید. |
| 12 | هضم را به مدت 2 ساعت در 37°C همراه با تکان‌دادن در 300 rpm انجام دهید. | برای جلوگیری از تبخیر، درپوش‌ها را محکم بسته نگه دارید. |
| 13 | برای اسیدی‌کردن محصول هضم، 1 µL از TFA با غلظت 1٫25% اضافه کنید. | اسیدی‌کردن، هضم را متوقف می‌کند و پپتیدها را برای LC-MS/MS آماده می‌سازد. |
| 14 | محصول هضم را به ویال‌ها یا پلیت‌های سازگار با LC-MS منتقل کنید. | از انتقال بقایای نامحلول خودداری کنید. |
| 15 | با nano-LC-MS/MS تحلیل کنید. | از حجم تزریق، گرادیان LC و تنظیمات داده‌برداری MS یکسان استفاده کنید. |
| 16 | داده‌های خام را حسب مورد با نرم‌افزار پروتئومیکس DIA، DDA یا هدفمند پردازش کنید. | پایگاه داده، ویژگی اختصاصی آنزیم، تنظیمات تغییرات و آستانه‌های FDR مناسب را اعمال کنید. |
(رجوع کنید به Mochizuki-Ono et al., 2026)
سونیکاتور پلیت چندچاهکی UIP400MTP
چرا فراصوت‌دهی میکروپلیت؟
UIP400MTP فراصوت‌دهی استاندارد و موازی نمونه‌های کم‌حجم را امکان‌پذیر می‌کند. این قابلیت زمانی مفید است که تکرارپذیری، مقدار ورودی کم نمونه و ظرفیت پردازش چندین نمونه اهمیت داشته باشند.
از هر نوع میکروپلیت استاندارد استفاده کنید! آماده‌سازی نمونه با ظرفیت پردازش بالا با UIP400MTP
در گردش‌کار پروتئومیکس EV مورد استناد، از ورودی EV معادل 5 µg پروتئین، 25 µL متانول، 3 دقیقه فراصوت‌دهی با UIP400MTP، هضم با تریپسین/Lys-C، اسیدی‌کردن با TFA و تحلیل nano-LC-MS/MS استفاده شد.
مراحل پیشنهادی LC-MS/MS و تحلیل داده‌ها
پس از هضم و اسیدی‌کردن، می‌توان نمونه‌ها را با استفاده از LC فاز معکوس با جریان نانو، متصل به طیف‌سنجی جرمی پشت‌سرهم با تفکیک‌پذیری بالا تحلیل کرد. در گردش‌کار منتشرشده، پپتیدها در یک سامانه nano-LC جدا شدند و با داده‌برداری مستقل از داده در یک طیف‌سنج جرمی Orbitrap تحلیل شدند.
| مرحله | توصیه | هدف |
|---|---|---|
| بارگذاری نمونه | از تله C18 یا آرایش معادل برای بارگذاری پپتید استفاده کنید. | پپتیدها را تغلیظ و آلاینده‌های بسیار قطبی را حذف می‌کند. |
| جداسازی پپتیدها | از LC فاز معکوس با جریان نانو استفاده کنید. | جداسازی پپتیدها و حساسیت MS را بهبود می‌دهد. |
| داده‌برداری MS | بسته به طراحی مطالعه، از DIA، DDA یا MS هدفمند استفاده کنید. | داده‌های طیفی در سطح پپتید تولید می‌کند. |
| جست‌وجوی پایگاه داده | از پایگاه داده مرجع متناسب با گونه استفاده کنید. | به شناسایی پپتیدها و پروتئین‌ها کمک می‌کند. |
| کنترل FDR | آستانه‌های نرخ کشف کاذب را برای پپتیدها و پروتئین‌ها اعمال کنید. | میزان اطمینان شناسایی را کنترل می‌کند. |
| اندازه‌گیری کمّی | از جدول‌های فراوانی پپتیدها، پیش‌سازها و پروتئین‌ها خروجی بگیرید. | مقایسه آماری بین گروه‌ها را امکان‌پذیر می‌کند. |
چک‌لیست کنترل کیفیت
- برابر بودن مقدار ورودی EV برحسب معادل پروتئین را در همه نمونه‌ها تأیید کنید.
- از چیدمان‌های تصادفی‌سازی‌شده یا متوازن برای پردازش نمونه‌ها استفاده کنید.
- حجم متانول، زمان فراصوت‌دهی، زمان خشک‌کردن و حجم هضم را یکسان نگه دارید.
- بازده پپتید و تعداد کل پروتئین‌های شناسایی‌شده را پایش کنید.
- نرخ برش‌های انجام‌نشده و توزیع طول پپتیدها را بررسی کنید.
- شکل پیک‌های کروماتوگرافی و تکرارپذیری زمان بازداری را بررسی کنید.
- برای پایش انتقال باقی‌مانده نمونه به نمونه بعدی، نمونه‌های بلانک را نیز بگنجانید.
- برای مطالعات بزرگ‌تر از نمونه‌های QC تجمیع‌شده استفاده کنید.
- ضریب تغییرات تکرارها را ارزیابی کنید.
- برای شناسایی اثرات دسته‌ای یا نمونه‌های پرت، از PCA یا روش‌های مرتبط استفاده کنید.
توصیه‌های ثبت و مستندسازی
هنگام انتشار یا مستندسازی این گردش‌کار، مقدار ورودی EV، قالب پلیت، حجم متانول، دامنه و زمان فراصوت‌دهی UIP400MTP، شرایط سانتریفیوژ، روش خشک‌کردن، بافر هضم، غلظت آنزیم، زمان هضم، شرایط اسیدی‌کردن، پلتفرم LC-MS/MS، حالت داده‌برداری، نسخه نرم‌افزار، پایگاه داده، آستانه FDR، روش نرمال‌سازی و گردش‌کار آماری را گزارش کنید.
همه سونیکاتورهای میکروپلیت Hielscher پارامترهای مهم فرایند، مانند دامنه، مدت فراصوت‌دهی و دما را همراه با برچسب تاریخ و زمان، به‌صورت خودکار در قالب فایل CVS روی کارت SD یکپارچه ثبت می‌کنند. ثبت داده‌ها برای تکرارپذیری و کنترل کیفیت هرگز به این آسانی نبوده است!
برای پروتئومیکس DIA، از تنظیمات داده‌برداری یکسان در همه نمونه‌ها استفاده کنید و در صورت امکان، نمونه‌های QC تجمیع‌شده را نیز بگنجانید. تعداد پیش‌سازها، پایداری زمان بازداری و تغییرپذیری تکرارها را پایش کنید.
این گردش‌کار نمونه‌ای آزموده‌شده در آزمایشگاه برای پروتئومیکس EV است. برای سایر انواع نمونه، پیش از گسترش آن به یک مطالعه کامل، مقدار ورودی، شرایط حلال، زمان فراصوت‌دهی، حجم هضم و راهبرد تزریق LC-MS/MS را بهینه کنید.
جزئیات مطالعه: پروتئومیکس شاتگان EV در مطالعه PLA2G12A
مطالعه PLA2G12A نمونه‌ای مشخص از استفاده UIP400MTP در گردش‌کار پروتئومیکس شاتگان ارائه می‌دهد. پرسش زیستی این بود که فسفولیپاز ترشح‌شده PLA2G12A چگونه وزیکول‌های خارج‌سلولی مشتق از سلول‌های Th17 را تغییر می‌دهد و از این طریق بر تمایز سلول‌های T بیماری‌زا اثر می‌گذارد. نویسندگان نشان دادند که PLA2G12A با اثر بر غشاهای EV، لیزوفسفولیپیدهایی از جمله 1-اولئوئیل-لیزوفسفاتیدیل‌اتانول‌آمین تولید می‌کند و پیام‌رسانی پایین‌دستی اسید لیزوفسفاتیدیک از طریق LPA2 به تمایز Th17 کمک می‌کند. این مطالعات علاوه بر پیام‌رسانی لیپیدی، محموله EV، از جمله محتوای RNA و پروتئین را نیز بررسی کردند و ازاین‌رو پروتئومیکس شاتگان جزء مهمی از راهبرد مشخصه‌یابی بود.
در گردش‌کار آماده‌سازی EV، سلول‌های Th17 در محیط حاوی سرم جنین گاوی تخلیه‌شده از اگزوزوم کشت داده شدند. مایعات رویی کشت ابتدا برای حذف سلول‌ها سانتریفیوژ شدند، از فیلتر 0٫22 µm عبور داده شدند، با اولترافیلتراسیون/اولتراسانتریفیوژ تغلیظ شدند، شسته شدند، مجدداً در PBS به حالت تعلیق درآمدند و با آزمون پروتئین BCA به‌صورت کمّی اندازه‌گیری شدند. این آماده‌سازی بالادستی EV تضمین کرد که مقدار مشخصی از ماده EV برحسب معادل پروتئین وارد گردش‌کار پروتئومیکس شود.
برای تحلیل پروتئومیکس شاتگان، نویسندگان از نمونه‌های EV معادل 5 µg پروتئین استفاده کردند. این نمونه‌ها در لوله‌های PCR خشک شدند و 25 µL متانول به آن‌ها اضافه شد. سپس نمونه‌ها به مدت 3 دقیقه با استفاده از سونیکاتور میکروپلیت UIP400MTP فراصوت‌دهی شدند. پس از فراصوت‌دهی، نمونه‌ها در 4°C به مدت 20 دقیقه با 19٬000 × g سانتریفیوژ شدند. پس از برداشتن 20 µL مایع رویی، نمونه‌ها تا خشک‌شدن سانتریفیوژ شدند. سپس پروتئین‌ها با فراصوت‌دهی در 4 µL محلول تریپسین/Lys-C با غلظت 100 ng/µL در بی‌کربنات آمونیوم 50 mM حل شدند. هضم به مدت 2 ساعت در 37°C همراه با تکان‌دادن در 300 rpm انجام شد. محصول هضم با 1 µL اسید تری‌فلوئورواستیک 1٫25% اسیدی شد و برای کروماتوگرافی مایع با جریان نانو متصل به طیف‌سنجی جرمی پشت‌سرهم با تفکیک‌پذیری بالا ارسال شد.
این گردش‌کار چند اصل مفید را برای پروتئومیکس EV با مقدار ورودی کم برجسته می‌کند. نخست، ورودی برحسب معادل پروتئین نرمال‌سازی شد که هنگام مقایسه EVهای حاصل از ژنوتیپ‌ها یا تیمارهای مختلف اهمیت دارد. دوم، متانول پیش از فراصوت‌دهی استفاده شد و ضمن کمک به تخریب و استخراج، از سامانه‌های شوینده‌ای که ممکن است LC-MS/MS را پیچیده کنند اجتناب شد. سوم، مرحله فراصوت‌دهی کوتاه و استاندارد بود که با پردازش موازی نمونه‌ها سازگار است. چهارم، هضم با تریپسین/Lys-C در حجم بسیار کمی انجام شد که رقیق‌شدن را کاهش داد و به بازیابی پپتید از ورودی کم کمک کرد. در نهایت، گذار مستقیم از هضم به اسیدی‌کردن و LC-MS/MS مراحل غیرضروری کار با نمونه را به حداقل رساند.
در روش پایین‌دستی LC-MS/MS از جداسازی فاز معکوس با جریان نانو، متصل به طیف‌سنج جرمی Q-Exactive HF Orbitrap استفاده شد. نمونه‌ها روی پیش‌ستون C18 به دام افتادند و سپس روی ستون تحلیلی با قطر داخلی 50 µm، در دبی 200 nL/min و دمای 40°C جدا شدند. گرادیان طی 60 دقیقه از مقدار کم حلال آلی به 35% حلال B رسید و پس از آن شست‌وشو با درصد بالای حلال آلی و تعادل‌سازی مجدد انجام شد. داده‌برداری MS در حالت یون مثبت با استفاده از داده‌برداری مستقل از داده و تفکیک القاشده با برخورد با انرژی بالاتر انجام شد. فایل‌های خام DIA با استفاده از DIA-NN 1.8 و یک کتابخانه طیفی پیش‌بینی‌شده به‌صورت محاسباتی تحلیل شدند.
استخراج پروتئین با ظرفیت پردازش بالا با سونیکاتور پلیت 96 چاهکی UIP400MTP
پرسش‌های متداول
چه کسانی بیشترین بهره را از فراصوت‌دهی میکروپلیت در پروتئومیکس شاتگان می‌برند؟
فراصوت‌دهی میکروپلیت به‌ویژه برای آزمایشگاه‌های پروتئومیکس که چندین نمونه را به‌صورت موازی پردازش می‌کنند مفید است؛ از جمله مراکز خدمات مشترک، گروه‌های پژوهش پروتئوم، آزمایشگاه‌های ایمنی‌شناسی، تیم‌های پژوهش ترجمانی و آزمایشگاه‌های علوم زیستی که به‌سوی گردش‌کارهای LC-MS/MS با ظرفیت پردازش بالاتر حرکت می‌کنند. این روش به‌خصوص زمانی کاربرد دارد که تکرارپذیری بین نمونه‌ها حیاتی باشد.
چرا به‌جای سونیکاتور پروبی متداول از UIP400MTP استفاده کنیم؟
سونیکاتور پروبی متداول معمولاً نمونه‌ها را یکی‌یکی پردازش می‌کند و برای کاهش انتقال باقی‌مانده نمونه به نمونه بعدی، به تمیزکاری دقیق بین نمونه‌ها نیاز دارد. مدل‌های سونیکاتور میکروپلیت UIP400MTP و UIP550MTP از فراصوت‌دهی موازی در قالب مبتنی بر پلیت یا کم‌حجم پشتیبانی می‌کنند و به کاهش کار دستی، بهبود یکنواختی و تسهیل آماده‌سازی چندین نمونه کمک می‌کنند. این دستگاه‌ها همچنین امکان ادغام آسان در گردش‌کارهای خودکار را فراهم می‌کنند.
فراصوت‌دهی در کدام بخش از گردش‌کار پروتئومیکس شاتگان قرار می‌گیرد؟
فراصوت‌دهی معمولاً در مرحله آماده‌سازی نمونه پیش از هضم انجام می‌شود. این روش می‌تواند پیش از هضم آنزیمی با تریپسین، Lys-C یا مخلوط تریپسین/Lys-C به تخریب، استخراج، همگن‌سازی و حل‌سازی مجدد کمک کند.
همچنین می‌توان فراصوت‌دهی را در حین هضم به کار برد تا هضم آنزیمی پروتئین به‌طور چشمگیری تسریع شود. با قابلیت هضم پروتئین با ظرفیت پردازش بالا به کمک فراصوت‌دهی برای یک گردش‌کار سریع پروتئومیکس آشنا شوید!
آیا فراصوت‌دهی میکروپلیت برای پروتئومیکس وزیکول‌های خارج‌سلولی مفید است؟
بله. وزیکول‌های خارج‌سلولی ذراتی غنی از لیپید و محصور در غشا هستند که پردازش تکرارپذیر آن‌ها می‌تواند چالش‌برانگیز باشد. در مطالعات PLA2G12A مورد استناد، نمونه‌های EV با متانول تیمار شدند، با UIP400MTP فراصوت‌دهی و خشک شدند، با تریپسین/Lys-C هضم شدند و با nano-LC/MS/MS تحلیل شدند.
چه نوع نمونه‌هایی می‌توانند از فراصوت‌دهی میکروپلیت بهره ببرند؟
فراصوت‌دهی میکروپلیت می‌تواند برای لیزات‌های سلولی، کسرهای اندامکی، رسوب‌های ایمنی، تجمعات پروتئینی، نمونه‌های غنی از غشا، وزیکول‌های خارج‌سلولی و سایر فرآورده‌های زیستی کم‌حجم مفید باشد. برای هر نوع نمونه باید شدت و زمان فراصوت‌دهی، شرایط حلال، مقدار ورودی و راهبرد هضم بهینه شود.
آیا فراصوت‌دهی جایگزین هضم آنزیمی می‌شود؟
خیر. فراصوت‌دهی با بهبود تخریب، استخراج یا حل‌سازی مجدد به آماده‌سازی نمونه برای هضم کمک می‌کند. برای تولید پپتیدها در پروتئومیکس شاتگان پایین‌به‌بالا، همچنان هضم پروتئولیتیک لازم است.
درباره هضم پروتئین تقویت‌شده با فراصوت در گردش‌کارهای پروتئومیکس بیشتر بخوانید!
آیا UIP400MTP با پروتئومیکس با مقدار ورودی کم سازگار است؟
بله، قالب میکروپلیت برای گردش‌کارهای کم‌حجمی که در آن‌ها حفظ نمونه و پردازش یکسان اهمیت دارد، بسیار مناسب است. در گردش‌کار منتشرشده EV، آماده‌سازی پروتئومیکس با ورودی EV معادل 5 µg پروتئین انجام شد.
آیا فراصوت‌دهی میکروپلیت می‌تواند تکرارپذیری را بهبود دهد؟
سونیکاتورهای Hielscher با اعمال شرایط استاندارد فراصوت‌دهی بر چندین نمونه، از تکرارپذیری پشتیبانی می‌کنند. بااین‌حال، عوامل دیگری مانند جداسازی سلول یا EV، نرمال‌سازی ورودی، کارایی هضم، پایداری LC-MS/MS، پردازش داده‌ها و تحلیل آماری نیز در تکرارپذیری کلی پروتئومیکس نقش دارند.
آیا فراصوت‌دهی میکروپلیت عمق شناسایی پروتئین را بهبود می‌دهد؟
هنگامی که تخریب نمونه یا حل‌سازی مجدد عامل محدودکننده باشد، این روش ممکن است به بهبود عمق شناسایی کمک کند. میزان اثر به نوع نمونه، شیمی پروتئین، راهبرد پاک‌سازی، شرایط هضم و عملکرد روش LC-MS/MS بستگی دارد.
پیش از استفاده معمول از این گردش‌کار، چه مواردی باید بهینه شوند؟
پارامترهای اصلی شامل مقدار ورودی نمونه، ترکیب بافر یا حلال، قالب پلیت، دامنه و مدت فراصوت‌دهی، شرایط خشک‌کردن، حجم هضم، غلظت آنزیم، زمان انکوباسیون و مقدار تزریق LC-MS/MS هستند. پیش از به‌کارگیری گردش‌کار برای یک مجموعه آزمایشی کامل، آزمون مقدماتی توصیه می‌شود.
آیا می‌توان این گردش‌کار را با پروتئومیکس DIA به کار برد؟
بله. گردش‌کار EV مورد استناد از داده‌برداری مستقل از داده و سپس تحلیل DIA-NN استفاده کرد. فراصوت‌دهی میکروپلیت بخشی از فرایند بالادستی آماده‌سازی نمونه است و می‌توان آن را با روش‌های پروتئومیکس DIA، DDA یا هدفمند ادغام کرد.
کدام شاخص‌های کنترل کیفیت باید پایش شوند؟
شاخص‌های پیشنهادی QC شامل بازده پپتید، تعداد پپتیدها و گروه‌های پروتئینی شناسایی‌شده، نرخ برش‌های انجام‌نشده، توزیع طول پپتیدها، شکل پیک‌های کروماتوگرافی، پایداری زمان بازداری، ضریب تغییرات تکرارها، انتقال باقی‌مانده نمونه به نمونه بعدی و تفکیک گروه‌های زیستی با PCA یا روش‌های مرتبط هستند.
مزیت اصلی ادغام مدل‌های سونیکاتور میکروپلیت UIP400MTP یا UIP550MTP در آماده‌سازی نمونه پروتئومیکس چیست؟
مزیت اصلی، پردازش استاندارد و موازی نمونه‌های کم‌حجم است. این قابلیت به آزمایشگاه‌ها کمک می‌کند تغییرپذیری ناشی از کار دستی را کاهش دهند و نمونه‌های زیستی پیچیده را به‌صورت یکسان‌تری برای هضم، داده‌برداری LC-MS/MS و تحلیل کمّی پروتئومیکس آماده کنند.
سونیکاتورهای میکروپلیت Hielscher را می‌توان به‌صورت یکپارچه در گردش‌کارهای خودکار ادغام کرد.
منابع علمی / مراجع
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP550MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- Mochizuki-Ono C., Taketomi Y., Irie A., Kano K. et al. (2026): PLA2G12A-driven extracellular vesicle-lipid signaling amplifies pathogenic T cell responses in inflammatory diseases. Cell Reports 45, 2026.
- Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
- Lischnig A., Bergqvist M., Ochiya T., Lässer C. (2023): Corrigendum for “Quantitative Proteomics Identifies Proteins Enriched in Large and Small Extracellular Vesicles”. Molecular & Cellular Proteomics, 22; 2023.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.
Hielscher Ultrasonics هموژنایزرهای فراصوتی با عملکرد بالا را در مقیاس‌های آزمایشگاهی تا صنعتی تولید می‌کند.