پروتکل پروتئومیکس: فراصوت‌دهی بدون تماس، آماده‌سازی نمونه‌های پپتیدی برای MS را بهبود می‌بخشد

پروتئومیکس پایین‌به‌بالا به یکی از ارکان کشف نوین نشانگرهای زیستی، زیست‌شناسی ساختاری و تشخیص بالینی تبدیل شده است. پژوهشگران با هضم پروتئین‌ها به پپتید پیش از تحلیل طیف‌سنجی جرمی (MS)، می‌توانند به پوشش گسترده‌تر توالی و اندازه‌گیری کمّی قابل‌اعتمادتر دست یابند. بااین‌حال، آماده‌سازی نمونه‌های زیستی بسیار پیچیده برای MS همچنان از نظر فنی دشوار است. پیشرفت‌های اخیر روش‌شناختی نشان می‌دهند که چگونه پردازش فراصوتی کنترل‌شده – به‌ویژه با سونیکاتور چندلوله‌ای بدون تماس VialTweeter و سونیکاتور میکروپلیت UIP400MTP – می‌تواند این روند کاری را به‌طور چشمگیری تسهیل کند، تکرارپذیری را بهبود بخشد و از گلوگاه‌های رایج دستگاهی جلوگیری کند.
در ادامه، پروتکلی تفصیلی برای آماده‌سازی نمونه و دستیابی به پپتیدهایی با اندازه مناسب برای تحلیل با MS ارائه شده است.

چه کسانی باید برای آماده‌سازی نمونه‌های پپتیدی از فراصوت‌دهی بدون تماس استفاده کنند؟

• آزمایشگاه‌های پروتئومیکس پایین‌به‌بالا و اکتشافی: پژوهشگرانی که نمونه‌های بسیار پیچیده را برای روندهای کاری LC-MS یا MALDI آماده می‌کنند و به بازیابی یکنواخت و پربازده پپتیدها از ماتریس‌های زیستی گوناگون نیاز دارند.
• کاربران S-Trap™ و به‌دام‌اندازی در سوسپانسیون: گروه‌هایی که برای پاک‌سازی نمونه به میکروستون متکی هستند و برای جلوگیری از گرفتگی ستون و اطمینان از بارگذاری و هضم بی‌دردسر نمونه، به برش کنترل‌شده DNA نیاز دارند.
• گروه‌های پژوهش بالینی و ترجمانی: آزمایشگاه‌هایی که بافت، سلول، پلاسما، سرم یا مایع مغزی‌نخاعی را پردازش می‌کنند و تکرارپذیری بین دسته‌های نمونه و حفظ یکپارچگی نمونه برای آن‌ها حیاتی است.
• گروه‌های MS کمّی و هدفمند: آزمایشگاه‌هایی که مطالعات مقایسه‌ای دقیق انجام می‌دهند و در آن‌ها سونیکاتورهای پروبی خطر آلودگی متقاطع ایجاد می‌کنند که می‌تواند اندازه‌گیری کمّی پپتیدهای کم‌فراوان را مختل کند.
• مراکز خدمات آزمایشگاهی مشترک و عملیات با ظرفیت پردازش بالا: گروه‌هایی که چندین تکرار زیستی را هم‌زمان پردازش می‌کنند و از فراصوت‌دهی بلوکی چندلوله‌ای در لوله‌های بسته با VialTweeter بهره می‌برند؛ روشی که نیاز به تمیزکردن پروب را حذف می‌کند، زمان کار مستقیم اپراتور را کاهش می‌دهد و شرایط آسپتیک را حفظ می‌کند.
• پژوهشگران PTM و ساختار پروتئین: پژوهشگرانی که برای حفظ تغییرات ناپایدار و به‌حداکثررساندن پوشش توالی در حین لیز و همگن‌سازی سلولی، به پردازش ملایم با دمای کنترل‌شده نیاز دارند.

مروری بر پروتکل: از بافت و سلول تا پپتیدهای آماده برای MS

روند کاری پروتئومیکس پایین‌به‌بالا که Wojtkiewicz et al. تشریح کرده‌اند و به‌طور گسترده به کار می‌رود، روشی قابل‌اتکا و مقیاس‌پذیر برای آماده‌سازی نمونه‌های پپتیدی از ماتریس‌های زیستی گوناگون فراهم می‌کند. این پروتکل با 50–100 mg بافت منجمدشده به روش انجماد سریع یا 1–20 میلیون سلول آغاز می‌شود و فناوری به‌دام‌اندازی در سوسپانسیون (S-Trap™) را برای حذف مؤثر شوینده‌ها، نمک‌ها و آلاینده‌ها پیش از هضم آنزیمی به کار می‌گیرد.
پس از لیز، اندازه‌گیری کمّی پروتئین، احیا و آلکیلاسیون، نمونه اسیدی و روی ستون سانتریفیوژی S-Trap™ بارگذاری می‌شود؛ هضم با تریپسین/lysC در این ستون انجام می‌گیرد. پپتیدهای حاصل از ستون واجذب و خارج می‌شوند، خشک می‌شوند و تحت تحلیل LC-MS قرار می‌گیرند. هنگامی که این روند کاری برای 50 mg بافت قلب انسان به کار می‌رود، به‌طور پایدار پپتید کافی برای 30–40 تزریق فراهم می‌کند و در هر نوبت تحلیل، بیش از 4٬000 پروتئین منحصربه‌فرد شناسایی می‌شود. اگرچه فرایندهای شیمیایی و پاک‌سازی مبتنی بر ستون به‌خوبی تعریف شده‌اند، موفقیت این زنجیره کاری تا حد زیادی به مراحل اولیه تخریب فیزیکی و مدیریت DNA بستگی دارد.
این پروتکل استفاده از سونیکاتور چندلوله‌ای VialTweeter را برای لیز سلول‌ها با فراصوت‌دهی و برش DNA توصیه می‌کند – هر دو مرحله برای تحلیل پپتیدها حیاتی هستند.

لیز فراصوتی سلول و بافت برای استخراج پروتئین

در روند کاری پروتئومیکس پایین‌به‌بالا، فراصوت‌دهی مرحله‌ای کلیدی در لیز نمونه‌های سلولی برای استخراج پروتئین‌ها به‌منظور تحلیل بعدی با طیف‌سنجی جرمی است. پس از افزودن بافر لیز سلولی SDS به رسوب سلولی، نمونه‌ها با سونیکاتور چندلوله‌ای VialTweeter تحت پردازش فراصوتی قرار می‌گیرند. در این پروتکل از لوله‌های میکروسانتریفیوژ 1٫5 mL استفاده می‌شود و مقرر شده است که سونیکاتور با توان 30%، به‌مدت 10 ثانیه روشن و 10 ثانیه خاموش کار کند و این الگو طی 3 چرخه تکرار شود. پس از 1 دقیقه انتظار، چرخه دو بار دیگر تکرار می‌شود. نمونه‌ها به‌طور پیوسته با یخ خنک می‌شوند.
این فرایند نه‌تنها به تخریب سلول‌ها کمک می‌کند، بلکه به‌طور مشخص برای برش DNA ژنومی آزادشده در حین لیز ضروری است. برش مؤثر DNA برای کاهش گرانروی نمونه و جلوگیری از گرفتگی ستون‌های S-Trap™ حیاتی است و در نتیجه، بازیابی بهینه پروتئین و هضم قابل‌اعتماد پپتیدها در مراحل بعدی را تضمین می‌کند.

نقش حیاتی برش فراصوتی DNA

یکی از رایج‌ترین مشکلات در روندهای کاری مبتنی بر S-Trap™، گرفتگی ستون است که تقریباً به‌طور انحصاری ناشی از DNA ژنومی با وزن مولکولی بالا است که در حین همگن‌سازی سلول یا بافت آزاد می‌شود. DNA دست‌نخورده گرانروی نمونه را به‌شدت افزایش می‌دهد، پپتیدها را به دام می‌اندازد و بستر جاذب ریزمتخلخل S-Trap™ را مسدود می‌کند.
پردازش فراصوتی با قطعه‌قطعه‌کردن مکانیکی DNA به قطعات کوچک و محلول، این مشکل را برطرف می‌کند. VialTweeter با اعمال انرژی صوتی کنترل‌شده، اسیدهای نوکلئیک را به‌طور مؤثر برش می‌دهد، بدون آنکه گرمای بیش‌ازحد تولید کند یا آلاینده‌های خارجی وارد نمونه کند. این کاهش گرانروی، بارگذاری روان نمونه، دبی یکنواخت عبور از ستون و تداوم بی‌وقفه سینتیک هضم را تضمین می‌کند.

پارامترهای بهینه فراصوت‌دهی با VialTweeter

این پروتکل برنامه‌ای با تکرارپذیری بالای فراصوت‌دهی تعیین می‌کند که برای حفظ یکپارچگی نمونه زیستی و سازگاری با MS در مراحل بعدی بهینه شده است. برای نمونه در لوله‌های میکروسانتریفیوژ 1٫5mL، هنگام استفاده از سونیکاتور بلوکی بدون تماس Hielscher VialTweeter، پارامترهای زیر ضمن حفظ ساختار پروتئین، لیز و برش بهینه DNA را فراهم می‌کنند:

• دامنه: توان 30%
• الگوی چرخه: 10 ثانیه روشن / 10 ثانیه خاموش
• مدت: 3 چرخه (10sec روشن/10sec خاموش) → استراحت 1 دقیقه‌ای روی یخ → تکرار 2 بار دیگر
• مدیریت دما: نمونه‌ها هنگام پردازش روی یخ قرار می‌گیرند تا از دناتوراسیون حرارتی و فعالیت زودهنگام آنزیمی جلوگیری شود

این روش فراصوت‌دهی پالسی از گرم‌شدن بیش‌ازحد موضعی جلوگیری می‌کند، اکسیداسیون پپتیدها را به حداقل می‌رساند و قرارگیری یکنواخت همه ویال‌ها در معرض امواج صوتی را تضمین می‌کند. آرایش لوله‌بسته همچنین نیاز به تمیزکردن پروب بین نمونه‌ها را حذف می‌کند و زمان کار مستقیم اپراتور و تغییرپذیری ناشی از اپراتور را به‌شدت کاهش می‌دهد.

مزایای کلیدی برای روندهای کاری نوین پروتئومیکس

گنجاندن VialTweeter در زنجیره کاری پروتئومیکس پایین‌به‌بالای شما چندین مزیت عملیاتی و علمی دارد:

1. قطعه‌قطعه‌سازی یکنواخت DNA: انتقال یکنواخت انرژی صوتی به همه ویال‌ها، کاهش تکرارپذیر گرانروی را تضمین می‌کند و از تغییرپذیری بین دسته‌های نمونه در بارگذاری S-Trap™ جلوگیری می‌کند.
2. حفظ تغییرات ناپایدار: پردازش در دمای پایین در حمام یخ از تغییرات پساترجمه‌ای (PTMs) محافظت می‌کند و از تجمع پروتئین ناشی از گرما در حین لیز سلولی جلوگیری می‌کند.
3. تسهیل پردازش در مراحل بعدی: لیزات‌های پردازش‌شده با VialTweeter را می‌توان مستقیماً با سانتریفیوژ شفاف‌سازی و بدون مراحل اضافی پاک‌سازی، اندازه‌گیری کمّی کرد؛ این امر مسیر رسیدن به هضم با S-Trap™ را تسریع می‌کند.
4. مقیاس‌پذیری و انعطاف‌پذیری: تنظیمات یکسان فراصوت‌دهی هم برای نمونه‌های بافتی بسیار پیچیده و هم برای سوسپانسیون‌های سلولی قابل‌استفاده است و از روندهای کاری پروتئومیکس اکتشافی، اندازه‌گیری کمّی هدفمند و گلیکوپروتئومیکس پشتیبانی می‌کند. سونیکاتورهای میکروپلیت Hielscher افزایش آسان مقیاس به تعداد زیادی نمونه در پلیت‌های چندچاهکی را امکان‌پذیر می‌کنند.

منابع علمی / مراجع

• FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
• FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• Wojtkiewicz M., Berg Luecke L., Kelly M.I., Gundry R.L. (2021): Facile Preparation of Peptides for Mass Spectrometry Analysis in Bottom-Up Proteomics Workflows. Current Protocols 2021 Mar;1(3):e85.
• Lori C., Kaczmarczyk A., de Jong I., Jenal U. (2018): A single-domain response regulator functions as an integrating hub to coordinate general stress response and development in alphaproteobacteria. mBio Vol 9, No 3; 2018.
• Jorge S., Pereira K., López-Fernández H., LaFramboise W., Dhir R., Fernández-Lodeiro J., Lodeiro C., Santos H.M., Capelo-Martínez J.L. (2020): Ultrasonic-assisted extraction and digestion of proteins from solid biopsies followed by peptide sequential extraction hyphenated to MALDI-based profiling holds the promise of distinguishing renal oncocytoma from chromophobe renal cell carcinoma. Talanta, 2020.