پروتکل پروتئومیکس: فراصوت غیر تماسی آماده سازی نمونه پپتیدی برای ام اس را افزایش می دهد
پروتئومیکس پایین به بالا به سنگ بنای کشف نشانگرهای زیستی مدرن، زیست شناسی ساختاری و تشخیص بالینی تبدیل شده است. با هضم پروتئین ها به پپتیدها قبل از تجزیه و تحلیل طیف سنجی جرمی (MS)، محققان می توانند به پوشش توالی عمیق تر و کمی سازی مطمئن تر دست یابند. با این حال، آمادهسازی نمونههای بیولوژیکی با پیچیدگی بالا برای MS از نظر فنی نیاز دارد. پیشرفتهای روششناختی اخیر چگونگی کنترل پردازش اولتراسونیک را نشان میدهد – به طور خاص با دستگاه صوتی بدون تماس VialTweeter Multi-Tube و دستگاه صوتی UIP400MTP Microplate – می تواند این گردش کار را به طور قابل توجهی ساده کند، تکرارپذیری را بهبود بخشد و از تنگناهای رایج ابزار جلوگیری کند.
یک پروتکل آماده سازی نمونه دقیق برای به دست آوردن پپتیدهایی با اندازه مناسب برای تجزیه و تحلیل توسط MS پیدا کنید.
چه کسی باید از فراصوت غیر تماسی برای آماده سازی نمونه پپتید استفاده کند؟
- پروتئومیکس پایین به بالا & آزمایشگاه های کشف: محققان نمونههای با پیچیدگی بالا را برای گردشهای کاری LC-MS یا MALDI آماده میکنند که نیاز به بازیابی مداوم پپتید با بازده بالا در ماتریسهای بیولوژیکی متنوع دارند.
- S-Trap™ & کاربران به دام انداختن تعلیق: تیم هایی متکی به پاکسازی ریز ستون که برای جلوگیری از گرفتگی ستون و اطمینان از بارگیری و هضم صاف نمونه نیاز به برش کنترل شده DNA دارند.
- بالینی & گروه های پژوهشی ترجمه: آزمایشگاههایی که بافت، سلولها، پلاسما، سرم یا مایع مغزی نخاعی را پردازش میکنند، جایی که تکرارپذیری دسته به دسته و یکپارچگی نمونه حیاتی است.
- کمی & تیم های هدف MS: آزمایشگاههایی که مطالعات مقایسهای دقیقی انجام میدهند که در آن دستگاههای کاوشگر قابل استفاده مجدد، خطرات آلودگی متقابل را معرفی میکنند که میتواند کمیت پپتید با فراوانی کم را به خطر بیندازد.
- تسهیلات اصلی & عملیات پرتوان: گروههایی که چندین نمونه زیستی را به طور همزمان پردازش میکنند و از سونیکاسیون با بلوک چندلولهای و درپوشدار VialTweeter بهره میبرند که نیاز به تمیز کردن پروب را از بین میبرد، زمان کار را کاهش میدهد و شرایط استریل را حفظ میکند.
- PTM & محققان پروتئینهای ساختاری: محققانی که به پردازش ملایم و کنترل شده دما نیاز دارند تا تغییرات ناپایدار را حفظ کنند و پوشش توالی را در طول لیز سلولی و هموژنیزاسیون به حداکثر برسانند.
چند نمونه سونیکاتور “VialTweeter(ویال گروهی)” برای آمادهسازی نمونه بدون تماس چندین ویال مهر و مومشده برای پروتئومیکس
مروری بر پروتکل: از بافت و سلولها تا پپتیدهای آماده برای MS
گردش کار پروتئومیکس از پایین به بالا که به طور گسترده توسط Wojtkiewicz و همکاران مشخص شده است. یک روش قوی و مقیاس پذیر برای تهیه نمونه های پپتید از ماتریس های بیولوژیکی متنوع ارائه می دهد. این پروتکل با شروع 50 تا 100 میلیگرم بافت منجمد فلاش یا 1 تا 20 میلیون سلول، فناوری تلهگیری تعلیق (S-Trap™) را برای حذف مؤثر مواد شوینده، نمکها و آلایندهها قبل از هضم آنزیمی ادغام میکند.
پس از لیز، تعیین کمیت پروتئین، احیا و آلکیلاسیون، نمونه اسیدی شده و بر روی یک ستون اسپین S-Trap که در آن هضم تریپسین/lysC رخ میدهد، بارگذاری میشود. پپتیدهای حاصل شسته، خشک شده و تحت آنالیز LC-MS قرار می گیرند. هنگامی که این جریان کار روی 50 میلی گرم از بافت قلب انسان اعمال می شود، به طور مداوم پپتیدهای کافی برای 30 تا 40 تزریق تولید می کند و بیش از 4000 پروتئین منحصر به فرد را در هر اجرا شناسایی می کند. در حالی که شیمی و پاکسازی مبتنی بر ستون به خوبی تعریف شده است، موفقیت خط لوله به شدت به اختلالات فیزیکی اولیه و مراحل مدیریت DNA بستگی دارد.
این پروتکل استفاده از VialTweeter Multi-Tube Sonicator را برای سونیکاسیون لیز سلول ها و برش DNA توصیه می کند. – هر دو مرحله برای تجزیه و تحلیل پپتید حیاتی هستند.
ویال تویتر لولههای Eppendorf با حجم 1.0، 1.5 و 2.0 میلیلیتر و همچنین ویالهای مختلف NUNC را سونیکه میکند
لایز سلولی و بافتی با اولتراسونیک برای استخراج پروتئین
در جریان کاری پروتئومیکس پایین به بالا، سونیکیشن یک گام کلیدی در لیز نمونههای سلولی برای استخراج پروتئینها جهت آنالیز طیفسنجی جرمی است. پس از افزودن بافر لیز سلولی SDS به پلت سلولی، نمونهها تحت پردازش اولتراسونیک با استفاده از سونیکاتور چند لولهای VialTweeter قرار میگیرند. این پروتکل از لولههای میکروفیوژ 1.5 میلیلیتری استفاده میکند و مشخص میکند که سونیکاتور باید با توان 30٪ برای 10 ثانیه روشن و 10 ثانیه خاموش اجرا شود و این چرخه 3 بار تکرار شود. پس از انتظار یک دقیقه، چرخه دوباره دو بار دیگر تکرار میشود. نمونهها به طور مداوم با یخ خنک میشوند.
این فرآیند نه تنها به از هم گسیختگی سلول ها کمک می کند، بلکه به طور خاص برای برش DNA ژنومی آزاد شده در طول لیز ضروری است. برش موثر DNA برای کاهش ویسکوزیته نمونه و جلوگیری از گرفتگی ستون های S-Trap بسیار مهم است، در نتیجه بازیابی پروتئین بهینه و هضم پپتید پایین دست قابل اطمینان را تضمین می کند.
نقش حیاتی برش DNA اولتراسونیک
یکی از متداولترین خرابیها در جریانهای کاری مبتنی بر S-Trap، گرفتگی ستون است که تقریباً به طور انحصاری ناشی از DNA ژنومی با وزن مولکولی بالا است که در طول همگنسازی سلول یا بافت آزاد میشود. DNA دست نخورده به طور چشمگیری ویسکوزیته نمونه را افزایش می دهد، پپتیدها را به دام می اندازد و بستر جاذب S-Trap™ میکرو متخلخل را مسدود می کند.
پردازش اولتراسونیک این مشکل را با قطعه قطعه کردن مکانیکی DNA به قطعات کوچک و محلول حل می کند. با استفاده از انرژی صوتی کنترل شده، VialTweeter به طور موثر اسیدهای نوکلئیک را بدون ایجاد گرمای بیش از حد یا وارد کردن آلاینده های خارجی برش می دهد. این کاهش ویسکوزیته بارگیری صاف نمونه، سرعت جریان ثابت و سینتیک هضم بدون وقفه را تضمین می کند.
پارامترهای فراصوت VialTweeter بهینه شده است
این پروتکل یک رژیم فراصوت بسیار تکرارپذیر را مشخص می کند که برای یکپارچگی نمونه بیولوژیکی و سازگاری پایین دستی MS بهینه شده است. برای نمونه در لولههای میکروسانتریفیوژ 1.5 میلیلیتری با استفاده از دستگاه سونیکاتور بلوک غیر تماسی Hielscher VialTweeter، پارامترهای زیر لیز و برش DNA بهینه را با حفظ ساختار پروتئین ارائه میکنند:
- دامنه: 30% قدرت
- الگوی چرخه: 10 ثانیه روشن / 10 ثانیه خاموش
- مدت زمان: 3 چرخه (10 ثانیه روشن / 10 ثانیه خاموش) → 1 دقیقه استراحت روی یخ → تکرار 2 بار دیگر
- مدیریت دما: نمونه ها در طول پردازش روی یخ قرار می گیرند تا از دناتوره شدن حرارتی و فعالیت آنزیمی زودرس جلوگیری شود.
این روش سونیکاسیون پالسی از گرمای بیش از حد موضعی جلوگیری می کند، اکسیداسیون پپتید را به حداقل می رساند و قرار گرفتن در معرض صوتی یکنواخت را در تمام ویال ها تضمین می کند. راهاندازی لوله بسته نیز نیاز به تمیز کردن پروب بین نمونهها را از بین میبرد و زمان عمل و تنوع اپراتور را به شدت کاهش میدهد.
مزایای کلیدی برای جریانهای کاری پروتئومیکس مدرن
ادغام VialTweeter در خط پروتئومیکس پایینبهبالای شما چندین مزیت عملی و علمی ارائه میدهد:
- تجزیه DNA یکنواخت: تحویل یکنواخت انرژی صوتی به همه ویالها باعث کاهش ویسکوزیته قابل بازتولید و جلوگیری از تغییر بین بچها در بارگیری S-Trap™ میشود.
- حفظ تغییرات حساس: فرآیند در دمای پایین در حمام یخ از تغییرات پس از ترجمه پروتئینها (PTMs) محافظت کرده و از تجمع پروتئین ناشی از حرارت در طول لیز سلولی جلوگیری میکند.
- سهولت در پردازشهای بعدی: لیزاتهای پردازش شده با VialTweeter میتوانند مستقیماً با سانتریفیوژ شفاف شده و بدون مراحل پاکسازی اضافی سنجیده شوند که مسیر به هضم S-Trap™ را سریعتر میکند.
- مقیاس پذیری & انعطاف: همان تنظیمات سونیکاسیون برای نمونههای بافتی با پیچیدگی بالا و سوسپانسیونهای سلولی اعمال میشود و از شناسایی پروتئومیک، کمیسازی هدفمند و جریانهای کاری گلیکوپروتئومیک پشتیبانی میکند. سونیکاتورهای میکروپلیت Hielscher امکان افزایش آسان مقیاس به تعداد نمونههای زیاد در چاهکهای چندگانه را فراهم میکنند.
سونیکاتور غیرتماسی چندلولهای VialTweeter میتواند در کابینتهای یخچالی کار کند.
سونیکاتورها برای آمادهسازی نمونه پروتئومیک
آمادهسازی نمونههای پپتیدی با کیفیت بالا برای اسپکترومتری جرمی بیش از یک لیسهای کارآمد نیاز دارد. – نیاز به کنترل دقیق برش DNA، دما و پیشگیری از آلودگی دارد. با گنجاندن Hielscher VialTweeter در گردش کار پروتئومیکس از پایین به بالا، می توانید گرفتگی S-Trap™ را از بین ببرید، از بازیابی پروتئین قابل تکرار اطمینان حاصل کنید و تمیزی لازم برای آنالیزهای حساس MS را حفظ کنید. چه در حال پردازش بافت انسانی، سلولهای کشتشده یا لیزات پیچیده باشید، پردازش بلوک اولتراسونیک قابلیت اطمینان، مقیاسپذیری و کنترل فرآیندی را که آزمایشگاههای پروتئومیکس مدرن میخواهند ارائه میکند.
برای افزایش تعداد نمونههای بالاتر، از مدلهای سونیکاتور میکروپلیتی بدون تماس Hielscher متمرکز و بدون تماس با مدلهای UIP400MTP و UIP550MTP استفاده کنید! هر صفحه استاندارد چند چاهی را برای پروتئومیک با توان بالا پردازش کنید!
پردازش با لوله بسته در مقابل سونیکاتورهای سنتی پروب
بهطور تاریخی، محققان برای خرد کردن DNA به سونیکاتورهای پروب با تماس مستقیم تکیه کردهاند. در حالی که این سیستمها مؤثر هستند، سونیکاتورهای پروب محدودیتهای مهمی را در جریانهای کاری پروتئومیکس ایجاد میکنند:
- ریسک آلودگی متقاطع: استفاده دوباره از یک پروب برای نمونههای مختلف باعث انتقال آئروسل و وارد شدن آلایندههای متقاطع میشود که نتایج کمیسازی شده طیفسنجی جرمی را تغییر میدهد.
- از دست رفتن نمونه: قرار دادن مستقیم میتواند باعث پاشیدن، تبخیر و چسبیدن پپتیدهای ارزشمند به سطح پروب شود.
- پاکسازی: آلودگیزدایی کامل پروب بین اجراها زمانبر و اغلب ناقص است و مطالعات پروتئین با فراوانی کم را به خطر میاندازد.
دستگاه سونیکاتور بلوک VialTweeter نمونه ها را به طور کامل در لوله های میکروسانتریفیوژ مهر و موم شده پردازش می کند. این طراحی سیستم بسته تماس پروب با نمونه را حذف می کند، از تولید آئروسل جلوگیری می کند و شرایط آسپتیک سخت را در سراسر همگن سازی و لیز حفظ می کند. برای آزمایشگاههایی که لیزهای بافتی با پیچیدگی بالا یا ردههای سلولی متعدد را پردازش میکنند، این به دادههای MS تمیزتر، بازیابی پپتید بالاتر و تکرارهای بیولوژیکی قابل اعتمادتر ترجمه میشود.
افزایش مقیاس تا آماده سازی نمونه با توان بالا در صفحات چند چاهی
با Microplate Sonicator مدل های UIP400MTP و UIP550MTP، پردازش لوله را می توان به راحتی برای پردازش نمونه با توان بالا در هر صفحه استاندارد چند چاهی مقیاس کرد.
چند چاه صفحه ماسونیکاتور UIP400MTP برای استخراج پروتئین با بازده بالا از نمونه ها
سوالات متداول در مورد فراصوت برای آماده سازی نمونه پپتید
چرا قبل از پردازش پپتید S-Trap سونیکاسیون لازم است؟
فراصوت برای برش DNA ژنومی با وزن مولکولی بالا آزاد شده در طول لیز سلولی یا بافتی ضروری است. DNA دست نخورده ویسکوزیته نمونه را به شدت افزایش می دهد، که می تواند ریزستون S-Trap™ را مسدود کند و پپتیدها را به دام بیندازد و به شدت بازیابی و سازگاری MS را کاهش دهد.
چگونه دستگاه سونیکاتور بلوکی VialTweeter آماده سازی نمونه را در مقایسه با دستگاه های سونیکاتور پروب سنتی بهبود می بخشد؟
برخلاف سونیکاتورهای پروب با تماس مستقیم که نیاز به تمیزکاری دقیق بین هر بار استفاده دارند و خطر انتقال هوازی دارند، VialTweeter نمونهها را به طور کامل در قیفهای دربسته و لولههای میکروسنتریفیوژ پردازش میکند. این طراحی لوله بسته، آلودگی متقاطع را از بین میبرد، از دست رفتن نمونه جلوگیری میکند و شرایط استریل دقیق را در طول هموژنسازی و لیز سلولی حفظ میکند.
پارامترهای بهینه سونیکیشن برای آمادهسازی نمونههای پروتئومیک چیستند؟
برای نمونههای بیولوژیکی مانند سلولها و بافتها، پروتکل پیشنهادی از سونیکاتور VialTweeter با توان 30% و چرخه 10 ثانیه روشن / 10 ثانیه خاموش استفاده میکند که 3 بار تکرار میشود. نمونهها باید در طول پردازش روی یخ نگه داشته شوند و چرخه در صورتی که ≥5 میلیون سلول پردازش شود، دوباره دو بار دیگر تکرار شود. (مراجعه شود به Wojtkiewicz و همکاران، 2021)
اگر ستون S-Trap™ من هنگام بارگذاری نمونه مسدود شد، چه کاری باید انجام دهم؟
انسداد ستون معمولاً به دلیل ویسکوزیته بالای DNA یا تصفیه ناکافی ایجاد میشود. برای حل این مشکل، لیزات خود را قبل از پیپت زدن بهطور کامل سانتریفیوژ کنید و اطمینان حاصل کنید که DNA از طریق سونیکاسیون بهطور کافی شکسته شده است.
سونیکاسیون بدون تماس چه سودی برای جریانهای کاری پروتئومیکس کمی دارد؟
در مطالعات کمی، حتی آلودگی متقابل جزئی بین نمونهها میتواند اندازهگیریهای پپتید با فراوانی کم را منحرف کند. پردازش چندویال بسته و بدون وارد کردن پروب توسط VialTweeter، تضمین میکند که تولیدات از دستهای به دسته دیگر قابل تکرار باشد و تمامی نمونهها برای تحلیلهای مقایسهای دقیق سالم باقی بمانند.
از این پروتکل چه میزان بازده پروتئین و عمق طیفسنجی جرمی (MS) میتوان انتظار داشت؟
با شروع 50 میلی گرم از بافت قلب انسان یا 5 میلیون سلول، جریان کار S-Trap™ معمولاً پپتیدهای کافی برای 30 تا 50 تزریق LC-MS تولید می کند که به طور مداوم بیش از 4000 پروتئین منحصر به فرد را در هر اجرا شناسایی می کند. (ر.ک. Wojtkiewicz و همکاران، 2021)
ادبیات / منابع
- FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
- FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- Wojtkiewicz M., Berg Luecke L., Kelly M.I., Gundry R.L. (2021): Facile Preparation of Peptides for Mass Spectrometry Analysis in Bottom-Up Proteomics Workflows. Current Protocols 2021 Mar;1(3):e85.
- Lori C., Kaczmarczyk A., de Jong I., Jenal U. (2018): A single-domain response regulator functions as an integrating hub to coordinate general stress response and development in alphaproteobacteria. mBio Vol 9, No 3; 2018.
- Jorge S., Pereira K., López-Fernández H., LaFramboise W., Dhir R., Fernández-Lodeiro J., Lodeiro C., Santos H.M., Capelo-Martínez J.L. (2020): Ultrasonic-assisted extraction and digestion of proteins from solid biopsies followed by peptide sequential extraction hyphenated to MALDI-based profiling holds the promise of distinguishing renal oncocytoma from chromophobe renal cell carcinoma. Talanta, 2020.
Hielscher Ultrasonics دستگاه های سونیکاتور غیر تماسی قدرتمندی را برای آماده سازی نمونه و آنالیز بالینی فراهم می کند. دستگاه سونیکاتور صفحه چند چاهی UIP400MTP، VialTweeter، CupHorn و دستگاه سونیکاتور جریان GDmini2 نمونه ها را بدون دست زدن به آنها پردازش می کنند.