پروتکل آزمون MBEC با استفاده از سونیکاتور پلیت 96 خانه‌ای UIP400MTP
آزمون MBEC برای تعیین غلظت عوامل ضدمیکروبی لازم برای حذف زیست‌لایه‌های تشکیل‌شده روی درپوش‌های میخک‌دار به کار می‌رود. برای ارزیابی زنده‌مانی زیست‌لایه، ابتدا باید زیست‌لایه‌ها را از درپوش‌های میخک‌دار پلیت 96 خانه‌ای جدا کرد. فراصوت‌دهی مطمئن‌ترین و کارآمدترین روش برای این جداسازی است. سونیکاتور پلیت چندخانه‌ای UIP400MTP به‌طور ویژه برای پردازش پلیت‌های آزمون با حداکثر کارایی و سهولت طراحی شده است و انجام آزمون‌های MBEC با ظرفیت پردازش بالا را ساده‌تر و سریع‌تر می‌کند.
فراصوت‌دهی برای جداسازی زیست‌لایه
فراصوت‌دهی مرحله‌ای حیاتی در آزمون‌های حداقل غلظت ریشه‌کن‌کنندهٔ زیست‌لایه (MBEC) است که جداسازی مؤثر سلول‌های زیست‌لایه از سطح اتصالشان را امکان‌پذیر می‌کند. زیست‌لایه‌ها ذاتاً اجتماعات ساختاریافته‌ای از میکروارگانیسم‌ها هستند که در یک ماتریکس خارج‌سلولی محصور شده‌اند؛ این ویژگی آن‌ها را در مقایسه با سلول‌های پلانکتونیک به‌مراتب مقاوم‌تر به عوامل ضدمیکروبی می‌کند. در آزمون‌های MBEC، فراصوت‌دهی با استفاده از امواج فراصوت، کاویتاسیون کنترل‌شده ایجاد می‌کند و با تخریب ماتریکس زیست‌لایه، سلول‌های محصور در آن را در یک سوسپانسیون آزاد می‌سازد. این مرحله توزیع یکنواخت سلول‌های زیست‌لایه در محیط بازیابی را تضمین می‌کند و ارزیابی دقیق زنده‌مانی را از طریق کشت روی پلیت، رقیق‌سازی یا روش‌های اسپکتروفتومتری تسهیل می‌کند. بدون جداسازی مناسب زیست‌لایه، اجزای باقی‌ماندهٔ ماتریکس ممکن است از سلول‌ها محافظت کنند و باعث شوند اثربخشی ضدمیکروبی کمتر از مقدار واقعی برآورد شود. بنابراین، فراصوت‌دهی برای دستیابی به مقادیر مطمئن و تکرارپذیر MBEC که توان واقعی عوامل آزمایش‌شده در ریشه‌کنی را نشان می‌دهند، ضروری است. سونیکاتور پلیت چندخانه‌ای UIP400MTP آماده‌سازی آسان نمونه‌ها با ظرفیت پردازش بالا را در پلیت‌های آزمون امکان‌پذیر می‌کند.
سونیکاتور پلیت چندخانه‌ای UIP400MTP آماده‌سازی نمونه‌ها با ظرفیت پردازش بالا را در پلیت‌های آزمون تسهیل می‌کند.
پروتکل آزمون حداقل غلظت ریشه‌کن‌کنندهٔ زیست‌لایه (MBEC)
مرحلهٔ 1: تشکیل زیست‌لایه
- سوسپانسیون باکتریایی را آماده کنید:
باکتری‌ها را در محیط کشت مناسب تا رسیدن به فاز رشد لگاریتمی پرورش دهید.
کشت باکتریایی را تا رسیدن به چگالی نوری مشخص رقیق کنید (برای مثال، OD600 ~0٫1). - پلیت 96 خانه‌ای را تلقیح کنید:
سوسپانسیون باکتریایی (برای مثال، 150–200 µL) را به هر خانهٔ یک پلیت میکروتیتر استاندارد 96 خانه‌ای اضافه کنید. - درپوش میخک‌دار را نصب کنید:
درپوش میخک‌دار را روی پلیت تلقیح‌شده قرار دهید تا زیست‌لایه روی سطوح میخک‌ها تشکیل شود. - پلیت را انکوبه کنید:
مجموعه را در دمای مناسب (برای مثال، 37°C) به‌مدت 24–48 ساعت بدون تکان‌دادن انکوبه کنید تا رشد زیست‌لایه تقویت شود.
مرحلهٔ 2: تیمار با عوامل ضدمیکروبی
- محلول‌های ضدمیکروبی را آماده کنید:
طیفی از غلظت‌های عامل ضدمیکروبی را در محیط کشت تازه آماده کنید.
زیست‌لایه‌ها را در معرض عوامل ضدمیکروبی قرار دهید:
درپوش میخک‌دار را از کشت باکتریایی بردارید و برای حذف سلول‌های پلانکتونیک، آن را در محلول نمکی استریل یا PBS آبکشی کنید.
درپوش میخک‌دار را در یک پلیت 96 خانه‌ای جدید حاوی محلول‌های ضدمیکروبی قرار دهید. - پلیت را انکوبه کنید:
برای فراهم‌شدن زمان مواجهه با عامل ضدمیکروبی، به‌مدت مشخص (برای مثال، 24 ساعت) انکوبه کنید.
سونیکاتور پلیت چندخانه‌ای UIP400MTP برای آماده‌سازی نمونه‌ها با ظرفیت پردازش بالا
مرحلهٔ 3: فراصوت‌دهی با سونیکاتور پلیت 96 خانه‌ای UIP400MTP
مرحلهٔ فراصوت‌دهی برای جداسازی زیست‌لایه‌ها از درپوش‌های میخک‌دار به‌منظور ارزیابی زنده‌مانی حیاتی است. برای سونیکاتور UIP400MTP این مراحل را دنبال کنید:
- مجموعه را آماده کنید:
هر خانهٔ یک پلیت 96 خانه‌ای جدید را با محیط بازیابی (برای مثال، براث خنثی‌کننده یا محیط رشد تازه) پر کنید. - درپوش میخک‌دار را منتقل کنید:
درپوش میخک‌دار را از پلیت تیمار ضدمیکروبی بردارید.
برای حذف عوامل ضدمیکروبی باقی‌مانده، درپوش میخک‌دار را در محلول نمکی استریل یا PBS آبکشی کنید. - پلیت و سونیکاتور را در جای مناسب قرار دهید:
درپوش میخک‌دار را روی پلیت حاوی محیط بازیابی نصب کنید.
پلیت حاوی محیط بازیابی را روی سکوی سونیکاتور UIP400MTP قرار دهید و مطمئن شوید که پلیت در مرکز قرار گرفته و ثابت است. - پارامترهای فراصوت‌دهی را تنظیم کنید:
پارامترهای فراصوت‌دهی را در UIP400MTP تنظیم کنید (تنظیمات را می‌توان متناسب با زیست‌لایه تغییر داد):
دامنه: 70–100%.
زمان فراصوت‌دهی: 1–3 دقیقه (متناسب با استحکام زیست‌لایه تنظیم کنید) در حالت چرخه‌ای. - فراصوت‌دهی کنید:
فرایند فراصوت‌دهی را آغاز کنید. ارتعاش فراصوتی زیست‌لایه‌ها را از سطوح میخک‌ها جدا کرده و وارد محیط بازیابی می‌کند. - فرایند را پایش کنید:
برای پایش دمای نمونه در خانه‌ها، از حسگر دمای قابل اتصال استفاده کنید. UIP400MTP را می‌توان برای خنک‌کاری به یک چیلر آزمایشگاهی متصل کرد. - اقدامات پس از فراصوت‌دهی:
محیط بازیابی را که اکنون حاوی زیست‌لایه‌های جداشده است، بلافاصله برای تحلیل‌های بعدی به یک پلیت استریل جدید منتقل کنید.
(A) پلیت حاوی TSB با 2% گلوکز که برای تشکیل زیست‌لایه، بازیابی سلول‌ها و
تعیین MIC و MBCB استفاده می‌شود؛ (B) درپوش دارای پین برای تشکیل زیست‌لایه‌های استافیلوکوکی. تعیین MIC و MBCB؛ (B) درپوش دارای پین برای تشکیل زیست‌لایه‌های استافیلوکوکی.
سلول‌های زیست‌لایهٔ تشکیل‌شده روی پین‌ها با فراصوت‌دهی (Hielscher Ultrasound Technology) به‌مدت 5 min در پلیت‌های 96 خانه‌ای حاوی محیط کشت تازه برای بازیابی سلول‌ها جدا شدند.
(تصویر و مطالعه: ©de Oliveira et al., 2016)
مرحلهٔ 4: ارزیابی زنده‌مانی
زیست‌لایه‌های جداشده را روی پلیت کشت دهید و پرورش دهید:
- از محیط بازیابی رقت‌های متوالی تهیه کنید و برای شمارش واحدهای تشکیل‌دهندهٔ کلنی (CFU)، آن‌ها را روی آگار کشت دهید.
به‌عنوان روش جایگزین، از آزمون زنده‌مانی رنگ‌سنجی یا مبتنی بر فلورسانس استفاده کنید. - نتایج را ثبت کنید:
MBEC را به‌عنوان کمترین غلظت عامل ضدمیکروبی تعیین کنید که زنده‌مانی قابل‌تشخیص زیست‌لایه را از بین برده است.
طراحی، ساخت و مشاوره – کیفیت ساخت آلمان
دستگاه‌های فراصوت Hielscher به بالاترین استانداردهای کیفیت و طراحی شهرت دارند. استحکام و کاربری آسان، ادغام بی‌دردسر دستگاه‌های فراصوت ما را در تأسیسات صنعتی امکان‌پذیر می‌کند. سونیکاتورهای Hielscher به‌آسانی از عهدهٔ شرایط سخت و محیط‌های دشوار برمی‌آیند.
Hielscher Ultrasonics شرکتی دارای گواهینامهٔ ISO است و بر دستگاه‌های فراصوت با عملکرد بالا، مجهز به فناوری روز و برخوردار از کاربری آسان، تأکید ویژه‌ای دارد. البته دستگاه‌های فراصوت Hielscher با CE انطباق دارند و الزامات UL، CSA و RoHs را برآورده می‌کنند.
آماده‌سازی نمونه را در پلیت‌های 96 خانه‌ای و پلیت‌های آزمون ساده‌تر کنید با استفاده از سونیکاتور پلیت چندخانه‌ای UIP400MTP
منابع علمی / مراجع
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
- Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
- Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
- Microplate Sonicator Validated in Peer-Reviewed Proteomics Study
پرسش‌های متداول
آزمون MBEC چیست؟
آزمون حداقل غلظت ریشه‌کن‌کنندهٔ زیست‌لایه (MBEC) روشی استانداردشده برای تعیین کمترین غلظت عامل ضدمیکروبی موردنیاز برای ریشه‌کنی باکتری‌های مرتبط با زیست‌لایه است. این آزمون شامل رشد زیست‌لایه‌ها روی سطوح ویژه، قرار دادن آن‌ها در معرض غلظت‌های مختلف عامل ضدمیکروبی و ارزیابی زنده‌مانی سلول‌های جداشده پس از تخریب زیست‌لایه، معمولاً از طریق فراصوت‌دهی، برای سنجش اثربخشی تیمار است.
تفاوت MBIC و MBEC چیست؟
حداقل غلظت مهارکنندهٔ زیست‌لایه (MBIC) کمترین غلظت عامل ضدمیکروبی موردنیاز برای جلوگیری از تشکیل زیست‌لایه است، درحالی‌که حداقل غلظت ریشه‌کن‌کنندهٔ زیست‌لایه (MBEC) کمترین غلظت لازم برای ریشه‌کنی یک زیست‌لایهٔ تشکیل‌شده است. MBIC بر پیشگیری از تشکیل زیست‌لایه تمرکز دارد، درحالی‌که MBEC اثربخشی تیمار را در برابر زیست‌لایه‌های بالغ ارزیابی می‌کند.
معمولاً از چه پلیت‌هایی برای آزمون‌های MBEC استفاده می‌شود؟
پلیت‌های میکروتیتر رایج برای آزمون‌های MBEC معمولاً پلیت‌های 96 خانه‌ای ساخته‌شده از پلی‌استایرن یا پلی‌پروپیلن هستند. این مواد سطح مناسبی برای تشکیل زیست‌لایه فراهم می‌کنند و در برابر عوامل ضدمیکروبی آزمایش‌شده در طول آزمون، مقاومت شیمیایی دارند. پلیت‌های پلی‌استایرنی به‌دلیل شفافیت نوری خود به‌طور گسترده ترجیح داده می‌شوند؛ این ویژگی برای تحلیل‌های بعدی مانند اندازه‌گیری‌های اسپکتروفتومتری یا مبتنی بر فلورسانس مزیت دارد. طراحی این پلیت‌ها شامل درپوش‌های میخک‌دار جداشدنی است که برای آزمون ضروری‌اند، زیرا زیست‌لایه‌ها روی میخک‌هایی تشکیل می‌شوند که در خانه‌های حاوی محیط رشد غوطه‌ور هستند. پلیت‌های استانداردشده، مانند پلیت‌های منطبق با پروتکل آزمون MBEC، به‌طور ویژه مهندسی شده‌اند تا تکرارپذیری و سازگاری با سونیکاتور UIP400MTP یا دیگر تجهیزات پردازش تضمین شود.
پلیت‌های دارای درپوش PEG چیستند؟
پلیت‌های دارای درپوش PEG سامانه‌های تخصصی پلیت چندخانه‌ای هستند که درپوش آن‌ها به میخک‌ها یا پین‌های کوچک پلی‌اتیلن گلیکول (PEG) مجهز است که به داخل هر خانه امتداد می‌یابند. این میخک‌ها سطحی برای تشکیل زیست‌لایهٔ میکروبی در شرایط کنترل‌شده فراهم می‌کنند و رشد زیست‌لایه در شرایط واقعی را شبیه‌سازی می‌کنند. این طراحی امکان رشد زیست‌لایه‌ها روی میخک‌ها را درحالی‌که خانه‌ها حاوی محیط رشد یا عوامل ضدمیکروبی هستند فراهم می‌کند و آزمودن حساسیت زیست‌لایه به تیمارها با ظرفیت پردازش بالا، مانند آزمون‌های MBEC و MBIC، را امکان‌پذیر می‌سازد.
Hielscher Ultrasonics هموژنایزرهای فراصوتی با عملکرد بالا را در اندازه‌های آزمایشگاهی تا صنعتی تولید می‌کند.