پروتکل سنجش MBEC با استفاده از UIP400MTP Plate Sonicator 96 چاهکی
روش MBEC برای تعیین غلظت عوامل ضد میکروبی مورد نیاز برای از بین بردن بیوفیلم های تشکیل شده بر روی درب های peg استفاده می شود. برای ارزیابی زنده ماندن بیوفیلم، بیوفیلم ها ابتدا باید از درب گیره یک صفحه 96 چاهی جدا شوند. فراصوت مطمئن ترین و کارآمدترین روش برای این جدایی است. UIP400MTP فراصوت صفحه چند چاه به طور خاص برای پردازش صفحات سنجش با حداکثر کارایی و راحتی، ساده سازی و تسریع سنجش MBEC با توان بالا طراحی شده است.
فراصوت برای جداشدگی بیوفیلم
فراصوت یک گام مهم در سنجش حداقل غلظت ریشه کنی بیوفیلم (MBEC) است که امکان جابجایی موثر سلول های بیوفیلم از اتصال سطحی آنها را فراهم می کند. بیوفیلم ها ذاتا جوامعی از میکروارگانیسم ها هستند که در یک ماتریکس خارج سلولی محصور شده اند، که آنها را در مقایسه با سلول های پلانکتونیک به طور قابل توجهی در برابر عوامل ضد میکروبی مقاوم تر می کند. در طول سنجش MBEC، فراصوت با استفاده از امواج مافوق صوت برای تولید حفره کنترل شده، مختل کردن ماتریس بیوفیلم و آزاد کردن سلول های تعبیه شده به یک تعلیق. این مرحله تضمین می کند که سلول های بیوفیلم به طور مساوی در محیط بازیابی پراکنده می شوند و ارزیابی دقیق زنده ماندن را از طریق روش های آبکاری، رقت یا اسپکتروفتومتری تسهیل می کنند. بدون جداشدگی مناسب بیوفیلم، اجزای ماتریکس باقیمانده می توانند از سلول ها محافظت کنند که منجر به دست کم گرفتن اثربخشی ضد میکروبی می شود. از این رو، فراصوت برای به دست آوردن مقادیر MBEC قابل اعتماد و تکرارپذیر ضروری است، منعکس کننده پتانسیل ریشه کنی واقعی از عوامل آزمایش شده. UIP400MTP فراصوت صفحه چند چاه اجازه می دهد تا برای آماده سازی نمونه با توان بالا آسان در صفحات سنجش.
سونیکاتور صفحه چند چاه UIP400MTP آماده سازی نمونه با توان بالا را در صفحات سنجش تسهیل می کند.
پروتکل سنجش حداقل غلظت ریشه کنی بیوفیلم (MBEC).
مرحله 1: تشکیل بیوفیلم
- سوسپانسیون باکتریایی را آماده کنید:
باکتری ها را در محیط های مناسب برای رشد فاز ورود به سیستم رشد کنید.
فرهنگ باکتریایی را به یک چگالی نوری تعریف شده رقیق کنید (به عنوان مثال، OD600 ~ 0.1). - بشقاب 96 چاهی را تلقیح کنید:
سوسپانسیون باکتریایی (به عنوان مثال، 150-200 میکرولیتر) را به هر چاه از یک صفحه میکروتیتر استاندارد 96 چاهی اضافه کنید. - درب گیره را وصل کنید:
درب گیره را روی صفحه تلقیح شده قرار دهید تا امکان تشکیل بیوفیلم روی سطوح گیره فراهم شود. - صفحه را جوجه کشی کنید:
تنظیم را در دمای مناسب (به عنوان مثال، 37 درجه سانتیگراد) به مدت 24 تا 48 ساعت بدون تکان دادن انکوبه کنید تا رشد بیوفیلم را تقویت کنید.
مرحله 2: درمان با عوامل ضد میکروبی
- محلول های ضد میکروبی را تهیه کنید:
طیف وسیعی از غلظت های ضد میکروبی را در محیط های تازه تهیه کنید.
بیوفیلم ها را در معرض عوامل ضد میکروبی قرار دهید:
درب گیره را از کشت باکتری خارج کرده و آن را با سالین استریل یا PBS بشویید تا سلول های پلانکتونی حذف شود.
درب گیره را در یک صفحه 96 چاهی جدید حاوی محلول های ضد میکروبی قرار دهید. - صفحه را جوجه کشی کنید:
برای یک دوره مشخص (به عنوان مثال، 24 ساعت) جوجه کشی کنید تا امکان قرار گرفتن در معرض ضد میکروبی فراهم شود.
چند چاه صفحه ماسونیکاتور UIP400MTP برای آماده سازی نمونه با توان بالا
مرحله 3: فراصوت با صفحه 96 چاه Sonicator UIP400MTP
مرحله فراصوت برای جدا کردن بیوفیلم از درب peg برای ارزیابی زنده ماندن بسیار مهم است. این مراحل را برای سونیکاتور UIP400MTP دنبال کنید:
- تنظیمات را آماده کنید:
یک بشقاب 96 چاهی تازه را با محیط بازیابی (به عنوان مثال، آبگوشت خنثی کننده یا محیط رشد تازه) در هر چاه پر کنید. - درب گیره را انتقال دهید:
درب گیره را از صفحه درمان ضد میکروبی بردارید.
درب گیره را با سالین استریل یا PBS بشویید تا عوامل ضد میکروبی باقیمانده از بین برود. - صفحه و فراصوت را قرار دهید:
درب گیره را به صفحه محیط بازیابی وصل کنید.
صفحه متوسط بازیابی را بر روی پلت فرم UIP400MTP صوتی قرار دهید و اطمینان حاصل کنید که صفحه در مرکز و پایدار است. - تنظیم پارامترهای فراصوت:
تنظیم پارامترهای فراصوت در UIP400MTP (تنظیمات را می توان به بیوفیلم تنظیم):
دامنه: 70-100٪.
زمان فراصوت: 1-3 دقیقه (تنظیم بر اساس استحکام بیوفیلم) در حالت چرخه. - فراصوتی:
روند فراصوت را شروع کنید. ارتعاش اولتراسونیک بیوفیلم ها را از سطوح گیره به محیط بازیابی خارج می کند. - نظارت بر فرآیند:
از سنسور دمای قابل اتصال برای نظارت بر دمای نمونه در چاه ها استفاده کنید. UIP400MTP را می توان برای خنک سازی به چیلر آزمایشگاهی متصل کرد. - رسیدگی پس از فراصوتی:
بلافاصله محیط بازیابی (که اکنون حاوی بیوفیلم های جدا شده است) را برای تجزیه و تحلیل پایین دست به یک صفحه استریل تازه منتقل کنید.
(الف) صفحه حاوی TSB با 2 درصد گلوکز که برای تشکیل بیوفیلم، بازیابی سلولی و
تعیین MIC و MBCB؛ (B) درب با سنجاق برای تشکیل بیوفیلم های استافیلوکوک. تعیین MIC و MBCB؛ (B) درب با سنجاق برای تشکیل بیوفیلم های استافیلوکوک.
سلول های بیوفیلم تشکیل شده بر روی پین ها توسط فراصوت جابجا شدند (فناوری سونوگرافی Hielscher) به مدت 5 دقیقه در صفحات 96 چاهی حاوی محیط کشت تازه برای بازیابی سلول ها.
(تصویر و مطالعه: ©دی اولیویرا و همکاران، 2016)
مرحله 4: ارزیابی زنده ماندن
بیوفیلم های جدا شده از صفحه و کشت:
- رقت های سریال محیط بازیابی و صفحه را روی آگار انجام دهید تا واحدهای تشکیل دهنده کلنی (CFU) را شمارش کنید.
از طرف دیگر، از روش زنده ماندن رنگ سنجی یا فلورسانس استفاده کنید. - نتایج رکورد:
تعیین MBEC به عنوان کمترین غلظت ضد میکروبی که زنده ماندن بیوفیلم قابل تشخیص را از بین می برد.
طراحی، ساخت و مشاوره – کیفیت ساخت آلمان
مافوق صوت Hielscher به خوبی برای بالاترین کیفیت و استانداردهای طراحی خود را شناخته شده. استحکام و بهره برداری آسان اجازه می دهد تا ادغام صاف از ultrasonicators ما به امکانات صنعتی. شرایط خشن و محیط های خواستار به راحتی توسط ماسوناتور Hielscher به دست آمده.
Hielscher اولتراسونیک یک شرکت دارای گواهینامه ISO است و تاکید ویژه ای بر مافوق صوت با کارایی بالا با ویژگی های دولت از هنر فن آوری و کاربر پسند قرار داده است. البته، مافوق صوت Hielscher مطابق با CE و دیدار با الزامات UL، CSA و RoHs.
آماده سازی نمونه در صفحات 96 چاهی و صفحات سنجش را ساده کنید با استفاده از سونیکاتور صفحه چند چاه UIP400MTP
ادبیات / منابع
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
- Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
- Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
- Microplate Sonicator Validated in Peer-Reviewed Proteomics Study
پرسش و پاسخهای متداول
سنجش MBEC چیست؟
سنجش حداقل غلظت ریشه کنی بیوفیلم (MBEC) یک روش استاندارد است که برای تعیین کمترین غلظت یک عامل ضد میکروبی مورد نیاز برای ریشه کن کردن باکتری های مرتبط با بیوفیلم استفاده می شود. این شامل رشد بیوفیلم ها بر روی سطوح تخصصی، قرار گرفتن آنها در معرض غلظت های مختلف ضد میکروبی و ارزیابی زنده ماندن سلول های جدا شده پس از اختلال بیوفیلم، معمولا از طریق فراصوت، برای ارزیابی اثربخشی درمان است.
تفاوت بین MBIC و MBEC چیست؟
حداقل غلظت مهاری بیوفیلم (MBIC) کمترین غلظت یک عامل ضد میکروبی مورد نیاز برای جلوگیری از تشکیل بیوفیلم است، در حالی که حداقل غلظت ریشه کنی بیوفیلم (MBEC) کمترین غلظت مورد نیاز برای ریشه کن کردن بیوفیلم تثبیت شده است. MBIC بر پیشگیری از بیوفیلم تمرکز دارد، در حالی که MBEC اثربخشی درمان را در برابر بیوفیلم های بالغ ارزیابی می کند.
چه پلاک هایی معمولا برای سنجش MBEC استفاده می شود؟
صفحات میکروتیتر که معمولا برای سنجش های MBEC استفاده می شوند، معمولا صفحات 96 چاهی هستند که از پلی استایرن یا پلی پروپیلن ساخته شده اند. این مواد سطح مناسبی را برای تشکیل بیوفیلم فراهم می کنند و از نظر شیمیایی در برابر عوامل ضد میکروبی آزمایش شده در طول سنجش مقاوم هستند. صفحات پلی استایرن به دلیل وضوح نوری که برای تجزیه و تحلیل های پایین دستی مانند اندازه گیری های اسپکتروفتومتری یا مبتنی بر فلورسانس مفید است، به طور گسترده ای ترجیح داده می شوند. طراحی این صفحات شامل درب های گیره ای قابل جدا شدن است که برای سنجش ضروری است زیرا بیوفیلم ها بر روی گیره هایی که در چاه های حاوی محیط رشد غوطه ور می شوند تشکیل می شود. صفحات استاندارد، مانند آنهایی که با پروتکل سنجش MBEC سازگار هستند، به طور خاص برای اطمینان از تکرارپذیری و سازگاری با سونیکاتور UIP400MTP یا سایر تجهیزات پردازش طراحی شده اند.
صفحات درب PEG چیست؟
صفحات درب PEG سیستم های صفحه ای چند چاهی تخصصی هستند که در آن درب مجهز به گیره ها یا پین های کوچک پلی اتیلن گلیکول (PEG) است که به هر چاه گسترش می یابد. این گیره ها سطحی را برای تشکیل بیوفیلم میکروبی در شرایط کنترل شده فراهم می کنند و رشد بیوفیلم در دنیای واقعی را تقلید می کنند. این طراحی به بیوفیلم ها اجازه می دهد تا روی گیره ها رشد کنند در حالی که چاه ها حاوی محیط های رشد یا عوامل ضد میکروبی هستند و امکان آزمایش با توان بالا حساسیت بیوفیلم به درمان ها، مانند سنجش های MBEC و MBIC را فراهم می کند.
Hielscher مافوق صوت تولید کننده هموژنایزرهای مافوق صوت با کارایی بالا از ازمایشگاه ها تا اندازه صنعتی.