پروتکل سنجش حداقل غلظت مهاری (MIC)
سنجش حداقل غلظت مهاری مبتنی بر بیوفیلم (MIC) یک روش ضروری برای ارزیابی اثربخشی عوامل ضد میکروبی در برابر میکروارگانیسم های مرتبط با بیوفیلم است که به دلیل داشتن ماتریکس خارج سلولی محافظ مقاومت بیشتری از خود نشان می دهند. یک گام مهم در این سنجش، اختلال در ساختارهای بیوفیلم برای آزاد کردن سلول های تعبیه شده برای ارزیابی دقیق زنده ماندن است. UIP400MTP چند چاه صفحه فراصوت تسهیل این فرایند با استفاده از سونوگرافی متمرکز برای تولید حفره کنترل شده, به طور موثر جدا سلول های بیوفیلم و پراکنده آنها را به یک سیستم تعلیق یکنواخت. این اختلال دقیق و قابل تکرار بیوفیلم، قابلیت اطمینان و توان سنجش های MIC را افزایش می دهد و UIP400MTP را به ابزاری ضروری در پیشبرد تحقیقات بیوفیلم تبدیل می کند.
فراصوت برای جداشدگی بیوفیلم
سنجش MIC مبتنی بر بیوفیلم معمولا زنده ماندن باکتری یا مهار رشد را با استفاده از روش هایی مانند آبکاری، شمارش کلنی یا اندازه گیری چگالی نوری اندازه گیری می کند. فراصوت یک گام مهم در سنجش MIC مبتنی بر بیوفیلم هنگام ارزیابی حساسیت ضد میکروبی میکروارگانیسم های مرتبط با بیوفیلم است. عملکرد اصلی آن جدا کردن و پراکنده کردن سلول های تعبیه شده در ماتریس بیوفیلم در یک سوسپانسیون یکنواخت برای تجزیه و تحلیل دقیق است.
بیوفیلم ها به طور قابل توجهی در برابر عوامل ضد میکروبی در مقایسه با سلول های پلانکتونیک مقاوم تر هستند، و جداشدگی مناسب را برای تجزیه و تحلیل دقیق حیاتی می کند. در طی این فرآیند، امواج اولتراسونیک کاویتاسیون کنترل شده را تولید می کنند، ماتریس بیوفیلم را از هم جدا می کنند و سلول های تعبیه شده را در یک سوسپانسیون یکنواخت در محیط بازیابی آزاد می کنند. این مرحله امکان ارزیابی دقیق زنده ماندن سلول های پراکنده بیوفیلم را از طریق روش هایی مانند آبکاری، رقیق سازی و شمارش کلنی ها فراهم می کند. اختلال بیوفیلم مناسب از طریق فراصوت مانع از اجزای ماتریکس باقیمانده از سلول های محافظ، که در غیر این صورت می تواند منجر به دست کم گرفتن فعالیت ضد میکروبی شود. UIP400MTP ماسونیکاتور صفحه چند خوبی به ویژه برای این منظور مناسب است، ارائه شرایط فراصوت دقیق و تکرارپذیر برای اطمینان از آماده سازی قابل اعتماد و با توان بالا از صفحات سنجش.
UIP400MTP میکروپلیت فراصوت برای جداسازی بیوفیلم دقیقا قابل کنترل در سنجش های MIC و MBEC.
چرا فراصوت در سنجش حداقل غلظت مهاری مبتنی بر بیوفیلم ضروری است؟
برای اندازه گیری زنده ماندن و شمارش سلول ها، جداسازی و پراکندگی کامل و قابل اعتماد سلول های منفرد مورد نیاز است. این UIP400MTP باعث جداشدگی یکنواخت و غیر آسیب رسان بیوفیلم و پراکندگی سلولی برای نتایج سنجش قوی می شود.
- پیچیدگی بیوفیلم: بیوفیلم ها جوامع میکروبی ساختاری هستند که در یک ماتریس ماده پلیمری خارج سلولی (EPS) محصور شده اند که از میکروارگانیسم ها محافظت می کند و آنها را در برابر عوامل ضد میکروبی مقاوم تر می کند.
- پراکندگی یکنواخت: برای اندازه گیری دقیق زنده ماندن سلول های تعبیه شده در بیوفیلم یا حساسیت آنها به داروهای ضد میکروبی، ابتدا باید بیوفیلم خارج شده و به یک سوسپانسیون همگن تجزیه شود.
پروتکل سنجش حداقل غلظت مهاری مبتنی بر بیوفیلم
سنجش حداقل غلظت مهاری (MIC) کمترین غلظت یک عامل ضد میکروبی مورد نیاز برای مهار رشد قابل مشاهده میکروارگانیسم ها را تعیین می کند. این پروتکل برای میکروارگانیسم های مرتبط با بیوفیلم طراحی شده است، با استفاده از UIP400MTP چند چاه سونیکاتور صفحه برای اختلال بیوفیلم.
مرحله 1: تهیه تلقیح باکتریایی
- سوسپانسیون باکتریایی را آماده کنید:
باکتری ها را در محیط های مناسب تا فاز لگاریتمی میانی رشد دهید.
برای دستیابی به تراکم سلولی استاندارد ، فرهنگ را رقیق کنید (به عنوان مثال ، استاندارد 0.5 مک فارلند یا OD600 ~ 0.1). - محلول های ضد میکروبی را تهیه کنید:
عامل ضد میکروبی را در یک محیط مناسب رقیق کنید تا طیف وسیعی از غلظت ها (به عنوان مثال، رقت های سریال دوگانه) ایجاد شود. - در صفحه 96well پخش کنید:
محلول های ضد میکروبی را به چاه های یک صفحه استاندارد 96 چاهکی با حجم چاه نهایی ~ 150-200 میکرولیتر اضافه کنید.
شامل کنترل های رشد (بدون ضد میکروبی) و کنترل های عقیم سازی (بدون تلقیح باکتریایی).
مرحله 2: تشکیل بیوفیلم روی درب گیره
- درب گیره را وصل کنید:
درب گیره تخصصی را روی چاه های تلقیح شده قرار دهید و اطمینان حاصل کنید که گیره ها به طور کامل در سوسپانسیون باکتریایی غوطه ور شده اند. - صفحه را جوجه کشی کنید:
در دمای مناسب (به عنوان مثال، 37 درجه سانتیگراد) برای مدت زمان مشخص (به عنوان مثال، 24 ساعت) در شرایط استاتیک جوجه کشی کنید تا امکان تشکیل بیوفیلم روی گیره ها فراهم شود. - گیره ها را بشویید:
درب گیره را از سوسپانسیون باکتریایی بردارید و به آرامی در سالین استریل یا PBS بشویید تا سلول های پلانکتونی شل متصل شده از بین بروند. - قرار گرفتن در معرض داروهای ضد میکروبی:
درب گیره را به یک صفحه 96 چاهی جدید حاوی رقت های ضد میکروبی که قبلا آماده شده است منتقل کنید.
برای یک دوره مشخص (به عنوان مثال، 24 ساعت) در شرایط استاتیک جوجه کشی کنید تا عامل ضد میکروبی بر روی بیوفیلم ها عمل کند.
مرحله 3: قرار گرفتن در معرض ضد میکروبی
چند چاه صفحه ماسونیکاتور UIP400MTP برای آماده سازی نمونه با توان بالا
مرحله 4: فراصوت با Microplate Sonicator UIP400MTP
مرحله فراصوت برای جدا کردن بیوفیلم از درب peg برای ارزیابی زنده ماندن بسیار مهم است. این مراحل را برای سونیکاتور UIP400MTP دنبال کنید:
- تنظیمات را آماده کنید:
یک بشقاب 96 چاهی تازه را با محیط بازیابی (به عنوان مثال، آبگوشت خنثی کننده یا محیط رشد استریل) در هر چاه پر کنید. - درب گیره را انتقال دهید:
درب گیره را از صفحه درمان ضد میکروبی بردارید.
درب گیره را با سالین استریل یا PBS بشویید تا عوامل ضد میکروبی باقیمانده از بین برود. - صفحه را در سونیکاتور قرار دهید:
درب گیره را به صفحه محیط بازیابی وصل کنید.
محل بازیابی صفحه متوسط را در UIP400MTP ماسونیکاتور ، اطمینان حاصل کنید که صفحه در مرکز و پایدار قرار دارد همانطور که در کتابچه راهنمای توضیح داده شده است. - تنظیم پارامترهای فراصوت:
تنظیم پارامترهای فراصوت در UIP400MTP (تنظیمات ممکن است به بیوفیلم تنظیم):
دامنه: 70-100٪.
زمان فراصوت: 1-3 دقیقه (تنظیم بر اساس ساختار بیوفیلم) در حالت چرخه. - فراصوتی:
روند فراصوت را شروع کنید. امواج اولتراسونیک ماتریس بیوفیلم را مختل کرده و سلول ها را به محیط بازیابی منتقل می کنند. - نظارت بر فرآیند:
از سنسور دمای قابل اتصال برای نظارت بر دمای نمونه در چاه ها استفاده کنید. UIP400MTP را می توان برای خنک سازی به چیلر آزمایشگاهی متصل کرد. - رسیدگی پس از فراصوتی:
بلافاصله محیط بازیابی حاوی بیوفیلم جدا شده را برای تجزیه و تحلیل بعدی به یک صفحه استریل تازه منتقل کنید.
(الف) صفحه حاوی TSB با گلوکز 2 درصد که برای تشکیل بیوفیلم، بازیابی سلولی و تعیین MIC و MBEC استفاده می شود. (B) درب با سنجاق برای تشکیل بیوفیلم های استافیلوکوک.
سلول های بیوفیلم تشکیل شده بر روی پین ها توسط فراصوت جابجا شدند (فناوری سونوگرافی Hielscher) به مدت 5 دقیقه در صفحات 96 چاهی حاوی محیط کشت تازه برای بازیابی سلول ها.
(تصویر و مطالعه: ©دی اولیویرا و همکاران، 2016)
مرحله 4: ارزیابی زنده ماندن
بیوفیلم های جدا شده از صفحه و کشت:
- رقت های سریال محیط بازیابی و صفحه را روی آگار انجام دهید تا واحدهای تشکیل دهنده کلنی (CFU) را شمارش کنید.
- MIC را ارزیابی کنید:
MIC را به عنوان کمترین غلظت ضد میکروبی تعیین کنید که به طور کامل رشد میکروبی قابل مشاهده را در محیط بازیابی مهار می کند.
حداقل غلظت مهاری MIC: نمونه ای از صفحه میکروتیتر و تفسیر نتایج میکرودایلوشن.
(مطالعه و تصویر: ©Jaskiewicz و همکاران 2019)
طراحی، ساخت و مشاوره – کیفیت ساخت آلمان
مافوق صوت Hielscher به خوبی برای بالاترین کیفیت و استانداردهای طراحی خود را شناخته شده. استحکام و بهره برداری آسان اجازه می دهد تا ادغام صاف از ultrasonicators ما به امکانات صنعتی. شرایط خشن و محیط های خواستار به راحتی توسط ماسوناتور Hielscher به دست آمده.
Hielscher اولتراسونیک یک شرکت دارای گواهینامه ISO است و تاکید ویژه ای بر مافوق صوت با کارایی بالا با ویژگی های دولت از هنر فن آوری و کاربر پسند قرار داده است. البته، مافوق صوت Hielscher مطابق با CE و دیدار با الزامات UL، CSA و RoHs.
آماده سازی نمونه در صفحات 96 چاهی و صفحات سنجش را ساده کنید با استفاده از سونیکاتور صفحه چند چاه UIP400MTP
ادبیات / منابع
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
- Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
- Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
پرسش و پاسخهای متداول
سنجش MIC چیست؟
سنجش حداقل غلظت مهاری (MIC) یک آزمایش استاندارد است که برای تعیین کمترین غلظت یک عامل ضد میکروبی مورد نیاز برای مهار رشد قابل مشاهده یک میکروارگانیسم استفاده می شود. این روش معمولا با استفاده از روش های میکرودایلوشن براث یا رقت آگار انجام می شود ، جایی که میکروارگانیسم ها در معرض رقت های سریال عامل ضد میکروبی قرار می گیرند. سنجش های MIC برای ارزیابی اثربخشی ضد میکروبی، هدایت درمان بالینی و ارزیابی سطح مقاومت در میکروارگانیسم های مرتبط با پلانکتونیک و بیوفیلم بسیار مهم هستند.
تفاوت بین سنجش حداقل غلظت مهاری مبتنی بر بیوفیلم و سنجش MBIC چیست؟
سنجش حداقل غلظت مهاری مبتنی بر بیوفیلم (MIC) و سنجش حداقل غلظت مهاری بیوفیلم (MBIC) از نظر هدف و روش شناسی مرتبط اما متمایز هستند.
سنجش MIC مبتنی بر بیوفیلم کمترین غلظت یک عامل ضد میکروبی مورد نیاز برای مهار رشد یا زنده ماندن بیوفیلم قابل مشاهده را ارزیابی می کند و بر سلول های مرتبط با بیوفیلم به جای باکتری های پلانکتونیک تمرکز می کند. در مقابل، سنجش MBIC به طور خاص توانایی یک عامل ضد میکروبی را برای جلوگیری از تشکیل بیوفیلم اندازه گیری می کند، به جای درمان بیوفیلم های از پیش تشکیل شده. در حالی که هر دو سنجش با باکتری های مرتبط با بیوفیلم سروکار دارند، سنجش MIC مبتنی بر بیوفیلم به درمان می پردازد و سنجش MBIC بر پیشگیری تأکید دارد و آنها را به ابزارهای مکمل برای مطالعه اثربخشی ضد میکروبی در برابر بیوفیلم ها تبدیل می کند.
چه بیوفیلم هایی در سنجش MIC استفاده می شود؟
بیوفیلم های میکروبی و سلول های پلانکتونی هر دو در سنجش حداقل غلظت مهاری (MIC) برای مطالعه اثربخشی ضد میکروبی در شرایط مختلف استفاده می شوند.
- سلول های پلانکتونیک:
سلول های پلانکتونیک سلول های میکروبی منفرد شناور آزاد هستند که به عنوان مدل استاندارد برای سنجش های سنتی MIC عمل می کنند. میکروارگانیسم های رایج عبارتند از اشریشیا کلی، سودوموناس آئروژینوزا، استافیلوکوکوس اورئوس و کاندیدا آلبیکانس. این سنجش ها MIC مورد نیاز برای مهار رشد سلول های آزاد را تعیین می کنند و برای غربالگری اولیه ضد میکروبی حیاتی هستند. - سلول های مرتبط با بیوفیلم:
سلول های بیوفیلم میکروارگانیسم هایی هستند که در یک ماتریکس خارج سلولی تعبیه شده اند که مقاومت آنها را در برابر ضد میکروبی ها به میزان قابل توجهی افزایش می دهد. سنجش های بیوفیلم MIC اغلب شامل موارد زیر است:- باکتری های گرم منفی: اشریشیا کلی، سودوموناس آئروژینوزا و کلبسیلا پنومونیه که برای تشکیل بیوفیلم در عفونت ها و محیط های صنعتی شناخته شده اند.
- باکتری های گرم مثبت: استافیلوکوکوس اورئوس (از جمله MRSA)، استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس و انتروکوک فکالیس، که معمولا در عفونت های مرتبط با دستگاه نقش دارند.
- قارچ ها: کاندیدا آلبیکنس و گونه های مرتبط، مهم در عفونت های قارچی مرتبط با بیوفیلم.
- بیوفیلم های گونه های مخلوط: اینها گاهی اوقات برای تکثیر بیوفیلم های چند میکروبی طبیعی، مانند آنهایی که در زخم های مزمن یا رسوب های زیستی صنعتی یافت می شوند، استفاده می شوند.
با مقایسه مقادیر MIC برای سلول های پلانکتونیک و سلول های مرتبط با بیوفیلم، محققان می توانند مقاومت افزایش یافته بیوفیلم ها را ارزیابی کرده و عوامل موثر در برابر این جوامع میکروبی انعطاف پذیرتر را شناسایی کنند.
تفاوت بین MIC و MBEC چیست؟
حداقل غلظت مهاری (MIC) کمترین غلظت یک عامل ضد میکروبی مورد نیاز برای جلوگیری از تشکیل بیوفیلم است، در حالی که حداقل غلظت ریشه کنی بیوفیلم (MBEC) کمترین غلظت مورد نیاز برای ریشه کن کردن بیوفیلم تثبیت شده است. MIC بر پیشگیری از بیوفیلم تمرکز دارد، در حالی که MBEC اثربخشی درمان را در برابر بیوفیلم های بالغ ارزیابی می کند.
چه پلاک هایی معمولا برای سنجش MBEC استفاده می شود؟
صفحات میکروتیتر که معمولا برای سنجش های MBEC استفاده می شوند، معمولا صفحات 96 چاهی هستند که از پلی استایرن یا پلی پروپیلن ساخته شده اند. این مواد سطح مناسبی را برای تشکیل بیوفیلم فراهم می کنند و از نظر شیمیایی در برابر عوامل ضد میکروبی آزمایش شده در طول سنجش مقاوم هستند. صفحات پلی استایرن به دلیل وضوح نوری که برای تجزیه و تحلیل های پایین دستی مانند اندازه گیری های اسپکتروفتومتری یا مبتنی بر فلورسانس مفید است، به طور گسترده ای ترجیح داده می شوند. طراحی این صفحات شامل درب های گیره ای قابل جدا شدن است که برای سنجش ضروری است زیرا بیوفیلم ها بر روی گیره هایی که در چاه های حاوی محیط رشد غوطه ور می شوند تشکیل می شود. صفحات استاندارد، مانند آنهایی که با پروتکل سنجش MBEC سازگار هستند، به طور خاص برای اطمینان از تکرارپذیری و سازگاری با سونیکاتور UIP400MTP یا سایر تجهیزات پردازش طراحی شده اند.
صفحات درب PEG چیست؟
صفحات درب PEG سیستم های صفحه ای چند چاهی تخصصی هستند که در آن درب مجهز به گیره ها یا پین های کوچک پلی اتیلن گلیکول (PEG) است که به هر چاه گسترش می یابد. این گیره ها سطحی را برای تشکیل بیوفیلم میکروبی در شرایط کنترل شده فراهم می کنند و رشد بیوفیلم در دنیای واقعی را تقلید می کنند. این طراحی اجازه می دهد تا بیوفیلم ها روی گیره ها رشد کنند در حالی که چاه ها حاوی محیط های رشد یا عوامل ضد میکروبی هستند و امکان آزمایش با توان بالا حساسیت بیوفیلم به درمان ها مانند سنجش های MBEC ، MBIC و MIC را فراهم می کند.
مزیت جابجایی بیوفیلم اولتراسونیک در مقایسه با خراش دادن سلول چیست؟
جابجایی بیوفیلم التراسونیک ارائه می دهد یک مزیت قابل توجهی نسبت به خراش دادن سلول با ارائه یک روش غیر تهاجمی, یکنواخت, و بسیار کارآمد برای از بین بردن بیوفیلم از سطوح. برخلاف خراش دادن ، که می تواند متناقض باشد و به سطح یا سلول های زیرین آسیب برساند ، امواج اولتراسونیک به ماتریس بیوفیلم نفوذ می کنند و بدون به خطر انداختن یکپارچگی ساختارهای مجاور ، آن را از هم جدا می کنند. این روش تکرارپذیری را تضمین می کند، خطر آلودگی را به حداقل می رساند و به ویژه برای کاربردهایی که نیاز به حذف دقیق بیوفیلم دارند، مانند مطالعات میکروبیولوژیکی یا آزمایش دستگاه های پزشکی، موثر است. بیشتر بخوانید که چگونه UIP400MTP Sonicator از خراش دادن سلول برتری دارد!
Hielscher مافوق صوت تولید کننده هموژنایزرهای مافوق صوت با کارایی بالا از ازمایشگاه ها تا اندازه صنعتی.